TEMA 4 RESPUESTA BIOQUÍMICA DE LOS VEGETALES A LA TOXICIDAD POR

TEMA 4
RESPUESTA BIOQUÍMICA DE LOS VEGETALES A LA TOXICIDAD POR
METALES PESADOS
Principios básicos de la respuesta de los vegetales a la toxicidad por metales
Aunque se conoce poco acerca del control de la toxicidad por iones metálicos
(MP) en plantas, existen tres principios básicos que se observan en las plantas
para evitar tal toxicidad:
1- Regulación de la captación del metal a nivel de la raíz, como así también
la distribución intracelular a larga distancia necesarias para controlar la
sobrecarga.
2- Fluctuaciones ambientales experimentadas por las plantas que pueden
conducir a un incremento en las concentraciones internas de los iones
metálicos. Varios compartimientos participan en este mecanismo, con la
colaboración de diversas moléculas que tienen afinidad por los MP y que
estarían involucradas en su almacenamiento y destoxificación.
3- La sobrecarga de iones puede conducir a concentraciones intracelulares
más allá de las capacidades de almacenamiento y destoxificación de las
células vegetales, esto lleva a un desequilibrio del balance celular que
se desplazará hacia el estado pro- oxidativo. La activación de los
mecanismos de destoxificación de oxígeno dependientes de metales,
cuando los iones metálicos están en exceso se produciría para proteger
la integridad vegetal cuando los mecanismos de transporte y
almacenamiento han sido superados.
Las acciones tóxicas de los MP son esencialmente ejercidas sobre las
enzimas. La inhibición de las enzimas puede deberse a la inactivación del
sitio catalítico o desnaturalización proteica. Cadmio (Cd) es un metal
pesado no esencial polutante del ambiente producto de la actividad
industrial, agrícola y de los gases de los automóviles. Es considerado
altamente polutante debido a su alta toxicidad y gran solubilidad en agua, lo
cual determina una amplia distribución en ecosistemas acuáticos. Los
síntomas de la toxicidad de Cd son fácilmente identificables. En plantas son
detención del crecimiento y clorosis. La clorosis por exceso de Cd parece
ser debido a una interacción directa o indirecta con el hierro foliar. También
se ha observado que la toxicidad de Cd induce deficiencia de fósforo o
reduce el transporte de magnesio. En general, se ha demostrado que Cd
interfiere con la captación, transporte y uso de varios elementos (Ca, Mg, P
y K) y de agua por parte de las plantas.
Efectos citogenéticos de Cd: inhibe la división celular y produce alteración
en los cromosomas. La inhibición de la proliferación celular demostrada por
el bajo índice mitótico, fue proporcional a la concentración y tiempo de
exposición. La inducción de picnosis en células de raíz confirmó la acción
citotóxica de Cd.
Captación de metales por las raíces: el apoplasto juega un importante papel
en el transporte y distribución de iones entre tejidos y células y en las
respuestas celulares a estrés ambiental. La selectividad de la captación de
cationes del suelo depende de sitios específicos localizados en la
membrana plasmática de cada célula. Se ha identificado un transportador
regulado por hierro (IRT1) que codifica un polipéptido de 339 aminoácidos,
con 8 dominios transmembrana, que representa una nueva clase de
transportador eucariótico de iones metálicos con secuencias homólogas en
arroz, levadura, nematodos y humanos. Similares sistemas carrier
transportan un amplio rango de cationes divalentes (cobre, níquel, zinc, y
cadmio) hacia las células de raíces. La captación de Cd aumenta cuando
disminuye el pH del suelo y disminuye cuando aumenta la capacidad de
intercambio catiónico del suelo. Cd parece ser absorbido pasivamente y
translocado libremente. Los quelantes en solución nutritiva pueden
favorecer la captación de Cd. Se han observado fuertes interacciones entre
zinc y Cd durante la captación y translocación de Cd. Aparentemente, parte
de la toxicidad de Cd sería resultado de la interferencia del mismo en
procesos dependientes de zinc. Las diferencias en la habilidad de las
plantas para acumular MP se han relacionado a diferencias en la morfología
de la raíz. Esto sugiere que una planta con numerosas raíces finas
acumularían más MP que una con pocas raíces gruesas. Se ha observado
también que las hojas viejas contienen mayores concentraciones de Cd que
las jóvenes y esto se debería a péptidos que unen metales presentes en
mayor concentración en hojas viejas, así el Cd sería transportado hacia las
vacuolas como medio de destoxificación. Así mismo, se ha determinado
mayor contenido de Cd en raíces que en hojas. Como recomendación de la
Junta Nacional de Investigación de los Estados Unidos (1980), el contenido
de Cd en el forraje de los cultivos no debe ser mayor de 0.5 g/g-1 a fin de
limitar la concentración de Cd en el hígado y riñón de los animales que se
alimentan con dicho forraje, para proteger a los humanos contra la toxicidad
de este MP.
