AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO Fundamento: La purificación

Práctica: Electroforesis y extracción de ADN
Biología
AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO
Fundamento:
La purificación de ADN se ha convertido hoy día en una técnica imprescindible en la
mayoría de los laboratorios dedicados a investigación biológica, farmacéutica o médica. Es
imprescindible obtener ADN para poder secuenciarlo, también para el diagnóstico de
enfermedades genéticas y para muchas otras finalidades. Por ejemplo, hoy se pueden
diagnosticar enfermedades infecciosas o parasitarias investigando la presencia de secuencias
de ADN bacteriano, vírico o de parásitos en las muestras de ADN humano. El estudio del ADN
tiene también variadas aplicaciones forenses, antropológicas, evolutivas, etc.
El aislamiento de ADN a partir de cualquier muestra biológica se realiza a partir de un
extracto en el que se solubiliza y del que posteriormente se eliminan todo tipo de moléculas
biológicas acompañantes, glúcidos, lípidos y proteínas.
Los métodos de extracción son muy variados y dependen del material biológico de
partida y de las características del ADN que se pretenda purificar. No es lo mismo pretender
purificar ADN cromosómico de una bacteria que ADN plasmídico. Tampoco es igual tratar de
purificar ADN a partir de una muestra ósea fosilizada que a partir de un cultivo bacteriano o de
una muestra de sangre. Cada situación requiere procedimientos particulares, aunque la
finalidad es siempre la misma, obtener en disolución el ADN requerido lo más intacto posible.
Hay que considerar que por su estructura, cadenas polinucleotídicas enormemente largas, el
ADN produce soluciones muy viscosas y puede romperse con suma facilidad.
Una vez solubilizado el ADN, la muestra debe tratarse adecuadamente para eliminar
glúcidos y lípidos, lo que normalmente no ocasiona problemas. Es más difícil eliminar
proteínas. Tenga en consideración que existen multitud de proteínas que se unen muy
fuertemente al ADN y que muchas de ellas, fundamentalmente histonas, forman parte
integrante de la cromatina, estableciendo interacciones muy estables para formar los
cromosomas eucarióticos.
Las proteínas se pueden eliminar forzando su desnaturalización y por medio de
incubaciones con proteasas para que se degraden a péptidos y aminoácidos libres que serán
fácilmente eliminados con posterioridad.
Las etapas finales de la purificación siempre se basan en la precipitación del ADN, lo
que se consigue fácilmente con disoluciones alcohólicas en presencia de sales que produzcan
una fuerza iónica adecuada.
En los últimos años se han desarrollado multitud de métodos para obtener ADN puro y
totalmente libre de proteínas. Este ADN es adecuado para estudios estructurales,
secuenciación, hidrólisis específica con enzimas de restricción, y en general para todas las
técnicas de biología molecular.
Este método necesita un tiempo relativamente largo para completarse, por eso vamos a
realizar un método más sencillo y rápido con el que vamos a extraer ADN genómico a partir de
la mucosa bucal.
Práctica: Electroforesis y extracción de ADN
Biología
EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE MUCOSA BUCAL
Reactivos:
S Dodecil sulfato sódico (SDS) al 5% en agua.
S Acetato sódico 3 M.
S Etanol absoluto.
Método:
1.
Tome un tubo estéril de 25 o 30 ml, y añada 10-12 ml de agua del grifo. Enjuáguese la
boca durante 15 segundos con el agua, procurando distribuirla bien por todas las mucosas
bucales. Deposite de nuevo el agua en el tubo. De esta forma se colectan muchas células de
descamación de las mucosas.
2.
Añada al tubo 0.5 ml de SDS al 5%, 0.5 ml de acetato sódico 3M y 10 ml de etanol
absoluto frío y mezcle suavemente por inversión del tubo. Mantenga el tubo en el congelador
durante unos minutos (mínimo 15 minutos para obtener buenos resultados).
3.
Mezcle suavemente, invirtiendo el tubo unas pocas veces y espere la aparición de
hebras blanquecinas, que están constituidas por ADN genómico.
4.
Obviamente esta preparación sencilla es un ejemplo de la facilidad para extraer ADN. En
este caso será un ADN muy contaminado con proteínas y otras biomoléculas.
5.
Si se pretendiera utilizar este ADN para posterior manipulación, secuenciación,
amplificación, etc. Debería ser procesado para la eliminación de todas las biomoléculas
contaminantes.
ELECTROFORESIS DE ADN
Se llevará a cabo una electroforesis para visualizar el ADN plasmídico. Se observarán varias
bandas que se corresponden con el ADN plasmídico en diferentes estados topológicos ya que
los ADN circulares presentan distinta movilidad electroforética en función de su grado de
enrollamiento. La electroforesis se realizará en un gel de agarosa al 1 %.
1. PREPARACIÓN DEL GEL
Fundamento
La agarosa disuelta en agua a temperaturas próximas a ebullición forma geles cuando se enfría
debido a que las fibras poliméricas forman agregados que se entrecruzan. Dependiendo de la
concentración de la disolución de agarosa los poros que quedan en la malla del gel serán de
distinto tamaño y, por tanto, hay que utilizar diferentes concentraciones para separar moléculas
de ácidos nucleicos para cada rango de tamaños.
Método
1. Cargar 10 ul de la muestra en un pocillo del gel y 5 ul en otro pocillo.
Práctica: Electroforesis y extracción de ADN
Biología
2.
Conectar los cables a la fuente de alimentación y colocar la tapa de la cubeta.
Asegúrense de que la polaridad es correcta.
3.
Fijar el voltaje en 80 v.
4.
Desconectar la electroforesis apagando la fuente de alimentación cuando el colorante
llegue al extremo del gel.
5.
Quitar la tapa al aparato y con cuidado retiren la bandeja con el gel (el gel puede
resbalar de la bandeja por lo que hay que colocar un dedo en los lados libres para que no se
mueva).
6.
Colocar el gel sobre el transiluminador UV y observen el ADN.
En la figura inferior se muestra un minigel con un plásmido en tres estados topológicos: