Tanto os bestiários do medioevo como as Wunderkammer do

ELABORADO POR:
1
Presentación
El presente manual es una respuesta a las numerosas consultas realizadas al
Centro Panamericano de Fiebre Aftosa-OPS/OMS (PANAFTOSA) por parte de los
profesionales de los servicios nacionales de los países sobre el uso, significado e
interpretación de las pruebas EITB e I−ELISA 3ABC.
Resume una trayectoria de trabajo multidisciplinario que contó con el apoyo
del equipo profesional de PANAFTOSA y el invalorable aporte de los profesionales de
los servicios nacionales de los países, que culminó con la reciente incorporación de
las técnicas en el Manual de Standards para Ensayos de Diagnóstico y Vacunas del
Office International des Epizooties (O.I.E.), 2000.
Seguirán a este manual otros, describiendo los principios técnicos para la
preparación de aquellos reactivos no descriptos aquí (antígenos recombinantes, tiras
de nictrocelulosa y microplacas sensibilizadas, etc.), de acuerdo a los nuevos
enfoques de cooperación técnica que PANAFTOSA brinda a los países.
José Germán Rodríguez Torres
Director del
Centro Panamericano de Fiebre Aftosa
2
Índice
ÍNDICE..........................................................................................................................................................0
PREFACIO ...................................................................................................................................................1
1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................................3
2. EXPLICACIÓN METODOLÓGICA.....................................................................................................7
3. EITB ........................................................................................................................................................11
3.1. SOLUCIONES Y REACTIVOS ...........................................................................................................11
3.2. MATERIAL DE LABORATORIO Y EQUIPOS NECESARIOS................................................................14
3.3. MUESTRAS BIOLÓGICAS ................................................................................................................15
3.4. CUIDADOS Y PRECAUCIONES ........................................................................................................16
3.5. PROCEDIMIENTO EITB ..................................................................................................................16
3.6. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS EITB.....................................................................................20
3.7. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO DEL EITB.............................................................................22
3.8. EVALUACIÓN DE INTERFERENCIA DE VACUNAS............................................................................27
4. I-ELISA 3ABC........................................................................................................................................30
4.1. SOLUCIONES Y REACTIVOS ...........................................................................................................30
4.2. MATERIAL DE LABORATORIO Y EQUIPOS NECESARIOS................................................................33
4.3. MUESTRAS BIOLÓGICAS ................................................................................................................34
4.4. CUIDADOS Y PRECAUCIONES ........................................................................................................34
4.5. PROCEDIMIENTO I-ELISA 3ABC ................................................................................................34
4.6. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS I-ELISA 3ABC ...............................................38
4.7. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO DEL I-ELISA 3ABC...........................................................41
5. CONSIDERACIONES FINALES .........................................................................................................46
6. REFERENCIAS......................................................................................................................................49
7. ANEXOS .................................................................................................................................................54
PLANILLA 1 ..............................................................................................................................................54
PLANILLA 2 .............................................................................................................................................55
PLANILLA 3 ..............................................................................................................................................56
MAPA 1 – EITB ......................................................................................................................................57
MAPA 2 – EITB ......................................................................................................................................58
MAPA 3 – ELISA....................................................................................................................................59
MAPA 4 - RESULTADOS I-ELISA 3ABC .............................................................................................60
Prefacio
Este manual fue elaborado por el Centro Panamericano de Fiebre AftosaOPS/OMS (PANAFTOSA), como instrumento de apoyo al proceso de transferencia de
las pruebas inmunoenzimáticas EITB (Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot) e
I-ELISA 3ABC (Indirect - Enzyme linked immunosorbent assay) a los países. Estos
ensayos permiten la detección de anticuerpos contra proteínas no capsidales1 del
virus de la fiebre aftosa (VFA), independientemente del estado de vacunación del
animal. Se destinan a confirmar ausencia de actividad viral en poblaciones a través
de muestreos seroepidemiológicos adecuadamente diseñados.
El
manual
tiene
como
núcleo
principal
la
descripción
detallada
de
procedimientos técnicos e interpretativos. Interesaba reunir en una única fuente, y
en general con mayores detalles, los aspectos cubiertos por las publicaciones
científicas, protocolos de trabajo y materiales de divulgación que acompañaron el
desarrollo y validación de estas pruebas. En todos los casos en que fue posible
fueron abordados otros aspectos pertinentes al objetivo propuesto. Así por ejemplo,
se consideró oportuno situar las técnicas aquí descriptas en el contexto de las
pruebas previamente propuestas para los mismos fines. Se dio especial énfasis a los
aspectos referentes a la interpretación de resultados, tanto a nivel de pruebas
individuales como a la integración de resultados para interpretación a nivel
poblacional. Para este último fin se incluyeron como referencia valores de
distribución epidemiológica y demográfica obtenidos para diferentes poblaciones.
También se abordaron aspectos de políticas de calidad, desde tipo de documentos,
formas de registro y archivo de resultados2 hasta pruebas de control de calidad,
tanto de reactivos como de evaluación del desempeño de las pruebas. Se resalta que
los mismos se presentan a título de ejemplo de la política de calidad practicada en
PANAFTOSA, y no deben ser asumidos como la única solución posible al aspecto de
calidad. Más que la forma, lo que interesa al introducir estos aspectos es llamar la
1
Optamos por usar el término "no capsidales" ya que la nomenclatura ampliamente difundida
"no estructurales" no contempla que varias de las proteínas tratadas como no estructurales
forman parte de la estructura del virión, como por ejemplo 3B y 3D.
2
Acompaña al manual un diskette con archivos de Excel para registro y cálculo de resultados.
1
atención para toda una estructura de trabajo que no sólo facilita, sino que optimiza
los procedimientos aquí descriptos.
Se espera que el manual cumpla su cometido y atienda tanto a las
necesidades de los laboratorios que ya trabajan con estas pruebas, como a las de
aquellos que aún están en proceso de implantación. Cabe destacar que el amplio
alcance dado al mismo, que resume gran parte de la experiencia metodológica,
técnica e interpretativa acumulada desde el año 1988 en el área, lo torna una útil
fuente de consulta. Los aspectos abordados no sólo son de suma importancia para el
proceso de transferencia, sino también para la armonización de técnicas entre
diferentes laboratorios, haciendo posible la comparación de diferentes ensayos y el
cotejo de resultados.
2
1. Introducción
En la década del 60 las técnicas inmunoenzimáticas, con especial énfasis el
ELISA (17, 31, 32), fueron desarrolladas y perfeccionadas. Rápidamente se
difundieron
y
pasaron
a
ser
predominantes
en
el
área
de
diagnóstico,
complementando y hasta substituyendo, en algunos casos, otras pruebas tales como
aglutinación, inmunofluorescencia, inmunodifusión en gel de agarosa (IDGA),
recuperación viral en cultivo celular, etc. Entre otros motivos, la gran difusión de
estos métodos puede ser atribuida a la rapidez con que se obtienen los resultados, a
la facilidad para manipular un gran número de muestras, al uso de reactivos
económicos, estables y de larga duración, y al hecho de no exigir equipos costosos
para su ejecución. Tales características resultan altamente ventajosas y justifican el
amplio interés que suscitaron estos procedimientos que permiten obtener resultados
precisos y reproducibles, siempre que estén bien padronizados y manipulados.
En relación a la fiebre aftosa, los ensayos inmunoenzimáticos para detección
de anticuerpos fueron usados básicamente en dos líneas distintas, que difieren
fundamentalmente en lo que se refiere al tipo de anticuerpo evaluado.
La primera línea surge en la década del 80, cuando Hamblin y colaboradores
(14, 15, 16) desarrollaron un ELISA para detección y cuantificación de anticuerpos
contra proteínas capsidales del VFA en suero de animales, que eventualmente podría
substituir el método de seroneutralización viral. Ambas pruebas tienen en común la
forma indirecta de detectar dichos anticuerpos, a través del análisis de la
interferencia del suero sobre una suspensión viral de título conocido. Sin embargo se
diferencian en el modo de visualizar tal interferencia: por inhibición del efecto
citopático
en
la
seroneutralización
viral
y
por
disminución
de
la
reacción
colorimétrica padrón en el ELISA. Otra diferencia se refiere a los anticuerpos
detectados, la seroneutralización viral evalúa sólo anticuerpos neutralizantes,
mientras que el ELISA no se limita apenas a este tipo de anticuerpos. El desarrollo
del ELISA fue de gran significado ya que permitió obviar el delicado y demorado
proceso de cultivo celular requerido para la seroneutralización viral, disminuyendo
además las exigencias de bioseguridad. Cabe señalar que si bien este ELISA se
incluye dentro de la línea de pruebas orientadas al control de vacuna, los autores
3
sugerían que también podía ser de utilidad para la evaluación de exposición previa al
virus de animales a ser exportados. Sin embargo, considerando que la prueba
detectaba anticuerpos capsidales, inducidos también por vacunas inactivadas del
VFA, su uso quedaba limitado a animales no inmunizados.
La segunda línea de pruebas inmunoenzimáticas en fiebre aftosa surge en la
década del 90 en respuesta a las necesidades del Plan Hemisférico de Erradicación
de la Fiebre Aftosa (PHEFA) implantado en 1988, y tiene como finalidad la detección
de anticuerpos contra proteínas no capsidales del VFA, generadas durante el proceso
de replicación del virus. Para acompañar el progreso del PHEFA en América del Sur
era necesario contar con instrumentos que permitiesen confirmar ausencia de
actividad viral en la población animal, a través de marcadores de exposición al
agente infeccioso que no pudiesen ser generados por las vacunas. La posibilidad de
desarrollar tales instrumentos se abrió con la perspectiva de detectar anticuerpos
contra proteínas no capsidales del VFA, los cuales se inducen en el animal como
resultado del proceso de infección. Considerando que los datos disponibles parecían
indicar que las vacunas inactivadas, utilizadas para prevención de la fiebre aftosa, no
eran capaces de inducir dichos anticuerpos, se enfocó el uso de los mismos como
marcadores de exposición al agente infeccioso en la población animal, independiente
del estado de vacunación. Cabe destacar el real alcance de estos marcadores: su
ausencia es prueba confirmatoria de inexistencia de actividad viral en la población
estudiada; por otro lado, su presencia permite inferir exposición al agente infeccioso,
habiendo necesidad de estratificar los resultados en función de la edad de los
animales para evaluar si existe riesgo de que la actividad viral aún esté presente en
la población. (Ver pág. 22, Características de desempeño del EITB).
Varios grupos trabajaron en el desarrollo de pruebas inmunoenzimáticas para
detección de anticuerpos contra proteínas no capsidales del VFA. Los primeros
trabajos publicados con este enfoque fueron los de PANAFTOSA (3, 4, 5, 6, 7, 8, 24,
27, 28), y luego siguieron los de otros grupos (9, 12, 13, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25,
26, 29, 34, 35, 36). Las pruebas desarrolladas difieren principalmente en el número
y tipo de proteína no capsidal a ser utilizada para la detección de anticuerpos.
PANAFTOSA propone en 1990 (27) la evaluación individual y simultanea de
anticuerpos contra las proteínas 3ABC, 3D, 2C, 3B y 3A. Posteriormente el
Laboratorio Mundial de Referencia propone el uso individual de 3ABC, Lb, 2C, 3A y
4
3D (21). Al contrario, otros enfoques evalúan anticuerpos contra una única proteína.
El uso de un único marcador tiene como limitación el hecho que todo y cualquier
suero reactivo es equiparado a un resultado positivo, lo que compromete el valor
predictivo positivo de diagnóstico, particularmente en áreas de baja prevalencia.
Cabe señalar que, a pesar de ocurrir en baja frecuencia, se han encontrado animales
con anticuerpos capaces de reconocer individualmente alguna de las proteínas no
capsidales del VFA en áreas libres sin vacunación, si bien esto se registra con mayor
frecuencia en áreas libres con vacunación (Ver pág. 22, Características de
desempeño del EITB). En este contexto, las pruebas que utilizan varios antígenos y
que permiten evaluar la reactividad individual para cada uno de ellos, minimizan el
error que puedan introducir reacciones individuales sobre los resultados positivos, ya
que se puede usar como criterio de positividad la presencia de anticuerpos para
todos los antígenos usados.
Así como en la década del 80 el ELISA surgió como una alternativa a la
seroneutralización viral, las pruebas inmunoenzimáticas desarrolladas en la década
del 90 surgen como alternativa a la IDGA, prueba que se aplicaba para estudiar la
presencia de antígenos asociados a la infección (10), y que utiliza como sonda
serológica un preparado de naturaleza empírica denominado VIAA (Antígeno
Asociado a la Infección Viral). Con el progreso de los programas de erradicación era
necesario contar con una prueba más consistente y con sensibilidad mejorada, que
permitiese analizar muestreos seroepidemiológicos con alta precisión en poblaciones
sistemáticamente vacunadas. Los intentos de aumentar la sensibilidad de la IDGA
mediante una prueba ELISA (2), manteniendo el VIAA como sonda serológica,
aumentaron los problemas de interferencia de vacuna ya observados en el ensayo de
IDGA (1) y que se venían acentuando en la última década a partir de la implantación
de nuevas exigencias de calidad de las vacunas, como consecuencia del PHEFA. El
surgimiento de las técnicas de ingeniería genética3, permitió obtener proteínas de
composición bioquímica bien definida, y con pureza adecuada para uso en pruebas
de alta sensibilidad. Estos métodos de bioingeniería permitieron no solamente la
3
Apenas Dekker (11) sugiere el uso de proteínas nativas purificadas de sobrenadante de
crecimiento del VFA; todos los otros trabajos proponen el uso de proteínas obtenidas por
técnicas de bioingeniería. Tales antígenos no sólo tienen la ventaja de una fácil producción
con eficiente rendimiento, sino también, y principalmente, la ventaja de no requerir la
manipulación de material infectivo.
5
preparación de la proteína 3D (principal componente del VIAA), sino también de
otros antígenos no capsidales, potenciales indicadores de exposición al agente
infeccioso.
El objetivo del presente manual es describir la metodología, discutir los
enfoques interpretativos y comentar la aplicación y alcances de las pruebas
inmunoenzimáticas desarrolladas por PANAFTOSA con antígenos recombinantes,
capaces de detectar anticuerpos contra proteínas no capsidales del VFA, en suero
bovino.
6
2. Explicación metodológica
Las dos pruebas que se describen en este manual, EITB e I-ELISA 3ABC, son
métodos inmunoenzimáticos y tienen por finalidad evaluar la presencia de
anticuerpos específicos contra proteínas no capsidales del VFA en suero bovino4. El
fundamento metodológico será descripto en conjunto, ya que en principio ambas
pruebas son semejantes, diferenciándose apenas en algunos aspectos secundarios.
Se puede considerar para efectos prácticos que ambos procedimientos operan
por la acción sucesiva de dos sistemas:
•
sistema de captura que permite extraer de la muestra problema el analito
(molécula que se quiere detectar) e inmovilizarlo al soporte
•
sistema de detección que permite revelar la presencia del analito a través
del desarrollo de color
Estos sistemas son accionados durante los ensayos, que constan de tres
etapas:
(a)
incubación de los sueros
(b)
incubación del anticuerpo-conjugado
(c)
incubación del substrato
Las reacciones (b) y (c) son precedidas de ciclos de lavado y al final del
proceso (c) se bloquea la reacción. El sistema de captura opera en la primera etapa y
el de detección es accionado en las dos etapas siguientes (Fig. 1, pág. 10).
El sistema de captura es montado sobre un soporte, que en el EITB consiste
en tiras de papel de nitrocelulosa y en el I-ELISA 3ABC en placa de poliestireno.
Dicho sistema está constituido por proteínas inmovilizadas que funcionan como
sondas serológicas (3ABC para I-ELISA 3ABC y 3ABC, 3D, 2C, 3B y 3A para EITB).
Tales proteínas al entrar en contacto con la muestra a ser investigada, y en el caso
7
de ésta efectivamente contar con anticuerpos contra las proteínas no capsidales del
VFA, reaccionarán con dichos anticuerpos específicos, formando el complejo
antígeno-anticuerpo. Dos propiedades de este complejo sustentan la estrategia de
las pruebas inmunoenzimáticas: por un lado la alta especificidad de la reacción
antígeno-anticuerpo y por otro la estabilidad de dicha unión. La especificidad de la
reacción antígeno-anticuerpo es capitalizada como un sistema altamente eficaz,
capaz de reconocer y "extraer" de la muestra en investigación el anticuerpo deseado.
La estabilidad de tal unión permite la inmovilización del anticuerpo, vía antígeno, al
soporte, consiguiendo retenerlo cuando se elimina la muestra al final de la etapa de
incubación, mediante lavado. En resumen, el sistema de captura permite seleccionar
anticuerpos específicos de la muestra, extrayendo él o los mismos vía inmovilización.
El sistema de detección permite revelar la presencia de anticuerpos
inmovilizados
mediante
el
uso
de
anticuerpos-conjugados
(conjugado).
Este
conjugado es un anticuerpo específico contra inmunoglobulinas de tipo IgG de
bovinos, y tiene acoplada una enzima (fosfatasa alcalina en el EITB y peroxidasa en
el I-ELISA 3ABC). Habiendo anticuerpos bovinos ligados al soporte, el conjugado
reaccionará con los mismos, quedando a su vez también inmovilizado. Al final de la
etapa de incubación, el conjugado que no haya reaccionado será eliminado mediante
lavado, restando apenas aquel que haya sido inmovilizado por reacción contra IgG
de bovino. En la última etapa de la prueba se agrega el substrato / cromógeno
adecuado para la enzima acoplada al conjugado (NBT-BCIP en el EITB y TMB en el IELISA 3ABC). Bajo la acción de la enzima el cromógeno desarrollará color,
adquiriendo una coloración azul en el I-ELISA 3ABC (que cambia para amarillo
cuando se adiciona la solución bloqueadora) y violácea en el EITB. Por otro lado, la
ausencia de color indica que no fue inmovilizado conjugado, lo que revela ausencia
de anticuerpos específicos contra proteínas no capsidales del VFA en el suero
estudiado.
En lo que se refiere a las diferencias entre las pruebas, la principal está
relacionada al soporte rígido, que limita el modo de presentación de la o las sondas
serológicas. La placa de poliestireno (soporte del ELISA) permite analizar por cada
pocillo la presencia de anticuerpos contra un único tipo de antígeno, pues en caso de
4
En lo que se refiere a otras especies ver pág. 45, Consideraciones finales.
8
usar varios antígenos en el mismo pocillo, no sería posible discernir en una muestra
reactiva, si la misma contenía anticuerpos contra todos los antígenos ofrecidos o
contra un único, y en este último caso, contra cual de ellos. En ciertas situaciones
tales discriminaciones pueden no ser relevantes, ya que un único tipo de anticuerpo,
independiente de cual sea efectivamente, puede ser suficiente para establecer de
modo inequívoco exposición previa al agente infeccioso. Para el caso de la fiebre
aftosa, como fue discutido previamente (pág. 3, Introducción), la presencia de
anticuerpos contra una única proteína no capsidal del VFA no permite inferir
inequívocamente exposición previa al agente infeccioso. La posibilidad de presentar
varios antígenos simultáneamente, manteniendo la capacidad de discriminar la
respuesta individual a cada uno de ellos en una única y misma reacción, no es
posible en un soporte del tipo placa5, pero si lo es en papel de nitrocelulosa. En el
EITB las proteínas son inicialmente separadas en bandas discretas en gel de
poliacrilamida
(SDS-PAGE)
según
su
peso
molecular
y
a
continuación
son
transferidas al papel de nitrocelulosa, donde se mantiene la resolución de las
proteínas como bandas discretas que no se sobreponen. Posteriormente este papel
es cortado en tiras, cada una de las cuales contiene los cinco antígenos
recombinantes utilizados en el EITB. De este modo es posible en un único ensayo no
sólo investigar la existencia de anticuerpos para varios antígenos, sino también
verificar el perfil de reactividad para cada uno de ellos.
5
Resta en el caso de placa el recurso de presentar diferentes antígenos por hilera o columna,
pero con esto aumenta el volumen de muestra requerido y disminuye drásticamente el
número de muestras que se puede procesar por placa. Para el caso de cinco antígenos como
se usa en el EITB, el rendimiento de una placa cae de 96 para 19 muestras, sin considerar los
controles.
9
Figura 1
Etapas de las pruebas
inmunoenzimáticas
SATURACIÓN DE LAS TIRAS
(a) INCUBACIÓN DE LOS SUEROS
YY
YY
60 MINUTOS A TA
30 MINUTOS A 37°C
LAVADO
Y Y
Y
Y
(b) INCUBACIÓN DEL ANTICUERPO CONJUGADO
60 MINUTOS A TA
30 MINUTOS A 37°C
YY
Y
LAVADO
Y
YY
Y
c) INCUBACIÓN DEL SUBSTRATO
15 MINUTOS A TA
Y
Y Y
Y
LECTURA DE RESULTADOS
3
4 5 6 7
-
+ L
+ -
-
Y
3ABC
3D
2C
3B
3A
Y
1 2
SUEROS
PROBLEMA
Y Y
CONTROLES
-
10
15 MINUTOS A TA
3. EITB
El EITB aquí descripto es un ensayo inmunoenzimático para detección in vitro
de anticuerpos contra proteínas no capsidales del VFA (3ABC, 3D, 2C, 3B y 3A) en
bovinos, que puede ser usado como prueba única, o para confirmar resultados
sospechosos y/o reactivos del I-ELISA 3ABC.