Almacenamiento de metales en plantas: Una vez adentro de las células
vegetales los MP en exceso y no necesarios para el metabolismo, son
almacenados para evitar su toxicidad. Este mecanismo es llevado a cabo
por diversas proteínas y péptidos específicos y por varias pequeñas
moléculas orgánicas.
1- Proteínas de almacenamiento de metales: son 2 las principales
proteínas responsables del almacenamiento y destoxificación de MP: las
ferritinas y metalotioneinas. Las ferritinas son proteínas multiméricas de
almacenamiento de hierro capaces de secuestrar varios miles de átomos
de hierro por moléculas. En las plantas, son codificadas por una
pequeña familia de genes y se localizan en los plastidios. Constituyen un
importante
componente de
la respuesta
al estrés oxidativo
y
probablemente participen en la protección de los plastidios contra el
estrés, almacenando un exceso de hierro libre, el cual incrementa la
concentración de dehidroascorbato y disminuye la concentración de
ascorbato. Las metalotioneinas son pequeñas proteínas que secuestran
el exceso de ciertos metales, más frecuentemente: zinc, cobre y cadmio,
por coordinación de estos metales con residuos cisteína. Estas proteínas
han recibido gran atención en la última década porque la quelación
intracelular de metales se creía que era llevada a cabo exclusivamente
por las fitoquelatinas.
2- Fitoquelatinas: también llamadas metalotioneinas de clase III, que a nivel
celular son sintetizadas en el cytosol y transportadas a las vacuolas.
3- Quelación de metales por pequeñas moléculas: existe un gran número
de compuestos de muy bajo peso molecular que juegan un importante
papel en el manejo de MP en las plantas. Entre ellos, algunos ácidos
orgánicos, aminoácidos y derivados fosfatados son de particular interés.
Citrato, por ejemplo, tiene una alta capacidad de quelación con hierro,
níquel y Cd. Algunos aminoácidos y derivados son muy buenos
quelantes y esta propiedad le confiere resistencia al vegetal ante
concentraciones tóxicas del MP. (Fig)
Transporte de MP a larga distancia: los metales una vez captados por las
raíces son transportados por la savia xilemática y translocados a las partes
aéreas del vegetal ya quelados. La movilidad de estos complejos a través
del floema aún no está bien documentada.
Distribución intracelular y transporte subcelular de MP: Los posibles
mecanismos de inactivación de MP en plantas pueden involucrar: unión del
MP a las paredes celulares, menor transporte a través de las membranas
celulares, eflujo activo, compartimentalización intracelular y quelación. En la
mayoría de las células vegetales, las vacuolas comprenden más del 8090% del volumen celular y actúan como un compartimiento central de
almacenamiento de iones. Los tonoplastos funcionan como una selectiva y
efectiva barrera para la difusión de MP. Se ha demostrado la rápida
inducción de la síntesis y acumulación de fitoquelatinas en respuesta a un
pequeño aumento de Cd u otros MP.
Mecanismos celulares de destoxificación y tolerancia: algunas especies
vegetales han desarrollado mecanismos de tolerancia que les permiten
sobrevivir en suelos metalíferos, presumiblemente por adaptación de la
homeostasis general hacia una tolerancia constitutiva a MP. Algunas
estrategias para evitar el aumento de MP pueden ser: a nivel extracelular, la
aparición de micorrizas y exudados en la pared celular. Los mecanismos de
tolerancia pueden involucrar la membrana plasmática, ya sea reduciendo la
captación de MP o por la estimulación de las bombas de eflujo de MP que
han entrado a la célula. Dentro del protoplasto existen una variedad de
mecanismos para la reparación de proteínas dañadas por el estrés con la
participación de las proteínas del shock de calor (HSP) o metalotioneinas y
la quelación de MP por aminoácidos, ácidos orgánicos o péptidos, o su
compartimentalización hacia las vacuolas.
La tolerancia a los MP puede definirse como la habilidad para sobrevivir en
un suelo que es tóxico para otras plantas y se manifiesta por una
interacción entre genotipo y su ambiente. En diversos estudios genéticos,
tal tolerancia adaptativa al MP estaría gobernada por un pequeño número
genes. Aún queda por resolver si un único cambio bioquímico o molecular
es requerido para producir tolerancia a un MP específico.
