Genómica y Proteómica

GENÓMICA
(Una guía de lectura introductoria al tema)
La genómica es el campo de la genética que intenta comprender el contenido, la
organización, la función y la evolución de la información genética contenidos en el genoma
completo. Su principal objetivo de estudio es la caracterización molecular de los genomas
completos.
La genómica integra las disciplinas tradicionales: citología, genética mendeliana,
cuantitativa, molecular, de poblaciones y nuevas disciplinas como la bioinformática.
Para identificar y cartografiar de manera sistemática todos los genes del genoma de un
organismo se procedió a:
Identificar mutaciones espontáneas o generar colecciones de mutantes usando agentes
químicos o físicos.
Generar mapas genéticos mediante análisis de ligamiento utilizando las cepas mutantes.
1
2
Figura 1. Organismos modelo utilizados
para identificar mutaciones y generar
5
mapas genéticos: 1. Maíz, 2. Drosophila,
3
3. E. coli, 4. Ratón y 5. Levadura.
4
Durante la década de 1980 los genetistas comenzaron a utilizar la tecnología del ADN
recombinante como una aproximación al análisis genético, cartografiando secuencias de ADN
clonadas en cromosomas específicos. La mayor parte de estas secuencias no eran genes, sino
marcadores como polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismo de
un único nucleótido (SNP) y otros. Una vez asignados a un cromosoma, estos marcadores se
utilizaban en árboles genealógicos para establecer un ligamiento entre los marcadores y
enfermedades genéticas. Este método denominado clonación posicional se utilizó para
cartografiar, aislar, clonar y secuenciar los genes de distintas enfermedades.
1
A mediados de 1980 ya se habían asignado más de 3.500 genes y marcadores a
cromosomas humanos. Actualmente se han secuenciado centenares de genomas de procariotas
y eucariotas, y hay más de mil proyectos en ejecución.
La Genómica incluye diversos campos
Genómica Estructural
Genómica Funcional
Genómica Comparativa
La Genómica Estructural incluye la construcción de los datos de la secuencia del genoma,
el descubrimiento de los genes y su localización y la construcción de mapas genéticos.
La Genómica Funcional estudia la función biológica de los genes, su regulación y sus
productos.
La Genómica Comparativa compara secuencias de genes y proteínas de diferentes
genomas para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas.
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La Proteómica es una extensión de la Genómica y su objetivo es el estudio de las proteínas
presentes en una célula, en un tejido, en un fluido en un momento dado bajo determinadas
condiciones. Define el conjunto completo de proteínas codificadas por un genoma. Incluye:

Identificación de todas las proteínas expresadas en una célula bajo determinadas
condiciones.

La naturaleza y el alcance de cualquier modificación pos-traduccional de las proteínas.

Las interacciones proteína-proteína.

La localización subcelular de las proteínas.
3
GENÓMICA ESTRUCTURAL
La Genómica estructural se ocupa de la secuenciación y la comprensión del contenido
del genoma. A menudo, uno de los primeros pasos en la caracterización de un genoma es
preparar mapas genéticos y físicos de sus cromosomas. Estos mapas proporcionan información
sobre las localizaciones relativas de genes, los marcadores moleculares y los segmentos
cromosómicos, que suelen ser esenciales para posicionar los segmentos cromosómicos y alinear
tramos del ADN secuenciado en una secuencia del genoma completo.
MAPAS GENÉTICOS
Los mapas genéticos (mapas de ligamiento) proporcionan una aproximación a grandes
rasgos de las localizaciones de los genes en relación con las de otros genes conocidos.
Estos mapas se basan en la función genética de recombinación. Para la construcción de
los mapas se cruzan individuos heterocigotos en dos o más loci genéticos y se determina la
frecuencia de recombinación mediante el examen de la progenie. Si la frecuencia de
recombinación entre dos loci es del 50%, entonces los loci están ubicados en cromosomas
diferentes o están muy separados en el mismo cromosoma. Si la frecuencia de recombinación es
menos del 50%, los loci están localizados muy próximos en el mismo cromosoma (pertenecen al
mismo grupo de ligamiento). Para los genes ligados, la frecuencia de recombinación es
proporcional a la distancia física entre los loci.
Las
distancias
genéticos
son
porcentaje
de
en
los
mapas
medidas
en
recombinación
(centimorgans, cM) o unidades
de mapa (um).
Figura 2. Los mapas
genéticos se basan
en la frecuencia de
recombinación.
Marcadores de ADN
Distancia en un
mapa genético
4
Durante muchos años, los genes podían detectarse sólo observando su influencia en un
rasgo (fenotipo) y la construcción de mapas genéticos estaba limitada por la disponibilidad de
rasgos de un locus individual que podrían examinarse por la evidencia de la recombinación. Al
final, esta limitación se superó con el desarrollo de técnicas moleculares, como el análisis de
polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción, la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y la secuenciación de ADN, mejorando los mapas genéticos.
Los mapas genéticos tienen varias limitaciones, la primera es la baja resolución o el detalle.
Segundo, no siempre se corresponden con precisión a las distancias físicas entre los genes. Los
mapas genéticos se basan en las frecuencias de entrecruzamiento o recombinación, que varían
de un cromosoma a otro, de modo que las distancias de un mapa genético son sólo
aproximaciones de distancias físicas reales a lo largo de un cromosoma. A pesar de estas
limitaciones, los mapas genéticos han sido fundamentales para el desarrollo de los mapas físicos y
la secuenciación de genomas completos.
MAPAS CITOGENÉTICOS
Los
mapas
citogenéticos
o
cromosómicos constituyen una etapa
intermedia entre los mapas genéticos y
los mapas físicos.
Figura 3. Comparación del mapa citogenético del
cromosoma 1 del búfalo (BBU1) a la izquierda y la
alineación
con
la secuencia
de
montaje del
cromosoma 1 y 27 del bovino (BTA1 BTA27) a la
derecha. Los marcadores comunes a ambos están
unidos
por una línea
o una línea
roja sólida
sólida de
color
(circulo). Las
negro
líneas rojas
indican los marcadores que se orientan de forma
secuencial pero invertida.
5
Con el avance de las técnicas de bandeo cromosómico, la citogenética cuenta con una
herramienta de mayor precisión en la individualización de los cromosomas, facilitando su
agrupamiento y clasificación morfológica.
El estudio citogenético en animales domésticos se ha desarrollado rápidamente en los
últimos años. Hoy en día es utilizado como elemento de diagnóstico que permiten detectar un
gran número de patologías. A su vez el bandeo cromosómico, ha permitido precisar la
localización de genes aportando información al mapa genético. Por otro lado permiten realizar
estudios evolutivos de especies relacionadas entre sí.
La construcción de los mapas citogenéticos o cromosómicos se realizan utilizando técnicas
que no incluyen la reproducción sexual (meiosis) y, por lo tanto, asignan una localización según las
regiones citogenéticas (además, estos mapas presentan la ventaja de no requerir del uso de
marcadores polimórficos). Esas técnicas son:

Hibridación in situ,

Híbridos de células somáticas

Híbridos de radiación.
Hibridación In Situ.
Cuando una secuencia de ADN, en este caso referida como una “sonda” de ADN (en
inglés, probe), es marcada con isótopos radioactivos o fluorescencia, podemos hibridarla con su
secuencia complementaria en el ADN genómico de un cromosoma específico y observar la
marca directamente sobre el extendido cromosómico con un microscopio óptico. Las células
deben estar fijas y los cromosomas esparcidos en un portaobjetos y expuestos a una solución de
pH elevado para romper el apareamiento de bases y permitir el acceso a las sondas. La
hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica muy sensible siempre que se cuente con
sondas lo suficientemente grandes (y homólogas) y que se suprima la fluorescencia de fondo. La
sensibilidad de esta variante de la técnica de hibridación in situ es que permite localizar una
secuencia con una precisión de hasta 30 Mb y de detectar anormalidades cariotípicas en
cromosomas metafásicos tanto como interfásicos. Los fluorocromos más empleados son:
fluoresceína (FITC), rodamina (XRITC) y Texas Red.
Figura 4. Cromosoma 4 que presenta una duplicación de
la banda q21 detectado con la técnica FISH
La hibridación in situ es la técnica de elección
para la localización rápida de los transgenes.
6
Por último, el pintado de cromosomas (del inglés chromosome painting) es una variante del
FISH que emplea una mezcla de sondas de ADN derivada de un cromosoma entero o de una
región cromosómica de interés. Se utiliza para obtener patrones de regiones homólogas entre
diferentes especies y es una forma muy directa de evaluar la cantidad de rearreglos que se
produjeron entre dos especies en el curso de la evolución.
Híbridos de Células Somáticas
Fibroblasto humano
Célula tumoral
del ratón
Para
esta
técnica
se
utilizan
células híbridas (viables) derivadas
de la fusión in vitro de células
Los fibroblastos
humanos y las células
tumorales de ratón se
mezclaron en presencia
de polietilenglicol
somáticas de especies diferentes
de
mamíferos.
Aunque
se
desconoce la razón, se observa
que los cromosomas que se van
Heterocarion
…y dan origen a
células híbridas
denominadas
heterocarion
perdiendo en las células híbridas
pertenecen exclusivamente a uno
de los conjuntos parentales. Por
Célula híbrida
con núcleos
fusionados
Figura 5. La hibridación
de células somáticas
puede utilizarse para
determinar cuál es el
cromosoma
que
contiene el gen de
interés.
ejemplo,
los
híbridos
humano/roedor tienden a perder
(a través de los sucesivos cultivos y
en
forma
preferencial)
los
cromosomas humanos y quedarse
con una mayoría de cromosomas
Líneas celulares
de roedor. Debido a esto, es
posible derivar un panel de células
híbridas que representen cada cromosoma humano en forma única, sobre un conjunto de
cromosomas de roedor. Por lo tanto, todos los genes de origen roedor son retenidos (y se expresan
normalmente), mientras que sólo los genes presentes en el único cromosoma humano que quedó
retenido en ese híbrido podrán ser localizados por medio del uso de sondas moleculares o el
análisis de expresión. De esta manera, detectando patrones de presencia o ausencia de
marcadores (o expresión de genes) y correlacionando con los cromosomas presentes en el
híbrido, se puede asignar un gen humano a un cromosoma en particular. Los híbridos de células
somáticas humano/ratón, con un complemento limitado de cromosomas humanos (intactos), han
sido muy usados para localizar genes humanos en los últimos 20 años, a pesar de ser muy
inestables.
7
Híbridos de Radiación (HR)
Otra técnica desarrollada para obtener mapas de alta resolución son los paneles de
híbridos de radiación (Radiation Hybrid –RH), enfoque descripto por Goss y Harris en 1975. Las dos
grandes ventajas de este sistema son que pueden mapearse marcadores o genes no polimórficos
(se evalúa sólo la presencia o ausencia de un marcador) y que se logra una resolución mayor que
con los mapas de ligamiento, constituyendo un puente entre éstos y los mapas físicos. Estos
paneles de células híbridas se construyen a partir de células donantes (de la especie a ser
mapeada) que han sido irradiadas letalmente (ya sea con rayos g o X) para causar la
fragmentación de sus cromosomas (por roturas de doble cadena). Las células así irradiadas son
fusionadas con líneas celulares receptoras deficientes para un marcador de selección, como ser
la timidina quinasa (TK–) o la hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT–). Usando condiciones de
selección con medios apropiados, sobrevivirán sólo aquellas células que contengan, por lo menos,
algún fragmento cromosómico proveniente de las células dadoras.
El concepto teórico es que aquellos loci que se encuentran muy próximos unos de otros
serán retenidos en el mismo fragmento cromosómico después de la radiación. Esta característica
es similar al principio de ligamiento genético que hemos visto en los mapas meióticos. Como en los
paneles de ADN obtenidos con cruzas de animales, la información de los paneles HR es
acumulativa y puede proveer datos para el ordenamiento (de alta resolución) de regiones no
polimórficas o no separables por los mapas de ligamiento.
Figura 6. Híbridos de radiación. Construcción de clones de híbridos de radiación (HR) a partir de células
donantes con un único cromosoma humano (híbrido mono-cromosómico) y células receptoras de hámster.
Cada clon (abajo) presenta una colección diferente (al azar) de fragmentos del cromosoma humano
original. Los 6 loci hipotéticos (A a F) se marcan como + (presencia) o - (ausencia), dando una idea del
ordenamiento en el cromosoma original
8
Cuando se evalúa un marcador (por Southern blot, FISH o PCR), el patrón de presencia (+)
o ausencia (–) a través del panel, define el emplazamiento del mismo: aquellos marcadores con el
mismo patrón de + y – estarán localizados en el mismo “bin” o posición. Estos estudios se conocen
como “patrones de retención de marcadores” y nos ayudan a determinar la ubicación de un gen
o marcador. En estos casos, la unidad para medir la distancia en el mapa es el Ray o el centiRay
(cR).
MAPAS FÍSICOS
Los mapas físicos están basados en el análisis directo del ADN y ponen los genes respecto
a distancias medidas en el número de pares de bases, kilobases o megabases. Un tipo común de
mapa físico es el que conecta piezas aisladas de ADN genómico que fue clonado en bacterias o
levaduras. Una de las ventajas es que, por lo general, los mapas físicos tienen resolución mayor y
son más exactos que los mapas genéticos.
Clones de ADN
alineados
Figura
mapas
7.
físicos
Los
a
menudo se utilizan
para ordenar los
fragmentos
de
ADN clonados.
Mapa genético
Cromosoma
Mapa físico
Secuencia de
ADN
Hay varias técnicas para crear mapas físicos, entre las que se incluyen el mapeo de
restricción, que determina las posiciones de sitios de restricción en el ADN; el mapeo del sitio de
secuencia específica (sequence-tagged site, STS), que localiza las posiciones de secuencias
cortas únicas de ADN en un cromosoma; la hibridación in situ fluorescente (fluorescent in situ
hybridization, FISH), por el cual pueden mapearse los marcadores visualmente en sus
localizaciones cromosómicas y la secuenciación de ADN.
9
VISUALIZACION DE LOS FRAGMENTOS DE ADN
Para la visualización de fragmentos de ADN se encuentran disponibles numerosas técnicas, entre
las que se pueden mencionar:
1. La electroforesis es una técnica bioquímica estándar para la separación de moléculas sobre la
base del tamaño y la carga eléctrica. Hay varios tipos. Se prepara un gel poroso de agarosa que
se funde en una solución buffer. Al enfriarse se solidifica. En uno de los extremos del gel se realizan
indentaciones (pocillos) para contener las soluciones con fragmentos de ADN y se somete a una
corriente eléctrica que pasa a través del gel. Dado que el grupo fosfato del ADN tiene carga
negativa, los fragmentos de ADN migran hacia el extremo positivo del gel. La distancia que
recorre cada fragmento depende de su tamaño. Luego se produce la tinción del gel con un
colorante específico como bromuro de etidio.
La electroforesis es muy utilizada en la tecnología de ADN recombinante.
2. Otra técnica es la Southern blot, sirve para transferir los fragmentos desnaturalizados
monocatenarios provenientes de un gel a un medio sólido delgado. Estos fragmentos son cortados
por una o más enzimas de restricción. Se puede identificar que clones de una biblioteca
contienen una determinada secuencia de ADN y para caracterizar el tamaño de los fragmentos.
También se puede utilizar para determinar si un clon contiene todo un gen o solo parte de el.
Los fragmentos se separan por electroforesis en gel, lo que produce una serie de bandas.
Se tiñe el ADN en el gel con bromuro de etidio y se fotografía o escanea para determinar el
número y peso molecular de los fragmentos. El ADN se debe desnaturalizar en fragmentos de
cadena sencilla con un tratamiento alcalino. Se cubre el gel con una membrana de nitrocelulosa.
Los fragmentos de ADN del gel se transfieren a la membrana colocando la membrana y el gel
sobre un pabilo (esponja) sumergida parcialmente en una solución tampón. Se colocan varias
capas de papel de celulosa secante. La acción capilar arrastra el tampón por el gel y de esta
manera se transfieren los fragmentos de ADN del gel al filtro de nitrocelulosa. Después de la
transferencia al gel se coloca en una solución de hibridación de una sonda marcada en forma
radiactiva o química. La sonda se unirá a todos los fragmentos de ADN en la membrana que
posee secuencias complementarias. Luego se lava la membrana para sacar la sonda no unida y
la sonda unida se detecta por autorradiografía u otro método para sondas marcadas.
10
Figura 8. Técnica de Southern blot
para
transferir
los
fragmentos
desnaturalizados monocatenarios
provenientes de un gel a un
medio sólido delgado.
3. El Nothern blot es la transferencia de ARN también de un gel a un soporte sólido mediante un
proceso denominado. La hibridación puede revelar el tamaño de una molécula de ARN
mensajero particular, su abundancia o los tejidos en los que se transcribe.
4. El Western blot es la transferencia de la proteína de un gel a una membrana. La sonda puede
ser un anticuerpo, utilizado para determinar el tamaño de una proteína y el patrón de expresión.
5. Hibridación in situ (explicada anteriormente)
6. Footprinting del ADN
Muchas secuencias del ADN actúan como sitios de fijación para proteínas por ej. las
secuencias consenso en promotores que son los sitios a menudo sitios de fijación para los factores
de transcripción. Esta técnica se utiliza para determinar las secuencias de ADN fijadas a estas
proteínas.
7. Mutagénesis
Una manera muy eficaz para estudiar los genes es provocar mutagénesis y estudiar los efectos
en el organismo.
11
8. Animales transgénicos
En ratones y otros mamíferos el ovocito es lo
suficientemente grande como para inyectar el ADN
de manera directa. En el estado de dos pronúcleos
antes de la fecundación. Antes de la fecundación se
puede inyectar el ADN en uno de ellos y así unas
copias de ADN son inyectadas y se integran al azar
mediante un proceso denominado recombinación
no homóloga. Los embriones se implantan luego en
una hembra seudopreñada, madre sustituta.
Figura 9. Animales transgénicos. Los animales alterados son
transgénicos y el ADN aportado extraño se denomina
transgen.
9. Ratones con desactivación génica ¨Knock-out¨
Es una variante que consiste en producir ratones en los
que se les desactiva un gen normal. Sus fenotipos ratones
con desactivación permiten determinar la función de un
gen. La manera habitual es insertar un gen neo que
confiere resistencia al antibiótico G418. La inserción
rompe el gen blanco y proporciona un marcador
conveniente para hallar copias del gen desactivado.
Después de transferir el gen desactivado a las células
embrionarias se seleccionan mediante el agregado del
antibiótico G418. Solo sobrevivirán las células con el gen
desactivado.
Figura 10. Knock-out. Dentro del ratón la copia normal del gen
puede intercambiarse con la desactivada a través de la
recombinación.
12
Reacción en Cadena de la Polimerasa para amplificar el ADN (PCR)
Permite amplificar los fragmentos de ADN miles a millones de veces en el transcurso de
unas pocas horas. Puede utilizarse con cantidades pequeñas de ADN original incluso una sola
molécula. La PCR ha revolucionado la biología molecular y es hoy una de las técnicas
moleculares más utilizadas.
La base de la PCR es la replicación catalizada por una ADN polimerasa, que tiene dos
requisitos esenciales: un molde de ADN monocatenario a partir del cual puede copiarse una
nueva cadena de ADN y un cebador al que pueden agregarse los nuevos nucleótidos. Debido a
que una molécula de ADN consta de 2 cadenas de nucleótidos cada una puede servir como
molde para producir una nueva molécula de ADN, la cantidad de ADN se duplica con cada
replicación. El punto de partida de la síntesis de ADN en el molde es determinado por la elección
de los cebadores. Los cebadores utilizados en la PCR son los fragmentos cortos de ADN, de
manera típica de 17 a 25 nucleótidos de longitud, que son complementarios a las secuencias
conocidas en el molde. Para cada cadena se utiliza un cebador diferente.
Para llevar a cabo la PCR se comienza con:

una solución que incluye el ADN blanco (ADN por ser amplificado),

la ADN polimerasa,

los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos

los cebadores que son complementarios a las secuencias cortas en cada cadena
de ADN blanco

los iones magnesio y otras sustancias que son necesarias para que se produzca la
reacción.
Una reacción en cadena de la polimerasa incluye 3 pasos:

Paso 1: una solución de ADN se calienta entre 90ºC y 100ºC para romper los puentes de
hidrógeno entre las dos cadenas de nucleótidos y producir así los moldes monocatenarios
necesarios. La mezcla de la reacción se mantiene a esta temperatura durante sólo uno o
dos minutos.

Paso 2: la solución de ADN se enfría con rapidez a una temperatura entre 30ºC y 65ºC y se
mantiene así durante un minuto o menos. Los cebadores se adhieren a sus secuencias
complementarias en las cadenas molde.

Paso 3: la solución se calienta entre 60ºC y 70ºC, temperatura a la cual la ADN polimerasa
puede sintetizar cadenas nuevas de ADN mediante el agregado de nucleótidos a los
cebadores. En el transcurso de unos pocos minutos se producen dos moléculas nuevas de
ADN bicatenario por cada molécula original de ADN.
Luego se repite cada ciclo completo. Con cada ciclo, la cantidad de ADN se duplica; de
modo que éste aumenta en forma geométrica. Una molécula de ADN aumenta a más de 10.000
13
moléculas en 10 ciclos de PCR, a más de un millón de moléculas en 20 ciclos y a más de mil
millones de moléculas en 30 ciclos. Cada ciclo se completa en el término de unos pocos minutos;
por tanto, en unas pocas horas se obtiene una amplificación grande de ADN.
Figura 11. Pasos de la PCR
Dos innovaciones importantes facilitaron el uso de la PCR:

El descubrimiento de la ADN polimerasa que es estable a las temperaturas elevadas
(polimerasa Taq).

El desarrollo de cicladores térmicos automatizados, es decir, máquinas que provocan los
cambios de temperaturas rápidos requeridos para los diferentes pasos de la PCR.
En la actualidad la PCR se utiliza con frecuencia en lugar de la clonación génica, pero
tiene varias limitaciones. El uso de PCR requiere el conocimiento previo de parte de la secuencia
del ADN para permitir la construcción de cebadores. Otra limitación es que el tamaño de los
fragmentos que pueden amplificarse por la polimerasa Taq estándar suele ser menor de 2000 pb.
A pesar de sus limitaciones la PCR se utiliza habitualmente en una amplia gama de aplicaciones
moleculares.
14
SECUENCIACION
SECUENCIACIÓN DEL ADN
En cierto sentido, un ADN clonado o no, no está
completamente
caracterizado
hasta
que
se
conoce
su
secuencia nucleotídica. La capacidad de secuenciar ADN ha permitido grandes avances en el
conocimiento de la organización del genoma y de los genes, incluyendo su estructura, función y
mecanismos de regulación.
Los primeros métodos para la secuenciación rápida de ADN se desarrollaron entre 1975 y
1977. Frederick Sanger y col. crearon el método de secuenciación dideoxi basado en la
elongación del ADN; Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un
segundo método basado en la degradación química del ADN. El
método de Sanger se convirtió con rapidez en el procedimiento
estándar para la secuenciación de cualquier fragmento purificado
de ADN.
Método químico de Maxam y Gilbert
Un fragmento de ADN se marca radioactivamente en sus extremos con gamma 32P ó
gamma 32S dATP por acción de la polinucleótido quinasa. La técnica consiste en romper estas
moléculas marcadas con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases.
Cuatro alícuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas, posteriormente el
tratamiento con piperidina rompe la molécula de ADN a nivel de la base modificada.
Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven en función de su tamaño en geles
de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radioactivas
obtenidas. Esta técnica permite la lectura de unas 100 bases de secuencia.
15
Figura
12.
Método
químico
de
Maxam y Gilbert.
Método enzimático de Sanger
En este método se utilizan pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radioactividad
que
en
el
método
de
Maxam-Gilbert,
y
su
característica
didesoxinucleótidos
particular
es
el
trifosfato
(ddNTPs)
uso
de
como
terminadores de la cadena de ADN. Los ddNTPs
Base nitrogenada
son desoxinucleótidos de los 4 nucleótidos
diferentes (dATP,dTTP, dCTP y dGTP) que carecen
de uno de los grupos hidroxilo, de manera que
cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a
una cadena de ADN en crecimiento, esta
cadena no puede continuar elongándose ya que la enzima ADN polimerasa necesita un extremo
3’ OH para añadir el siguiente nucleótido, y el ddNTP, marcado en forma radioactiva o química,
incorporado carece de este grupo hidroxilo. Al terminar la elongación de la cadena, se producen
varios fragmentos de ADN de longitud variable, los cuales son desnaturalizados por calor y
separados por tamaño (con una resolución de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel
16
de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reacciones de síntesis se corre en calles
individuales (A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante autorradiografía o luz
ultravioleta. Las bandas obtenidas en el gel corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes
longitudes
ADN
monocatenario que
debe ser
secuenciado
Figura
13.
didesoxi
de
El
de
ADN
se
método
Los cuatro
ddNTP
de
secuenciación
basa
en
Autorradiograma de
la electroforesis en
gel
la
terminación de la síntesis de
ADN.
Secuencia de la cadena
obtenida complementaria
Secuencia de la cadena
molde original
Una banda en una calle indica un fragmento de ADN que es el resultado de una
terminación de la cadena tras la incorporación de un didesoxinucleótido (ddATP, ddGTP, ddCTP o
ddTTP). El nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucleótido que se
añadió en la reacción que dio lugar a esa banda. Las posiciones relativas entre las cuatro calles
se utilizan entonces para leer la secuencia de ADN.
17
Secuenciación automática de Sanger
Durante muchos años, la secuenciación del ADN se realizó sobre todo en forma manual y
era una técnica laboriosa y costosa. En la actualidad, la secuenciación se lleva a cabo mediante
aparatos automatizados que utilizan colorantes fluorescente y escáneres de láser para los miles de
secuencias de pares de bases en unas pocas horas.
Figura 14. Esquema de la secuenciación por el método automático de electroforesis capilar con la secuencia
obtenida.
Los ddNTP utilizados en la reacción automatizada se marcan cada uno con un colorante
fluorescente distinto. Las cuatro reacciones pueden tener lugar en el mismo tubo de ensayo y
pueden colocarse en el mismo pocillo durante la electroforesis, dado que cada dNTP se marca en
forma distintiva. Los aparatos de secuenciación recién desarrollados llevan a cabo la electroforesis
en tubos capilares que contienen gel. Los fragmentos de diferentes tamaños producidos por la
reacción de secuenciación se separan dentro de un tubo y al migrar pasan por delante de un haz
de láser y un detector.
Cuando los fragmentos pasan por el láser, sus colorantes fluorescentes se activan y la
fluorescencia resultante se detecta por un escáner óptico. Cada colorante emite fluorescencia de
una longitud de onda característica que se lee en el escáner óptico. Para la interpretación, la
información ingresa en una computadora y los resultados se imprimen como un conjunto de picos
18
en un gráfico (Fig. 14). Los aparatos de secuenciación automatizados pueden contener 96 tubos
capilares o más, lo que permite leer secuencias de 50.000 a 60.000 pb en unas pocas horas.
Secuenciación automática en geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida
La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando
un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el
cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplará en el
secuenciador automático para proceder a la carga de la muestras.
El número de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado por el
número de pocillos que posee el peine (de dientes de tiburón) que utilicemos. Hay peines de
cuatro tamaños distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos.
La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura de unos
700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del ADN, de la correcta
cuantificación del mismo, de la utilización del “primer” adecuado, y de la polimerización correcta
del gel de acrilamida/bis principalmente.
Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb, podemos
disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la velocidad de barrido del laser, y
el resultado es igualmente optimo.
Figura 15. Esquema de los geles
desnaturalizantes.
Secuenciadores automáticos capilares
Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa al sistema
basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde el soporte ha sido sustituido por un polímero
que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la muestra a secuenciar; las
muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no
superiores a unos 450pb.
19
El equipo funciona de forma completamente automática inyectando las muestras (que se
preparan exactamente igual que durante la secuenciación en geles y se colocan en una placa
de 96 pocillos), en un capilar previamente cargado con un cierto polímero que funciona como lo
hace la matriz de acrilamida-bisacrilamida-urea de los geles de secuencia, permitiendo resolver
fragmentos de ADN de cadena sencilla que se diferencian en una única base.
A una altura determinada el laser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena
sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisión de fluorescencia en la secuencia
correspondiente. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra, el capilar se vacía
rellenándose nuevamente con polímero fresco. Se inyecta a continuación una segunda muestra,
se procede a desarrollar nuevamente la electroforesis y así sucesivamente.
Figura 16. Secuenciador ABI Prism 310
LAS PRINCIPALES VENTAJAS DE ESTOS NUEVOS EQUIPOS SON:

Automatización completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia
de un técnico que cargue las muestras en los diferentes capilares del equipo.