3.1. Soluciones y reactivos
•
Soluciones stock
Todas las soluciones a seguir pueden ser preparadas con anticipación y, si son
conservadas del modo indicado, pueden ser usadas por un período de hasta seis
meses. Los códigos y marcas de los reactivos usados por PANAFTOSA para la
preparación de estas soluciones constan en la planilla 1 (pág. 54). Cabe señalar que
no es necesario usar estrictamente las mismas marcas, apenas reactivos de calidad
equivalente al especificado. Se recomienda usar para la preparación de las
soluciones agua deionizada, destilada, y en lo posible autoclavada. Asimismo, es
conveniente esterilizar las soluciones stock (autoclavar o filtrar), a excepción del NBT
y BCIP.
Se sugiere que se preparen las soluciones a seguir en cantidad suficiente para
6 meses de trabajo, lo que permitirá el control, por comparación con las soluciones
anteriores en el momento de substitución, sin implicar un trabajo o costo excesivo.
Se recomienda seguir el mismo procedimiento para control de lotes de leche
descremada, entre los cuales puede existir variación en la capacidad de saturación.
Una vez abierta, utilizar la leche dentro de los siguientes 30 días. Para el cálculo de
los volúmenes a preparar consultar la planilla 2 (pag. 55), que especifica la cantidad
de reactivos y los volúmenes de soluciones necesarios para el número de muestras a
analizar. Estos cálculos pueden realizarse directamente utilizando la planilla 2 del
archivo ″EITB.xls″ en el diskette
anexo. Se resalta que en los cálculos de esta
planilla ya están contemplados los materiales necesarios para incluír un juego de
sueros controles para cada gel de 24 tiras (1 gel = 20 muestras problema + 4 sueros
control)
11
Buffer de lavado 10x
0,5 M Tris-HCl
60,5 g
1,5 M NaCl
87,66 g
2% Tween 20
20 ml
H2O csp
1000 ml
Ajustar el pH a 7,5 +/- 0,1 (HCl ~40 ml/l) Conservar entre 4 – 8°C
NBT (Nitro Blue Tetrazolium)
5% NBT
50 mg
70% Dimetilformamida
700 µl
H2O csp
300 µl
Conservar entre 4 – 8°C
BCIP ([4] 5-Bromo 4-Chloro 3-Indolyl Phosphate)
5% BCIP
50 mg
100% Dimetilformamida
1000 µl
Conservar entre 4 – 8°C
Buffer substrato
100 mM NaCl
5,84 g
5 mM MgCl2
0,48 g
100 mM Tris-HCl
12,1 g
H2O csp
1000 ml
Ajustar el pH a 9,5 +/- 0,1 (HCl ~200 µl/l) Conservar entre 4 – 8°C
12
Otros reactivos:
Tiras de nitrocelulosa - con 20 ng/mm de cada antígeno, 3ABC, 3D, 2C, 3B y
3A (28). Guardar a temperatura ambiente (TA) (aproximadamente 23-250C) en lugar
seco.
Obs. Para facilitar la prueba, impidiendo que se confundan tiras con
una misma numeración, PANAFTOSA identifica con un único color
(en general rojo, verde, azul o negro) cada papel de nitrocelulosa
proveniente de un mismo gel. Se recomienda no analizar más de 80
muestras en una misma prueba, y considerando que las mismas
pueden ser analizadas a partir de cuatro geles, usar uno de cada
color.
• Sueros controles - fraccionar de modo que la alícuota en uso sea
consumida en un período máximo de dos semanas y conservar a –20°C.
Mantener la alícuota en uso a 4°C. Los sueros controles, "standards
secundarios", serán preparados en cada laboratorio, y validados en
PANAFTOSA mediante su comparación con los sueros controles "standards
primarios".
• Conjugado - anticuerpo anti-IgG bovino, producido en conejo y conjugado
con fosfatasa alcalina. Fraccionar el original, sin diluir, en alícuotas
de
100 µl y conservar a 4°C.
Titulación del conjugado - la dilución de uso para el conjugado
deberá ser determinada inicialmente por comparación frente al
conjugado de referencia de PANAFTOSA. Una vez implementada la
técnica deberá ser titulado por comparación al lote anterior, y en
este contexto recomendamos mantener tanto una alícuota de
conjugado como un panel de sueros apropiados exclusivamente para
ser usados en este tipo de prueba. No se recomienda trabajar con
diluciones inferiores a 1/4000.
• Lisado E. coli 537.
13
3.2. Material de laboratorio y equipos necesarios
•
Material de laboratorio
• Micropipetas tipo Pipetman con volúmenes de 20, 200 y 1000 µl (P20,
P200 y P1000), con inexactitud inferior a 5%.
• Pipeta multicanal ajustable para volúmenes entre 50 y 200 µl (Tipo
Eppendorf Plus/8TM) y/o repipetador (Tipo Eppendorf Repeater 4780), con
inexactitud inferior a 5%.
• Tips adecuados para las micropipetas.
• Bandejas para las reacciones con ocho canaletas - Accutran Mini Incubation Trays (BioRad, número de catálogo: 170-3902 y 170-3903,
respectivamente para 20 y 100 unidades). A pesar de ser descartables, las
bandejas pueden ser reutilizadas. Para lavarlas, seguir el procedimiento a
continuación:
(a)
Después de usadas, colocarlas en solución de hipoclorito de
sodio a 0,5% en jabón neutro. Dejar toda la noche
(b)
Enjuagar bien 10 veces con H2O
(c)
Colocar 30 minutos en solución con detergente
(d)
Enjuagar bien 10 veces con H2O
(e)
Por último, realizar 3 enjuagues con H2O destilada
• Piceta
• Pinza de plástico
• Material de vidrio
• Hipoclorito de sodio 5% para inactivación del material y soluciones a
descartar.
14
•
Equipos
• Vórtex
• Equipos
básicos
de
laboratorio
(pHmetro,
balanza,
equipos
para
purificación de H2O)
• Agitador tipo rocker oscilante - (Hoefer PR50 o Thomas Scientific, número
de catálogo 8292-B76)
Se recomienda seguir las instrucciones del fabricante para operación,
calibración y mantenimiento de los mismos.
3.3. Muestras biológicas
Para la preparación y la conservación de los sueros recomendamos seguir los
procedimientos a continuación:
• Después de la retracción del coágulo, centrifugar la muestra a 2000 g
durante 10 minutos.
• Conservar los sueros a –20°C. Para aquellos sueros que haya interés en
conservar para pruebas de control de calidad, sugerimos que se les
adicione azida de sodio 0,1% y gentamicina 0,01%. También se puede
usar Bromidox a dilución final 0,05%.
• Evitar
ciclos
muestras.
repetidos
Para
aquellos
de
congelamiento/descongelamiento
sueros
que
sean
usados
con
de
las
frecuencia
recomendamos preparar fracciones con volumen suficiente para las
pruebas a realizar en el período de dos semanas. Mantener la alícuota en
uso en la heladera, por no más que dos semanas.
• No usar sueros contaminados o que presenten material precipitado. En
caso de extrema necesidad, clarificar la muestra antes de usarla,
centrifugándola durante 10 minutos a 2000 g.
• Homogeneizar con vórtex los sueros antes de usarlos.
15
3.4. Cuidados y precauciones
Todas las soluciones y materiales descriptos en este manual se destinan a
pruebas de diagnóstico in vitro y deben ser manipulados en el laboratorio de acuerdo
a las normas de buenas prácticas de laboratorio (30). Sugerimos especial cuidado en
relación a los siguientes puntos:
• Manipular las muestras y sueros controles con las precauciones adecuadas
para material capaz de transmisión de agente infeccioso. Se recomienda el
uso de guantes.
• Manipular las tiras de nitrocelulosa siempre con pinza plástica, evitar
contacto con las manos.
• No usar soluciones que presenten señales de alteración, tales como
turbidez, precipitados, etc.
• Todo residuo de la prueba (soportes de incubación y líquidos resultantes de
las etapas de lavado) deberá ser inactivado antes de ser eliminado.
Autoclavar durante 45 minutos a 1210C a 1 atmósfera o tratar con
hipoclorito de sodio a una concentración final de 0,5% durante 1 hora.
3.5. Procedimiento EITB
Procedimientos preliminares
1.1.
Preparar el buffer de saturación y buffer de lavado necesarios para las pruebas
de acuerdo a lo indicado en la tabla 1, a seguir:
16
Tabla 1 - Volúmenes de soluciones en función del número de muestras
problema
N° de muestras problema
1 - 20
21 - 40
41 - 60
Buffer de saturación
40 ml
80 ml
120 ml
Buffer de lavado 1x
500 ml
1000 ml
1500 ml
14 ml
28 ml
42 ml
Substrato – cromógeno
Buffer de saturación
Buffer lavado 10x
4 ml
5% Leche descremada
2g
0,1% Lisado E.coli 537
40 µl
H2O csp
40 ml
Usar en el transcurso del día
Buffer de lavado 1x
Buffer lavado 10x
50 ml
H2O csp
500 ml
Usar en un período de dos semanas
Substrato – cromógeno
NBT
100 µl
BCIP
50 µl
Buffer substrato
14 ml
Preparar en el momento de uso
17
1.2.
Aproximadamente una hora antes de iniciar la reacción, retirar todos los
reactivos de la heladera, con excepción del conjugado, de modo que los
mismos se estabilicen a TA.
1.3.
Preparar mapa de la prueba (Mapa 1, diskette archivo ″EITB.xls″ o pág. 57),
reservando 4 tiras de cada gel para los controles (negativo, positivo, positivo
tenue y límite).
Obs. Los controles deben ser repetidos en cada gel y para cada prueba,
ya que los resultados deben ser siempre interpretados por comparación
de la reactividad del suero problema con la del control límite procesado
en el mismo gel. Asimismo la reactividad relativa de todos los controles
define la validez del ensayo. Así, en el caso de utilizar un mismo gel en
más de una prueba, recordar que se deben volver a procesar todos los
controles en cada nueva prueba.
1.4.
Colocar el número de tiras necesarias para la reacción en las canaletas de las
bandejas usando pinza plástica. Adicionar 0,8 ml de buffer de saturación por
canaleta, verificar que las tiras queden bien sumergidas y con la numeración
visible. Colocar las bandejas sobre el agitador y dejar incubando durante 30
minutos a TA. (Obs. Velocidad del agitador 6 ciclos/minuto)
Incubación de las muestras
2.1
Adicionar a los 0,8 ml de buffer de saturación de cada canaleta 4 µl de muestra
a analizar o suero control (dilución final 1:200) de acuerdo al orden establecido
en el mapa de reacción, (Mapa 1, pág. 57). Incubar con agitación durante 60
minutos a TA. (Obs. Velocidad del agitador 6 ciclos/minuto).
Obs. Para permitir que la reacción se inicie simultáneamente en todas las
canaletas, durante la adición de los sueros, posicionar el agitador de tal
forma que al apoyar las bandejas, éstas queden inclinadas en un ángulo
de aproximadamente 30°. Colocar las tiras en la parte superior de la
canaleta de modo que no tengan contacto con el buffer en la parte
inferior, donde se adicionarán las muestras problema o sueros controles.
18
Lavado de las tiras
3.1
Finalizada la etapa de incubación de las muestras, descartar el buffer de
saturación
volcándolo con cuidado de la bandeja para evitar contaminación.
Invirtiendo la bandeja, secarla muy bien sobre papel toalla/secante. Lavar las
canaletas y tiras con abundante buffer de lavado, usando una piceta. Secar las
bandejas con papel toalla/secante. Luego, adicionar aproximadamente 1 ml de
buffer de lavado por canaleta y dejar agitando durante 5 minutos a TA. (Obs.
Velocidad del agitador 6 ciclos/minuto). Cambiar el buffer de lavado dos veces
más dejando, cada vez, 5 minutos en agitación. Luego del último lavado secar
muy bien las bandejas golpeándolas invertidas sobre papel toalla/secante.
Incubación del conjugado
4.1.
Finalizada la etapa de lavado, diluir el conjugado en buffer de saturación de
acuerdo al título determinado en el laboratorio. Aplicarlo inmediatamente.
4.2.
Adicionar 600 µl de conjugado diluido por canaleta, posicionando las bandejas
como indicado en la observación del punto 2.1. Incubar con agitación durante
60 minutos a TA (Obs. Velocidad del agitador 6 ciclos/minuto).
Lavado de las tiras
5.1.
Proceder de acuerdo a lo indicado en el punto 3.1.
Incubación del substrato
6.1.
Finalizada la etapa de lavado, preparar el substrato – cromógeno (NBT/BCIP)
(Ver pág. 17). Utilizarlo inmediatamente.
6.2.
Adicionar 500 µl de la solución substrato – cromógeno a cada canaleta,
posicionando las bandejas como indicado en la observación del punto 2.1.
Incubar con agitación a TA hasta que la tira del suero control límite desarrolle
cinco bandas discernibles, aproximadamente luego de 15 minutos.
19
6.3. Finalizada la etapa de incubación del substrato – cromógeno, descartar el líquido
y lavar las tiras con abundante agua. Luego del último lavado secar muy bien las
bandejas invirtiéndolas y golpeándolas sobre papel toalla/secante.
6.4. Dejar secar las tiras (aproximadamente dos horas a TA) dentro de las bandejas
o bien con ayuda de una pinza depositarlas sobre papel de filtro. Una vez secas
depositarlas sobre vidrio, cubrirlas con cinta adhesiva para después fijarlas en el
mapa de resultados. (Mapa 2, diskette archivo ″EITB.xls″ o pág. 58). La lectura
de los resultados no precisa ser inmediata, sin embargo conviene registrar las
bandas observadas en el plazo de una semana, ya que con el transcurso del
tiempo la coloración se atenúa, desapareciendo en general al cabo de algunos
meses. Otra posibilidad para el registro de los resultados consiste en realizar el
barrido "scanning" de las tiras.
3.6. Interpretación de resultados EITB
1. Validación de la prueba
Para considerar una prueba válida y poder proceder al análisis de los
resultados, los controles deben satisfacer los siguientes criterios:
• el suero control negativo no debe presentar reacción para ninguno de los
cinco antígenos. Este control proviene de un "pool" de sueros de animales
de áreas libres sin vacunación para el VFA y corresponde al padrón
obtenido para sueros de bovinos sin historia de exposición previa al VFA.
• el suero control positivo debe presentar bandas intensas para los antígenos
3ABC, 3D, 3A y 3B, con una intensidad algo menor para 2C. Este control
(standard secundario) se obtiene de un "pool" de sueros de animales
comprobadamente infectados y su reactividad es equivalente a la del suero
de un bovino no vacunado persistentemente infectado a 70 días postinfección (dpi) experimental (standard primario).
• el suero control positivo tenue debe presentar reacción para cada uno de
los cinco antígenos, con intensidades inferiores a las del suero control
positivo y superiores a las del límite. Este control (standard secundario)
20
proviene de un "pool" de sueros y/o diluciones, y su reactividad equivale a
las mayores reactividades observadas por EITB en regiones de muy bajo
riesgo epidemiológico (tres años después del último brote). Es validado
contra un standard primario que corresponde al suero de un animal no
vacunado a 714 dpi experimental y del cual se recuperaba ocasionalmente
virus del líquido esofágico-faríngeo (LEF).
• el suero control límite (L) debe presentar bandas apenas apreciables para
cada uno de los cinco antígenos. Este control (standard secundario) es
derivado de un "pool" de sueros y/o diluciones y su reactividad equivale a
la reactividad de fondo observada individualmente para cada uno de los
cinco antígenos en animales no vacunados en regiones libres de fiebre
aftosa. Es validado contra un standard primario que corresponde al suero
de un animal a 714 dpi experimental y del cual no se recuperó virus del
LEF por lo menos desde los 328 dpi.
En caso que los controles satisfagan las condiciones antes detalladas, la
prueba podrá ser considerada válida y se procederá al análisis de los resultados. En
caso contrario la prueba deberá ser considerada no válida, debiendo ser repetida.
Eventuales problemas y posibles causas:
• ausencia total de reacción - en caso que no se deba al olvido del
conjugado, puede resultar de un conjugado o substrato degradado.
• controles con intensidad superior o inferior al padrón - controlar y calibrar
conjugado y leche, controlar pH de buffers, especialmente el buffer
substrato, controlar velocidad de agitación.
• bandas con reacción desigual de fondo - comúnmente un lavado más
enérgico elimina estos problemas.
2. Análisis de resultados
La reactividad de cada suero deberá ser analizada por comparación con la
reactividad del suero control límite ("cut-off") del mismo gel, procesado en la misma
21
prueba, evaluando la intensidad de cada una de las cinco bandas, en caso que estén
presentes.
La muestra deberá ser considerada no reactiva si se observa:
• ausencia total de reacción para los cinco antígenos;
• reactividad con intensidad menor a la banda correspondiente del control
límite para cada uno de los cinco antígenos, individualmente o en
conjunto;
• reactividad igual o mayor a la banda correspondiente del suero control
límite para un máximo de dos antígenos simultáneamente.
La muestra deberá ser considerada reactiva si se observa:
• bandas para 3ABC, 3D, 3B y 3A (+/- 2C) con intensidad igual o superior a
la banda correspondiente del suero control límite.
El resultado deberá ser considerado indeterminado:
• cuando el padrón de bandas obtenido no se ajusta a los parámetros
definidos para muestras reactivas o no reactivas.
3.7. Características de desempeño del EITB
• Evaluación de la especificidad
La especificidad analítica6 fue evaluada con un panel de 1345 sueros (3, 5)
obtenidos de áreas libres sin vacunación, en ocho países diferentes, en las cuales no
se había registrado enfermedad clínica por lo menos en los últimos 15 años. Ninguno
de los sueros investigados resultó reactivo, lo que indica un valor de 100% de
especificidad para el panel analizado.
6
Especificidad analítica: capacidad de un método de medir solamente lo que se propone
evaluar (ausencia de reacción cruzada para otros anticuerpos).
22
Sin embargo, es importante destacar que, sí, fueron observadas reacciones
individuales para todas las proteínas, lo que no generó resultados positivos ya que
ningún suero presentó reacción para 3ABC, 3D, 3B y 3A simultáneamente. La tabla 2
presenta la frecuencia de reactividad observada para cada proteína, así como el
porcentaje de reacción simultánea para más de una proteína.
Tabla 2. Frecuencia de reactividad de los antígenos (Ag) individualmente
(A) y de más de un Ag (B) para sueros de animales en áreas libres sin
vacunación
A
B
Frecuencia individual
Ag.
Frecuencia simultanea
%
N° de Ags.
%
3ABC
4,2
(0 – 12,5)*
-
-
3D
3,0
(0 – 25)
2
2,2
2C
2,2
(0 – 6,6)
3
0,5
3B
3,1
(0 – 9)
4*
0,6
3A
2,2
(0 – 3,4)
5
0
(*) Menor y mayor frecuencia observada
para las nueve regiones estudiadas.
(*) En ninguno de estos sueros el Ag ausente era 2C.
En ninguno de los sueros que presentaron reacción fueron detectados
anticuerpos contra proteínas capsidales del VFA, lo que indica que los anticuerpos
que reaccionaban con los antígenos en el EITB no habían sido generados por
exposición previa al VFA, sino que se trataba de "reacción cruzada"7. Como puede
observarse en la tabla 2, la frecuencia de reactividades individuales para cada
proteína puede ser alta, dependiendo de la región. Únicamente una prueba como el
EITB (que a pesar de trabajar con varios antígenos simultáneamente, permite
discriminar la respuesta individual a cada uno de ellos) evita que las "reacciones
7
Cuando alguno de los determinantes de un antígeno es común o semejante al de otros, una
porción de los anticuerpos dirigidos contra uno será capaz también de reaccionar con el otro.
A este fenómeno se da el nombre de reacción cruzada. (33, p. 7.3)
23
cruzadas" individuales sean decodificadas como resultados positivos. No fue posible
determinar el origen de estas reacciones ya que no se obtuvo ningún resultado
positivo para sueros de animales con infecciones causadas por otros virus (3).
• Evaluación de la sensibilidad
La sensibilidad diagnóstica8 fue evaluada con un panel de 110 sueros de
animales que participaron de focos a campo y presentaron síntomas clínicos de la
enfermedad. Los sueros fueron colectados a 20 días post-foco y para todos ellos se
obtuvieron resultados positivos por EITB, lo que indica un valor de 100% de
sensibilidad para el panel analizado (5). Cabe señalar que si bien el resultado
obtenido era altamente satisfactorio, interesaba saber si la prueba presentaría el
mismo desempeño para detección de bajos títulos de anticuerpos, como puede
ocurrir durante una infección persistente. Para estudiar tal situación fue analizado el
modelo que se describe a continuación.
Modelo de infección experimental
Para evaluar la cinética de anticuerpos contra las proteínas no capsidales del
VFA durante el curso de una infección persistente 15 bovinos no vacunados fueron
experimentalmente infectados. Durante dos años fueron tomadas muestras de LEF y
de sangre a intervalos de 15 ó 30 días. Los resultados obtenidos por EITB, IDGA y
OP (recuperación viral en cultivo celular de material extraído de LEF) para cuatro de
los bovinos son ejemplificados en la tabla 3.
8
Sensibilidad diagnóstica: incidencia de resultados verdaderamente positivos, obtenidos
cuando un ensayo es aplicado en individuos conocidamente infectados.
24
Tabla 3. Frecuencia de resultados positivos para recuperación de virus
(OP), prueba IDGA (VIAA) y EITB durante el transcurso de infecciones
persistentes (5)
Días post-infección
Bovino
Hasta 150
150-300
300-450
450-600
600-750
OP VIAA EITB
OP VIAA EITB
OP VIAA EITB
OP VIAA EITB
OP VIAA EITB
A
4/11* 10/11 11/11
3/10 10/10 10/10
1/5
0/5
5/5
0/5
0/5
5/5
0/5
0/5
5/5
B
10/11 10/11 11/11
4/10 10/10 10/10
2/5
0/5
5/5
1/5
0/5
5/5
1/6
0/6
6/6
C
8/11 10/11 11/11 2/10 9/10
10/10
1/5
0/5
5/5
1/5
0/5
5/5
2/5
0/5
5/5
D
7/11 10/11 11/11 4/10 8/10
10/10
2/5
0/5
5/5
1/5
0/5
5/5
0/5
0/5
5/5
* Número de positivos/ número total de muestras analizadas
Los resultados obtenidos por EITB para todos los modelos analizados
permitieron establecer:
• que la detección de anticuerpos comienza aproximadamente a los siete dpi.
Como todo ensayo que utiliza anticuerpos como indicadores de exposición
previa al agente infeccioso, el EITB tendrá como limitación metodológica9
el tiempo real de formación de tales anticuerpos.
• que los títulos más altos de anticuerpos se observan alrededor de los 90
dpi., posteriormente, comienzan a decaer en forma gradual.
• que los títulos de anticuerpos por EITB de animales que recuperaban
ocasionalmente virus del LEF eran mayores que los de aquellos de los que
no se recuperaba virus.
9
Limitación metodológica: limitaciones del proceso de medición. Refleja, por ejemplo, para
pruebas que usan anticuerpos como marcadores de infección, el intervalo temporal que existe
entre la infección y el desarrollo de anticuerpos.
25
• que
la
sensibilidad
diagnóstica
relativa10
del
EITB
supera
considerablemente a la del IDGA. Este último deja de detectar anticuerpos
a 300 dpi, mientras que el EITB continúa detectando a 750 dpi. Este
resultado fue también corroborado estableciendo la sensibilidad analítica11
con un mismo padrón.
Con base en estos resultados, la reactividad del suero control limite del EITB
fue igualada a la de un animal a 714 dpi, del cual en el segundo año ya no se
recuperaba virus del LEF. Se optó por trabajar con alta exigencia de sensibilidad de
modo de evitar resultados falsos negativos, que podrían ocurrir particularmente en
muestras de animales persistentemente infectados, que siendo OP positivos
presentan bajos títulos de anticuerpos (3, 8), si bien se desconoce el riesgo potencial
de transmisión de tales animales. A pesar de lo limitado del panel cabe indicar que,
en estas condiciones, para todos los sueros de los animales persistentemente
infectados, según indicado por recuperación viral de LEF (aproximadamente 200),
fueron obtenidos resultados positivos por EITB, lo que resultó para el panel analizado
en una sensibilidad de 100%.
Es importante destacar que la recíproca de la afirmación anterior no
necesariamente es verdadera: de un animal con resultado positivo por EITB no
siempre se recuperará virus del LEF. Como fue mencionado anteriormente, un
resultado positivo para EITB permite inferir exposición previa al agente infeccioso. En
cambio la posibilidad de inferir actividad viral aun presente, es apenas posible
cuando se analiza una población, pero no si se evalúa un animal aisladamente. El
recurso de estratificar los resultados de la población estudiada en edades y la
disponibilidad de la información epidemiológica de la región permiten evaluar si las
muestras reactivas reflejan infección subclínica capaz de ser transmitida a la
población
o
cicatrices
inmunológicas
(con
posibles
"boosters"
de
múltiples
vacunaciones). Si las muestras reactivas se restringen coherentemente a los
animales de las edades contemporáneas y/o próximas a los últimos eventos de
aftosa
y
si
el
grupo
de
animales
correspondiente
10
a
los
bovinos
nacidos
Sensibilidad diagnóstica relativa: evaluación de la sensibilidad por comparación con otras
pruebas serológicas con características de desempeño bien establecidas y que funcionan como
standard de comparación.
11
Sensibilidad analítica: es la menor concentración del analito detectada por el sistema.
26
aproximadamente hasta uno o dos años después de este evento no presenta ningún
resultado reactivo, queda claro que las reactividades encontradas en los animales
mayores de dos años reflejan o bien cicatrices inmunológicas o que, inclusive
habiendo infección persistente remanente en dichos bovinos, la misma no fue
transmitida a animales más jóvenes, y por lo tanto no hay actividad viral en dicha
población.
Para resultados negativos la distribución por edades no resulta necesaria ya
que, excepto para el caso de animales inmunosuprimidos, resultados negativos son
indicativos de ausencia de actividad viral en la población.
3.8. Evaluación de interferencia de vacunas
El enfoque diagnóstico propuesto utiliza proteínas no capsidales que viabilizan
el empleo de los tests en áreas con vacunación sistemática, siempre y cuando los
antígenos utilizados en la producción de las vacunas mantengan el grado de
purificación constatado en las evaluaciones realizadas para diferentes marcas
comercializadas en América del Sur y descriptas a seguir. Inicialmente se evaluó la
inducción de anticuerpos contra antígenos no capsidales en sueros de animales
inmunizados con vacunas de diferentes productores a 30 días post-vacunación (dpv)
y ocasionalmente a 30 días post-revacunación (dpr). A continuación, se estudiaron
sueros de animales vacunados en los cuales se inducía una respuesta inmune
aumentada (vacunas con concentraciones superiores a las normalmente usadas y/o
períodos de revacunación menores a los habituales), no registrándose resultados
reactivos bajo estas condiciones controladas (3, 7). Por último, y teniendo en cuenta
que los métodos de producción de las vacunas pueden variar entre los diferentes
laboratorios, lo que significa que ninguno de estos modelos sería capaz de reflejar
las complejas situaciones que pueden suceder a campo (generadas entre otros por
inmunizaciones sucesivas con vacunas de diferentes productores, rebaños expuestos
a múltiples vacunaciones que pueden inducir "boosters" cuyo efecto variará según
incida sobre un animal sano o sobre uno que guarda memoria inmunológica de
infecciones previas), se analizaron sueros provenientes de áreas con vacunación
27
sistemática y con más de cuatro años sin enfermedad clínica12. Los resultados fueron
desdoblados en dos grupos: animales mayores y menores de dos años. Cabe señalar
que dos años es el período mínimo de ausencia de infección clínica exigido por la OIE
para declarar un área como libre con vacunación. En este ejemplo fueron analizados
3113 sueros, los resultados obtenidos son presentados en la tabla 4.
Tabla 4. Evaluación de áreas sin registro de
enfermedad clínica por más de cuatro años, con vacunación
sistemática
Resultados EITB
Total de sueros
% Positivos
% Ind.*
% Negativos
0
1,1
98,9
0,9
2,4
96,7
< 2 años
2002
> 2 años
1111
* Ind. - indeterminados
Los resultados obtenidos para animales menores de dos años indican que las
vacunas aplicadas en esta población no generaron interferencias. Por otro lado, la
incidencia de resultados positivos apenas en animales mayores de dos años sugiere
que no hubo transmisión de VFA a la población nacida en los últimos dos años,
enfatizando la importancia de la estratificación por edades para el análisis de la
población. Cabe señalar que en caso que no se hubiese realizado el análisis de
resultados en función de las edades, no habría como evaluar el real riesgo y/o
significado de los resultados reactivos. Dichos resultados por incidir exclusivamente
sobre animales de más de dos años indican o bien interferencia de vacunas, o
cicatrices inmunológicas, o eventual infección persistente, no transmitida a la
población menor de dos años como lo indica la ausencia de cualquier resultado
reactivo en este grupo.
12
Amplios muestreos correspondientes a diferentes regiones de América del sur con estas
características epidemiológicas ya han sido analizados (más de 50.000 muestras).
28
En líneas generales los resultados obtenidos hasta el presente no muestran
una interferencia apreciable de vacuna que pudiera comprometer la interpretación de
los muestreos seroepidemiológicos. Sin embargo, teniendo en cuenta la diversidad
de métodos de concentración y purificación de los antígenos utilizados en las
vacunas producidas por los distintos laboratorios de América del Sur, y que los
métodos modernos pueden incluir procedimientos más elaborados de concentración
y purificación, es imprescindible controlar la ausencia de respuesta de anticuerpos
contra las diferentes proteínas no capsidales del VFA inducida por inmunización y
preferentemente revacunación con las vacunas a ser aplicadas en campo (7).
29
4. I-ELISA 3ABC
El I-ELISA 3ABC es un ensayo inmunoenzimático indirecto para detección in
vitro de anticuerpos bovinos contra la proteína no estructural 3ABC del VFA. Fue
desarrollado como prueba "screening" para un sistema que tiene el EITB como
ensayo confirmatorio.
4.1. Soluciones y reactivos
•
Soluciones stock
Las soluciones a seguir pueden ser preparadas con anticipación y, si son
conservadas en la forma sugerida, pueden ser usadas por un período de hasta seis
meses. Las marcas y códigos de los reactivos usados por PANAFTOSA están
especificadas en la Planilla 1 (pág. 54), constan apenas como referencia, no siendo
estrictamente necesario el uso de las marcas relacionadas. Recomendamos usar en
la preparación de las soluciones agua deionizada, destilada, y en lo posible
autoclavada. Asimismo, es conveniente esterilizar las soluciones stock (filtrar).
Se sugiere que siempre que sea posible estas soluciones se preparen en
cantidad suficiente para seis meses de trabajo, lo que permitirá controlarlas por
comparación a las soluciones anteriormente en uso en el momento de la
substitución, sin implicar un trabajo o costo excesivo. Se recomienda seguir el
mismo procedimiento para control de lotes de leche descremada y de suero equino,
entre los cuales podrían observarse variaciones en la capacidad de bloqueo. Una vez
abierta, utilizar la leche en los siguientes 30 días. Para un cálculo preciso de los
volúmenes de soluciones stock a preparar consultar la planilla 3 (pág. 56). Estos
cálculos pueden realizarse directamente utilizando la planilla 3 del
"ELISA.xls" en el diskette en anexo
30
archivo
PBS 20x concentrado
NaCl
160 g
KCl
4g
Na2HPO4.12H20
58 g
KH2PO4
4g
H2O csp
1000 ml
Ajustar el pH a 7,6 +/- 0,1. Conservar entre 4 – 8°C
Ácido cítrico 0,1 M
C6H8O7.H2O
21,01 g
H2O csp
1000 ml
Conservar entre 4 - 8°C
Fosfato de sodio 0,2 M
Na2HPO4.12H2O
71,63 g
H2O csp
1000 ml
Conservar entre 4 - 8°C
Diluyente de substrato
0,1 M Ácido cítrico
24,3 ml
0,2 M Na2HPO4.12H2O
25,7 ml
H2O2 30 Vol.
20 µl
H2O csp
100 ml
Ajustar pH a 5,0 +/- 0,2. Conservar entre 4 - 8°C
31
Solución bloqueadora H2SO4 0,5 M
H2SO4
27,8 ml
H2O csp
1000 ml
Cuidado – adicionar el ácido al H2O! Conservar a TA.
•
Otros reactivos:
• Placas sensibilizadas con 0,1 µg/pocillo de 3ABC (24), guardar selladas a
4°C por un período de hasta 6 meses.
• Sueros controles ("standards secundarios") - fraccionar en alícuotas de 100
µl y conservar a –20°C. Mantener la alícuota en uso a 4°C. Los mismos,
con excepción del control interno del laboratorio (CL), serán preparados en
cada laboratorio, y validados en PANAFTOSA mediante comparación con los
sueros controles "standard primarios". Para el control CL se sugiere el uso
de un suero reactivo de título medio (T/C - 3).
• Conjugado - anticuerpo anti-IgG bovino, producido en conejo, conjugado
con peroxidasa. Diluir 1:10 en PBS 1x, fraccionar en alícuotas de 100 µl y
conservar a -20° C Mantener la alícuota en uso a 4°C.
Titulación del conjugado - la dilución de uso para el conjugado
deberá ser determinada inicialmente por comparación frente al
conjugado de referencia de PANAFTOSA. Una vez implementada la
técnica deberá ser titulado por comparación al lote anterior y en
este contexto recomendamos mantener tanto una alícuota de
conjugado como un panel de sueros apropiados exclusivamente
para ser usados en este tipo de prueba. No se recomienda trabajar
con diluciones inferiores a 1/4000.
• Lisado E.coli 537.
32
4.2. Material de laboratorio y equipos necesarios
•
Material de laboratorio
• Pipeta multicanal ajustable para volúmenes entre 50 y 200 µl, con
inexactitud inferior a 5%.
• Micropipetas tipo Pipetman con volúmenes de 10 y 100 µl (P20 y P100),
con inexactitud inferior a 5%.
• Tips adecuados para las micropipetas.
• Papel para sellar placas (Thomas Scientific, Sealing Tape Mylar – número
de catálogo 6106-J23).
• Placas tipo ELISA para dilución previa de las muestras.
• Hipoclorito de sodio 5% para inactivación del material y soluciones a
descartar.
•
Equipos
• Vórtex
• Equipos
básicos
de
laboratorio
(pHmetro,
balanza,
equipos
para
purificación de H2O)
• Lavadora de placas - por ej. Nunc Immuno Wash 8 (Thomas Scientific,
número de catálogo 6106-Z25)
• Estufa 37°C +/- 1°C.
• Lectora de placas con filtros para lecturas a 450 y 620 nm, conectada a
computadora.
Se recomienda seguir las instrucciones del fabricante para operación,
calibración y mantenimiento de los mismos.
33
4.3. Muestras biológicas
Ver pág. 15.
4.4. Cuidados y precauciones
Todas las soluciones y materiales descriptos en este manual se
destinan a pruebas de diagnóstico in vitro y deben ser manipulados en el laboratorio
de acuerdo a las normas de buenas prácticas de laboratorio (30). Sugerimos especial
cuidado en relación a los siguientes puntos:
• Manipular las muestras y sueros controles con las precauciones adecuadas
para material capaz de transmisión de agente infeccioso. Se recomienda el
uso de guantes.
• Evitar contacto con la solución bloqueadora (H2SO4). En caso de contacto
con la piel, lavar abundantemente la región afectada con agua.
• Una vez iniciada la reacción, la misma no deberá ser interrumpida. No se
debe permitir que la placa se seque durante la ejecución del ensayo.
• No usar soluciones que presenten señales de alteración, tales como
turbidez, precipitados, etc.
• Todo residuo de la prueba (placas y líquidos resultantes de las etapas de
lavado) deberá ser inactivado antes de ser eliminado. Autoclavar durante
45 minutos a 121°C a 1 atmósfera o tratar con hipoclorito de sodio a
concentración final de 0,5% durante 1 hora.
4.5. Procedimiento I-ELISA 3ABC
Procedimientos preliminares
1.1. Preparar la solución de lavado y el diluyente de muestra / conjugado necesarios
para la prueba de acuerdo a lo indicado en la tabla 5 a seguir:
34
Tabla 5 - Volúmenes de soluciones en función del número de
muestras problema
N° de muestras (placas)
1 - 86 (1)
87 - 172 (2)
Dil. Muestra / Conjugado
40 ml
80 ml
500 ml
1000 ml
Substrato – cromógeno
11 ml
22 ml
Solución bloqueadora
11 ml
22 ml
Solución de lavado
Solución de lavado
PBS 20x
25 ml
0,05% Tween 20
250 µl
H2O csp
500 ml
Conservar por un máximo de dos semanas
Diluyente de muestra / conjugado
Solución de lavado
36 ml
5% Leche descremada
2g
10% Suero equino
4 ml
0,1% Lisado E.coli 537
40 µl
Preparar csp para la prueba. Usar en el transcurso del día !
Substrato – cromógeno
Disolver 1 pastilla de TMB en 1 ml de DMSO
Adicionar 10 ml de diluyente de substrato
35
1.2. Aproximadamente una hora antes de iniciar la reacción, retirar todos los
reactivos de la heladera (menos el conjugado), de modo que los mismos se
estabilicen a TA.
1.3. Preparar las soluciones necesarias para la prueba: diluyente de muestra /
conjugado y solución de lavado. Para cálculo de volúmenes ver Procedimientos
preliminares, tabla 5 (pág. 34).
1.4. Preparar mapa de la prueba (Ver mapa 3, pág. 59). Para automatizar el cálculo
de resultados se puede usar el archivo "Análisis de I-ELISA.xls" adjunto en
diskette, respetando las siguientes condiciones:
•
los controles deben ser procesados en
duplicado en
las siguientes
posiciones:
•
Suero control negativo CN
-
A1 A2
Suero control positivo CP1
-
B1 B2
Suero control positivo CP2
-
C1 C2
Suero control positivo CP3
-
D1 D2
Suero control laboratorio CL
-
E1 E2
la distribución secuencial de los sueros deberá ser realizada en la vertical:
completar primero la columna 1 antes de pasar a la 2 y así sucesivamente.
1.5. Pre-diluir las muestras 1/20 en placa virgen. Pipetar 190 µl de diluyente de
muestra / conjugado en toda la placa y a seguir adicionar 10 µl de suero por
pocillo, respetando las posiciones definidas en el mapa de reacción (Obs. usar un
tip limpio para cada muestra). Homogeneizar la dilución.
Incubación de las muestras
2.1. Transferir con pipeta multicanal 100 µl de las muestras diluidas para la placa
sensibilizada, respetando las posiciones.
Obs. La dilución puede ser realizada directamente en la placa sensibilizada,
en la cual se adicionan 5 µl de suero a 95 µl de diluyente de muestra /
36
conjugado. En caso que se use este procedimiento tener especial
cuidado
para que el tiempo de aplicación de las muestras y controles no exceda los
10 minutos. En este caso nunca procesar más de una placa por prueba. Con
dilución previa es posible procesar dos placas por prueba, y en lo posible se
recomienda no procesar más que dos pruebas en un mismo día.
2.2.
Sellar la placa e incubar a 37°C durante 30 minutos +/- 3.
2.3.
Faltando 10 minutos para acabar la etapa de incubación de las muestras
preparar el conjugado. Adicionar a 12 ml de diluyente de muestra / conjugado
el volumen de conjugado 1/10 necesario según la dilución determinada en el
laboratorio, homogeneizar.
Lavado
3.1. Lavar la placa seis veces, en tres ciclos duplos, evitando que transborde líquido
de un pocillo para otro. Al final del lavado eliminar cualquier excedente de
solución golpeando la placa invertida sobre papel toalla/secante.
Incubación del conjugado
4.1. Adicionar 100 µl de conjugado diluido por pocillo. Sellar la placa e incubar a
37°C durante 30 minutos +/- 3.
4.2. Faltando 10 minutos para acabar la etapa de incubación del conjugado preparar
el substrato - cromógeno, como especificado en Procedimientos preliminares
(pág. 34).
Lavado
5.1. Proceder como indicado en el punto 3.1.
Incubación del substrato - cromógeno
6.1. Adicionar 100 µl de substrato - cromógeno por pocillo e incubar a TA durante 15
minutos.
6.2. Al final de la etapa, bloquear la reacción adicionando 100 µl de H2SO4 0,5 M por
pocillo
37
Lectura de resultados
7.1. Leer la absorbancia en un plazo máximo de 30 minutos después de bloqueada la
reacción. Utilizar filtro doble,
450 y 620 nm, con substracción automática de
blanco.
4.6. Cálculo e interpretación de resultados I-ELISA 3ABC
• Validación de la prueba
Calcular las medias de todos los controles y la relación CP2/CP1. La prueba
sólo podrá ser considerada válida si los controles satisfacen las siguientes
condiciones:
• los resultados de absorbancia para el suero control negativo deben ser
inferiores a 0,1.
• los resultados de absorbancia para el suero control CP1 deben estar entre
0,15 - 0,4.
• la relación CP2/CP1 debe ser igual a 2,5 +/- 20%.
En caso que los controles satisfagan las condiciones antes detalladas, la
prueba podrá ser considerada válida y se procederá al análisis de los resultados. En
caso contrario la prueba será considerada no válida, debiendo ser repetida.
Eventuales problemas y posibles causas:
• Ausencia total de reacción - en caso que no se deba al olvido del
conjugado, puede resultar de conjugado o substrato degradado.
• Reacción homogénea en toda la placa - substrato degradado
• Sueros controles fuera del rango - en caso que el resultado se reproduzca,
controlar y calibrar conjugado, suero equino y leche.
• Resultados no reproducibles - controlar los lavados. Tanto puede deberse a
contaminación cruzada de pocillos (más fácil de suceder durante la etapa
38
de
lavado),
como
a
un
lavado
poco
eficiente
que
no
remueve
completamente el material que no reaccionó.
• Control de calidad
Se sugiere que se controle el desempeño de las pruebas, observando el
comportamiento de los sueros controles positivos, por comparación de resultados
intra como inter-ensayo, calculando los coeficiente de variación. Son valores
aceptables hasta 10% para resultados intra-ensayo y 20% para inter-ensayo.
El control de las pruebas puede ser simplificado a través del uso de gráficos
del tipo Levey-Jenning, que permite una rápida visualización de tendencias de
desvío, dispersión de resultados e impacto de substitución de reactivos (37).
• Análisis de resultados
Los resultados del I-ELISA 3ABC se expresan en relación a la media del suero
control CP1 como:
T/C = Absorbancia de muestra problema / Media de absorbancia CP1
Las muestras deberán ser consideradas:
• no reactivas para T/C < 0,8, indicando que el suero no contiene
anticuerpos contra 3ABC
• inconclusivas o sospechosas para T/C ≥ 0,8 y < 1
• reactivas para T/C
≥ 1, indicando que el suero contiene anticuerpos
contra 3ABC
El cálculo de resultados puede automatizarse o bien usando recursos de la
lectora de microplacas13, o derivando los resultados a la computadora. Ambos
procedimientos simplifican el análisis, pero el último tiene la ventaja adicional de
13
Ciertas lectoras permiten definir la posición de controles y son capaces de emitir el
resultado por comparación a los mismos, clasificando las muestras con absorbancia iguales o
superiores a la del control definido como reactivas y las menores como no reactivas.
39
permitir archivar electrónicamente los resultados y procesarlos con recursos de los
programas actuales.
