¿COLORACION o TINCION DE GRAM?
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INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. ¿COLORACION o TINCION DE GRAM? Artículo escrito por: Lic. TM Yvan V. Salazar Criado Lic TM Julia M. Neciosup Zapata INTRODUCCION La rápida evolución tecnológica está transformando el Mundo en que vivimos, desde lo más simple como los artefactos usados para la comodidad del hogar, hasta lo más complejo usado en el área científica y más aun en lo que respecta a la SALUD. Es por eso que hemos querido tocar en este numero de la Revista el Tema de ¿COLORACION o TINCION DE GRAM?, el cual quizás, para muchos de nosotros, es un tema tan simple que tal vez restamos importancia en la mayoría de las ocasiones los fundamentos básicos, dejando de lado muchas pautas, indicaciones y hasta criterios, puesto que solo nos abocamos a realizar el procedimiento sin ver mas allá de la técnica usada en el quehacer diario del Laboratorio. Comenzaremos con algunos conceptos básicos que no solo nos ayudaran a recordar y afianzar lo aprendido sino que también nos harán renovar conocimientos que debido a las constantes investigaciones científicas podrían estar desactualizados. Daremos inicio con algo tan sencillo como es la definición de Tinción y Coloración, dos palabras que usamos habitualmente para una misma acción, aunque sus conceptos no sean los mismos y cuyas diferencias, generalmente pasamos por alto. ¿TINCION O COLORACION? Para solucionar de manera objetiva esta “grave” confusión de conceptos es importante, en primer lugar, ir definiendo términos básicos y fundamentales como “coloreado(a)” y “teñido(a)” los cuales deben de usarse desde un principio con propiedad, porque demarcan y limitan exactamente los posteriores conceptos a aclarar. El término Coloreado(a), más allá de que lo definimos solamente como un “efecto (consecuencia) de una coloración (colorear)”, es también, esencialmente “toda substancia que posee color propio”, mientras que el término Teñido(a), se define como el “efecto de una tinción (teñir)”, dicho de otro modo, “es cuando una substancia ha recibido un color distinto al suyo mediante otra substancia“. Para ser didácticos y comprender nuestra conceptualización decimos cotidianamente, “coloreamos un dibujo en un papel”, o decimos también, “teñimos nuestro cabello o una tela”, empero, en ambos casos cambiamos el color de estas cosas por acción de una “substancia que les dio el color o el nuevo color”, es decir, coloreamos. De allí a que se defina y conceptualice al término “coloración” como “la aplicación de un colorante”, pudiendo ser tal aplicación de dos maneras: pintando o tiñendo. No conceptualizaremos el termino coloración como tonalidad o intensidad de color porque ello es otro tema. En coloración, se considera a la primera aplicación (pintando), como una coloración externa en donde se deposita el color sobre la superficie del objeto recubriéndola, ocultando su calidad o su estructura, mientras que a la segunda aplicación (tiñendo o tinción), como una coloración interna, en donde se trata de incorporar el colorante a la masa del material a colorear, conservando en lo posible las cualidades del mismo, siendo de un efecto más fuerte y permanente con fundamentos químicos y físicos propios. Llegado a este punto podemos conceptualizar que los “colorantes” son, “substancias que son capaces de colorear (pintar) o teñir otras substancias”. Remarcamos y resaltamos la disyunción “o”, debido a que se considera, como ya se mencionó, a la “coloración” y “tinción” como conceptos completamente diferentes por definición, y para ser más drásticos aún, debemos de explicar y ser enfáticos en que el concepto “colorante”, es en sí, relativo (y de aquí parte el error del concepto), con la finalidad de que pueda ser generalizado y mejor entendido, permitiendo conceptualizarlo y definirlo finalmente como “toda aquella substancia coloreada que es capaz de teñir o colorear otras substancias”. Tomando en cuenta todo lo descrito, tenemos que aclarar los crasos errores de concepto y definición cometidos, mencionando que: 1) La coloración es el simple hecho de dar o aplicar color a un objeto, material o compuesto por medio de un colorante. 2) Un colorante en esencia es una substancia coloreada. 3) La solución, disolución o mezcla en la que se involucra un “colorante” que le da el color, es una substancia teñida a la cual se le sigue denominando colorante, este posteriormente es usado como colorante en una tinción. 4) Un colorante puede colorear o teñir, INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. 5) Toda tinción es una coloración y, no toda coloración es una tinción. 6) En Laboratorio de Análisis Clínicos, muchas tinciones son erróneamente llamadas coloraciones. COLORANTES DEFINICION DE COLORANTE: Los colorantes son compuestos orgánicos o inorgánicos que tiene la capacidad de colorear, dichos compuestos son más o menos complejos en cuanto a su estructura molecular y de acuerdo a eso se clasifican en diversos grupos: 1.- Colorantes según su origen: 1.1.- Naturales: Son extraídos de animales y sobre todo de plantas. Ejemplos: Hematoxilina, extraída por oxidación del tronco de una planta (HEMATEINA), el Carmín extraído de un animal (COCHINILLA). 1.2.- Artificiales: Son preparados artificiales obtenidos en su mayoría del Alquitrán de Hulla. Son colorantes de anilina, pueden ser ácidos, básicos y formar sales para ser neutros. Ejemplo: Cristal Violeta, Violeta de Genciana, Fucsina Básica, Azul de metileno etc. 2.- Colorantes según su comportamiento químico: Constituidos fundamentalmente por un anillo bencénico al que se unen distintos radicales de los cuales uno de ellos será coloreado y corresponderá al radical cromoforo. Así pues a mayor numero de radicales cromoforos mayor será el poder colorante de la solución. 2.1.- Ácidos o Aniónicos (-).- la carga del radical (cromoforo) es negativa. Corresponden fundamentalmente a colorantes citoplasmáticos, ya que los citoplasmas de las células se consideran básicos, captando muy bien los colorantes ácidos. Ejemplo: Las eosinas, las auraminas, etc. 2.2.- Básicos o Catiónicos (+).- la carga del ion cromoforo es positiva. Corresponden a colorantes que tiñen estructuras nucleares o similares, que son acidas, es decir, cargadas negativamente. Ejemplo: Fucsina Básica, Cristal Violeta o Violeta de Genciana, Azul de Metileno, etc. 2.3.- Neutros.- son sales compuestas de un colorante acido y un colorante básico por ejemplo el Eosinato Azul de Metileno que, en general posee propiedades de colorante ácido y básico. 2.4.- Colorantes Indiferentes.- son insolubles en agua y solubles en alcohol donde no predomina ni la carga positiva ni la carga negativa, pero, tampoco tienen un carácter neutro, son los colorantes de los lípidos. Ejemplo: Sudan III, Sudan Negro, etc. “EL PROCESO DE TINCION SUPONE UNA REACCION DE INTERCAMBIO DE IONES ENTRE EL COLORANTE Y LOS SITIOS ACTIVOS DE LA SUPERFICIE O DEL INTERIOR DE LA CELULA, DE TAL FORMA QUE, LOS IONES TEÑIDOS DEL COLORANTE REEMPLAZAN LOS IONES DE LOS COMPONENTES CELULARES” TIPOS TINCIONES BACTERIANAS: 1.- TINCION SIMPLE: Se basa en la afinidad de los colorantes a los distintos componentes celulares, ya que las células bacterianas en medios con pH neutros suelen presentar una débil carga negativa. Así pues, la bacteria cargada negativamente se combinara con los iones positivos de los colorantes básicos, como por ejemplo, el azul de metileno, de tal forma que la bacteria queda coloreada. Esto explica porque en las tinciones simples los colorantes usados suelen ser de tipo básico. Se caracteriza por: Necesita una fijación previa Se utiliza un solo colorante Permite la visualización de la morfología bacteriana. Las tinciones simples se pueden realizar con colorantes básicos, ácidos o neutros. 2.- TINCION NEGATIVA: Consiste en la aplicación de un colorante acido (cargado negativamente). Por ello los microorganismos, que también están cargados negativamente, no van a captar el colorante, quedando claros y brillantes sobre un fondo teñido oscuro, es decir, en realidad no tiñe las bacterias sino que tiñe su entorno, aumenta el contraste entre este y las células y facilita su observación. Este tipo es menos utilizado en bacteriología que otras técnicas de tinción, pero proporciona una visión más exacta de las células bacterianas INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. y se consigue una imagen más real de su forma y tamaño, además de permitirnos observar si presentan o no capsulas. Se caracteriza por: Es un tipo de tinción simple No necesita fijación previa Se utiliza un solo colorante (por eso es tinción simple) Nos permite visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria, además de, alguna otra característica estructural como la presencia de capsulas. 3.