universidad veracruzana facultad de ciencias agrícolas

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES BACTERIANAS
CAUSANTES DE PUDRICIÓN BLANDA EN ALCATRAZ
(Zantedeschia aethiopica) FERTILIZADO CON SOLUCIÓN
DE NITRATOS Y FOSFATOS
INGENIERO AGRÓNOMO
TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL
P R E S E N TA
JOSÉ MARTÍN ORTÍZ AQUINO
XALAPA DE ENRÍQUEZ, VERACRUZ
ENERO DE 2013
II
Contenido
Pág.
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................ VI
ÍNDICES DE CUADROS ........................................................................................... VII
DEDICATORIA ........................................................................................................... IX
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................. X
RESUMEN .................................................................................................................. 1
I. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 2
II. ANTECEDENTES.................................................................................................... 4
2.1 El cultivo del alcatraz en el estado de Veracruz .................................................... 4
2.2 Generalidades del alcatraz (Zantedeschia sp) ...................................................... 5
2.2.1 Origen del alcatraz.............................................................................................. 5
2.2.2 Posición Taxonómica ......................................................................................... 6
2.3 Propagación del cultivo.......................................................................................... 6
2.3.1 Siembra de semilla ............................................................................................. 6
2.3.2 División de rizoma .............................................................................................. 7
2.3.3 Cultivo de tejidos ................................................................................................ 7
2.3.4 Desgajado .......................................................................................................... 7
2.4 Problemas fitosanitarios del alcatraz ..................................................................... 7
2.4.1 Pectobacterium carotovorum .............................................................................. 8
2.4.2 Xanthomona campestris ..................................................................................... 8
2.4.3 Phytophthora erythroseptica ............................................................................... 8
2.4.4 Pythium spp. ....................................................................................................... 8
2.4.5 Rhizoctonia spp. ................................................................................................. 9
2.4.6 Penicillium spp. .................................................................................................. 9
2.4.7 Phytophthora erythroseptica............................................................................... 9
2.4.8 Alternaria spp. y Botrytis spp. ............................................................................. 9
2.4.9 Virus del mosaico del alcatraz ............................................................................ 9
2.4.10 Virus de la Marchitez y Moteado del tomate................................................... 10
2.5 Importancia de la pudrición blanda causadas por bacterias ................................ 10
2.5.1 Ralstonia solanacearum ................................................................................... 10
III
2.5.2 Pectobacterium carotovorum............................................................................ 11
2.5.2 Dickeya chrysanthemi (Syn. Pectobacterium chrysanthemi) ............................ 12
III. HIPÓTESIS .......................................................................................................... 14
IV. OBJETIVOS ......................................................................................................... 14
4.1. Objetivo general ................................................................................................. 14
4.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 14
V. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 15
5.1 Obtención de aislamientos bacterianos ............................................................... 15
5.2 Pruebas de patogenicidad ................................................................................... 15
5.2.1 Preparación del tejido vegetal .......................................................................... 15
5.2.2 Preparación de suspensiones bacterianas ...................................................... 16
5.2.3 Preparación de solución nutritiva ..................................................................... 16
5.2.4 Inmersión de tallos en suspensiones bacterianas ............................................ 16
5.2.5 Inmersión de rizomas en suspensiones bacterianas, causantes de pudrición
blanda. ...................................................................................................................... 17
5.2.6 Respuesta en tallo por inoculación de suelo, con aislamientos bacterianos
causantes de pudrición. ............................................................................................ 18
5.2.7 Prueba de patogenicidad en plantas de alcatraz............................................. 19
5.3 Pruebas para la identificación de bacterias causantes de la pudrición blanda en
alcatraz ...................................................................................................................... 20
5.3.1 Tinción Gram .................................................................................................... 20
5.3.2 Oxidación y fermentación de glucosa ............................................................... 21
5.3.3 Actividad de la enzima citocromo-oxidasa........................................................ 21
5.3.4 Actividad de la enzima catalasa ....................................................................... 21
5.3.5 Reducción de nitratos ....................................................................................... 22
5.3.6 Licuefacción de gelatina ................................................................................... 22
5.4
Reacciones
bioquímicas
para
diferenciar
especies
de
la
familia
Enterobacteriaceae ................................................................................................... 22
5.4.1 Crecimiento a 37 ºC ......................................................................................... 22
5.4.2 Azúcares reductores de sacarosa .................................................................... 22
5.4.3 Sensibilidad a la eritromicina (disco 15 µg) ...................................................... 23
IV
5.4.4 Producción de indol .......................................................................................... 23
5.5 Identificación de especies Pseudomonales ......................................................... 23
5.5.1 Levana.............................................................................................................. 23
5.2.2 Dihidrolasa de Arginina .................................................................................... 24
5.2.3 Prueba de hipersensibilidad en tabaco ............................................................ 24
5.2.4 Prueba de pudrición en papa ........................................................................... 24
VI. RESULTADOS ..................................................................................................... 25
6.1 Aislamientos bacterianos.................................................................................... 25
6.2 Pruebas de patogenicidad .................................................................................. 25
6.2.1 Inmersión de tallos en suspensión bacteriana................................................. 25
6.2.2 Inmersión de rizomas en suspensión bacteriana ............................................. 26
6.2.3 Inoculación de tallos en suelo .......................................................................... 27
6.2.4 Respuesta de patogenicidad en plantas de alcatraz ........................................ 28
6.3 Pruebas bioquímicas básicas para la identificación de bacterias causantes de
la pudrición blanda en alcatraz. ................................................................................. 28
6.4 Reacciones bioquímicas para identificar bacterias pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae. .................................................................................................. 29
6.5 Reacciones bioquímicas para diferenciar especies de Pseudomonas ............... 30
VII. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 32
VIII. CONCLUSIÓN ................................................................................................... 35
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 36
ANEXO I .................................................................................................................... 40
ANEXOS II ................................................................................................................ 43
ANEXO III .................................................................................................................. 45
ANEXO IV ................................................................................................................. 46
ANEXO V .................................................................................................................. 48
V
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Descripción
Pág.
1
Localización geográfica de la Perla y Mariano Escobedo Ver.
4
2
Prueba de patogenicidad mediante la inmersión de tallos en
17
suspensión bacteriana.
3
Tratamientos empleados para la prueba de patogenicidad
mediante
la
inmersión
de
rizomas
en
18
suspensiones
bacterianas.
4
Prueba de patogenicidad de tallos de alcatraz en vivero.
19
5
Plantas de alcatraz utilizadas en pruebas de patogenicidad
20
por inoculación de suspensiones bacterianas.
VI
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro
Descripción
Pág.
1
Composición química de solución nutritiva empleada en la
16
fertilización de alcatraz.
2
Tratamientos empleados en la prueba de patogenicidad
17
mediante inmersión de tallos en suspensión bacteriana.
3
Tratamientos empleados para la prueba de patogenicidad
mediante
inmersión
de
rizomas
en
18
suspensiones
bacterianas.
4
Tratamientos empleados para la prueba de patogenicidad
19
mediante inoculación de tallos en suelo, en condiciones de
vivero.
5
Tratamientos empleados para la prueba de patogenicidad
20
mediante inoculación de plantas en suelo, bajo condiciones
de vivero.
6
Clave y especificación del órgano de la planta de alcatraz de
25
donde fue obtenido cada aislamiento bacteriano.
7
Resultados de la prueba de patogenicidad de tallos inmersos
26
en suspensiones bacterianas.
8
Resultados de la prueba de patogenicidad de rizomas
27
inmersos en suspensiones bacterianas.
VII
9
Aislamientos bacterianos responsables de pudrición de tallos
27
por inoculación en suelo.
10
Patogenicidad de aislamientos bacterianos, en plantas de
28
alcatraz.
11
Pruebas bioquímicas básicas para la identificación del
29
género de los aislamientos bacterianos causantes de
pudriciones blandas en alcatraz.
12
Reacciones bioquímicas para la identificación de las
30
especies Pectobacterium carotovorum y Pectobacterium
chrysanthemi.
13
Reacciones bioquímicas básicas para diferenciar especies de
31
Pseudomonas fitopatógenas.
VIII
DEDICATORIA
A mi madre Maxímina Aquino García y a mi padre Martiniano Ortiz Estudillo por su
apoyo incondicional, sus consejos siempre tan atinados, por no dejarme solo en
ningún instante y siempre estar en los momentos más importantes en mi vida por
ser mis dos motores que nunca me dejaron de impulsar, los amo.