Rapidez en el análisis de cada muestra: dado el pequeño diámetro de los capilares, se
pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de acrilamida:bisacrilamida:urea, por lo
que pueden leerse del orden de 450 nucleótidos en el plazo de una hora mientras que esta
misma longitud de secuencia necesita unas 2-4 horas en un secuenciador en gel.

El tiempo necesario del proceso es, para la polimerización del mismo, unas dos horas y
para la preelectroforesis, una hora aproximadamente.
20
SECUENCIACIÓN DE TODOS LOS GENES DEL GENOMA
El genoma o secuencia completa de ADN de un organismo constituye la información
genética heredable de un organismo.
Secuenciar es determinar el orden en que se enlazan las bases de dicha secuencia. Ese
trozo de ADN puede corresponder a un gen, un genoma, o a una parte de ellos. Los avances de
las técnicas de secuenciación del ADN permiten hoy en día leer el ADN a gran velocidad lo que
ha llevado a abordar proyectos a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Además se
dispone ya de la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y
microorganismos.
Se usan dos métodos diferentes para secuenciar genomas:
A- Método clon a clon
B- Método Hierarchical Shotgun Sequencing (secuenciación de la perdigonada jerárquica) y
Shotgun Sequencing (secuenciación de la perdigonada).
A- Método clon a clon:
Se realiza la construcción de una biblioteca con fragmentos clonados que incluyen el ADN de
todo el genoma de un organismo, que luego se ensamblan en mapas genéticos y físicos.
Corte de ADN
con enzima de
restricción
Figura 17. Estrategia general para clonar un gen.
Un trozo de ADN es manipulado con enzimas de
restricción e introducido en un plásmido el cual a
su vez es introducido en una bacteria. Al cultivar la
bacteria se obtienen múltiples copias del ADN de
Introducción del
plásmido
recombinante a
la bacteria
interés.
El clonado se realiza con distintos tipos
de enzimas de restricción y vectores: Las
enzimas de restricción son proteínas aisladas
de bacterias cuya función es cortar ADN.
Cada enzima reconoce un sitio particular del
ADN, es decir que reconoce una secuencia
particular de nucleótidos. Esa secuencia
específica se denomina “sitio de restricción”.
Una vez que la enzima reconoce estos sitios,
se posiciona sobre la molécula de ADN y
corta dentro o en torno de esa secuencia.
21
Cortes con extremos romos
Cortes con extremos cohesivos
Figura 18. Las enzimas según el
corte se clasifican en: Enzimas que
generan
“extremos
romos”
y
Enzimas que generan “extremos
cohesivos”.
Los
vectores
son moléculas transportadoras
que
transfieren
y replican
fragmentos
de ADN que llevan insertados. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de
replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de
reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.
Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se
mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.
Los
vectores
que
transportan
un
fragmento
insertado
se
denominan
vectores
recombinantes.
Hay muchos vectores de clonación, que es una molécula de ADN replicante y estable a la
cual puede adherirse un fragmento de ADN extraño para la introducción en una célula. Difieren
en la especificidad de la célula huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en el
número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen.
Tipos de Vectores:

Vectores procariotas:
1. Plásmidos: (ADN episómico). Para secuencias cortas de 10.000 bases (10 Kb). Son circulares y
existen naturalmente en las bacterias. Contienen orígenes de replicación y pueden por eso
replicarse independientemente del cromosoma bacteriano.
Figura 19. pUC19 vector plásmido típico de clonación.
El método de inserción más sencillo es a
través de las enzimas de restricción.
Un segundo método para insertar ADN en un
plásmido es mediante una cola homopolimérica o
tailing
donde
se
crean
extremos
cohesivos
complementarios sobre las piezas del ADN con
22
extremos romos. Primero, se corta el plásmido y el ADN extraño con una enzima de restricción. Si la
enzima de restricción produce extremos cohesivos, estos se eliminan por una enzima que digiere el
ADN monocatenario. De manera alternativa el plásmido y el ADN extraño pueden cortarse por
una enzima de restricción que produce extremos romos. Una vez que el plásmido y el ADN extraño
tienen extremos romos, los extremos cohesivos monocatenarios son agregados por una enzima
transferasa terminal.
Un tercer método de inserción de fragmentos consiste en utilizar la enzima ligasa T4, capaz
de conectar dos piezas cualquiera de extremos romos de ADN y se denomina clonación
mediante el uso de conectores.
Una vez insertado el plásmido debe introducirse en las células bacterianas. Esta tarea suele
cumplirse mediante la transformación y que es la capacidad de las bacterias de captar el ADN
del ambiente externo. Muchas veces la transformación es un proceso natural, y otros deben
tratarse en forma química o física previamente. Los plásmidos dentro de la célula se replican y
multiplican.
2. Bacteriófagos: (gran capacidad para invadir bacterias, se utiliza para ADN complementario y
genómico). Ofrecen ciertas ventajas y el más común es el bacteriófago λ que infecta E. Coli. Una
de sus ventajas es la elevada eficiencia para transferir el ADN a las bacterias. Una segunda
ventaja es que cerca de la tercera parte del genoma λ no es esencial para la infección ni para la
reproducción. Estos genes no esenciales que comprenden alrededor de 15 Kb pueden ser
reemplazados por hasta 23 Kb de ADN extraño. El ADN extraño cortado con EcoRI tendrá
extremos cohesivos que son complementarios con los de los extremos de los genes λ esenciales, a
los cuales puede conectarse mediante la ligasa. El cromosoma λ posee extremos monocatenarios
cortos denominados sitios cos, necesarios para empaquetar en ADN λ dentro de la cabeza de un
fago. Los cromosomas del fago recombinante pueden entonces empaquetarse en la cubierta
proteica y agregarse a E. coli. Los fagos inyectan su ADN recombinante dentro de la célula,
donde se replicará. Sólo los fragmentos de ADN de tamaño adecuado y que contienen genes
esenciales se empaquetarán en las cubiertas del fago.
3. Cósmidos: Los cósmicos combinan las propiedades de los vectores plásmidos y los fagos. Los
fragmentos de ADN grandes de 44 Kb pueden clonarse en cósmicos.
Los cósmicos son plásmidos pequeños que contienen los sitios cos del fago λ; pueden
empaquetarse con las cubiertas virales y transferirse a las bacterias por infección viral. Dado que
se pierden todos los sitios virales menos los sitios cos, un cósmico puede tener más del doble del
ADN extraño que puede transportar el fago vector.
23
El ADN extraño es insertado en los cósmicos del mismo modo que se introduce en los plásmidos.
Figura 20. Vector cósmido.
4. Vectores de expresión: Muchas veces es interesante no solo replicar el gen si no también
producir la proteína que codifica. Uno de los primeros productos comerciales elaborados por
tecnología recombinante fue la proteína insulina. La expresión exitosa es un tema difícil sobre todo
las secuencias que regulan la trascripción y la traducción son diferentes en las bacterias y en los
eucariontes. Para solucionar este problema suele insertarse un gen extraño en un vector de
expresión que, además del origen de replicación, los marcadores seleccionables y los sitios de
restricción, contienen secuencias requeridas para los procesos mencionados.
Figura 21. Puede insertarse
un gen extraño en un vector
de
expresión;
ejemplo
un
en
vector
este
de
expresión E. coli.