- TINCION DIFERENCIAL: Nos permite visualizar la morfología bacteriana y otras características, como pueden ser, la composición de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloración acida etc. Ejemplo: Tinción de Gram, Tinción de Zhiel- Neelsen. Se caracterizan por: Necesita de fijación previa, generalmente por calor Utiliza dos colorantes, siendo el último un colorante para contraste. TINCION DE GRAM: La coloración de Gram ha constituido desde los albores de la bacteriología un elemento fundamental para la taxonomía e identificación de las bacterias. Luego del descubrimiento casual realizado por el investigador Danés Christian Gram en 1884, pasaron muchos años durante los cuales se efectuaron las más variadas especulaciones sobre el mecanismo de esta coloración, sin embargo es indudable su practicidad para los fines de la identificación. Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana, la cual al sufrir daño por una u otra causa se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared celular para la retención o el escape del colorante. A continuación les mencionamos las teorías del posible del mecanismo de tinción: 1. Teoría: En las bacterias Gram positivas, el complejo Cristal Violeta-Iodo queda retenido en la pared después del tratamiento con etanol, el cual por deshidratación se supone que causa una disminución en el diámetro de los poros glucopéptido o péptidoglicano de la pared celular. Las bacterias gram negativas, tienen una cantidad mucho menor de péptidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias gram positivas, y además los lípidos de la pared (más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven con el etanol u acetona, permitiendo de esta manera el escape del complejo de Cristal VioletaIodo. Bacteria Gram Positiva Esquema de las envolturas celulares bacterianas Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano. El ácido Teicoico es el responsable del determinante antigénico del organismo. Bacteria Gram Negativa INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O polisacárido está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico, pero el lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte. Arriba: Bacteria Gram-positiva: 1) membrana citoplasmática, 2) peptidoglicano, 3) fosfolípidos, 4) proteínas, 5) acido Lipoteicoico Abajo: Bacteria Gram-negativa: 1) membrana citoplasmática (membrana interna), 2) espacio periplasmático, 3) membrana exterior, 4) fosfolípidos, 5) peptidoglicano, 6) lipoproteína, 7) proteínas, 8) lipopolisacáridos, 9) porinas (poro) 2.- Teoría.Stern y Stearn (1923), se basó en que existe una “combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias”. Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros (tienen facultad de reaccionar con ácidos y con bases) gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. Ellos comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; las bacterias se conducen como cuerpos anfóteros, combinándose con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. 3.- Teoría.Gianni (1952), explica que la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo, basó su teoría en que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción. 4.- Teoría.Libenson y Mcllroy sostienen que, amén de sus resultados experimentales obtenidos con una difusión celular excenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo Cristal Violeta-Iodo en alcohol y acetona, la reacción grampositiva consiste esencialmente en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de Colorante-Iodo difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos grampositivos, a diferencia de la de los gramnegativos, sería prácticamente impermeable al INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. Cristal Violeta. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con Cristal Violeta, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con Iodo. Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy concluyen que la permeabilidad de la pared celular al Cristal Violeta, la escasa solubilidad del complejo de Colorante-Iodo en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración. En nuestra humilde opinión, y de acuerdo a los resultados obtenidos según las últimas investigaciones realizadas en este campo, podemos decir, que el conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas tanto en el aspecto físico como en su composición molecular, ha logrado demostrar que la Coloración GRAM distingue dos grandes grupos de bacterias totalmente diferentes. Las bacterias GRAM positivas que poseen una gruesa capa de peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmática, y las GRAM negativas que encima de