A mi tía Rosalba Ortiz Estudillo por brindarme su apoyo durante mi carrera, por ser
otro motor que me impulso siempre, que me tendió la mano cuando la necesitaba
y por siempre preocuparse por mí.
A mis hermanos Elsa, Francisco, Flor e Alexa por haberse limitado, para que mis
padres pudieran darme económicamente lo que necesitaba para mi escuela, por
los bellos momentos que he pasado con cada uno de ellos gracias, los amo.
A mis abuelos paternos Martin O. y Ninfa E. por siempre desearme lo mejor, y por
aconsejarme en todo momento los amo.
A mis abuelos maternos Zoilo A. y Julia G., por sus buenos deseos, que aunque
casi no los veo siempre están en mi corazón.
A mi amigo Rodrigo Atanasio López por haberme brindado siempre su amistad,
por apoyarme en los buenos y malos momentos, gracias por siempre estar allí.
A mis amigos de la Facultad de Ciencias Agrícolas con los que pase momentos de
gran alegría pero también momentos de Tristeza especialmente a Hugo Martin
Ramírez Ortiz por haberse convertido en uno de mis grandes aliados y apoyarme
en toda ocasión. También a Conchita Rodríguez, Amayrani Lagos, Eliseo
Guevara, Jorge Perdomo y Alfonso Galicia por su amistad verdadera, y a todos los
demás que no mencione gracias.
IX
AGRADECIMIENTOS
A Dios por haberme permitido cumplir esta meta.
A la Universidad Veracruzana y
a la Facultad de Ciencias Agrícolas, por la
formación académica que me brindaron, por los profesores, aulas y laboratorios
que me permitieron formarme profesionalmente.
Al Dr. Mauricio Luna Rodríguez por haberme permitido trabajar con él, por siempre
darme consejos constructivos, por la paciencia que me tuvo, por el interés que le
dio a mí trabajo.
A la M.C. Doris G. Castillo Rocha por haberme dado consejos y técnicas para
mejorar mí trabajo.
A la Dra. María de Jesús Martínez Hernández por los consejos y apoyo que me
brindo, para mejorar este trabajo.
Al M.C. José Antonio Contreras Jiménez (†) que aunque ya no se encuentra entre
nosotros, fue uno de los iniciadores de este trabajo.
A Crystel Ortega por su apoyo incondicional en mi estancia en el Laboratorio de
Alta Tecnología de Xalapa (LATEX), por su paciencia e interés que demostró por
mí trabajo.
A Thalia Ramírez y Edgar Guevara por la paciencia y apoyo que me brindaron en
la redacción de mi tesis y por sus buenas ideas sugeridas.
Al Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, por las facilidades de materiales,
reactivos y equipos para la realización de mi trabajo.
X
RESUMEN
Las plantas de alcatraz (Zantedeschia aethiopica) sintomáticas con pudrición blanda
pertenecían a un proyecto de investigación donde se evaluaba la respuesta de la planta
a la aplicación de un programa de fertilización basado en nitratos y fosfatos bajo la
responsabilidad del M.C. José Antonio Contreras Jiménez (†) de la Facultad de
Ciencias Agrícolas de la Universidad Veracruzana. Dando continuidad al proyecto, el
objetivo de este trabajo fue identificar las cepas bacterianas responsables de la
pudrición blanda del alcatraz, y su respuesta en plantas y tejidos embebidos con
soluciones nutritivas de fosfato y nitrato. Se obtuvieron 14 aislamientos bacterianos a
partir de los cuales se prepararon soluciones como tratamiento para impregnar los
tallos, rizomas y plantas; además se agregaron tratamientos adicionales con una
solución nutritiva de fosfatos y nitratos. Se observó que solo 7 aislamientos fueron
causantes de la pudrición blanda en tejidos de alcatraz, denotando que la severidad de
la pudrición era mayor en los tejidos y plantas tratadas con solución nutritiva en
conjunto con solución bacteriana. Pruebas bioquímicas aplicadas a estos 7 aislamientos
indicaron que la cepa bacteriana TA P2-B pertenece a la especie Pseudomonas
marginalis, las cepas TU P1-B, TU P1-C, TU P2-A, TA P1-A y TA P2-D a la especie
Pectobacterium carotovorum, y la cepa TU P1-A corresponde a Dickeya sp. El empleo
de concentraciones de fosfatos y nitratos, en conjunto con las cepas responsables de la
pudrición blanda reportadas en este trabajo, incrementan la severidad de la pudrición
blanda en alcatraz generada por las cepas bacterianas empleadas.
I. INTRODUCCIÓN
El alcatraz (Zantendeschia sp.) es una planta perenne tropical y tuberosa, originaria
de Sudáfrica, pertenece a la familia Araceae que incluye plantas trepadoras,
epífitas así como acuáticas flotantes (Salinger, 1991).
En México es una ornamental de gran importancia como flor de corte y de
maceta presente en arreglos florales o como adorno en jardines, el alcatraz es
comercializado principalmente en las ciudades de México, Guadalajara y Veracruz,
y es exportado a los Estados Unidos de América (Cruz y Alfaro, 2001).
En Veracruz, el alcatraz blanco resalta en el paisaje de las grandes montañas
con clima templado húmedo, y es uno de los productos hortícolas de mayor
importancia comercial para los habitantes de esas zonas (Cruz y Alfaro, 2001),
forma parte de la lista de cultivos de importancia comercial del Estado de Veracruz
en varios municipios y se estima una superficie cultivada de 50 Ha, todas a cielo
abierto (Cruz y Alfaro, 2001).
En los municipios de la Perla y Mariano Escobedo desde hace más de 25 años
se han generado negocios con la venta de esta flor, se especulaba un monto de $1
millón de $USA dólares semanales en todas las interacciones comerciales que
conllevaba su cadena productiva (Cruz y Alfaro, 2001).
En la actualidad muchos pequeños productores están abandonado el cultivo de
alcatraz debido a una significativa reducción en la producción de flor provocada por
el ataque de bacterias entéricas, como Pectobacterium carotovorum a la cual se le
atribuye, ser el principal agente causal de la enfermedad conocida como la
pudrición blanda (Cruz y Alfaro, 2001); se caracteriza por ser una bacteria que
provoca una infección latente en el rizoma que puede convertirse en activa cuando
la planta se estresa bajo condiciones de temperatura y humedad (Guss, 1999;
Wright y Burge, 2000).
2
Dado a la oportunidad económica que este recurso representa y en la
búsqueda de alternativas de cultivo, en la Facultad de Ciencias Agrícolas (U.V.) se
inició un estudio para evaluar opciones de fertilizantes basados en soluciones de
nitratos y fosfatos en plantas cultivadas en condiciones de vivero. Un gran número
de las plantas experimentales mostró síntomas agresivos de pudrición blanda en el
tallo y rizoma, por lo que, al ser este un problema grave para los productores, que
frecuentemente se presenta en la producción a cielo abierto y que puede generarse
bajo condiciones de vivero con adición de fertilizantes, se propuso aislar e
identificar la(s) especie(s) patogénica causante de la enfermedad, como
contribución en la búsqueda de alternativas para disminuir la actividad patogénica
del agente causal.
3
II. ANTECEDENTES
2.1
El cultivo del alcatraz en el estado de Veracruz
Los principales municipios donde se cultiva el alcatraz en Veracruz son La Perla y
Mariano Escobedo (Figura 1).
El municipio de La Perla, se localiza en la Sierra Madre Oriental,
entre las
coordenadas geográficas: a los 18º 55´38´´ de latitud norte y a 97º 08´ 00’’de longitud
oeste del meridiano de Greenwich, por México. A una altitud de 1,620 msnm en la
cabecera municipal, misma que se localiza a 8 kilómetros de la ciudad de Orizaba y a
185 Km de Xalapa, la capital del estado.
El municipio de Mariano Escobedo se localiza en la parte central del estado de
Veracruz, entre las coordenadas 18° 55' latitud norte del Trópico de Cáncer y 97° 08'
longitud oeste del meridiano de Greenwich.
Figura 1. Localización geográfica de La Perla y Mariano Escobedo Ver.
http://maps.google.com.mx/
4
En La Perla, con 1331 productores de alcatraz blanco, es el municipio con mayor
superficie cultivada de esta ornamental en el Estado y quizá de todo México (Mejía,
2010). Este municipio con casi 200 km2 de superficie se encuentra en la región de las
grandes montañas del Estado de Veracruz, muy cerca del Pico de Orizaba. Su
cabecera municipal se ubica a una altitud de 1620 m. con una temperatura media anual
de 14 °C, y una precipitación promedio anual de 2429 mm. (Cruz y Alfaro, 2001). En
este municipio, además del alcatraz, se producen otros cultivos como el maíz, haba,
papa, agapando, follaje ornamental, y frutales como el tejocote, el capulín, la pera y la
manzana (Cruz y Alfaro, 2001).