Vectores eucariotas:
24
1. YACs: (cromosoma artificial de levadura). Es un material bastante inestable. Para secuencias
de hasta 1 Mb (1000 Kb o 1 millón de bases). Son moléculas de ADN con un origen de replicación
de levadura, que permite que se replique, un par de telómeros que garantizan estabilidad dentro
de la célula y un centrómero.
Figura 22. Vector YAC
2. BAC: Cromosoma artificial de bacterias. Se utilizan para clonar segmentos grandes desde 100
a 500 Kb (100.000 bases a 500.000 bases).
Figura 23. Vector BAC. Cromosoma artificial de
bacteria con distintos sitios de corte de enzimas
de restricción.
El ADN clonado en los BACs es por lo general más pequeño que los YACs. Sin embargo, los
BACs ofrecen ventajas importantes como por ejemplo, son más manipulables para ciertos tipos de
25
estudios en el laboratorio. Los BACs se usan a gran escala para construir mapas físicos de alta
resolución de los cromosomas, con el fin de establecer la secuencia completa del genoma.
PAPEL DE LA CLONACIÓN GÉNICA
La manipulación y el análisis de los genes con tecnología de ADN recombinante requiere
copias múltiples de las secuencias de ADN utilizadas. La clonación fue un requisito previo para
muchos métodos moleculares, En la actualidad los métodos de amplificación del ADN han
obviado la necesidad de la clonación, aunque sigue siendo muy utilizada para crear secuencias
de genes novedosos y para otras manipulaciones.
¿Como encontrar la secuencia de ADN para ser clonada?
Dado que en una célula puede haber millones de pares de bases de ADN es necesario
clonar para encontrar un gen. Este enfoque clonar primero y buscar después, se denomina
clonación de fragmentos escogidos al azar (Shotgun). Primero se clona un número grande de
fragmentos en conocimiento de que uno o más tienen el ADN de interés y entonces se busca el
Una
biblioteca
genómica
es
un
conjunto de clones, cada uno de los
cuales contiene un fragmento de un
genoma de un organismo dado.
Las
bibliotecas
genómicas
se
consiguen clonando los fragmentos
en vectores.
fragmento entre los clones. La colección de clones que
contiene todos los fragmentos de ADN provenientes de
una
fuente
se
denomina
genoteca
o
biblioteca
genómica.
Para crear una genoteca genómica se recolectan
las células y se rompen. Así se produce la liberación de
ADN. Este se puede aislar por diferentes métodos. Uno de
ellos utiliza fenol. Una vez extraído el ADN se corta el ADN
con enzimas de restricción y debido a que los sitios de corte son al azar las moléculas de ADN se
cortan en lugares diferentes y se producirán fragmentos superpuestos. Estos se unen a vectores
que pueden transferirse a las bacterias. Esta técnica produce un conjunto de células bacterianas
o bacteriófagos que contienen los fragmentos genómicos superpuestos. Una genoteca puede
contener un número importante de clones para garantizar que todas las secuencias de ADN estén
representadas.
B- Método Hierarchical Shotgun Sequencing (secuenciación de la perdigonada
jerárquica) y Shotgun Sequencing (secuenciación de la perdigonada)
El método de Hierarchical Shotgun Sequencing fue propuesto por James Watson y Francis
Collins, entre otros, contando con la mayor parte de la financiación pública.
Esta metodología resulta la más compleja, con un conocimiento más exhaustivo del
genoma. Básicamente consiste en secuenciar el genoma completo, cromosoma a cromosoma de
26
un extremo al otro. Se hacen 2 o 3 fragmentos del ADN (fragmentos cortos de 2 Kb, fragmentos de
15-20 Kb y también se pueden hacer fragmentos de 200-300 Kb).
Luego se construye una biblioteca genómica con cada preparación con la utilización de
vectores BAC. Se seleccionan y secuencian clones al azar de estas bibliotecas. Luego se utiliza un
programa para ensamblar y superponer largos tramos de secuencia a partir de los fragmentos
cortos, usando las secuencias de los clones más largos como marco de referencia.
1
2
Figura 24. Representación esquemática de la estrategia de secuenciación utilizado por 1. El Proyecto
Genoma Humano financiado con fondos públicos y 2. Por Celera genomics.
El método de Shotgun Sequencing desarrollado por Craig Venter bajo la financiación de
“Celera Genomics” y otras compañías biotecnológicas privadas, emplearían una segunda
técnica, más práctica. Consistiría en la secuenciación de ¨genes expresados¨ en las células
diferenciadas en las que se encuentran activos, partiendo de los ARNm resultantes de su
traducción.
El método Shotgun Sequencing es más rápido y menos costoso, pero es más propenso a los
errores debidos a un montaje incorrecto de la secuencia final.
Hasta el momento se han secuenciado 180 eucariotas (17 mamíferos, 3 especies
de aves, 2 anfibios, 4 especies de peces, 24 especies de insectos, plantas, etc.) y
17 están en proyecto borrador. También se han secuenciado 2149 bacterias.
(Información Marzo 2013)
Fuente http://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html.
27
Tabla 1. Ejemplos de genomas completos o de borradores de secuencias publicadas.
28
NUEVOS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN
SECUENCIACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO
La elevada demanda de secuenciación de bajo costo ha dado lugar a las distintas
tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Estos esfuerzos han sido financiados por
instituciones públicas y privadas así como desarrolladas y comercializadas dentro de la empresa
privada por las compañías de biotecnología. Se pretende que las tecnologías de secuenciación
de alto rendimiento disminuyan los costos de secuenciación de las bibliotecas de ADN más allá de
lo que se puede hacer con el método corriente del terminador marcado basado en la separación
del ADN por electroforesis capilar. Muchos de los nuevos métodos de alto rendimiento usan
métodos que paralelizan el proceso de secuenciación, produciendo miles o millones de
secuencias a la vez.
Figura 25. Evolución de las tecnologías de alto rendimiento. ABI-3730 de Applied Biosystems, posiblemente el
más utilizado en la secuenciación del genoma Humano, con una capacidad de 1 Mb por día (Un millón de
bases). El AB-SOLID actual, en menos de 10 años ha multiplicado por 1000 la capacidad de secuenciación.
29
Amplificación clonal in vitro
Ya que los métodos de detección molecular frecuentemente no son lo suficientemente
sensibles para la secuenciación de una sola molécula, la mayoría de los métodos utilizan un paso
con clonación in vitro para generar muchas copias de cada molécula individual. Uno de los
métodos es la PCR de emulsión, en la que se aíslan las moléculas individuales de ADN junto con
microesferas recubiertas con cebadores en burbujas acuosas dentro de una fase oleosa.
Posteriormente una PCR recubre cada microesfera con copias clonales de la biblioteca de
moléculas aisladas y seguidamente se inmovilizan para ser más tarde secuenciadas. La PCR de
emulsión (Fig. 26) se usa en los métodos publicados por Margulis y colaboradores (comercializado
por 454 Life Sciences, adquirido por Roche), Shendure y Porreca et al. (conocido como
"secuenciación polony ", término formado por polimerasa "pol" y colonia "colony"), y la
secuenciación SOLiD (desarrollada por Agencourt y adquirida por Applied Biosystems). Otro
método para la amplificación clonal in vitro es la "PCR de puente", en la que los fragmentos se
amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie sólida, desarrollados y usados por
Solexa (de la que ahora es propietaria la empresa Illumina) (Fig. 27). Estos métodos producen
ambos muchas localizaciones físicamente aisladas que contienen cada una muchas copias de un
solo fragmento. El método con una única molécula desarrollado por el laboratorio de Stephen
Quake (y más tarde comercializado por Helicos) se salta este paso de amplificación, fijando
directamente las moléculas de ADN a una superficie.
Figura 26. Emulsión de PCR. Una molécula de ADN por perla. La amplificación clonal de miles de copias se
produce en microrreactores en una emulsión.
30
Figura 27. Amplificación en fase sólida. Una molécula de ADN por Cluster.
Secuenciación paralelizada
Una vez que las secuencias clonales de ADN se localizan físicamente en posiciones
separadas de la superficie, se pueden utilizar varios métodos de secuenciación para determinar
las secuencias de ADN de todas las localizaciones en paralelo.
1
2
Figura 28.Terminación reversible. 1. Illumina/Solexa; 2. Helicos BioSciences.
31
La "secuenciación por síntesis", como en la popular secuenciación electroforética con
terminador marcado con colorante, usa el proceso de síntesis de ADN por ADN polimerasa para
identificar las bases presentes en la molécula complementaria de ADN. Los métodos de
terminador reversible (usados por Illumina y Helicos) utilizan versiones reversibles de terminadores
marcados con colorante, añadiendo un nucleótido cada vez, y detectando la fluorescencia
correspondiente a esa posición y removiendo posteriormente el grupo de bloqueo para permitir la
polimerización de otro nucleótido.
La
Pirosecuenciación
(utilizada
por
Roche/454) también usa la polimerización
del
ADN
para
añadir
nucleótidos,
añadiendo cada vez un tipo diferente y
después detectando y cuantificando el
número de nucleótidos añadidos a una
determinada localización a través de la luz
emitida por la liberación de los pirofosfatos
unidos a ellos.
Figura 29. Roche/454. Pirosecuenciación.
La "secuenciación por ligación" es otro método enzimático de secuenciación que emplea
una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo. Se usa en el
método polony y en la tecnología SOLiD que ofrece Applied Biosystems. Este método utiliza un
32
reservorio de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con