Micorrizas: Aunque no siempre se consideran entre los mecanismos de
tolerancia a MP, las micorrizas y en particular las ectomicorrizas
características de árboles y arbustos, pueden ser muy eficientes para
disminuir los efectos de la toxicidad de MP en las plantas huésped. La
endosimbiosis formada entre plantas y microorganismos juega un
importante papel en la agricultura y ecosistemas naturales. La interacción
endosimbiótica más conocida es la formada por planta y hongo, incluyendo
interacciones de tipo parasitaria, que resultan en enfermedades como el
moho y por otro lado la simbiosis mutualística establecida entre raíces y los
hongos
arbusculares
micorrizales
(AMF).
AMF
(zygomycotina)
se
encuentran típicamente asociados con una gran variedad de plantas
terrestres, preferiblemente angiospermas. El establecimiento exitoso de
esta asociación mutualística constituye una estrategia
para mejorar el
estatus nutricional de ambos participantes. El hongo recibe compuestos
carbonados de la planta huésped y ésta se beneficia con una mayor
captación de nutrientes (principalmente fósforo), con un aumento de
tolerancia al estrés abiótico y resistencia
a patógenos. La penetración
dentro de la raíz y el desarrollo intracelular de los AMF, involucra una
compleja
secuencia
de
eventos
bioquímicos
y
citológicos
con
modificaciones intracelulares, que implican que el hongo debe ser
reconocido claramente por la planta huésped. Se ha observado que los
cambios inducidos por Cd en raíces micorrizadas estuvieron ausentes o
fueron menores que en raíces no-micorrizadas. Estas observaciones
sugieren que aunque los cambios en las condiciones de la rizósfera fueron
percibidos por la raíz, la respuesta típica al estrés por Cd fue compensada.
Aún no se sabe si la micorrización protege las raíces de la injuria por Cd,
evitando el acceso de éste a sitios extra o intracelulares sensibles o por
quelantes intrínsecos o excretados o por otros sistemas de defensa. Es
posible que AMF provean protección vía GSH ya que se encontraron
mayores concentraciones de este tiol en cultivos puros de hongos que en
raíces desnudas. El desarrollo de asociaciones planta- micorriza tolerantes
al estrés podría ser una nueva estrategia para la fitorremediación de suelos.
TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES DURANTE EL ESTRÉS OXIDATIVO
Como desafortunada consecuencia de la vida aeróbica, las especies activas
del oxígeno (AOS; ROS) se forman por la reducción parcial del oxígeno
molecular. Las plantas poseen una compleja batería de antioxidantes
enzimáticos y no-enzimáticos que pueden proteger las células del daño
oxidativo eliminando las AOS. Es evidente que las AOS generadas durante el
ataque de patógenos y por situaciones de estrés abiótico, son reconocidas por
los vegetales como una señal para disparar las respuestas de defensa.
A pesar del daño celular extremo, las AOS pueden actuar como ubicuas
moléculas señal en los vegetales. Las AOS son un componente central en las
respuestas al estrés y el nivel de las mismas determina el tipo de respuesta.
Mientras que a bajas concentraciones AOS inducen los genes de defensa y
respuestas adaptativas, a altas concentraciones se inicia la muerte celular o
apoptosis. Para permitir este doble rol, los niveles celulares de AOS deben ser
rigurosamente controlados.
Las numerosas fuentes de AOS (cloroplastos, mitocondrias, peroxisomas,
apoplasto) y el complejo sistema de eliminación de oxidantes proveen la
flexibilidad necesaria para estas funciones. Aún no se entiende como estos
sistemas son regulados para llevar a cabo el control espacial y temporal de la
producción de AOS.
Cantidades subletales de AOS aclimatan a las plantas a condiciones de estrés
biótico y abiótico y reducen el desarrollo de las mismas, probablemente como
parte de un mecanismo de aclimatación. Hay múltiples estudios que confirman
el rol de señalización de AOS en las respuestas de defensa de los vegetales:
-
Se ha demostrado que catalasa actúa como proteína unida al ácido
salicílico.
-
Plantas transgénicas con elevados niveles de H2O2 debido a la
sobreproducción constitutiva de glucosa oxidasa o represión de la
catalasa peroxisomal fueron más resistentes a patógenos, acumularon
más ácido salicílico y expresaron genes y proteínas PR (relativos a
patógenos).
-
Bacterias y levaduras inducen distintas proteínas de defensa en
respuesta ya sea a H2O2 o O2°-.
Aunque se conoce una parte substancial de la respuesta genómica y la
actividad de muchas enzimas afectadas por las AOS, los mecanismos
moleculares y bioquímicos de aclimatación aún no se conocen y las vías de
señalización involucradas están en estudio.
Las AOS se comunican con otras moléculas señal y vías, siendo parte de una
red de señalización que controla las respuestas “downstream” de AOS. Datos
recientes sugieren que las AOS no solo son moléculas señal de estrés sino que
también actuarían como señales en el crecimiento y desarrollo vegetal. Se ha
demostrado que bajo condiciones de estrés, una de las estrategias que las
plantas han desarrollado es disminuir el crecimiento. La habilidad para reducir
la división celular bajo condiciones desfavorables puede no solo permitir la
conservación de energía para la defensa sino también limitar el riesgo de daño
heredable. La progresión del ciclo celular está bajo control negativo por las
AOS.
Las plantas pueden censar, transducir y traducir las señales de las AOS en
respuestas celulares apropiadas, este proceso requiere de la presencia de las
“Proteínas redox sensibles” que mantienen reversible el equilibrio oxidación/
reducción. Las AOS pueden oxidar directamente a estas proteínas o
indirectamente a través de moléculas redox- sensibles tales como: GSH o
tioredoxinas.
Se están llevando a cabo estudios genéticos y fisiológicos para ubicar la
posición de las señales AOS en las vías de transducción y cómo estas son
percibidas y transducidas en respuestas específicas de la vía.
En cuanto a la regulación de la expresión génica regulada por el estado redox y
su relación con las AOS, se han descripto dos etapas principales en la
activación transcripcional de factores de trascripción eucarióticos que
parecieran estar influenciados por el equilibrio redox: localización nuclear y
unión al ADN. El estado pro-oxidante en el citoplasma (determinado por la
relación de GSH/ GSSG) o por AOS, activa a los factores de trascripción
(similares a NF-B) induce su translocación al núcleo, donde se necesita un
ambiente reductor para la apropiada unión de estos al ADN.
Elementos proteicos y bioquímica de los sistemas de señalización de dos
componentes: una His- quinasa y un regulador de respuesta.
En los últimos años, se han estudiado H2O2 y NO y se los considera como
jugadores centrales en la señalización celular. Queda aún por dilucidar como
estas señales son percibidas por las células. Tal percepción podría involucrar
interacción directa de H2O2 y NO con distintas proteínas tales como factores de
trascripción, canales iónicos o enzimas. Las enzimas sensibles a H2O2 y NO
incluirían a protein- quinasas y fosfatasas.
Glutatión (GSH) tiene numerosos roles en la defensa celular y en el
metabolismo del sulfuro. Estas funciones dependen o impactan sobre la
concentración y/o estado redox del pool de GSH. La efectiva función requiere
del control homeostático de la concentración y estado redox, con la pérdida de
la homeostasis actuando como señales que disparan respuestas adaptativas.
Los pools intracelulares y extracelulares se encuentran ligados por el transporte
a través de las membranas. El control de la concentración de GSH y estado
redox se debe a una compleja interacción entre: biosíntesis, utilización,
degradación, oxidación/ reducción y transporte. Todos estos factores deben ser
considerados a fin de evaluar el significado de GSH como un componente de
señalización durante el desarrollo, estrés abiótico o ataque de patógenos.
TEMA 5
Metabolismo de las fitoquelatinas. Tolerancia y sensibilidad.
Además
de
su
función
antioxidante,
el
glutatión
también
es
un precursor de fitoquelatinas (FQ). En las plantas cultivadas bajo estrés
abiótico en forma de metales pesados, GSH es la pieza repetitiva a partir de
la cual se sintetizan las fitoquelatinas, pequeños péptidos que participan en
la destoxificación de zinc (Zn) y cadmio (Cd, (Cobbett y Goldsbrough, 2002)
(Romero-Puertas et al., 2006). Las FQ participan en la quelación de Cd y su
almacenamiento en las vacuolas (Clemens, 2001).
Las FQ son una familia de péptidos que complejan metales y tienen una
estructura general (-Glu-Cys) n-Gly, donde n = 2-11, y son rápidamente
inducidos en las plantas con tratamiento de metales pesados (Rauser, 1995;
Zenk de 1996; Cobbett de 2000; Goldsbrough, 2000). FQ se sintetizan no
traduccionalmente utilizando GSH como sustrato de la FQ sintetasa (PS ó
PCS) (Grill et al., 1989; Rauser, 1995), una enzima que se activa en
presencia de iones metálicos (Cobbett, 2000). Los genes de la FQ sintetasa
(PCS1) han sido identificados en Arabidopsis y levadura (Clemens et al.,
1999; Vatamaniuk et al., 1999) (Hall, 2002).
Los metales pesados son capaces de regular la síntesis de
fitoquelatinas. Se ha demostrado que un número de especies vegetales
responden a los metales pesados mediante la activación de la FQ sintetasa y
así aumentan los contenidos de FQ.