De acuerdo a los diversos estudios que se han realizado en estos años, se
estableció que la bacteria llamada Pectobacterium carotovorum que proviene de los
cultivos de papa que se encuentran en la parte alta de los municipios de La Perla y
Emiliano Zapata, es la que afectó la producción de esta flor ornamental (Mejía, 2010).
La demanda de las flores cortadas y el follaje en los pueblos del Estado de
Veracruz depende principalmente de las fiestas tradicionales pero también es utilizada
como adorno en capillas, en salones para fiesta, también hay gran demanda en fechas
especiales como el día 14 de febrero y 10 de mayo (Cruz y Alfaro, 2001).
2.2
Generalidades del alcatraz (Zantedeschia sp)
2.2.1 Origen del alcatraz
El alcatraz es originario de Sudáfrica, se encuentra principalmente en las montañas de
Kenya, prefiere áreas húmedas y sombreadas con abundante agua (Cruz y Alfaro,
2001). Zantedeschia aethiopica está confinada a la costa sur y este que rodea
Sudáfrica, también se encuentra establecida en el sureste de las regiones montañosas
a altitudes superiores a 1000 msnm (Letty, 1973).
5
2.2.2 Posición Taxonómica
De acuerdo a Cruz y Alfaro (2001) el nombre científico Zantedeschia aethiopica (L) K.
Spreng, conmemora al sacerdote católico y físico italiano, Francesco de Zantedeschi,
quien nació en 1797 y murió en 1873. El alcatraz es una planta herbácea, que se cultiva
como ornamental por sus vistosas espatas de color blanco. Es una planta perenne, de
la familia de las Araceas, la más robusta y ampliamente naturalizada del género.
De acuerdo a NCBI Taxonomy.
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Liliopsida
Orden: Alismatales
Familia: Araceae
Género: Zantedeschia
Especie: Z. aethiopica
Nombre binomial: Zantedeschia aethiopica
Nombre común: Alcatraz Cala, cala de Etiopía, lirio de agua
2.3
Propagación del cultivo
2.3.1 Siembra de semilla
Se usa principalmente en programas de mejoramiento genético con el objetivo de
mejorar especies puras, de otro modo se puede diluir la pureza de la plantación. La
siembra se lleva a cabo en primavera para que en otoño se formen pequeños
tubérculos que requieren dos ciclos de crecimiento (Armitage, 1993).
6
2.3.2 División de rizoma
Esta técnica es la más utilizada para aumentar la disponibilidad del material vegetativo
(Armitage, 1993). La división es con navaja estéril antes de la plantación y se realiza en
rizomas maduros, que tengan por lo menos dos años, cortando las secciones
individuales en el punto de unión con el rizoma madre. También cortando el tubérculo
en secciones asegurándose que cada una posea al menos una yema latente (Chain,
2001).
2.3.3 Cultivo de tejidos
Este método se realiza principalmente en laboratorios que posean técnicas que
permitan una propagación rápida de un amplio rango de clones seleccionados,
asegurando material vegetal libre de virus y otra enfermedades que pudieran ocasionar
problemas a la propagación de este. Una vez fuera del laboratorio, se requieren dos
ciclos de crecimiento para formar un tubérculo con tamaño adecuado y tres años para
la floración (Armitage, 1993; Chain, 2001).
2.3.4 Desgajado
En base a lo descrito por Armitage (1993). Este método consiste en permitir la brotación
de los rizomas y separación de tallos cuando estos hayan producido raíces en su base.
2.4
Problemas fitosanitarios del alcatraz
El cultivo de Zantedeschia aethiopica no es atacado por un número significativo de
plagas y enfermedades, sin embargo a continuación se detallan algunos de las
principales enfermedades y sus agentes patogénicos.
7
2.4.1 Pectobacterium carotovorum
Los síntomas de esta bacteria causan una pudrición blanda en los rizomas, tallos y
raíces del alcatraz, con una errática emergencia de plántulas y caída de plántulas. El
tejido colapsado desprende un fuerte olor a podrido, por otro lado, se dice que no existe
cura química establecida para controlar los daños causados a nivel de plantación en
terreno pero que se puede prevenir con la desinfección correcta en el terreno donde se
va cultivar el alcatraz (Seemann y Andrade, 1999). P. corotovorum es una de las
principales causas de pérdidas económicas anuales fuertes (Chain, 2001).
2.4.2 Xanthomona campestris
Bajo condiciones de humedad se producen lesiones húmedas en las hojas, lo que
resulta en un colapso de estas. Bajo condiciones de sequedad en las hojas se producen
lesiones necróticas y clorosis (Seemann y Andrade, 1999).
2.4.3 Phytophthora erythroseptica
Esta especie causa una enfermedad cuyos síntomas son pudriciones de rizomas,
formando lesiones húmedas irregulares de color café oscuro en la superficie de estos.
El tejido infectado interno es de color gris, de una consistencia semejante al caucho e
inodoro. Se produce colapso en la emergencia de las plántulas (Seemann y Andrade,
1999).
2.4.4 Pythium spp.
En los tejidos infectados se producen lesiones de color rosado. Las lesiones de los
rizomas van incrementando su tamaño pero permanecen inodoras. Hay amarillez de
hojas, plantas atrofiadas y floración pobre (Seemann y Andrade, 1999).
8
2.4.5 Rhizoctonia spp.
Organismo causante de pudrición de rizomas en almacenaje y en los cultivos,
provocando un colapso en la emergencia de plántulas (Seemann y Andrade, 1999).
2.4.6 Penicillium spp.
Este hongo durante el almacenamiento produce un moho azul verdoso sobre la
superficie del rizoma. Se debe controlar condiciones de curado, y sumergir estos en
algún fungicida antes de su almacenaje (Seemann y Andrade, 1999).
2.4.7 Phytophthora erythroseptica
Existe una estirpe de esta especie que se caracteriza por producir tizón, necrosis,
perdida de turgencia, rizado y finalmente un colapso de las hojas. Los peciolos se
decolaran y luego sufren una pudrición blanda inodora. Los márgenes de la espata se
tornan amarillos y necróticos (Seemann y Andrade, 1999).
2.4.8 Alternaria spp. y Botrytis spp.
Causan daño a la flor durante su almacenaje y transporte, caracterizado pormanchas
negras en espata y márgenes de las hojas (Seemann y Andrade, 1999).
2.4.9 Virus del mosaico del alcatraz
Distorsión de hojas y flores y manchas circulares en las hojas (Seemann y Andrade,
1999).
9
2.4.10 Virus de la Marchitez y Moteado del tomate
Manchas que pueden ser de color amarillo o blanco en el follaje y flores (Seemann y
Andrade, 1999).
2.5
Importancia de la pudrición blanda causadas por bacterias
La pudrición blanda es una patología que se ha estudiado considerablemente en el
cultivo de la papa, sin embargo esta enfermedad no es exclusiva del cultivo y
representa un factor importante en cultivos como el alcatraz. Se caracteriza por la
maceración del tejido parenquimatoso, que termina en una pudrición húmeda. El olor
desagradable que frecuentemente acompaña a la pudrición es causado por organismos
secundarios, los cuales son particularmente activos a temperaturas superiores a los 25
0
C (Elphistone, 1987).
La pudrición puede iniciarse en las lenticelas o heridas y propagarse rápidamente
por el tejido afectado, en muchos casos, al momento de la cosecha, los tejidos
aparentemente sanos ya están infectados latentemente, estos no muestran síntomas,
pero llevan bacterias en la superficie (Elphistone, 1987).
Las especies bacterianas que afectan al rizoma del alcatraz son Ralstonia
solanacearum antes (Pseudomonas solanacearum), que casi siempre está asociada
con infección latente, Pectobacterium carotovorum ssp. atrosepticum, Pectobacterium
carotovorum ssp. carotovorum y Dickeya chrysanthemi (Syn.
Pectobacterium
chrysanthemi) que ocasionan la pudrición blanda.
2.5.1 Ralstonia solanacearum
Afecta más de 30 familias de plantas. Entre las más susceptibles se encuentran la
papa, el tabaco, el tomate, la berenjena, el ají, el pimiento, y en rizomas de alcatraz.