• Procedimiento para análisis de resultados con archivo "Análisis I-Elisa.xls"
(diskette anexo)
Seguir estrictamente las instrucciones a continuación:
1. Tanto los sueros controles como las muestras deben ser sembradas como
indicado en el ítem 1.3. Procedimientos preliminares (pág. 34).
2. Una vez realizada la lectura de la placa derivar los resultados al computador y
transportarlos al Excel.
3. Abrir el archivo "Análisis de I-ELISA". En la planilla "Identificación sueros"
colocar el cursor en la posición C11 y digitar el primer número de la secuencia
de sueros. En caso que no falte ningún número en la secuencia, todos los otros
sueros quedarán identificados. En caso que falte algún suero de la serie,
localizar el número que falta y digitar sobre el mismo el número de suero en
que se retoma la secuencia. Los números de esta planilla serán derivados
automáticamente a la planilla "Mapa 4", apareciendo en la placa con título Identificación de los sueros -.
4. Copiar los resultados de absorbancia a la posición D6 de la planilla
"Absorbancia". Una vez copiados, los
resultados serán
inmediatamente
derivados a la planilla "Mapa 4", apareciendo en la placa con título - Valores de
absorbancia -.
5. Debajo de la placa - Valores de absorbancia - (Planilla "Mapa 4") aparecerán
automáticamente los valores de media de CP1 y CP2; la relación CP2/CP1 y el
resultado de la prueba (válida o no válida). En caso que la prueba no sea
válida, el cálculo de resultados en la placa de título - Resultados para las
muestras será bloqueado. En caso contrario saldrá el resultado para cada suero
en su respectiva posición.
40
4.7. Características de desempeño del I-ELISA 3ABC
El desempeño del I-ELISA 3ABC fue evaluado por comparación al EITB. Como
fue explicado anteriormente, el alcance del EITB es mayor por el hecho de trabajar
con cinco antígenos.
• Evaluación de la especificidad
La especificidad analítica de la prueba fue evaluada preliminarmente con un
panel de 250 sueros de animales de área libre sin vacunación, en los que no se había
detectado anticuerpos contra las proteínas capsidales del VFA. Dos sueros generaron
reactividad en el I-ELISA 3ABC, resultando un valor de especificidad de 99,2% para
el panel analizado (24).
• Evaluación de la sensibilidad (5)
Para una primera evaluación de sensibilidad fue usado un panel formado por
185 sueros. De estos, 105 eran de animales que participaron en brotes de aftosa,
con historia clínica conocida, y los otros 80 eran de animales experimentalmente
infectados con alguno de los tres serotipos del VFA presentes en Sudamérica. Para
todos los sueros se obtuvo resultado positivo, resultando un valor de sensibilidad de
100%, para el panel. También para el modelo experimental de persistencia citado en
la pág. 25 los resultados obtenidos fueron satisfactorios, demostrando que el I-ELISA
3ABC conseguía un desempeño de sensibilidad equivalente al del EITB.
• Uso combinado del sistema I-ELISA 3ABC y EITB - Valores de referencia obtenidos
para poblaciones en diferentes situaciones epidemiológicas
Los gráficos a seguir de distribución de frecuencia de los resultados del IELISA 3ABC fueron obtenidos respectivamente a partir de las siguientes poblaciones:
• Gráfico 1 Sueros de animales de áreas libres sin vacunación
• Gráfico 2 Sueros de animales experimentalmente infectados
• Gráfico 3 Sueros de animales que participaron de episodios de fiebre aftosa
41
• Gráfico 4 Sueros de animales menores de dos años de áreas con vacunación
sistemática y sin enfermedad clínica en los últimos cuatro años
• Gráfico 5 Sueros de animales mayores de dos años de áreas con vacunación
sistemática y sin enfermedad clínica en los últimos cuatro años
Como se puede observar en los gráficos 1, 2 y 3 el I-ELISA 3ABC separa
nítidamente poblaciones expuestas de aquellas no expuestas al agente infeccioso.
Los perfiles de distribución son claros. Para poblaciones sistemáticamente vacunadas
sin enfermedad clínica en los últimos cuatro años la distribución de resultados
negativos es relativamente más abierta que la de área libre sin vacunación (Gráficos
4 y 5), siendo que tal efecto es más acentuado en animales mayores de dos años
que en los menores. De todas formas el número de resultados sospechosos o
reactivos en el I-ELISA 3ABC no excedió 2,1% y 4,8% en animales menores y
mayores de dos años respectivamente.
El uso del EITB como prueba confirmatoria generó los siguientes resultados
para las poblaciones indicadas en los gráficos:
-
Áreas libres sin vacunación (833 sueros) (Gráfico 1): todos los resultados
negativos por I-ELISA 3ABC fueron confirmados como negativos por el
EITB. Los 10 sueros reactivos o sospechosos por I-ELISA 3ABC dieron
resultados negativos en el EITB. En algunos casos se observaba reactividad
individual para 3ABC en el EITB, lo que podría explicar el resultado
obtenido en el I-ELISA 3ABC.
-
Animales experimentalmente infectados (28 sueros) (Gráfico 2): todos los
sueros fueron confirmados como reactivos por EITB.
-
Episodios de aftosa (119 sueros) (Gráfico 3): los sueros con resultado
negativo fueron confirmados como tales en el EITB. También los sueros
reactivos fueron confirmados, con excepción de un suero que generó
resultado indeterminado y que posiblemente se trataba de un animal en
etapa de seroconversión.
-
Áreas con vacunación sistemática (4396 sueros) (Gráficos 4 y 5): el IELISA 3ABC generó 2,1% (80 sueros) y 4,8% (31 sueros) con resultados
42
positivos o inconclusivos para animales menores y mayores de dos años
respectivamente. Los 80 sueros con resultados sospechosos de animales
menores de dos años generaron 70 resultados negativos, 9 indeterminados
y uno reactivo por EITB. Para los 31 sueros con resultados inconclusivos de
animales mayores de dos años se obtuvieron 22 resultados negativos, 7
indeterminados y 2 positivos. No se observó ningún resultado positivo por
EITB en las muestras con resultado negativo por I-ELISA 3ABC.
43
Gráfico 1 Distribución de frecuencia de sueros de animales de
áreas libres sin vacunación
100
No reactivos
Reactivos
80
n = 149
40
n = 684
%
60
10
8
6
4
2
0,9
0,7
0,5
0,1
0
0,3
20
T/C
Gráfico 2 Distribución de frecuencia de sueros de animales
experimentalmente infectados
No reactivos
100
Reactivos
80
%
60
40
n = 28
10
8
6
4
2
0,9
0,7
0,5
0,3
0
0,1
20
T/C
Gráfico 3 Distribución de frecuencia de sueros de animales
que participaron de episodios
Reactivos
No reactivos
50
40
n = 78
30
%
n = 41
20
T/C
44
10
8
6
4
2
0,9
0,7
0,5
0,3
0
0,1
10
Gráfico 4 Distribución de frecuencia de sueros de animales
menores de 2 años de áreas con vacunación sistemática y
sin enfermedad clínica en los últimos 4 años
60
Reactivos
No reactivos
n = 999
40
%
n = 1075
n = 1680
10
8
6
4
2
0,9
0,7
0,5
0,3
0
0,1
20
T/C
Gráfico 5 Distribución de frecuencia de sueros de animales
mayores de 2 años de áreas con vacunación sistemática y sin
enfermedad clínica en los últimos 4 años
60
No reactivos
Reactivos
n = 285
40
%
n = 357
T/C
45
10
8
6
4
2
0,9
0,7
0,5
0,3
0
0,1
20
5. Consideraciones finales
Las pruebas descriptas en este manual han sido diseñadas para uso conjunto
y no como pruebas independientes, las características de cada una adquieren pleno
significado apenas en la perspectiva del sistema. Cabe señalar que:
•
Se propone el uso combinado de ambas pruebas: "screening" con I-ELISA 3ABC,
seguido de confirmación de resultados positivos y/o inconclusivos por EITB.
•
El I-ELISA 3ABC fue diseñado como prueba "screening", lo que significa que la
sensibilidad fue privilegiada sobre la especificidad. Interesaba que la primera
prueba a ser aplicada no dejase de detectar ningún animal expuesto al agente
infeccioso, aún cuando bajo estas condiciones de exigencia se pudiesen generar
un cierto número de resultados falsos positivos. Por otro lado, las características
del I-ELISA 3ABC permiten manipular con rapidez y facilidad un número
significativo de muestras, y por lo general posibilita elucidar hasta 90% de los
sueros analizados para áreas libres sin o con vacunación.
•
El EITB fue diseñado como ensayo confirmatorio, aunque también puede ser
usado como prueba única. Mantiene la alta sensibilidad del I-ELISA 3ABC
combinada a una alta especificidad. Cabe señalar una vez más que la
especificidad del EITB se debe al hecho de permitir discriminar de modo
individual la presencia de anticuerpos contra varios antígenos no capsidales del
VFA, ya que al contrario del I-ELISA 3ABC trabaja con cinco antígenos. El uso de
varios antígenos en un ELISA para "screening" no mejoraría la especificidad, ya
que al presentarlos en un mismo pocillo no permitiría discriminar la reacción para
cada uno de ellos, con lo que lo único que se conseguiría sería sumar las
reacciones cruzadas para cada uno. Por otro lado, en caso que fuesen
presentados en diferentes pocillos, se perdería la posibilidad de manipular un
número significativo de muestras en el "screening" y se requeriría mayor
volumen de muestra.
•
Por último y ya que el sistema tiene como finalidad corroborar la ausencia de
actividad viral en rebaños, insistimos que sea usado con enfoque poblacional y no
individual. Con base en los resultados semi-cuantitativos del I-ELISA 3ABC es
46
posible construir gráficos de distribución de frecuencia, que son útiles para definir
el perfil de la población y que permiten acompañar la evolución del estado
inmunológico de la misma por comparaciones sucesivas a lo largo del tiempo. En
tales estudios es conveniente tener en cuenta los antecedentes de la población y
distribuir los resultados de la población según edades, usando como valor de
corte para la edad él o los últimos eventos significativos para la enfermedad.
Acompañar la evolución de cada uno de estos perfiles a lo largo del tiempo
genera una eficiente herramienta de control seroepidemiológico.
En función de los resultados obtenidos hasta el presente recomendamos para
la aplicación del sistema I-ELISA 3ABC / EITB:
•
Evaluar la respuesta de anticuerpos contra las proteínas no capsidales del VFA
inducida por las vacunas, este control es esencial en áreas bajo campañas de
erradicación.
•
Colectar los sueros a usar en la evaluación epidemiológica inmediatamente antes
del siguiente ciclo de vacunación.
•
Adecuar la sensibilidad y especificidad del sistema a los objetivos de uso y a las
diversas situaciones epidemiológicas a analizar. Recordar que tanto el I-ELISA
3ABC como el EITB usan más de un suero control positivo y que dependiendo de
la finalidad eventualmente se puede substituir el suero "cut-off".
