daño a adn desnudo por partículas contaminantes del aire

DAÑO A ADN DESNUDO POR PARTÍCULAS CONTAMINANTES DEL AIRE
VÁZQUEZ-LÓPEZ María Inés1, GARCÍA-CUELLAR Claudia M.1, ALFARO-MORENO
Ernesto, SÁNCHEZ-PEREZ Yesennia, SEGURA Yazmín, OSORNIO-VARGAS
Alvaro R. Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología, México, D.F.
C.P. 14080, correo electrónico [email protected] Fax: 5628 0432.
Palabras clave: degradación de adn, pm, estrés oxidante
RESUMEN
La exposición diaria a partículas del medio ambiente representa un riesgo en la salud
como enfermedades cardiovasculares, pulmonares y cáncer. El mecanismo por el
cual interviene las partículas en la salud es mediante inflamación y estrés oxidativo.
El presente estudio determina si los metales que componen a las partículas inducen
degradación de ADN desnudo. Para ello se colectaron partículas PM10 y PM2.5 de
diferentes zonas de la ciudad de México, PM10 de Monterrey y polvo de Mexicali. Se
aisló ADN de células Balb C que se expuso durante 24 h a las partículas a 37ºC en
agitación constante. Veinticuatro horas después las muestras se sometieron a
electroforesis en un gel de agarosa al 1.5% a 100 V durante 3 h aproximadamente,
se tiño con bromuro de etidio para observarse bajo luz UV. La evaluación de la
degradación de ADN mostró que las PM tienen la capacidad de inducir grados de
degradación diferentes, dependiendo del tamaño, año y lugar en el que se
colectaron. El daño a ADN únicamente ocurrió en presencia de H2O2 y fue inhibido
importantemente por deferoxamina (DFO). Dado que las partículas provocan la
degradación de ADN en un ambiente pro-oxidante y es inhibida por DFO, esto
demuestra una participación de los metales que componen a las partículas.
INTRODUCCIÓN
Las partículas del aire (PM) han sido clasificadas de acuerdo a su diámetro
aerodinámico: Las partículas finas de menos de 2.5 µm (PM2.5), las menores de 10
µm (PM10), así como también las partículas ultrafinas (PM0.1). Las partículas están
constituidas por productos de combustión, polen, contaminantes microbianos,
metales, etc. (Hsiao, Bonner y Lotte). Recientes estudios epidemiológicos han
correlacionado el incremento de los niveles de PM10 con el incremento de morbilidad,
mortalidad, emergencias y visitas hospitalarias por enfermedades pulmonares,
cardiovasculares y cáncer (García-Cuellar, Donald, Longyi). Las partículas se
encuentran suspendidas en el aire que al ser respiradas llegan a causar problemas
de salud ya que mediante la inhalación del aire en el que se encuentran suspendidas
llegan a ser fagocitadas por macrófagos alveolares, lo cual provoca la liberación de
citocinas que llevan a inflamación (Vinzents, Bonner) y estrés oxidativo (Kelly). El
estrés oxidativo se define como un desbalance en favor de los pro-oxidantes y en
contra de los antioxidantes y se caracteriza principalmente por el incremento de
niveles de peróxido e incremento de especies reactivas de oxigeno que son
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altamente reactivas con el ADN provocándole daño que potencialmente puede llegar
a desencadenar una enfermedad como el cáncer (Lotte, Tenopoulou y Frank). La
evaluación del daño al ADN inducido por PM’s utilizando DNA desnudo permite
evidenciar el potencial que tienen cada partícula para provocar un daño. El objetivo
del presente trabajo es determinar si las PM inducen degradación de ADN “desnudo”
y si la degradación es resultado del daño oxidante mediado por los metales que
componen a las PM.
MATERIAL Y METODO
Las PM10 y PM2.5 fueron colectadas en diferentes zonas (Norte, Centro y Sur) y año
(1991, 2003 y 2004-2005) de la ciudad de México, además de las ciudades de
Monterrey y de Mexicali. Las PM fueron colectadas mediante colectores (High Vol
Andersen) con membrana de fibra de vidrio o de nitrocelulosa (poro 3 µm). Las
partículas atrapadas en la membrana, se recuperaron mediante cepillado y se
depositaron en un frasco de vidrio libre de endotoxinas, estas fueron guardadas a 4º
C hasta su uso. Se cultivaron células Balb-c en medio DMEM con 10% de FBS al
80% de confluencia. Estas células se lavaron con una solución de fosfatos, se
agregaron 4 ml de PBS-EDTA y se incubaron a 37ºC aproximadamente 3 minutos.