10
Esta bacteria es más dañina en regiones de climas tropicales, subtropicales y
templados donde puede ocasionar severas pérdidas en los cultivos (Martín, 1981).
La marchites bacteriana produce dos tipos de síntomas, síntomas aéreos que
ocasionan enanismo y amarillamiento del follaje. El amarillamiento es parecido al de
una planta bajo estrés, y los síntomas subterráneos que son más notorios debido a la
pudrición de los tubérculos y rizomas cuando las infecciones son severas (Martin,
1981).
2.5.2 Pectobacterium carotovorum
Los miembros del género Pectobacterium pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
(Toth et al., 2003), son bacilos rectos 0.7-1.5 µm, gram negativos, no esporulados,
móviles por flagelos perítricos. Son anaerobios facultativos, catalasa negativa y oxidasa
positiva. Las colonias son blancas, grises o amarillentas, con temperaturas óptimas de
cultivo de 27º C ± 10C (Pérombelon y Kelman, 1987).
P. carotovorum es la principal bacteria que ataca al alcatraz, provocando
importantes pérdidas económicas (Wright, 1998). Los síntomas causados por esta
bacteria son la pudrición húmeda en rizomas y raíces, una errática emergencia de las
plántulas, caída de las mismas y el colapso del pedúnculo de la flor cortada en
poscosecha (Welsh, 1991).
Están reportadas dos subespecies de P. carotovorum como causantes de dicha
enfermedad, P. carotovorum ssp. carotovorum y P. carotovorum spp. atrosepticum,
donde la principal arma que utilizan, es la producción de múltiples exoenzimas, como
las pectinasas, celulasas y proteasas, que dañan la pared celular. Las Pectinasas, en
especial la pectin transeliminasa o pectatoliasa (PL) y poligalacturonasa (PG), son las
principales exoenzimas relacionadas en el desarrollo de la enfermedad (Starr y
Chatterjee, 1972). Estas utilizan las pectinas de la lámina media y la pared celular,
causando el colapso del tejido (Pérombelon, 2002).
11
De acuerdo a Toth et al. (2003), estas bacterias se encuentran principalmente
sobre la superficie de las plantas o en el suelo. Las vías de penetración son a través de
heridas o de aperturas naturales en la superficie de la planta. Una vez dentro, estos
residen en el tejido vascular y espacio intracelular del tejido parenquimático.
2.5.2 Dickeya chrysanthemi (Syn. Pectobacterium chrysanthemi)
D. chrysanthemi es una bacteria Gram negativa, anaeróbica facultativa, con forma de
varilla, mide de 1.3-3.8 x 0.5-1 micras; por lo general solitarias, móviles con muchos
flagelos perítricos. Es oxidasa negativa, catalasa positiva, fermenta la glucosa y reduce
nitratos. La principal característica que distingue a la pudrición blanda de Dickeya de
otras especies del mismo género, es la capacidad para producir grandes cantidades de
enzimas pectolíticas que les permiten ablandar el tejido parenquimático de una amplia
gama de especies de plantas (CABI, 2011).
D. chrysanthemi es el patógeno de la pudrición suave, degrada órganos
suculentos de sus hospederos tales como rizomas, raíces, tubérculos y hojas gruesas.
También coloniza el xilema, convirtiéndose en una infección sistémica, causando
marchitez general. Este último aspecto es el más alarmante en la propagación
vegetativa ya que el patógeno puede permanecer latente y, por lo tanto, se puede
propagar. La bacteria puede sobrevivir en el suelo (en los desechos vegetales), por lo
que el riesgo de infección es latente entre cosechas (EPPO/CABI, 2011).
El desarrollo de la enfermedad se debe a la acción de enzimas extracelulares
producidas por estas bacterias como pectatoliasa, poligalacturonasa, celulasa y
proteasa, que degradan los componentes de la pared celular de las plantas, lo cual
conlleva a la maceración de los tejidos y la liberación de nutrientes para el crecimiento
bacteriano. La actividad de estas enzimas, principalmente de las pectatoliasas, ha sido
correlacionada con la patogenicidad y la virulencia de estas bacterias fitopatógenas
(Franco y Stefanova, 2008).
12
La alta humedad y la alta disposición del agua en el suelo, facilita la entrada de
bacterias a la planta, y su desarrollo se ve favorecido con altas temperaturas que van
de 25 a 30° C (EPPO/CABI, 2011).
Los síntomas característicos de D. chrysanthemi son: necrosis y colapso de los
tallos frecuentemente sobre los dos tercios superiores de las plantas afectadas, la
infección debilita al tallo y ocasiona una deformación y doblamiento de la parte terminal
(Ayvar et al., 1994).
13
III. HIPÓTESIS
• Si la pudrición blanda del rizoma y tallo de alcatraz (Zantedeschia aethiopica) son
causados por bacterias, entonces estas corresponderán a alguna especie de los
grupos de Enterobacterias o Pseudomonas.
• El uso de solución nutritiva de nitratos y fosfatos como fertilizante en el cultivo de
alcatraz propicia el potencial patogénico de bacterias saprófitas.
IV. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
• Aislar e Identificar las especies bacterianas causantes de pudrición blanda en
rizomas y tallos de Alcatraz (Zantedeschia aethiopica), correspondientes a un
trabajo experimental fertilizado con solución de nitratos y fosfatos.
4.2. Objetivos específicos
• Aislar in-vitro las bacterias causantes de pudrición blanda en alcatraz cultivado
en vivero y fertilizado con solución de nitratos y fosfatos.
• Comprobar la capacidad patogénica de los aislamientos bacterianos.
• Caracterizar las cepas bacterianas causantes de pudrición blanda mediante un
esquema de pruebas fisiológicas básicas.
14
V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Obtención de aislamientos bacterianos
Los aislamientos bacterianos se obtuvieron a partir de plantas de alcatraz
(Zantedeschia aethiopica) que presentaban pudrición blanda en tallo y rizoma. Estas,
pertenecían a un proyecto de investigación bajo la responsabilidad del M.C. José
Antonio Contreras Jiménez de la Facultad de Ciencias Agrícolas, U.V., donde se
evaluaba la respuesta de la planta a la aplicación de un programa de fertilización
basado en nitratos y fosfatos.
Las plantas se llevaron al Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa (LATEX)
para realizar el estudio del agente causal del daño. Para ello, se siguieron las
recomendaciones de Schaad et at. (2001), bajo el siguiente procedimiento:
 Los rizomas y tallos fueron lavados con agua corriente y posteriormente,
enjuagados con agua destilada, durante 5 minutos; a continuación se desinfectaron
con hipoclorito de sodio comercial al 1% (v/v) por 1 minuto y se enjuagaron con agua
destilada estéril.
 Con un asa bacteriológica, se tomó material de la periferia del tejido
dañado, el cual fue depositado en cajas Petri con medio B de King (KB).
 Las cajas fueron incubadas a 27ºC ± 1ºC hasta obtener un crecimiento
bacteriano considerable.
 Se llevó a cabo el aislamiento de las distintas morfologías coloniales por
agotamiento de estría; este proceso se repitió hasta obtener cepas bacterianas
puras.
5.2
Pruebas de patogenicidad
Se realizaron pruebas fisiológicas de patogenicidad en tallos, rizomas y plantas de
alcatraz, con la finalidad de elegir las cepas bacterianas con capacidad de provocar
pudriciones blandas. Para ello se llevó a cabo lo siguiente:
5.2.1 Preparación del tejido vegetal
15
Para llevar a cabo las pruebas fisiológicas se seleccionaron tallos y rizomas sanos, los
cuales fueron lavados con agua corriente y con agua destilada estéril; posteriormente
fueron desinfectados con hipoclorito de sodio comercial al 1% (v/v) por 2 minutos y
enjuagados con agua destilada estéril por 3 minutos(Schaad et al., 2001).
5.2.2 Preparación de suspensiones bacterianas
A partir de las cepas bacterianas previamente obtenidas, se prepararon suspensiones
de la forma siguiente: se tomó crecimiento bacteriano y se mezcló en tubos de vidrio de
10 ml, que contenía agua destilada estéril, hasta alcanzar una concentración de 0.5 de
Mcfarland (1.2 X 108ufc/ml) (Gradwonhl´sclinicallaboratorymethods, 1980).
5.2.3 Preparación de solución nutritiva
La solución nutritiva tuvo la siguiente composición (Cuadro 1)
Cuadro 1. Composición química de solución nutritiva
empleada en la fertilización de alcatraz.