Vatamaniuk et al., (2000) informó que la FQ sintetasa se activa
primariamente en forma post- traduccional.
Algunas investigaciones
muestran que la regulación transcripcional de PCS1 de Arabidopsis por Cd
aparece sólo durante las primeras etapas de desarrollo de la planta (Lee y
Korban, 2002). Otros resultados estaban de acuerdo con la conclusión que la
FQ sintetasa era regulada por metales pesados a nivel de la transcripción
(Zhang et al., 2005) (Wawrzynski et al., 2006)
.
SINTESIS DE FITOQUELATINAS
Fig. 16: Síntesis de Fitoquelatinas.(Cobbett y col., 2000)
Gong y col., (2003) observaron la movilización de FQ por análisis de
espectrometría de emisión atómica y se han detectado en raíces, hojas y tallos.
La menor acumulación de Cd en raíces y un mayor transporte del mismo desde
raíz a los brotes en plantas transgénicas fueron anuladas por la acción de (lbitionina- sulfoximina (BSO). Estos resultados demuestran que las FQ pueden
ser transportadas a lo largo de la planta y que la expresión transgénica del gen
TaPCS1 suprime la sensibilidad a Cd, incrementa el transporte a larga
distancia del Cd y reduce su acumulación en raíces.
Mishra y col., (2006) observaron que las FQ disminuían en las raíces a
50m de Cd a tiempos prolongados de intoxicación, lo cual se correlaciona con
reducidos niveles de GSH, probablemente debido a la menor actividad de GR,
proceso que conduce a estrés oxidativo, que se evidencia por los cambios
fenotípicos en la planta tales como amarronamiento de las raíces y hojas
amarillas.
Entre los procesos de destoxificación que se activan cuando las plantas
son expuestas a Cd se destacan: - la unión del metal a fitoquelatinas, - su
compartimentalización en vacuolas, - la inmovilización a nivel de pared
celular y - la exclusión por acción de la membrana plasmática, entre los más
conocidos (Sanita di Toppi L y col, 1999).
Fig. 17: Biosíntesis de Glutatión. (Noctor y col., 2002)
Por los antecedentes considerados, se observa que la relación del Cd con la
defensa antioxidante no es clara y requiere de más estudio
TEMA 6
METABOLISMO DEL ÓXIDO NÍTRICO, SU PAPEL EN LA BIOQUÍMICA DEL
ESTRÉS
El óxido nítrico (NO) es una ubicua y pequeña biomolécula gaseosa altamente
difusible. Sus propiedades químicas la convierten en una molécula señal muy
versátil que funciona a través de interacciones con blancos (targets) celulares
ya sea por mecanismos redox o química aditiva. En las plantas, NO juega un
papel en un amplio espectro de procesos fisiopatológicos y del desarrollo.
Aunque se ha demostrado la producción de NO dependiente de óxido nítrico
sintetasa (NOS) en plantas, no se ha aislado ningún gen, o cDNA o proteína la
fecha. Paralelamente, se puede medir la producción de NO precisa y regulada
mediante la actividad de la enzima nitrato reductasa (NR). Además de la
producción endógena de NO, se han detectado altas emisiones del mismo en
suelos fertilizados, pero sus efectos sobre la fisiología de las plantas aún no se
conoce. Muchos estímulos ambientales y hormonales son transmitidos directa
o indirectamente a través de cascadas de señalización mediadas por NO. La
habilidad de NO para actuar simultáneamente sobre diversos nodos
bioquímicos no relacionados y sus propiedades homeostáticas redox sugieren
que podría ser una molécula de sincronización en los vegetales.
Historia del NO en animales: NO ha sido identificado como una molécula señal
crítica en:
-
Mantener la presión arterial en el sistema cardiovascular.
-
Estimular el sistema inmune.
-
Regular la transmisión neuronal en el cerebro.
-
Regular la expresión génica.
-
Agregación plaquetaria.
-
Aprendizaje y memoria.
-
Función sexual masculina.
-
Cito toxicidad y citoprotección.
-
Desarrollo de arterioesclerosis.
Química del NO y moléculas target: Las diferentes formas del NO muestran
diferentes reactividades y propiedades químicas. Una de las propiedades más
importantes de esta molécula es la existencia de un electrón desapareado, lo
que le permite una alta reactividad con el oxígeno, superóxido, derivados de N
y metales de transición. En sistemas biológicos, NO reacciona con O 2, O2-, y
metales de transición (Me
+/ 2+),
generando óxidos de nitrógeno: NO2, N2O3,
NO2-, NO3- , peroxinitrito (ONOO-) y aductos metal- NO. Las proteínas que
contienen metales o tioles son sitios de ataque del NO, también lo son:
mensajeros celulares, canales iónicos, enzimas, receptores y factores de
trascripción, (Fig.1).