En lo que se refiere a otros hospedadores, particularmente búfalos, cabras,
ovinos y porcinos, tanto el I-ELISA 3ABC como el EITB ya fueron padronizados,
habiendo necesidad para su uso apenas de substitución del anticuerpo conjugado y
de los sueros controles.
Por último se resume el desempeño del sistema para análisis de sueros de
bovinos (tabla 6 a seguir).
47
Tabla 6 - Desempeño del sistema I-ELISA 3ABC / EITB
Especificidad
I-ELISA 3ABC
EITB
99,2%
100%
I-ELISA 3ABC %
EITB %
Área libre de FA sin vacunación
(833 animales)
Interferencia de vacunas
Área sin FA por más de 4 años
Pos.*
Inc.
Pos.
Ind.**
< 2 años (3754 animales)
1,22
0,90
0,03
0,23
> 2 años (642 animales)
3,27
1,55
0,31
1,09
*Pos. (positivos) sueros con resultados T/C ≥ 1; Inc. (inconclusivos) sueros con
resultados T/C ≥ a 0,8 y < 1.
** Ind. – resultado indeterminado.
Sensibilidad
Animales convalecientes de FA
I-ELISA 3ABC
EITB
100%
100%
100%
100%
I-ELISA 3ABC
EITB
100%
100%
100%
100%
Infectados naturalmente (105 animales a
20 días post-foco)
Experimentalmente infectados (80
animales a 20 dpi)
Animales persistentes* (OP+)
Experimentalmente infectados (25
animales a 180 dpi)
Naturalmente infectados (11 animales a
180 días post-foco)
* Cinética de anticuerpos en infección experimental ver Tabla 3 (pág. 25)
48
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27 Neitzert E., Beck E., Augé de Mello P., Gomes I. & Bergmann I.E. (1990) The use
of bioengineered proteins as antigens in diagnostic kits for detection of antibodies
to Foot-and-Mouth Disease Virus Infection Associated Antigen. VIII International
Congress of Virology, Berlin, Germany, August 26-31.
28 Neitzert E., Beck E., Augé de Mello P., Gomes I. & Bergmann I.E. (1991)
Expression of the aphtovirus RNA polymerase gene in Escherichia coli and its use
together with other bioengineered nonstructural antigens in detection of late
persistent infections. Virology, 184: 799-804.
29 O’Donnell V.K., Boyle D.B., Sproat K., Fondevila N.A., Forman A., Schudel A.A. &
Smitsaart E.N. (1996) Detection of antibodies against foot-and-mouth disease
using a liquid-phase blocking sandwich ELISA (LPBE) with a bioengineered 3D
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30 OECD Principles of Good Laboratory Practice. OECD Environmental health and
safety publications. Series on principles of good laboratory practice and
compliance monitoring. Paris, 1998.
31 Office International des Epizooties.(1996) World organisation for animal health.
Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. OIE, Paris.
32 Price C.P. & Newman D.J. (1991) Principles and practice of immunoassay.
Stockton Press, New York.
33 Roitt I., Brostoff J. & Male D. (1989) Immunology Gower Medical Publishing,
London - New York.
52
34 Shen F., Chen P.D., Walfield A.M., Ye J., House J., Brown F. & Wang C.Y. (1999)
Differentiation of convalescent animals from those vaccinated against foot-andmouth disease by a peptide ELISA. Vaccine 17: 3039 - 3049.
35 Silberstein E., Kaplan G., Taboga O., Duffy S. & Palma E. (1997) Foot-and-mouth
disease virus-infected but not vaccinated cattle develop antibodies against
recombinant 3AB1 nonstructural protein. Arch. Virol., 142: 795-805.
36 Sorensen K.J., Hansen C.M., Madsen E.S. & Madsen K.G. (1998) Blocking ELISAs
using the FMDV non-structural proteins 3D, 3AB, and 3ABC produced in the
baculovirus expression system. The Veterinary Quarterly, 20, Sup. 2: S17-S20.
37 Wright P.F., Nilsson E., Van Rooij E.M.A., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1993)
Standardization
and
validation
of
enzyme-linked
immunosorbent
assay
techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev. Sci.
Tech. Off. Int. Epiz., 12 (2): 435- 450.
53
7. Anexos
Planilla 1 – Relación de códigos y marcas de reactivos
EITB
Marca
Código
Fórmula
BCIP
Sigma
B 8503
C7H9N
Cloruro de magnesio
Sigma
M 8266
MgCl2
Cloruro de sodio
Sigma
S 5886
NaCl
Conjugado (Bovino)
Sigma
A 0705
*
Dimetilformamida
Sigma
D 4254
C3H7NO
Leche desc. en polvo
Nestlé-Molico
*
*
Lisado de E.coli 537
PANAFTOSA
*
*
NBT
Sigma
N 6876
C60H30Cl2N10O6
Trizma Base
Sigma
T 1503
C4H11NO3
Riedel de Haen
63158
*
Marca
Código
Fórmula
Ácido cítrico
Merck
21549
C6H8O7.H2O
Ácido sulfúrico
Merck
601
H2SO4
Agua oxigenada 30vol
Merck
7210
H2O2
Cloruro de potasio
Merck
4933
KCl
Cloruro de sodio
Merck
6404
NaCl
Conjugado (Bovino)
Sigma
A 8917
*
Dimetilsulfóxido
Merck
2951
C2H6OS
Fosfato de potasio
Merck
4873
KH2PO4
Fosfato de sodio Hidr.
Merck
579
Na2HPO4.12H2O
Leche desc. en polvo
Nestlé-Molico
*
*
Lisado de E.coli 537
PANAFTOSA
*
*
*
*
*
Sigma
T 5525
C16H20N2
Riedel de Haen
63158
*
Tween 20
I-ELISA 3ABC
Suero equino
TMB
Tween 20
54
Planilla 2 – Cálculo de volúmenes de soluciones stock y cantidad de
reactivos para EITB en función del número de muestras a analizar
Obs. Digitar el número de muestras problema en C6
N° de muestras problema
N° de geles necesarios
Soluciones stock
2000
100
B.Lavado
NBT
BCIP
10x
Volumen (ml)
6000
10
5
526 g
Dimetilformamida
7 ml
NBT **
0,5 g
Tween 20
1400
0,25 g
Cloruro de magnesio
Trizma Base
Total
trato
BCIP *
Cloruro de sodio
B.Subs-
0,25
g
0,67 g
0,67
g
8,18 g
534,2
g
12
ml
0,5
g
379,9
g
120
ml
5 ml
363 g
16,94 g
120 ml
* 5-Bromo 4-Chloro 3-Indolyl Phosphate
** Nitro Blue Tetrazolium
55
Planilla 3 – Cálculo de volúmenes de soluciones stock y cantidad de
reactivos para I-ELISA 3ABC en función del número de muestras a analizar
Obs. Digitar el número de muestras problema en D6
N° de muestras problema
N° de placas necesarias
Soluciones stock
Volumen (ml)
8600
100
PBS 20x
2700
Ácido cítrico
A.Cítrico
F. Sodio
D.Subs-
0,1 M
0,2 M
trato
250
260
1000
H2SO4
Total
0,5 M
1100
5,25 g
5,25 g
Ácido sulfúrico
30,58 ml
A.oxigenada 30Vol.
0,2 ml
30,58 ml
0,2 ml
Cloruro de potasio
10,8 g
10,8 g
Cloruro de sodio
432 g
432 g
Fosfato de potasio
10,8 g
10,8 g
Fosfato de sodio
156,6 g
18,62 g
175,22 g
x 12 H2O
Solución Ácido cítrico 0,1 M
243 ml
243
ml
Solución Fosfato de sodio 0,2 M
257 ml
257
ml
56
Mapa 1 – EITB
Buffer 10x:
Leche:
E.coli:
H2O:
Dilución del suero
Dil. del conjugado
Buffer substrato:
NBT:
BCIP:
Conj.
Gel:
Bandeja - 1
Canal Tira
1
2
3
4
5
6
7
8
Suero
Bandeja –2
Canal Tira
9
10
11
12
13
14
15
16
Suero
Bandeja - 3
Canal Tira
17
18
19
20
21
22
23
24
Gel:
Bandeja - 4
1
2
3
4
5
6
7
8
Bandeja –5
9
10
11
12
13
14
15
16
Bandeja - 6
17
18
19
20
21
22
23
24
Bandeja - 7
1
2
3
4
5
6
7
8
Bandeja –8
9
10
11
12
13
14
15
16
Bandeja - 9
17
18
19
20
21
22
23
24
Gel:
57
Suero
Mapa 2 – EITB
Propiedad
Fecha de colecta de muestra
Dos últimas vacunaciones
Vacuna
Fecha
Suero
Vacuna
Fecha
Tira
3A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Observaciones:
58
3B
2C
3D 3ABC EITB IDGA
Mapa 3 – ELISA
Fecha:
Sueros
A
B
C
D
E
F
G
H
A
B
C
D
E
F
G
H
No:
Placa:
1
CN
CP1
CP2
CP3
CL
2
CN
CP1
CP2
CP3
CL
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
CN
CP1
CP2
CP3
CL
2
CN
CP1
CP2
CP3
CL
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Sueros:
Dilución:
Buffer:
Tiempo de incubación:
Conjugado:
Dilución:
Buffer:
Tiempo de incubación:
Substrato:
Dilución:
Buffer:
Tiempo de incubación:
Observaciones:
59
Mapa 4 - Resultados I-ELISA 3ABC
Identificación de los sueros
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
CN
CP1
CP2
CP3
CL
33
34
35
CN
CP1
CP2
CP3
CL
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
Valores de absorbancia
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0,01
0,2
0,5
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,2
0,4
0,12
0,13
0,14
0,15
0,16
0,17
0,18
0,19
0,2
0,21
0,22
0,23
0,24
0,25
0,26
0,27
0,28
0,29
0,3
0,31
0,32
0,33
0,34
0,35
0,36
0,37
0,38
0,39
0,4
0,41
0,42
0,43
0,44
0,45
0,46
0,47
0,48
0,49
0,5
0,51
0,52
0,53
0,54
0,55
0,56
0,57
0,58
0,59
0,6
0,61
0,62
0,63
0,64
0,65
0,66
0,67
0,68
0,69
0,7
0,71
0,72
0,73
0,74
0,75
0,76
0,77
0,78
0,79
0,8
0,81
0,82
0,83
0,84
0,85
0,86
0,87
0,88
0,89
0,9
0,91
0,92
0,93
0,94
0,95
0,96
Media CP1
Media CP2
CP2/CP1
-
0,2
0,45
2,3
Prueba -
VÁLIDA
Resultados para las muestras
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
-----------
----------Inc.
Inc.
Inc.
Inc.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
--*
Inc.
Pos.
Posición de controles
Resultados no calculados, prueba inválida
Resultado negativo
Resultado inconclusivo
Resultado positivo
60
61
Centro Panamericano de Fiebre Aftosa (PANAFTOSA/OPS/OMS)
Caixa Postal 589, 20001-970 Rio de Janeiro, Brasil
[email protected]
Mayo 2000
62