Componentes
Cantidad para 2 L
Fosfato diamónico
0.6 g
Sulfato de magnesio
1.4 g
Nitrato de calcio
3.3 g
Nitrato de potasio
2.9 g
*Agua destilada estéril
Las pruebas de patogenicidad se llevaron a cabo por medio de los siguientes
métodos:
5.2.4 Inmersión de tallos en suspensiones bacterianas
Esta prueba fue un ensayo preliminar para seleccionar aquellas cepas
bacterianas capaces de ocasionar pudrición blanda en alcatraz, para lo cual se
colocaron tallos de 5 cm en frascos de vidrio (Figura 2) que contenían los tratamientos
16
descritos en la (Cuadro 2) El experimento se realizó por duplicado, y se mantuvo a 22
°C, por 48 horas (Khaled, 2007).
Figura 2. Prueba de patogenicidad mediante la inmersión de tallos en suspensión
bacteriana (Fotografía tomada por Ortiz, M. 2012).
Cuadro 2. Tratamientos empleados en la prueba de patogenicidad mediante
inmersión de tallos en suspensión bacteriana.
Tratamiento
Descripción
1
5 ml de suspensión bacteriana + 12.5 ml de solución nutritiva +
8.5 ml de agua destilada estéril.
2
25 ml de solución nutritiva.
Testigo
25 ml de agua destilada estéril.
Nota: se colocaron dos tallos de alcatraz por frasco.
5.2.5 Inmersión de rizomas en suspensiones bacterianas, causantes
de pudrición blanda.
Aquellas cepas que generaron pudrición blanda de tallo fueron empleadas para
evaluar su patogenicidad en rizomas, utilizando frascos de vidrio que contenían los
tratamientos que se describen en la (Cuadro 3). Los en sayos se llevaron a cabo por
duplicado y se mantuvieron en charolas a 24 °C por 48 h, cubiertos con poli-papel para
controlar condiciones de temperatura y humedad (Figura 3).
17
Figura 3.Tratamientos empleados para la prueba de patogenicidad mediante la
inmersión de rizomas en suspensiones bacterianas (Fotografía tomada por Ortiz,
M. 2012).
Cuadro 3. Tratamientos empleados para la prueba de patogenicidad mediante
inmersión de rizomas en suspensiones bacterianas.
Tratamiento
Descripción
1
40 ml Solución nutritiva + 10 ml suspensión bacteriana + 8.5 ml de
agua destilada estéril.
2
10 ml de suspensión bacteriana + 40 ml de agua destilada estéril.
3
50 ml de solución nutritiva.
Testigo
50 ml de agua destilada estéril.
Nota: se colocaron dos rizomas de alcatraz por frasco.
5.2.6 Respuesta en tallo por inoculación de suelo, con aislamientos
bacterianos causantes de pudrición.
En vasos de unicel (# 8) se colocaron 120 g de suelo estéril y un tallo de 5 cm de
longitud (Figura 4), donde se aplicaron los tratamientos descritos en la (Cuadro 4). La
suspensión bacteriana que estaba a una concentración de 0.5 de acuerdo a la escala
Mcfarland, se aplicó al inicio del experimento y a las 76 h. Los ensayos fueron puestos
bajo condiciones de vivero a 22 °C, por duplicado.
18
Figura 4. Prueba de patogenicidad de tallos de alcatraz en vivero (Fotografía tomada
por Ortiz, M. 2012).
Cuadro 4. Tratamientos empleados para la prueba de patogenicidad
mediante inoculación de tallos en suelo, en condiciones de vivero.
Tratamientos
1
2
Testigo
Descripción
5 ml de suspensión bacteriana + 12.5 ml de solución nutritiva
+ 8.5 ml de agua destilada estéril.
25 ml de solución nutritiva.
25 ml de agua destilada estéril.
5.2.7 Prueba de patogenicidad en plantas de alcatraz
Se utilizaron 80 plantas de dos meses de edad, con 20 cm de altura, aproximadamente
(Figura 5), provenientes de la localidad de Allende, Municipio de Altotonga, Ver. Estas
se sembraron en bolsas de plástico con suelo de la localidad y fueron llevadas a
LATEX para la realización del experimento, como se indica en la (Cuadro 5). Las
plantas fueron inoculadas alrededor del cuello, por una suspensión bacteriana; los
tratamientos se mantuvieron en vivero a temperatura ambiente por 15 días, con cinco
réplicas.
19
Figura 5. Plantas de alcatraz utilizadas en pruebas de patogenicidad por inoculación
de suspensiones bacterianas (Fotografía tomada por Ortiz, M. 2012).
Cuadro 5. Tratamientos empleados para la prueba de patogenicidad mediante
inoculación de plantas en suelo, bajo condiciones de vivero.
Tratamiento
1
40 ml de solución nutritiva + 10 ml de suspensión bacteriana.
2
40 ml de agua destilada estéril + 10 ml de suspensión bacteriana.
3
50 ml de solución nutritiva.
Testigo
5.3
Descripción
50 ml de agua destilada estéril.
Pruebas para la identificación de bacterias causantes de la
pudrición blanda en alcatraz
Para la identificación preliminar de las especies bacterianas causantes de la pudrición
blanda en alcatraz, se aplicó un esquema de pruebas bioquímicas y de tinción, de
acuerdo a las recomendaciones de Schaad et al. (2001), estas fueron las siguientes:
5.3.1 Tinción Gram
La tinción de gram consistió en esparcir una muestra de cultivo bacteriano (de 24 a 48
h), sobre un portaobjetos limpio, siendo cubierto con solución A durante un minuto;
20
posteriormente se lavó el portaobjetos con agua destilada, se secó y cubrió con
solución lugol, por 2 min. Una vez transcurrido el tiempo de reposo, este se lavó y se
adicionó solución decolorante por 30 s; a continuación se lavó el decolorante, se aplicó
solución de safranina y se dejó por 10 min; después de este tiempo el portaobjetos fue
llevado a un microscopio compuesto para observar las tinciones realizadas, donde
células Gram positivas quedan teñidas de violeta azul obscuro y las Gram negativas, de
rosa-rojo.
5.3.2 Oxidación y fermentación de glucosa
Para la determinación del crecimiento anaeróbico facultativo de los aislamientos
bacterianos se preparó el medio Hugh & Leifson. Se inoculó un tubo de vidrio con una
asada de cultivo microbiano, de resiembras de 24 h; posteriormente se agregó 1 ml de
aceite mineral estéril, y se incubó a 28 ºC por 24 h. Se ocupó un tubo testigo insertando
el asa microbiológica sin inoculo bacteriano, adicionado con aceite mineral. La prueba
se llevó a cabo por duplicado.
5.3.3 Actividad de la enzima citocromo-oxidasa
Para esta prueba se cortó papel filtro de 2 cm2, al cual se le agregaron 2 gotas de
solución citocromo-oxidasa y con un palillo de madera, previamente impregnado con
una muestra de crecimiento bacteriano de resiembras de 24 h, se mezcló con la
solución sobre el papel filtro. La prueba se consideró positiva si, al cabo de 20
segundos, adquiría una coloración rosa o roja púrpura.
5.3.4 Actividad de la enzima catalasa
En 1 ml de agua destilada, se disolvió 0.01 ml de peróxido de hidrógeno no;
posteriormente en una caja Petri, se colocó una asada de cultivo bacteriano y se
21
mezcló con dos gotas de la solución. La prueba se consideró positiva si, al cabo de 20
segundos, se formaban burbujas de gas.
5.3.5 Reducción de nitratos
Se inocularon cultivos bacterianos, por punción, en tubos de ensayo que contenían
medio para reducción de nitratos, posteriormente se adicionó 1 ml de aceite mineral
estéril, y se colocó un tapón. La prueba se consideró positiva si había crecimiento
bacteriano.
5.3.6 Licuefacción de gelatina
Se inocularon cepas bacterianas, por punción, en tubos de ensayo que contenían
medio para licuefacción de gelatina. La prueba se consideró positiva si el medio obtenía
una consistencia liquida.
5.4 Reacciones bioquímicas para diferenciar especies de la familia
Enterobacteriaceae
5.4.1 Crecimiento a 37 ºC
Se preparó caldo YS el cual fue vaciado a tubos de vidrio, estos se esterilizaron a 121ºC
por 15 min. A una presión de 15 libras. Posteriormente se inocularon cepas bacterianas,
por punción, en tubos de ensayo que contenían el medio. La prueba se consideró
positiva sí había crecimiento bacteriano a una temperatura de 37 ºC.
5.4.2 Azúcares reductores de sacarosa
Para esta reacción se disolvió un gramo de peptona y 1.7 g de agar bacteriológico en
80 ml de agua destilada estéril, se esterilizó a 1210C durante 15 minutos.
22
Posteriormente se disolvieron 4 g de sacarosa en 20 ml de agua destilada estéril y se
metieron a la autoclave a 108 °C por 10 minutos. Se estriaron las cajas Petri y se
incubaron a 270C por 48 horas. Transcurrido este tiempo se agregaron 5 ml de la
solución Benedict por caja. La prueba se consideró positiva, sí al término de 5 minutos
se formaba una mancha naranja alrededor de la cepa bacteriana.
5.4.3 Sensibilidad a la eritromicina (disco 15 µg)
Para esta reacción se pesaron 3 mg/ml de eritromicina, posteriormente se disolvió en
0.5 ml de etanol y en 0.5 ml de agua destilada estéril en un recipiente previamente
esterilizado. A continuación se prepararon los sensi-discos de eritromicina (15
µg/disco), de papel filtro de 7 mm de diámetro, estos se esterilizaron a 121 0C por 15
minutos. Por último se adicionó 1 µL de la solución de eritromicina por disco y se dejó
secar, para que se colocaran en las cajas con el medio agar nutritivo. La prueba se
consideró positiva sí la eritromicina inhibía a la bacteria formando un halo alrededor del
disco.
5.4.4 Producción de indol
Se preparó el medio líquido producción de indol, el cual fue vaciado a tubos de vidrio,
estos se esterilizaron a 1210C por 15 min. Posteriormente se inocularon cepas
bacterianas, por punción, en tubos de ensayo que contenían el medio, posteriormente
se Incubaron a 27 °C durante 48 h. Después de este lapso se le adicionó 0.3 ml de
reactivo kovac, por último se agitaron moderadamente. La prueba se consideró positiva
sí hubo presencia de anillo rojo en la superficie.
5.5 Identificación de especies Pseudomonales
5.5.1 Levana
Se preparó el medio agar nutritivo más sacarosa al 5%. Se distribuyó en cajas Petri y
posteriormente se esterilizó a 121 0C durante 15 min. Las cajas fueron estriadas por
23
picadura con asa bacteriológica. La prueba se consideró positiva si la cepa bacteriana
formaba una capa gruesa sobre el medio.
5.2.2 Dihidrolasa de Arginina
Se preparó el medio líquido Arginina, el cual fue vaciado a tubos de vidrio, estos se
esterilizaron a 1210C por 15 min. Posteriormente se inocularon cepas bacterianas, por
punción, en tubos de ensayo que contenían el medio. Por último se les adicionó 1 ml de
aceite mineral estéril para generar anaerobiosis y se incubo durante 74 h. La prueba se
consideró positiva cuando el indicador rojo de fenol viró de rosa a violeta, debido a la
alcalinidad del medio para la acumulación del amoniaco.
5.2.3 Prueba de hipersensibilidad en tabaco
La solución bacteriana se preparó con crecimiento bacteriano activo (24-48 h). Estas
se adicionaron a 8 ml de agua destilada estéril haciendo comparaciones periódicas con
los tubos: 0.5 de acuerdo a la escala Mc Farland, 1.2 X 108 ufc/ml.
Con una jeringa estéril se infiltró una cantidad suficiente de la suspensión
bacteriana en el espacio intercelular del tejido foliar de planta de tabaco. Las plantas se
mantuvieron con temperaturas entre 16-280C por 5 días. La prueba se consideró
positiva cuando hubo necrosis en la zona infiltrada.
5.2.4 Prueba de pudrición en papa
Se desinfectó el tubérculo de papa con agua corriente y agua destilada por 2 minutos,
posteriormente se colocó la papa en hipoclorito de sodio al 1% (v/v) durante 2 minutos,
por último se enjuagó con agua destilada estéril.
El tubérculo se cortó en rodajas y cuatro de éstas se colocaron en una charola
sobre una sanita húmeda con agua estéril. Por último, se estrió la cepa bacteriana
activa (24-48 h) sobre dos de las rodajas, dejando dos rodajas sin inoculo como testigo.
La prueba se consideró positiva cuando la papa mostró síntomas de pudrición blanda.
24
VI. RESULTADOS
6.1 Aislamientos bacterianos
Se obtuvieron 14 aislamientos bacterianos, a partir de tejidos de dos plantas de alcatraz
que presentaron daños por pudrición blanda (Cuadro 6)
Cuadro 6. Clave y especificación del órgano de la planta de
alcatraz de donde fue obtenido cada aislamiento bacteriano.
Clave del aislamiento
bacteriano
TU P1-A
TU P1-B
TU P1-C
TU P1-D
TU P2-A
TU P2-B
TU P2-C
TA P1-A
TA P1-B
TA P1C
TA P2-A
TA P2-B
TA P2-C
TA P2-D
Descripción
Rizoma de la planta 1-A
Rizoma de la planta 1-B
Rizoma de la planta 1-C
Rizoma de la planta 1-D
Rizoma de la planta 2 –A
Rizoma de la planta 2 –B
Rizoma de la planta 2 –C
Tallo de la planta 1 –A
Tallo de la planta 1 –B
Tallo de la planta 1 –C
Tallo de la planta 2 –A
Tallo de la planta 2 –B
Tallo de la planta 2 –C
Tallo de la planta 2 –D
6.2 Pruebas de patogenicidad
6.2.1 Inmersión de tallos en suspensión bacteriana
En este experimento se probaron los 14 aislamientos bacterianos obtenidos de plantas
de alcatraz con síntomas de pudrición, observando que sólo siete de ellos ocasionaron
pudrición blanda (Cuadro 7). El tratamiento que contenía las suspensiones bacterianas
fueron las que presentaron pudriciones, después de 24 h, por otro lado los testigos no
presentaron cambios.
25
Cuadro 7. Resultados de la prueba de patogenicidad de tallos inmersos en
suspensiones bacterianas.
Aislamientos
Solución
Solución
Testigos No. de
Clasificación
Bacterianos
Nutritiva Bacteriana + agua
tallos con general del
Solución
pudrición
daño
Nutritiva
TU P1-B
N/P
P/B
N/P
2
+++
TU P1-C
N/P
P/B
N/P
2
++++
TU P2-A
N/P
P/B
N/P
2
++
TA P1-A
N/P
P/B
N/P
1
+
TA P1-B
N/P
P/B
N/P
2
++
TA P2-B
N/P
P/B
N/P
0
+
P/B: Pudrición blanda; N/P: No presentó; (-): No dañado, +: Levemente
dañado, ++: Moderadamente dañado, +++: Medianamente dañado, ++++:
Completamente dañado.
Debido a los resultados obtenidos en este ensayo, para las pruebas posteriores
se utilizaron únicamente los siete aislamientos bacterianos causantes de pudrición.
6.2.2 Inmersión de rizomas en suspensión bacteriana
Seis de los siete aislamientos bacterianos que causaron pudrición blanda en tallo fueron
causantes de pudrición en rizomas (Cuadro 8) después de 48 h.
26
Cuadro 8. Resultados de la prueba de patogenicidad de rizomas inmersos
en suspensiones bacterianas.
Bacterias
Solución
Solución Bacteriana Solución Testigos
Nutritiva + Solución Bacteriana
agua
Nutritiva
No. De
rizomas
con
pudrición
Clasificación
general del
daño
TU P1-A
N/P
P/B
P/B
N/P
4
++++
TU P1-B
N/P
P/B
P/B
N/P
4
++
TU P1-C
N/P
P/B
P/B
N/P
4
++
TU P2-A
N/P
P/B
P/B
N/P
4
++
TA P2-B
N/P
P/B
P/B
N/P
4
++
TA P2-D
N/P
P/B
P/B
N/P
4
+++
P/B: Pudrición blanda; N/P: No presentó; (-): No dañado, +: Levemente dañado, ++:
Moderadamente dañado, +++: Medianamente dañado, ++++: Completamente
dañado.
6.2.3 Inoculación de tallos en suelo
Únicamente cinco aislamientos bacterianos ocasionaron pudrición blanda de tallos en el
experimento en suelo (Cuadro 9). Las observaciones se hicieron por cinco días, que fue
el tiempo que tardó la bacteria en provocar síntomas en el tejido vegetal.
Cuadro 9. Aislamientos bacterianos responsables de pudrición de tallos por
inoculación en suelo.