Propiedades antioxidantes y pro-oxidantes del NO: Desde el momento en que
NO es identificado como una radical libre, se ha propuesto que tiene funciones
tanto citoprotectoras como citotóxicas. La citoprotección se basa en la habilidad
de NO para regular el nivel y toxicidad de ROS. Como el complejo mecanismo
químico redox del NO está relacionado a los cambios en el medio ambiente
redox, se hipotetiza que NO provee un mecanismo general para la regulación
de la homeostasis redox celular. Así, NO puede ejercer una acción protectora
contra el estrés oxidativo, provocado por un aumento en la concentración de
superóxido, peróxido de hidrógeno, y alquil peróxidos, y además es una
molécula que posee por sí misma, propiedades antioxidantes. Se ha visto que
NO puede atenuar el daño oxidativo producido por la reacción de Fenton,
evitando la formación de oxidantes al eliminar el hierro o el ión superóxido
limitando así la formación de radicales hidroxilo. Otros estudios han
demostrado que NO puede actuar como un antioxidante que rompe cadenas al
inhibir reacciones de lipoperoxidación. En plantas se ha visto que NO actúa
protegiendo al vegetal en condiciones de estrés biótico o abiótico. Esta
protección se observa a diferentes niveles de organización, desde cultivos
celulares, tejidos, órganos y en toda la planta, y ejercida en todo tipo de
macromoléculas: DNA, RNA, proteínas, clorofilas y lípidos. Se ha reportado
activación mediada por NO de enzimas antioxidantes y expresión génica de las
mismas.
Los efectos citotóxicos del NO se generan por reacción con el ión superóxido
que forma el ONOO- poderoso oxidante. Esta molécula puede nitrar proteínas a
nivel de los residuos tirosina, por lo cual estas proteínas no pueden ser
fosforiladas.
Generación de NO y métodos de determinación: NO es una molécula muy
inestable producida a muy bajas concentraciones. Para su determinación son
necesarios métodos analíticos que permitan su análisis en diferentes sistemas.
Puede
ser
medido
directa
o
indirectamente,
los
directos
incluyen
quimioluminiscencia y electroquímica. El método indirecto más utilizado es la
Reacción de Griess basada en la cuantificación de NO2, que es estable y se
forma de la descomposición del NO en medio acuoso, in vitro.
Generación de NO en plantas: Las formas inorgánicas del nitrógeno oxidado
son fuente para la producción de NO mucho más en plantas que en animales
ya que son componentes de la vía de asimilación de nitrógeno. En ciertas
condiciones, la reducción enzimática y no- enzimática de nitrato y nitrito puede
conducir a la formación de NO. La formación no- enzimática de NO es
favorecida por valores de pH ácidos y por la acumulación extracelular de nitrito,
mecanismo que puede ocurrir en anaerobiosis.
También se ha discutido si NO puede generarse regularmente in vivo durante
la asimilación de nitrógeno:
Vías de transducción, procesamiento y señalización de NO:
Hasta la fecha no hay evidencias de la existencia de elementos del DNA para
analizar secuencias promotoras de genes eucarióticos que se unan o
respondan directamente a NO. En consecuencia, NO activa vías de
señalización, lo que resulta en cambios en la expresión de genes, a través de
mensajeros celulares.
NO y su relación con las hormonas vegetales:
-
Auxina, NO y raíz: las auxinas son hormonas asociadas a diferentes
procesos fisiológicos, principalmente: dominancia apical, tropismos,
elongación de los brotes, inducción de la división celular e iniciación de
la raíz. Se ha demostrado la dependencia del NO en el desarrollo de las
raíces adventicias inducido por auxinas.
-
ABA, NO y déficit de agua: El déficit de agua está asociado con la
acumulación de la hormona vegetal Ácido Abscísico (ABA) y la inducción
de genes regulados por ABA, los que a su vez están involucrados en
muchos procesos fisiológicos. ABA regula varios procesos vitales tales
como: maduración de las semillas, dormición, desarrollo vegetativo e
induce la tolerancia diferentes estreses incluyendo: sequía, salinidad y
bajas temperaturas. Se ha demostrado en Pisum sativum y Vicia fava
que ABA induce un aumento de los niveles endógenos de NO, esta
producción fue suficiente y necesaria para inducir el cierre de estomas, a
través de un proceso dependiente de Ca2+, impidiendo así la
evaporación de agua por transpiración. La hipótesis es que NO puede
regular directamente la endomembrana y los canales de Ca2+, como así
también otros canales iónicos.