esta, presentan una fina capa de peptidoglicano a la que se superpone una capa de polisacáridos–lipoproteína, denominada membrana externa (Ver Esquema 1). La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisiones en sistemática bacteriana: Las que no la poseen, FIRMICUTES (Gram POSITIVOS) y, las que sí poseen, GRACILICUTES (Gram NEGATIVOS), la diferencia entre ambos grupos es de gran importancia taxonómica. Esquema 1 Teniendo claro el fundamento de esta tinción, debemos añadir que ésta emplea un primer colorante básico, generalmente Cristal Violeta o Violeta de Genciana, que teñirá de color azul todas las bacterias. El Cristal Violeta contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teñir por este método. Posteriormente el Lugol, aumentara la afinidad del primer colorante a las células, es decir, lo fijará, este compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana (el I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el Cristal Violeta). Finalmente un agente decolorante decolorara solamente un tipo de bacterias que serán teñidas con el colorante de contraste o segundo colorante. Este distinto comportamiento frente a la coloración es dependiente de la composición de la pared bacteriana lo cual ya hemos explicado anteriormente, hecho que servirá para clasificarlas como Gram + (aquellas que no han sido decoloradas y que por lo tanto quedan teñidas de color azul violáceo) o como Gram – (aquellas bacterias que han sido decoloradas y son teñidas con el colorante de contraste, la safranina; por lo tanto, su color es rosa – rojo). METODO DE TINCION DE GRAM: 1.- FIJACIÓN DE LA MUESTRA: Los frotis pueden ser fijados al calor o con metanol. A) Al calor: INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. – Dejar secar el frotis en una superficie plana – Una vez seco pasarlo dos o tres veces por la llama del mechero. No sobrecalentar. – Dejar enfriar la lámina antes de colorear. B) Metanol: – Dejar secar el frotis en una superficie plana. – Colocar unas cuantas gotas de metanol y dejar un minuto. Eliminar el restante y secar la lámina al aire. – No usar calor antes de colorear. La fijación por metanol previene la lisis de los glóbulos rojos brindando una visualización más clara del campo. También previene el arrastre de las muestras de orina. 2.- PREPARACIÓN DE COLORANTES Y PROCEDIMIENTOS DE TINCION: A) COLORACIÓN GRAM DE HUCKER • Cristal violeta: Solución stock - Cristal violeta Certificado (90–95% contenido del colorante)…… 40 g - Etanol 95% ………………………………………………………………………………...400 ml Disolver y mezclar. Almacenar en un frasco oscuro. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente. • Solución de oxalato de amonio (1%): sol. Stock - Oxalato de amonio (grado reactivo)………………………… 16 g - Agua destilada………………………………………………………….. 1600 mL Disolver y mezclar en un frasco oscuro. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente. Cristal violeta: Solución de trabajo - Solución stock de cristal violeta………………………………… 40 Ml - Solución de oxalato de amonio (1%)…………………………..160 mL Filtrar la solución stock de cristal violeta en una botella de vidrio. Una vez que ha filtrado completamente, filtrar a continuación la solución stock de oxalato de amonio. Mezclar de acuerdo a las cantidades indicadas. Rotular y Almacenar a Temperatura ambiente. Lugol de Gram - Cristal de yodo…………………………….. 1 gr - Yoduro de potasio………………………… 2 gr - Agua destilada……………………………… 300 mL Mezclar los cristales de yodo con el yoduro de potasio en un mortero. Agregar el agua destilada en pequeñas cantidades. Depositarlo en un frasco de vidrio oscuro. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente. Precaución: El yodo y yoduro de potasio son corrosivos. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Decolorante: alcohol – acetona (1:1) - Etanol 95% 500 mL - Acetona 500 mL Mezclar el Etanol con la Acetona. Depositarlo en un frasco de vidrio oscuro. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente. La decoloración también se puede realizar con Alcohol Etílico 95-96%. Algunos utilizan hasta Alcohol Etílico al 90%. INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. Colorante de contraste: Safranina Solución Patrón: - Safranina O (certificada)………………….. 2,5 gr - Etanol (95%)………………………………………. 100 mL Prepare la solución patrón de safranina, combinando la safranina O con el alcohol etílico al 95%. Solución de Trabajo: - Solución Patrón de Safranina…………… 10 ml - Agua destilada………………………………….. 