Bacterias
Solución
Nutritiva
Suspensión
Bacteriana +
Solución
Nutritiva
Testigos
agua
No. de
tallos con
pudrición
Clasificación
general del
daño
TU P1-A
N/P
P/B
N/P
3
++
TU P1-B
N/P
P/B
N/P
4
+++
TU P1-C
N/P
P/B
N/P
4
+++
TA P1-A
N/P
P/B
N/P
4
+++
TA P2-D
N/P
P/B
N/P
3
+
P/B: Pudrición blanda; N/P: No presentó; (-): No dañado, +: Levemente dañado, ++:
Moderadamente dañado, +++: Medianamente dañado, ++++: Completamente
dañado.
27
6.2.4 Respuesta de patogenicidad en plantas de alcatraz
Cuatro aislamientos bacterianos fueron causantes de pudriciones blandas en rizomas y
tallos en plantas (Cuadro 10).
Cuadro 10. Patogenicidad de aislamientos bacterianos en plantas de alcatraz.
Solución
Nutritiva
Solución
Bacteriana
+ Solución
Nutritiva
Solución
Bacteriana
U P1-A
N/P
P/B
P/B
N/P
5
++
TU P2-A
N/P
P/B
P/B
N/P
5
+
TA P2-B
N/P
P/B
P/B
N/P
6
++
TA P2-D
N/P
P/B
P/B
N/P
8
+++
Bacterias
No. de
Testigos
plantas con
agua
pudrición
Clasificación
general del
daño
P/B: Pudrición blanda; N/P: No presentó; (-): No dañado, +: Levemente dañado, ++:
Moderadamente dañado, +++: Medianamente dañado, ++++: Completamente dañado.
6.3 Pruebas bioquímicas básicas para la identificación de bacterias
causantes de la pudrición blanda en alcatraz.
De acuerdo a los resultados de las reacciones bioquímicas básicas aplicadas a los
aislamientos bacterianos, la cepa TA P2-B pertenece a la familia Pseudomonaceae, al
dar positivo a la producción de un pigmento fluorescente en medio KB y negativo al
crecimiento anaerobio en medio Hugh & Leifson. Las 6 cepas restantes fueron
negativas para citocromo oxidasa y positivas al crecimiento anaeróbico fermentando la
glucosa, por lo que se considera que pertenecen a la familia Enterobacteraceae
(Cuadro 11).
28
Cuadro11. Pruebas bioquímicas básicas para la identificación del género de los
aislamientos bacterianos causantes de pudriciones blandas en alcatraz.
Reacciones
Cepas bacterianas
bioquímicas
TU
TU
TU
TU
TA
TA
TA
P1-A
P1-B
P1-C
P2-A
P1-A
P2-B
P2-D
Producción de
citocromo-oxidasa
-
-
-
-
-
+
-
Catalasa
-
-
-
-
-
-
-
Tinción gram
-
-
-
-
-
-
-
Reducción de nitratos
+
+
+
+
+
-
+
Licuefacción de gelatina
-
-
+
-
+
-
-
Crecimiento anaerobio
en el medio Hugh &
Leifson
Producción pigmento
fluorescente en KB
+
+
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
+
-
6.4 Reacciones bioquímicas para identificar bacterias pertenecientes
a la familia Enterobacteriaceae.
De acuerdo a los resultados de las reacciones bioquímicas (Cuadro 12) y lo establecido
por Schaad et al. (2001), la cepa bacteriana TA P1-A pertenece a la especie
Pectobacterium chrysanthemi (Syn. Dickeya spp.), mientras que TU P1-B, TU P1-C, TU
P2-A, TA P1-A y TA P2-D pertenecen a la especie Pectobacterium carotovorum. Las
pruebas cruciales para la determinación de estas especies fueron las de sensibilidad a
eritromicina y producción de Indol.
29
Cuadro 12. Reacciones bioquímicas para la identificación de las especies
Pectobacterium carotovorum y Pectobacterium chrysanthemi.
Reacciones
Bioquímicas
Cepas bacterianas
Especies
TU
TU
TU
TU
TA
TA
Pectobacterium Pectobacterium
P1-A
P1-B
P1-C
P2-A
P1-A
P2-D
carotovorum
chrysanthemi
(Dickeya sp.)
0
Crec. 37 C
+
+
+
+
+
+
+
+
Azucares
-
-
-
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
-
+
reductores
de sacarosa
Sensibilidad
eritromicina
(15 µg)
Indol
6.5
Reacciones
bioquímicas
para
diferenciar
especies
de
Pseudomonas
De acuerdo a los resultados de las reacciones bioquímicas y a lo establecido por
Schaad et al. (2001) (Cuadro 13), la cepa bacteriana TA P2 –B mayoritariamente se
asemeja a la especie Pseudomonas marginalis.
30
Cuadro 13. Reacciones bioquímicas básicas para diferenciar especies de
Pseudomonas fitopatógenas.
Reacción bioquímica
Cepa bacteriana
Resultados establecidos
para
TA P2-B
Pseudomonas marginalis
Levana
-
+
Oxidasa
+
+
Pudrición en papa
+
+
Arginina
+
+
Respuesta de
-
+/- (Variable)
hipersensibilidad
31
VII. DISCUSIÓN
Con base en los resultados para la identificación de las especies que corresponde a
cada aislamiento bacteriano, las reacciones bioquímicas aplicadas a TU P1-B y TA P2D no fueron contundentes, sin embargo todas ellas apuntan a que pudieran pertenecer
a Pectobacterium carotovorum, por lo cual se recomienda hacer pruebas moleculares
para su identificación. Esto también aplica para la cepa TAP2-B, que pertenece al
género Pseudomonas, que presentó inconsistencia en los resultados, y que con los
datos arrojados en este estudio se asemeja a Pseudomonas marginalis.
Aunado a ello, el género actualmente conocido como Dickeya spp., correspondía
anteriormente a Pectobacterium chrysanthemi con sus respectivas subespecies, hoy en
día este género ha venido evaluándose mediante técnicas moleculares de ADN, dado
que las bacterias presentan un amplia diversidad fenotípica y genotípica, para ello es
necesario realizar la identificación no solo bioquímica y fisiológica sino también
molecular basada principalmente en la secuencia del gen 16s rRNA. Con base en los
estudios iniciales de las relaciones filogenéticas en base al análisis de ADN, D.
chrysanthemi podría dividirse en cuatro grupos relacionados genéticamente como D.
dieffenbachia, D. chrysanthemum, D. morifolium y D. parthenium (Samson et al., 2005).
El hecho de encontrar consorcios bacterianos ocasionando algunas patologías
no es nuevo, de acuerdo con Luna-Rodríguez et al. (2009) quienes encontraron a P.
carotovorum y Pectobacterium chrysanthemi causando pudriciones blandas en
Cucurbita pepo en un cultivo establecido en el estado de Veracruz, o bien a GarcíaEstrada et al. (2008) quien aisló e identificó a Erwinia carotovora subsp. carotovora a
partir del cultivo de Chile bell en Culiacán Sinaloa.
Según CABI (2011) la enfermedad causada por D. chrysanthemi y P.
carotovorum generalmente se presenta en forma severa en órganos de plantas
suculentas con altas temperaturas, alta humedad y altos niveles de nitrógeno, esto
pudiera explicar lo encontrado en este estudio, donde la adición de la solución nutritiva
basada en nitratos potenció la expresión de la enfermedad. Otro factor importante es el
32
exceso de agua ya que permite que las células bacterianas se muevan fácilmente a
través del tejido de la planta, además de llevar a una disminución en la disponibilidad de
oxígeno, lo que crea un ambiente anaeróbico dentro de la planta limitando sus defensas
dependientes de oxígeno (Toth et al., 2003). Los autores también indican que los
síntomas son destructivos a temperaturas iguales o por encima de 28° C, y que las
plantas pueden permanecer asintomáticas o con síntomas leves a temperaturas
inferiores a 20° C.
El género Pseudomonas fue establecido y caracterizado principalmente por
morfología y metabolismo (Moore et al., 1996). Comprende alrededor de 200 especies,
siendo uno de los grupos con mayores especies bacterianas de importancia fitosanitaria
(alrededor de 25 especies). La fitopatogenia de las Pseudomonas causa numerosas
enfermedades en plantas afectando varios tipos de estructuras vegetales, entre las que
destacan hojas, ramas y flores, con diversos síntomas como: pudriciones blandas,
tumores, marchitamiento, etc. Los síntomas más frecuentes causados por P. marginalis
pv. marginalis corresponden a necrosis marginal de las hojas, donde las áreas
necróticas tienen una consistencia acuosa, en un comienzo, para volverse secas una
vez avanzada la enfermedad.