-
Citoquininas, Giberelinas, NO y vías del fitocromo: hay muchos procesos
en los cuales las hormonas y fitocromo interactúan o actúan
separadamente para dar la misma respuesta. NO también dispara varias
de esas respuestas. Las citoquininas (CKs) pueden estimular
respuestas fotomorfogénicas, principalmente aquellas relacionadas con
el proceso de síntesis de pigmento. La primera evidencia de una relación
directa entre CKs y producción de NO, fue que la aplicación exógena de
CKs en cultivos celulares de Arabidopsis, condujo a una rápida
estimulación de la liberación de NO. Las giberelinas (GAs) actúan como
la forma activa del fitocromo para inducir la germinación. Se ha
observado que el tratamiento con CK solo no es efectivo para romper
con la dormición, pero CK actúa en forma sinérgica con la luz y GAs
para permitir la germinación. La relación propuesta de NO en la
señalización de CK y luz, sugiere que habría una síntesis de NO
regulada que depende de estas señales. Se ha demostrado que NR es
regulada por la luz y CKs, principalmente a nivel transcripcional.
-
Etileno, NO y senescencia: el etileno juega un importante papel en
muchas respuestas de las plantas a señales ambientales y endógenas.
Influencia cada etapa del desarrollo y crecimiento de la planta, desde la
germinación y expansión celular hasta las respuestas al estrés y
maduración de los frutos. Las evidencias de la relación entre NO y
etileno en la maduración senescencia sugiere un efecto antagónico de
ambos gases durante estas etapas del desarrollo vegetal. La aplicación
exógena de NO extendió la vida post- cosecha de verduras frescas por
inhibición de la producción de etileno. Se ha observado que en el
proceso de maduración los niveles de NO disminuyen y aumenta el
etileno. La senescencia es un proceso caracterizado por pérdida de
agua y desecación de los tejidos vegetales.
ENZIMAS PRODUCTORAS DE NADPH
GLUCOSA 6 FOSFATO DESHIDROGENASA e ISOCITRATO
DESHIDROGENASA
Los peroxisomas (P) son organelas con membrana simple y un metabolismo
esencialmente oxidativo y una morfología simple que no refleja la complejidad
de su composición enzimática. Las funciones de los P son fotorrespiración,
beta- oxidación, ciclo del glioxilato, metabolismo de purinas y ureidos. Se
caracterizan por presentar una plasticidad metabólica ya que su contenido
enzimático puede variar según el organismo, el tejido o célula y
las
condiciones ambientales. Estudios preliminares que confirmaron la presencia
de SOD en P de plantas, se extendieron luego al humano y animales y se
encontró en estas organelas, no solo CuZn- SOD sino también Mn-SOD.
Además encontramos otro tipo de metabolitos como:
-
Las purinas: xantina y ácido úrico, alantoína, esto indica que los P están
involucrados en el catabolismo de xantina (producida como resultado del
metabolismo de nucleótidos, RNA y DNA).
-
Los
antioxidantes
no-
enzimáticos:
Glutatión
y
Ascorbato
que
contribuyen a regular el estado redox de la organela. Glutatión también
podría tener una función adicional como “señal intracelular”.
-
Ribulosa-5-P producto de la vía pentosa fosfato, catalizada por glucosa
6-P deshidrogenasa y 6 fosfogluconato deshidrogenasa, que también se
encuentran localizada en los P.
La presencia de estos metabolitos en los P indica que estas organelas
podrían participar e intercambiar componentes con otras vías metabólicas
en otros compartimientos celulares. Es importante la comunicación entre
diferentes compartimientos celulares a través del flujo de metabolitos.
Generación de moléculas señal en peroxisomas:
-
Cloroplastos: (O2.-) son producidos por el fotosistema I, a nivel de la
ferredoxina- NADP reductasa.
-
Mitocondria: (O2.-) son producidos en 2 segmentos de la cadena de
transporte electrónico.
-
Apoplasto: las peroxidasas unidas a la pared celular generan H2O2.
En P de levaduras y mamíferos hay poca información sobre la producción
de radicales del oxígeno.
En P de ratón se identificó una proteína en membrana peroxisomal (Mpv17),
involucrada en la producción de ROS y se piensa que tiene un papel
importante en enfermedad renal.
En sistemas animales las actividades enzimáticas peroxisomales parecen
estar moduladas por NO°.
Catalasa y glutatión peroxidasa (GPx) se encuentran disminuidas (“down
regulated”) por NO°.
La actividad de la beta- oxidación peroxisomal se encuentra aumentada por
NO°, esto justifica que sea el mecanismo responsable de la toxicidad del
NO° asociada a H2O2, en P, citoplasma y mitocondria de células animales.