Las células fueron despegadas y recuperadas en PBS, el paquete celular obtenido
se lavó dos veces con PBS para ser resuspendido en buffer de lisis del kit de
extracción de ADN (Roche 11 814 770 001). Posteriormente se adicionó proteinasa K
para romper proteínas, se incubó durante 2 horas a 65ºC y finalizado este tiempo de
incubación, se adicionó RNAsa y se incubó nuevamente a 37ºC. Se adicionó una
solución de precipitación de proteínas y se incubó durante 5 minutos en hielo para
ayudar a precipitar las proteínas. Esta suspensión fue centrifugada a 19,000 rpm a
20ºC durante 20 minutos, se recuperó el sobrenadante, se adicionó 0.7 ml de
isopropanol para precipitar el ADN, el cual es rehidratado con agua bi-destilada
estéril. El ADN fue cuantificado y guardado a 4ºC hasta su uso. Para evidenciar el
daño a ADN se expusieron 400 ng de ADN a diferentes concentraciones de
partículas (5, 10, 20, 40, 80 y 160 µg/mL) en un volumen final de 40 µl por reacción.
La reacción se incubó a 37ºC en agitación constante durante 24 horas.
Adicionalmente se utilizaron varios controles: 1) λ/hind III, 2) ADN solo, 3) ADN con
H2O2 1 mM, 3) ADN con deferoxamina (DFO) 1 mM y 4) un control positivo (CuSO4 5
mM y H2O2 1 mM, “Reacción Fenton”). Las muestras fueron incubadas en ausencia o
presencia de H2O2. 24 horas después se midió y ajustó el volumen de la muestra
antes de cargarlas en un gel de agarosa al 1.5%, con buffer de carga en una
proporción 5 a 1. Las muestras se corrieron a 100 V aproximadamente durante 3 hrs.
(cámara de electroforésis GibcoBRL H5 Horizontal Gel), al termino se tiñeron los
geles con bromuro de etidio (1.2 µg/mL) para ser fotografiados con un
fotodocumentador Gel Logic 200 (Kodak).
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RESULTADOS
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Las partículas del 2004 – 2005 muestran degradación con 40 µg/mL y se observa
que la degradación es mayor con PM10 que PM2.5, además se observa que las que
tiene mayor capacidad de degradación son las del Norte seguida de Centro y al final
las del Sur (Figura 1). Para 1991 PM10 de Norte, Centro y Sur lograron inducir
degradación del ADN con 40 µg/mL y aumenta de manera proporcional a la
concentración de partículas. Aunque para este caso el grado de degradación parece
ser mayor con las muestras del Norte y Centro, pero menor con las del Sur (Figura
2). También para las partículas del 2003 la degradación es con 40 µg/mL y
proporcional a la concentración. Las PM2.5 2003 inducen mayor degradación que las
PM10 y las del Norte resultaron ser más potentes que las del Centro (Las figuras de
este año no se muestran ya que tienen el mismo patrón que las figuras mostradas).
Por su parte el polvo de Mexicali representa la muestra que menor degradación
indujo ya que se requirieron al menos 160 µg/mL de partículas para inducirla.
Finalmente, las muestras de Monterrey indujeron el mayor grado de degradación al
requerirse una concentración tan baja como 5 µg/mL (Figura 2). En todos los casos
la degradación únicamente ocurrió en presencia de peróxido y siempre fue inhibida
total (p. ej.: PM2.5 2004-2005 en Norte y Centro; PM10 2004-2005 para Norte) o
parcialmente (PM10 Monterrey y D.F. 2004-2005 centro, y PM2.5 sur) con DFO.
DISCUSIÓN
La evaluación de la degradación de ADN muestra que las PM tienen una diferente
capacidad de inducir degradación dependiendo del tamaño, año y zona de
recolección. El daño únicamente se puede mostrar cuando el ADN está en presencia
de un ambiente pro-oxidante, y que dicha degradación es inhibida por la presencia
de un quelante de metales como lo es la deferoxamina. Esto sugiere una fuerte
participación de los metales presentes en las PM. Las diferentes grados de
degradación encontradas por año, lugar y región sugiere la existencia de variación
de metales presentes en nuestras muestras estudiadas. Estudios realizador por otros
autores en cuanto a la variación del contenido de metales por zona de la Ciudad de
México parece corroborar esta observación (Miranda).
AGRADECIMIENTOS
A Flor Martínez por su apoyo metodológico y el apoyo de CONACYT 43138-M,
LASPAU 2005 y CAM-MIT.
REFERENCIAS
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