90 ml Combine 10 ml de la solución patrón con 90 ml de Agua destilada. Almacenar la solución preparada en un frasco oscuro. PROCEDIMIENTO: - Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire. - Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el proceso de tinción, pasando rápidamente el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama del mechero o con metanol y dejar secar. - Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de cristal violeta. - Colorear un minuto y lavar con agua de caño. - Cubrir la lámina con lugol de Gram durante un minuto. Lavar nuevamente con agua. - Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas de alcohol acetona hasta no arrastrar más colorante violeta. Generalmente requiere de unos diez segundos o menos. - Lavar con agua de caño y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el soporte. - Cubrir la superficie con safranina durante un minuto. Lavar con agua de caño. - Dejar secar la lámina. - Examinar la lámina coloreada al microscopio con objetivo 100 x de inmersión (aceite). B) COLORACIÓN GRAM – MODIFICACIÓN DE KOPELOFF Cristal violeta alcalino Solución A - Cristal Violeta…………………… 10 g - Agua destilada…………………. 1000 mL Disolver el colorante en el agua destilada. Almacenar en un frasco color ámbar. Rotular y temperatura ambiente. Almacenar a INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. Solución B: Bicarbonato de sodio - Bicarbonato de sodio…………………….. 50 g - Agua destilada……………………………….. 1000 mL Disolver el bicarbonato en el agua. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente. Solución de Lugol - Hidróxido de sodio………………….. 4 g - Agua destilada………………………… 25 mL - Cristales de yodo…………………….. 20 g - Yoduro de potasio……………………. 1 g - Agua destilada…………………………. 925 Ml Disolver el hidróxido de sodio en 25 mL de agua destilada en un frasco oscuro. Agregar el yodo, yoduro de potasio y disolverlos bien. Gradualmente agregar 975 ml de agua destilada, mezclando bien después de cada adición. Precaución El yodo y yoduro de potasio son corrosivos. Evitar la inhalación, Ingestión o contacto con la piel. Decolorante - Etanol 95%............................. 700 mL - Acetona…………………………………………… 300 mL Combinar y mezclar en un frasco color ámbar. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente. Precaución: El etanol y la acetona son inflamables. Colorante de Contraste: Safranina - Safranina O, certificada……………………… 20 gr - Etanol 95% ………………………………………….. 100 mL - Agua destilada……………………………………. 1000 mL En un frasco de un litro agregar solo suficiente etanol para disolver la safranina (aproximadamente 50 mL). Agregar agua destilada a la solución de safranina. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente. PROCEDIMIENTO: – Cubrir el frotis con la solución A. Agregar aproximadamente 5 gotas de la solución B. – Colorear 2 – 3 minutos cuidando que no se seque. – Enjuagar completamente con la solución de lugol y descartar. – Agregar más solución de lugol para que cubra la lámina y dejarlo por 2 minutos. – Manteniendo la lámina en posición inclinada agregar el decolorante y enjuagar inmediatamente. – Colorear con safranina al menos 30 segundos. – Enjuagar con abundante agua de caño. – Dejar secar. Hemos considerado estas dos técnicas de Tinción para que las evalúen, y apliquen la que más se ajuste a las necesidades de su Laboratorio. Finalmente para complementar, nos pareció necesario y muy útil mencionarles los Factores que afectan toda tinción, los cuales provocan errores en los procedimientos, aquí les detallamos algunos: Pureza del Colorante A mayor grado de impurezas, mayor error y menor calidad en la tinción. INSTITUTO PERUANO DE LABORATORIO CLINICO Promueve: GRUPO SAPIENS MÉDICA. Concentración del colorante - A mayor o menor concentración del colorante elaborado, mayor error en la tinción. Los valores permitidos oscilan entre 0.2 y 2%. Los colorantes en la medida de lo posible deben ser certificados, es decir, cuando se selecciona un proveedor de productos químicos para la elaboración de compuestos, parte del proceso de toma de decisión no solo es el COSTO, sino también, el asegurarse que estos posean los respectivos certificados de análisis para la revisión de su pureza (presencia de impurezas), características físicas y químicas que nos den la seguridad de la obtención de un colorante de buena calidad. - Concluimos comentándoles que en el próximo número de la revista seguiremos detallando otros factores que afectan las tinciones y, ampliaremos nuestra discusión a la TINCION DE ZIELH NEELSEN.