Hay datos donde P. marginalis es el principal agente causal de pudrición blanda
en la familia de las Araceas y Cucurbitaceas, como lo reportado por Krejzar et al. (2008)
quienes encontraron a P. marginalis, P. carotovorum subsp. carotovorum y
Pseudomonas putida causando pudriciones blandas en rizomas de Zantedeschia spp.
O bien, Schollenberger et al. (2005) quienes aislaron e identificaron a P. marginalis en
plantas hospederas de Philodendron scandens subsp. oxycardium. Por otra parte,
Jinhua-Li et al. (2007)
identificaron a Pseudomonas marginalis pv. marginalis por
métodos fisiológicos y moleculares (16 S rDNA secuencia), como la causante de
pudrición blanda bacteriana en papa (Solanum tuberosum).
De acuerdo con lo anterior y en los resultados obtenidos en esta investigación,
se puede decir que P. marginalis es una de las principales bacterias que ataca a las
familia de las aráceas, y aunque en México no existen reportes de que microorganismo
33
cause pudrición blanda en alcatraz, en República Checa fue aislada e identificada a
partir de plantas sintomáticas en alcatraz (Krejzar, 2008).
Con base en los aislamientos obtenidos
y a las reacciones bioquímicas
aplicadas a la cepa TU P2-A, se infiere que ésta corresponde al grupo de P. marginalis,
lo que hace interesante su pronta identificación apoyada en herramientas moleculares,
ya que esta reportado que esta bacteria ataca principalmente al cultivo de piña y papa
(Krejzar, 2008). En México para la familia de las aráceas no se considera una bacteria
de gran importancia, sin embargo, en este trabajo de investigación fue la bacteria que
provocó mayor severidad de pudrición blanda en plantas sanas de alcatraz, aunque
esto deberá ser confirmado mediante el establecimiento de investigación en cultivos
establecidos o bien en poblaciones naturales.
34
VIII. CONCLUSIÓN
De los 14 aislamientos obtenidos solo 7 ocasionaron pudrición blanda en los 4
diferentes métodos que se utilizaron, la pudrición blanda se presentó principalmente en
el tratamiento con suspensión bacteriana más solución nutritiva a base de nitratos y
fosfatos, por lo que se infiere que estos, son detonantes que favorecen el desarrollo de
las poblaciones saprófitas de Pectobacterium y Pseudomonas que cohabitan con el
alcatraz potencializando su poder patogénico.
De este modo, se observó que un consorcio de especies de Enterobacterias y
Pseudomonas está involucrado simultáneamente con el desarrollo de pudriciones
blandas en el alcatraz.
Es necesario aplicar herramientas de diagnóstico complementarias que refuercen
la identificación de Pseudomonas marginalis, Pectobacterium carotovorum y Dickeya
sp. como las especies bacterianas responsables de la pudrición blanda del alcatraz
favorecida por el uso de solución nutritiva de nitratos y fosfatos, así como, el establecer
proyectos de investigación en cultivos establecidos o bien en poblaciones naturales de
alcatraz.
35
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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39
ANEXO I
Materiales y Método
Tinción Gram
Solución A, la cual se constituye de una mezcla de Cristal violeta y alcohol etílico al
(95%), con Oxalato de amonio. Estas se almacenaron durante 24 h. Posteriormente se
preparó la
solución Lugol, la cual está compuesta por yodo y yoduro de potasio
(disueltos en agua destilada) estos se
mantuvieron en condiciones de obscuridad
aproximadamente 12 h.
En seguida se preparó la solución decolorante con alcohol etílico al 95%, acetona y
acetona alcohol relación 1:1.
Por último se preparó la solución Stok a base de safranina O y alcohol etílico más agua
destilada estéril.
A) Oxidación y fermentación de glucosa.
Componentes del medio Hugh & Leifson.
Componentes
Medio de cultivo base medio OF
Cantidad
1.88 g
de Hugh & Leifson
Aceite mineral
Agua destilada
1 Ml
200
B) Reducción de nitratos
Medio para reducción de nitratos.
Composición química del medio empleado para el
crecimiento de las cepas bacterianas.
Componentes
Extracto de levadura
KNO3
NH4 H2 PO4
KCl
Mg SO4. 7 H2O
Aceite mineral
Agua destilada
Cantidad
0.4 g
0.24 g
0.08 g
0.016 g
0.016 g
0.8 ml
80 ml
40
A) Licuefacción de gelatina
Composición química del medio Licuefacción de gelatina
empleado para el crecimiento de las cepas bacterianas
Componentes
Para Cantidad
Extracto de carne
0.75 g
Peptona
1.25 g
Gelatina
30 g
Agua destilada
250 m L
B) Crecimiento a 37 °C
Composición química del medio (YS) empleado para el
crecimiento de las cepas bacterianas
Componentes
Para 250 mL
NH4 H2PO4
0.125 g
K2 HPO4
0.125 g
Mg SO4 7H2
0.05 g
Na Cl
1.25 g
Extracto de levadura
1.25 g
Agua destilada
250 mL
C) Producción de indol
Para esta reacción se preparó el medio líquido.
Composición química del medio Líquido empleado para el
crecimiento de las cepas bacterianas
Componentes
Para 80 mL
Polipeptona
0.8 g
Cloruro de sódio (Na Cl)
0.4 g
Agua destilada
80 mL
41
D) Arginina
Para esta reacción se preparó el medio de Arginina (Thornley, 1969).
Composición química del medio Arginina para el crecimiento
de las cepas bacterianas.
Componentes
Peptona
Na Cl
K2HPO4
Rojo de fenol
L(+) Hidrocloruro de arginina
Agar
Agua destilada
Cantidad
0.03 g
0.15 g
0.009 g
0.009 g
0.3 g
0.3 g
25 mL
42
ANEXOS II
Resultados
Aislamientos bacterianos obtenidos
Figura 1. Aislamientos bacterianos que causaron pudrición blanda en rizomas, tallos y
plantas de alcatraz.
1. Inmersión de tallos en suspensión bacteriana
Figura 2. Actividad patogénica de los aislamientos obtenidos en tallos en solución de
alcatraz.
2. Inmersión de rizomas en suspensión bacteriana
Figura 3. Actividad patogénica de los aislamientos obtenidos en rizomas de alcatraz.
43
3. Inoculación de tallos en suelo
Figura 4. Actividad patogénica de los aislamientos obtenidos en tallos de alcatraz en
suelo.
4. Respuesta de patogenicidad en plantas de alcatraz
Figura 5. Testigo
Figura 6. Actividad patogénica de los aislamientos obtenidos en plantas de alcatraz en
suelo.
44
ANEXO III
Reacciones bioquímicas para los géneros de las familias de Enterobacterias y
Pseudómonas.
A
B
E
F
C
D
G
Figura 7. La cepa TU P2-A (c) salió negativa al crecimiento anaerobio Hugh & Leifson,
las cepas restantes salieron positivas.
Actividad de la enzima citocromo-oxidasa
A
F
B
C
D
E
G
Figura 8. La cepa bacteriana TA P2 –B (B) salió positiva a la reacción Citocromo
oxidasa, las cepas restantes dieron negativas.
45
ANEXO IV
Crecimiento a 37 ºC
A
E
B
C
D
F
Figura 9. Las cepas salieron positivas al crecimiento a 37 ºC
Azúcares reductores de sacarosa
Figura 10. Cepa TA P2 –D dio positiva a la reacción azucares reductores de sacarosa,
las cepas restantes fueron negativas.
Sensibilidad a la eritromicina (disco 15 µg)
Figura 11. Cepa TU P1-B salió positiva a la sensibilidad a la eritromicina, las cepas
restantes, salieron negativas.
46
Producción de indol
A
E
C
B
D
F
Figura 12. Las cepas TA P2 –D (A), TU P1 –A (E), y TU P1 –B, positivas ala producción
de indol.
47
ANEXO V
Identificación de especies Pseudomonales
Levana
Figura 13. Cepa negativa a la reacción de levana.
Dihidrolasa de Arginina
Figura 14. Cepa TU P2 –B positiva a la reacción Dihidrolasa de Arginina
Prueba de pudrición en papa
Figura 14. Prueba de pudrición en tubérculos de papa la prueba fue positiva, con daños
notorios en los tubérculos de papa.
48
Prueba de hipersensibilidad en tabaco
A
B
Figura 15. Reacción de hipersensibilidad en plantas de tabaco. B) planta testigo en la
que sólo se inoculó agua destilada estéril y A) se inoculo con la cepa bacteriana, la cual
dio negativa.
49