la posición secuenciada. Los oligonucleótidos se templan y ligan; el ligamiento preferente de las
ADN ligasas por su secuencia específica produce una señal correspondiente a la secuencia
complementaria en esa posición concreta. Shendure et al., usaron este método para secuenciar
el genoma de E. coli MG1655.
Figura 30. Life/APG. Secuenciación por Ligación.
33
Real Time (Secuenciación en Tiempo Real)
Es un nuevo método de tecnología que está llevando adenlante Pacific Biosciences. En
esta técnica, los nucleótidos no detienen el procesos de síntesis de ADN. La secuenciación en
tiempo real implica una imagen continua de la incorporación de los nucleótidos marcados
durante la síntesis de ADN.
En la plataforma de Pacific Biosciences moléculas individuales de ADN polimerasa están
unidos a la parte inferior de detectores individuales (ZMW detectors) obteniendo información
mientras los nucleótidos son fosforilados mientras el cebador va traduciendo.
Otros enfoques han propuesto mejorar la relación de mediciones señal-ruido en la
secuenciación en tiempo real con esquemas de detección más convencionales.
Por ejemplo, Life/Visiten ha diseñado ADN polimerasas que se adjunta con un colorante
fluorescente para producir una señal mejorada por la energía de resonancia de fluorescencia
Figura 31. Pacific BioSciences. Secuenciación en Tiempo Real.
Genoma de enriquecimiento
A pesar de las reducciones de costes sustanciales asociados con tecnologías NGS (Next
Generation Sequencing) en comparación con el método automatizado de Sanger, la
secuenciación del genoma completo es todavía un esfuerzo costoso. Una solución provisional a
este problema puede ser el uso de plataformas de NGS para apuntar a regiones de interés
específicas. Esta estrategia se puede utilizar para examinar todos los exones en el genoma, genes
específicos de las familias que constituyen dianas farmacológicas conocidas o las regiones que
están implicados en enfermedades o en efectos farmacogenéticos.
34
El concepto de focalización de regiones específicas del genoma está bien establecido,
con la PCR es el más ampliamente utilizado, aunque en una escala pequeña. PCR acoplado con
secuenciación de Sanger está adecuadamente emparejado para analizar unos cuantos
candidatos genes, pero el acoplamiento de la PCR con las plataformas NGS de alto rendimiento
no es práctico porque la preparación de la muestra requeriría el manejo de decenas de miles de
cebadores de forma individual o en grupos multiplex.
Un artículo de Frazer y sus colegas en colaboración con RainDance Technologies (2009)
informaron la amplificación simultánea de 3.976 productos que utilizan tecnologías de microgotas
PCR.
La producción de grandes cantidades a bajo costo hace que las plataformas de NGS
descritas anteriormente sean útiles para muchas aplicaciones. Estos incluyen el descubrimiento de
la variante por resecuenciación de regiones específicas de interés o genomas en su totalidad, el
asamblado de novo de bacterias y de genomas eucariotas menores, la catalogación de los
transcriptomas de células, tejidos y organismos (ARN-seq), los perfiles en todo el genoma de las
marcas epigenéticas y la estructura de la cromatina usando métodos basados en la seq (CHIPseq, metil-seq y ADNsa-seq) y la clasificacion de especies y el descubrimiento de genes pora
estudios de la metagenómica.
Por ejemplo, las plataformas Illumina/Solexa y LIfe/APG son variantes muy adecuadas para
el descubrimiento de resecuenciación de genomas humanos, porque se producen por ciclo
volúmenes gigantescos de bases de alta calidad.
Además, la plataforma, Helicos BioSciences es muy adecuado para aplicaciones que
exigen información cuantitativa de ARN o ARN seq.
El rápido ritmo de los avances tecnológicos en el campo podría cambiar esta información
en un futuro próximo.
Genomas individuales
Los estudios del genoma humano tienen por objeto un catálogo de SNV S (variante de un
simple nucleótido) y la SVS (variantes estructurales) y su asociación a diferencias fenotípica, con el
objetivo final de personalizar la genómica con fines médicos. En 2004, el Consorcio Internacional
de Secuenciación del Genoma Humano publicó la primera, y todavía única, referencia terminada
del genoma humano (actualmente Centro Nacional de Biotecnología de la Información: NCBI). Su
costo fue estimado en US $300 millones.
La genómica individual también está siendo aplicada al estudio de la enfermedad. Por
ejemplo, Mardis et al., reportaron la secuencia de dos genomas del cáncer de leucemia mieloide
agudo mediante la plataforma Illumina/Solexa, y ambos estudios, identificaron mutaciones
somáticas que pueden ser asociada con la enfermedad. Gibbs et al., describieron recientemente
35
la elucidación de las dos variantes alélicas en una familia con una forma recesiva de la
enfermedad de Charcot-Marie-Tooth utilizando la plataforma Life/APG.
Varios proyectos destinados a la secuenciación de más individuos, incluyendo el “Atlas del
genoma del cáncer” y “El proyecto de 1000 Genomas”, también están utilizando las plataformas
Illumina/Solexa y Life/454 para secuenciar genomas enteros.
En comparación con la secuenciación automatizada de Sanger, las plataformas de NGS
han aumentado dramáticamente el rendimiento y redujo sustancialmente los gastos, con varios
grupos presentando informes de costos de reactivos por debajo de $100.000. Sin embargo, existe
una gran variabilidad entre y dentro de plataformas NGS en términos de tamaño del molde y
construcción, largo de lectura, rendimiento y la base y la cobertura del genoma, y dicha
variabilidad hace que sea difícil evaluar la calidad (es decir, la precisión de la cobertura del
genoma y continuidad del genoma) de los genomas basado en consideraciones de costo.
En junio de 2009, Illumina anunció la secuenciación del genoma individual por el precio de
US$ 48.000. Complete Genomics ofrece un servicio similar a un precio de US$ 5.000. Sin embargo, el
logro del ahorro de los costos también puede venir con una disminución de la calidad de la
información.
Las tecnologías de NGS tienen una impresionante gama de aplicaciones, y actualmente se
están desarrollando aún más. Además de las aplicaciones descritas anteriormente, las tecnologías
de NGS están siendo utilizadas para caracterizar las relaciones evolutivas de genomas antiguos y
para dilucidar el papel de secuencias no codificantes en la salud y enfermedades. En un futuro no
muy lejano, es previsible que las tecnologías de NGS pudieran ser utilizadas para obtener datos de
alta calidad a partir de la secuencia un genoma aislado de una sola célula, lo que sería un
avance importante, sobre todo para la genómica del cáncer. Para que esto ocurra, serán
necesarios avances en las técnicas, para aislar eficazmente largas moléculas de ADN intactas, y
en los métodos, para la lectura precisa de la secuencia. El campo del desarrollo de NGS y las
aplicaciones es un área de rápido movimiento de la investigación, que hace de este un momento
emocionante para los estudios genómicos.
Análisis de las secuencias de ADN
Además de la clonación y amplificación las técnicas moleculares se utilizan para analizar
las moléculas de ADN mediante la secuenciación.
Secuenciación del ADN: una técnica poderosa que surge de la tecnología del ADN recombinante
es la capacidad de secuenciar con rapidez las moléculas de ADN. La secuenciación consiste en
determinar la secuencia de bases, permite leer la información brindando información acerca de
la estructura y función de los genes.
36
Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante
Además de proporcionar información valiosa sobre los genes la Tecnología del ADN
recombínate tiene numerosas aplicaciones como la elaboración de productos farmacéuticos
(insulina), y otras sustancias, bacterias especializadas (como producción de etanol a partir de
plantas), plantas y animales de granja diseñados por ingeniería genética y para corregir defectos
genéticos humanos. Algunos fármacos oligonucleótidos (secuencias cortas de ADN sintético o de
ARN pueden utilizarse para tratar enfermedades (terapia génica). Los oligonucleótidos antisentido
son complementarios a los ARN no deseados, como el ARN viral. Cuando se agrega a una célula,
estos ADN antisentido se unen al ARNm viral e inhiben su traducción. Varios fármacos han sido
probados para diferentes tratamientos para el cáncer.
También ha permitido el desarrollo de sondas para detectar mutaciones causantes de
enfermedades. Se
dispone de
la
comprobación
prenatal
para varios centenares de
enfermedades genéticas. Para muchas enfermedades genéticas las únicas pruebas diagnósticas
disponibles son las que identifican una mutación predisponerte en el ADN, pero muchas
enfermedades genéticas son provocadas por varias mutaciones diferentes y derivar en resultados
pueden ser falsos Salvo la completa secuenciación del gen que es costosa no hay manera de
identificar a todos los individuos predispuestos.
En la terapia génica debían primero localizarse los genes causantes de enfermedades y
desarrollarse vectores. Un método de terapia consiste extraer células del cuerpo agregar los virus
con los genes recombinantes e reintroducir las células en el cuerpo del paciente. En este caso los
vectores se introducen directamente.
Figura 32. Evolución de proyectos y publicaciones
37
Generalidades del análisis genómico
Los proyectos genoma generan grandes cantidades de información sobre la secuencia
del ADN. Estos datos son útiles sólo cuando son analizados. Para identificar y caracterizar las
regiones codificantes de los genes de las secuencias anónimas de ADN se necesitan diversos tipos
de análisis mediante la utilización de programas y bases de datos, como por ejemplo:

Asegurar que la secuencia está completa y es precisa.

Identificar los genes encontrando las pautas de lectura abiertas (ORF: Open Reading
Frames). Empiezan con una secuencia de iniciación: ATG y terminan con una secuencia
de terminación: TAA, TAG o TGA.

Encontrar los sitios promotores de inicio de transcripción y de traducción.

Encontrar los sitios de empalme, los intrones y los exones.

Traducir la secuencia de ADN en una secuencia proteica y compararla con otras proteínas
conocidas.
Figura 33. Sitios de empalme,
intrones y exones.
Para asegurar que la secuencia nucleotídica de un genoma está completa y no contiene
errores, el genoma se secuencia más de una vez. Este proceso se denomina compilación.
Una vez secuenciado, compilado y comprobado la exactitud de un genoma, se realiza
una búsqueda de todos los genes que codifican productos (proteínas y ARN) formados por una
pauta de lectura abierta, tripletes nucleotídicos que se pueden traducir en la secuencia
aminoacídica de una proteína. Este es el primer paso de la anotación, el proceso que identifica
los genes, sus secuencias reguladoras y su función o funciones. La anotación también identifica los
genes que no codifican proteínas y encuentra y caracteriza los elementos genéticos móviles y las
familias de secuencias repetitivas.
El objetivo final del análisis de la secuencia es obtener una descripción funcional completa
de todos los genes del genoma de un organismo.
38
GENÓMICA FUNCIONAL
La Genómica Funcional clasifica los genes de las secuencias dilucidadas por la Genómica
Estructural e identifica sus funciones.
Algunos genes pueden tener funciones previamente asignadas mediante los métodos
clásicos de mutagénesis y de cartografía de ligamiento; pero muchos genes no tienen aún una
función asignada.
La genómica funcional es el estudio simultáneo de todos los genes involucrados en un
estado fisiológico determinado o en un tejido en particular.
Permite comprender la organización y los mecanismos genéticos que en conjunto hacen a
la fisiología de un organismo.
La secuencia de nucleótidos de un gen puede utilizarse para predecir la secuencia de
aminoácidos de la proteína que codifica. Entonces, la proteína puede sintetizarse o aislarse y
estudiarse sus propiedades para determinar su función. Sin embargo, este enfoque bioquímico
para la comprensión de la función génica insume tiempo y es costoso. Un objetivo fundamental
de la genómica funcional fue desarrollar métodos informáticos que permitan identificar la función
génica a partir de la secuencia de ADN sola, evitando el proceso laborioso de aislar y caracterizar
las proteínas individuales.
Después de obtener una secuencia genómica, la siguiente tarea es asignar funciones a los
genes de la secuencia. Algunos genes pueden tener funciones previamente asignadas mediante
los métodos clásicos de mutagénesis y de cartografía de ligamiento; pero muchos genes no
tienen una función bien dirigida asignada.
Una aproximación para asignar funciones a estos genes es la utilización de búsqueda de
homología. Este análisis tiene diversos componentes: búsqueda en bases de datos como GenBank
para encontrar genes parecidos aislados en otros organismos, comparar la secuencia de un ORF
con la de un gen bien caracterizado de otro organismo, rastrear el ORF en busca de motivos
funcionales, regiones del ADN que codifican dominios proteicos como canales de iones, regiones
de unión a ADN o señales de secreción/exportación.
Aplicaciones de la genómica funcional

Caracterizar transcriptomas específico de tejidos.

Determinar patrones de expresión génica asociados a procesos celulares tales como
diferenciación, proliferación y muerte celular.

Estudiar las alteraciones en los perfiles de expresión asociados a procesos patológicos
(infecciones; carcinogénesis, etc.)

Efectuar inferencias funcionales de genes escasamente caracterizados.
39

Predecir redes “sociales” de genes estrechamente relacionadas con procesos biológicos
específicos.
Desde el advenimiento de la genómica moderna, se han desarrollado diversas tecnologías
de gran cantidad de datos que permiten a los investigadores analizar las interacciones genéticas
de miles de genes simultáneamente. Estas tecnologías incluyen de ADN y de expresión proteica,
métodos automatizados para el aislamiento y la disección de grandes complejos proteicos y
búsquedas de alcance genómico de sitios de interacción proteína-DNA. Dado que estas técnicas
se basan en la abundancia de datos proporcionados por la terminación de los proyectos de
secuenciación del genoma, a menudo se denominan técnicas de genómica funcional.
Métodos de análisis de la Genómica Funcional o Transcriptómica

Northern Blot

PCR cuantitativa

Hibridación substractiva

Differential display

Microarrays (Microarreglos de ADN)