En células de tabaco, se ha observado que NO° y ONOO- inhiben la
actividad de catalasa y ascorbato peroxidasa (APx), las 2 enzimas más
importantes en la eliminación de H2O2 en vegetales.
Rol regulatorio múltiple del NADPH peroxisomal:
NADPH: es un dador básico de electrones en numerosas reacciones de
biosíntesis y destoxificación.
En células vegetales tiene un importante papel en la protección contra el
estrés oxidativo, debido a su intervención en el ciclo ascorbato- GSH.
Las NADP- deshidrogenasas pueden por lo tanto ser incluidas en el grupo
de enzimas antioxidantes junto a catalasa (CAT), superóxido dismutasa
(SOD), ascorbato peroxidasa (APx), glutatión reductasa (GR) y glutatión
peroxidasa (GPx).
Tomando en cuenta los parámetros catalíticos de las 3 deshidrogenasas:
glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, 6 fosfogluconato deshidrogenasa e
isocitrato deshidrogenasa, ésta última puede ser considerada como la
enzima con mayor capacidad para reciclar NADPH.
El pool de NADPH es necesario para varios procesos:
-
Es un cofactor esencial para la actividad de glutatión reductasa (GR),
(ciclo GSH- Asc), así NADPH aumenta el nivel de GSH que participa en
el control del estado redox y en la regulación del nivel de H2O2.
-
NADPH es estrictamente requerido para la generación de NO° por la
óxido nítrico sintetasa (NOS) peroxisomal.
-
Catalasa es protegida del daño oxidativo por NADPH.
-
NADPH tiene un importante papel en la importación de proteínas hacia
adentro del peroxisoma y la relación NADPH/NADP+
regularía este
proceso.
Significancia fisiológica de los peroxisoma como fuentes adicionales de
moléculas señal:
Bajo condiciones fisiológicas normales, la producción de ROS, H2O2 y O2.estaría controlada por CAt, APx y SOD, respectivamente.
Se sabe que CAT es inactivada por la luz y diferentes condiciones de estrés
que disminuyen la síntesis de proteínas y en esta situación aumenta la
generación de H2O2 y O2.-.
-
CAT es inhibida por los radicales O2.-
-
CAT y APx (enzimas que eliminan H2O2) son inhibidas por NO° y ONOO.
-
Aumenta la síntesis de NO° y aumenta la beta-oxidación en células
animales con aumento de H2O2.
Todos estos datos indican que el aumento de O2.- y NO°, disminuyen CAT y
APx produciendo aumento de H2O2, por aumento de beta- oxidación de
ácidos grasos.
Esta destrucción de las defensas antioxidantes peroxisomales crearían
condiciones tóxicas en la célula vegetal conduciendo a daño oxidativo y
posiblemente muerte celular.
La producción de ROS y NO° tiene un doble efecto:
-
Aumento de productos con gran daño oxidativo.
-
Disminución de los niveles de NO°, H2O2 y O2.- que actuarían como
moléculas señal en muchos procesos fisiológicos como por ejemplo,
respuesta hipersensible a patógenos, crecimiento y desarrollo.
Estas moléculas mensajeras son mediadoras claves en la muerte celular
programada inducida por patógenos y funcionarían como parte de una vía
de transducción de señales que conduce a la inducción de la respuesta de
defensa.
La función de estas moléculas señal en los peroxisomas es más relevante
considerando que estas organelas proliferan durante la senescencia y bajo
distintos estreses (xenobióticos, ozono y metales pesados)
Se ha demostrado que H2O2 induce genes peroxisomales para su
proliferación.
También se ha observado la proliferación de P en hígado de ratas
expuestas a xenobióticos, herbicidas, etc.
La proliferación P por xenobióticos es cancerígena en ratas y ratones, por lo
cual se propone la hipótesis que la continua proliferación de P sería
iniciadora y promotora de carcinogénesis con la participación de ROS.
BIBLIOGRAFÍA:
-
Das P, Samantaray S and Rout GR. “Studies on cadmium toxicity in
plants: a review”. Environmental pollution, vol. 98, 1, 29- 36, 1997
-
Briat JF and Lebrun M. “Plant responses to metal toxicity”. Plant Biology
and pathology, 322, 43- 54, 1999.
-
Vranová E, Inzé D and Van Breusegem F. “Signal transduction during
oxidative stress”. Journal of experimental botany, 53: 372, 1227- 1236,
2002.
-
Lamattina l, García-Mata C, Graziano M and Pagnussat G. “Nitric oxide:
the versatility of an extensive signal molecule”. Annu. Rev. Biol. 54: 10936, 2003.
-
Corpas F, Barroso J and del Río L. “Peroxisomes as a source of reactive
oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cells”. Trends in
plant science, vol. 6, N°4, 145- 50, 2001.