SAGE

XX-seq: RNA-Seq, Chl-Seq, CVN-Seq.
Northern Blot
Es una técnica para
transferir fragmentos de ARN
desnaturalizados provenientes
de un gel a un medio sólido. El
ARN es separado en un gel de
agarosa,
y
posteriormente
transferido a una membrana
de
nylon.
Después
de
la
transferencia, se agrega una
sustancia
marcada
para
permitir la visualización de los
genes.
Figura 34. Técnica de Northern Blot.
40
PCR cuantitativa o PCR en tiempo real
Al igual que la PCR convencional, se utiliza un molde de ADN, cebadores específicos, dNTP
y una ADN polimerasa; a esto se le adiciona una sustancia marcada con fluoróforo.
Figura 35. PCR en Tiempo
Real. A diferencia de la
PCR
convencional,
los
ciclos se observan desde
el inicio.
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre
cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia
emitida por el fluoróforo excitado.
Tabla 2. Diferencias entre PCR convencional y PRC en tiempo real.
Sensibilidad
Especificidad
Resultados Cuantitativos
PCR en Tiempo Real
Alta
Alta
Si – Fluorescentes específicos
Método de detección
Fluorescencia
Rango de detección
Tiempo de reacción
Amplio rango
1 hs
Pasos Post-PCR
No
Contaminación
No
PCR
Baja
Baja
No
Electroforesis en gel de
agarosa
Pequeño rango
3-5 hs
Electroforesis en gel de
agarosa
Si
Hibridación Substractiva y Differential Display
Tanto la hibridación substractiva como el Differential Display son técnicas comparativas
que no requieren conocimiento previo de los genes involucrados pero es necesario el clonado y
secuenciación para la identificación de los genes expresados diferencialmente.
41
1
2
Figura 36. Expresión diferencial de genes.
1-Hibridación substractiva.
2. Differential Display. Se expresan y comparan
como porcentaje muestras de mRNA en el rumen (1)
y abomaso (4) a las 3 y 13 semanas de edad y
adultos (18 - a 20 meses de edad) en ganado
Holstein.
Microarrays, Microarreglos o microordenaciones de ADN (chips de ADN)
Se utilizan para examinar la expresión de miles de genes simultáneamente. Los
microarreglos de ADN son simplemente trozos de vidrio (chips) sobre los que se aplican nuestras de
ADN
siguiendo
un
patrón
ordenado,
es
decir,
una
ordenación.
A
menudo
estas
microordenaciones son producidas por máquinas automáticas que ponen gotas microscópicas
de muestras específicas de ADN en posiciones específicas del chip. Las muestras de ADN que se
pueden aplicar pueden ser cualquier tipo de ADN clonado, pero a menudo son oligonucleótidos
cortos sintetizados in vitro.
En un microarreglo de ADN se pueden aplicar más de 30.000 muestras diferentes, lo que
representa miles de genes distintos. Teóricamente, todos los genes del genoma de un organismo
pueden estar presentes en un microarreglo, lo que permite el análisis de la expresión genética de
todo el genoma.
Los microarreglos de ADN se pueden usar para comparar los patrones de expresión
genética en dos o más tejidos diferentes, en un mismo tejido en dos momentos diferentes del
desarrollo, o en células normales respecto de enfermas.
42
1. Se construye o compra un
microarray o chip, que contiene el
ADN de cadena simple que
representa
miles
de
genes
diferentes.
2. Se obtienen dos muestras de
células, luego de aplicar la droga a
una muestra y se recogen las
moléculas de ARNm.
3. Transcribe el ARNm en ADN
complementario más estable y añade
etiquetas fluorescentes verde a ADNc
derivado de las células no tratadas, y de
color rojo a los células tratadas.
4. Se aplica la etiqueta de ADNc al chip,
la unión ocurre cuando se encuentra con
una secuencia complementaria de
bases del chip.
5. Se pone el chip en un escáner y
con cálculos computacionales se
estiman las tasas de rojo a verde.
6. Se determina si algún gen respondió
fuertemente a la droga para promover o reflejar
los daños.
Figura 37. Microarrays.
Análisis en Serie de la Expresión Génica (SAGE)
Permite conocer y cuantificar la expresión de genes en la célula o tejido mediante la
medición de los ARNm que están presentes en un momento determinado. Esto permite crear
perfiles de expresión de cada célula o tejido en determinadas situaciones. De esta manera se
pueden comparar estos perfiles y determinar que genes están siendo apagados o activados y así
determinar cual puede ser la causa.
La base de esta técnica esta en el uso de “tags” de ADNc que son pequeños fragmentos
de ARNm que han sido transformadas a ADNc. Se parte de una muestra de ARNm y
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aprovechando la característica del ARNm de tener una cola de adeninas en el extremo 3´ (poli
A), se utiliza un soporte con colas de timinas para provocar la unión de los ARNm al soporte. Estas
timinas cumplen la función de primers para poder sintetizar ADNc a partir del ARNm por medio de
una transcriptasa inversa. Se corta el ADNc a una distancia determinada a partir del soporte de
timinas por medio de una enzima de restricción, dejando extremos adhesivos en el sitio de corte.
En el extremo adhesivo se une una molécula llamada “linker” que posee una enzima de
restricción tipo II que corta nuevamente el ADNc, esta vez dejando un extremo romo. Aquí se
obtiene por primera vez un “tag” de ADN (ARNm), unido a las secuencias que han permitido
hibridaciones. Dos tag para formar un “ditag”, es decir, dos tags junto a dos moléculas linkers.
Posteriormente se procede a amplificar por PCR para obtener mayor cantidad de ditags y
favorecer la secuenciación.
Los ditags se cortan con la primer enzima de restricción para eliminar los linkers y dejar a los
ditags puros y con un extremo adhesivo, permitiendo la unión de estos a una gran hebra de ADNc
(ditags) o concatenado de ADNc. Éste concatenado se pasa luego a un vector de clonamiento
para obtener múltiples copias. Por último se procede a secuenciar este concatenado de ditags,
identificando cuantos tags hay en total de cada ARNm, y se procede a identificar qué proteína
codifican, mediante el uso de una base de datos.
Figura 38. SAGE. Luego de la obtención de los ditaq se realiza clonado, secuenciación y análisis
bioinformático.
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Figura 39. Comparación de las secuencias de los Tag con bases de datos específicas como SAGE Genie
donde ya se encuentran mapeados los tags con sus respectivos genes y permite la identificación y
caracterización de los transcriptos
ARN-Seq
Figura 40. ARN-Seq. Secuenciación de última generación aplicada al análisis de transcriptomas.
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El ARN-Seq se refiere al uso de la secuenciación de última generación aplicada al análisis
de transcriptomas. Puede realizarse utilizando distintas plataformas: Ilumina, Roche, Solid.
Independientemente de la plataforma utilizada la información obtenida es la misma. Permite
obtener información, por ejemplo, como lo diferentes alelos de un gen se expresan, detectar
mutaciones post-trascriptacional o identificar las funciones de genes. ARN-Seq proporciona una
medición mucho mas precisa de los niveles de transcriptos y sus isoformas que otros métodos.
La secuenciación a gran escala llevada a cabo en los proyectos genoma constituye la
base de partida de la genómica funcional, que tiene como objetivo la caracterización del
proteoma, esto es el conjunto completo de genes que determinan proteínas en un genoma, y la
caracterización de los patrones de expresión génica. En la actualidad se dispone de numerosas
estrategias para identificar el conjunto de genes funcionalmente activos como los microarreglos
de ADN, SAGE y mas recientemente la secuenciación de alto rendimiento.
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GENÓMICA COMPARATIVA
La Genómica Comparativa, un nuevo campo de la biología que se desarrolla con rapidez,
compara directamente la información genética de un organismo con la de otro. Es un campo con
muchas aplicaciones tanto en ciencia básica como aplicada, incluyendo el descubrimiento de
genes, el desarrollo de organismos modelo para enfermedades humanas y animales, la
elucidación de la historia evolutiva entre los genes, genomas y especies, y la relación entre los
organismos y su ambiente.
La Genómica Comparativa usa una amplia gama de técnicas y recursos, incluyendo la
construcción y utilización de bases de datos que contengan secuencias nucleotídicas y
aminoacídicas, técnicas citogenéticas de cartografía génica como hibridación in situ fluorescente
(FISH), y métodos experimentales, como mutagénesis. La genómica comparativa utiliza estos
recursos para identificar las semejanzas y las diferencias genéticas entre organismos, para
determinar como estas diferencias contribuyen a las diferencias fenotípicas, de ciclo vital, y para
verificar la historia evolutiva de estas diferencias genéticas.
El análisis de un número cada vez mayor de secuencias genómicas confirma que todos los
seres vivos están relacionados y descienden de un ancestro en común. Todos los organismos
utilizan grupos génicos parecidos para realizar las funciones celulares básicas, como la replicación
del ADN, la transcripción y la traducción. A partir de los organismos modelo se pueden comparar
estas funciones básicas para estudiar enfermedades hereditarias y analizar la interacción entre los
genes.
Para estudiar las homologías entre genomas de especies diferentes se usa el pintado
cromosómico comparativo que utiliza sondas marcadas con fluorescencia de una especie e
hibridando sobre los cromosomas de otra especie.
Figura 41. Los genes ortólogos son aquellos
que descienden de un gen ancestral común
que tienen la misma función en diferentes
especies. Las proteínas que surgen a partir de
la
duplicación
de
un
único
gen
se
denominan parálogas.
Definir el
número mínimo de
genes para la vida es una tarea que
implica
métodos
experimentales.
comparativos
La
y
aproximación
comparativa se basa en la premisa que
es probable que los genes compartidos
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por organismos alejados sean esenciales para la vida. Comparando los conjuntos de genes
compartidos por organismos diferentes sería posible catalogar los compartidos y desarrollar una
lista de genes que se considerarían indispensables para la vida.
Los genes ortólogos son aquellos que descienden de un gen ancestral común que tienen la
misma función en diferentes especies. Así por ejemplo Mycoplasma genitalium comparte 240
genes ortólogos con Haemophilus influenzae además se identificaron 16 genes cuyas secuencias
son diferentes pero realizan la misma función. Mycoplasma genitalium tiene un genoma con 480
genes que codifican proteína, lo que representa el genoma bacteriano mas pequeño de entre los
casi 150 genomas secuenciados hasta la fecha.
Los genes que pertenecen a familias multigénicas comparten secuencias de ADN similares
pero no idénticas como resultado de una mutación en linaje con un único gen ancestral. Sus
productos a menudo son diferentes con funciones parecidas pero sus genes no siempre se
encuentran en una misma localización del cromosoma.
Las familias multigénicas permiten aportan conocimientos sobre la evolución del genoma.
Las proteínas que surgen a partir de la duplicación de un único gen se denominan parálogas. La
familia de la globina es un ejemplo de familia multigénica paráloga que surgió por duplicación y
dispersión a diferentes sitios cromosómicos.
Las familias multigénicas están presentes en muchos genomas. Además de las amplias y
grandes mutaciones de los genes pequeños bloques de genes pueden duplicarse mediante
diversos mecanismos. La filogenia molecular ha trazado el linaje y las relaciones entre los miembros
de las familias génicas. Uno de los ejemplos mejor estudiados de divergencia es la superfamilia
génica de las globinas. En esta familia hace 800 años se produjo la duplicación de un gen
ancestral que codificaba a una proteína de transporte de oxígeno. De los dos genes generados,
uno evolucionó hasta la mioglobina actual y el otro en el gen de la globina ancestral el que se
duplicó y formó los prototipos de las subfamilias génicas de la α y β globina. Otros patrones se
observan en otras familias génicas las que son intensamente estudiadas en el genoma humano.
Como se observa en la figura 42, en la región media del cromosoma 6 bovino (BTA6) se
han mapeado diferentes QTL asociados a rasgos fenotípicos como producción de leche,
conformación y rasgos funcionales en animales de tambo y composición corporal y crecimiento
en animales de cría. En BTA6, la proporción de los genes de la especie bovina que se han
asignado es relativamente pequeña y se distribuye de manera desigual. Estudios comparativos del
mapeo cromosómico de alta resolución combinados con la información de las secuencias
nucleotídicas pueden ser utilizado para detectar la posición y función, dentro de regiones del
cromosoma, de genes candidatos polimórficos que afectan variables fenotípicas de importancia
económica y fisiológica en bovinos. La alineación comparativa de las secuencias de los
cromosomas ortólogos humanos, de ratón, de gallina y de perro con la secuencia bovina permitió
enriquecer mapas previos del cromosoma BTA6 determinando loci nuevos. Utilizando el análisis de
RH, incluyeron un total de 63 nuevos genes y EST con precisión en relación con la posición de los
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loci conocidos, por lo tanto, aumentaron la densidad de los genes y ESTs integrados en el mapa
de BTA6.
Figura 42. Mapeo comparativo entre cromosomas de pollo, bovino, humano, ratón y perro.
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LA PROTEÓMICA
Esta rama se ocupa de Identificar y analizar las proteínas de una célula. El Proteoma define
el conjunto completo de proteínas codificadas por un genoma.
En la mayoría de los genomas secuenciados se desconoce la función de muchos de los
genes recién descubiertos. Muchas veces se le asigna una función por su homología con genes
conocidos. En E coli y S cerevisiae se desconoce la mayor parte de la función de los genes
codificados al igual que en humanos.
A medida que se dispone de más datos de las secuencias de los eucariotas se hace
evidente que su complejidad no esta necesariamente correlacionada con la cantidad de genes.
Por ejemplo Drosophila tiene menos genes que C. elegans pero no es menos complejo que el
nemátodo. La relación entre gen y producto génico es compleja. Los genes pueden tener sitios
múltiples de inicio de la transcripción que produce varios transcriptos distintos. El corte y empalme
alternativo y la edición de las moléculas generan docenas de proteínas diferentes a partir de un
único gen. En humanos se estima que el 40 – 60% producen más de una proteína por ese motivo.
El análisis de la función proteica se ve dificultado por el hecho de que muchas proteínas trabajan
vía interacciones proteína – proteína o como parte integrante de un gran complejo molecular.
La proteómica se utiliza para reconciliar las diferencias entre el número de genes de un
genoma y el número de proteínas (producto final) observadas en la célula. Proporciona
información sobre la función de las proteínas, su estructura, las modificaciones posttraduccionales, las interacciones proteínicas sus variantes y las relaciones con otras proteínas del
genoma.
La proteómica utiliza técnicas para separar e identificar las proteínas aisladas. La
combinación de técnicas implica un gel de electroforesis bidimensional (2DGE) y espectrometría
de masas. En la primera las proteínas extraídas de una célula se cargan en un gel de
poliacrilamida y se separa según su carga eléctrica. El gel se rota 90º y las proteínas se separan
según su peso molecular. Las modernas técnicas de espectrometría de masas permiten
determinar con precisión la masa de moléculas. Uno de estos métodos se denomina ionización
por láser asistida por matriz (MALDI). Se pueden identificar cientos de proteínas por día y los
bancos de espectrómetros pueden procesar cientos de muestras en un solo día. Nuevos
instrumentos se están desarrollando para el procesado de muestras con más rapidez, sensibilidad
y precisión.
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