Enzimas de Restricción Las enzimas de restricción, también

Enzimas de Restricción
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que
cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que
reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).Son extraídas de
organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para
degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad
de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio.
Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el
DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
Tipo I y Tipo III:
- Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
- Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo Icortan lejos de la
secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases
antes o despúes de la secuencia que reconocen.
- Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio del corte.
Tipo II:
- Sólo tienen actividad de restricción.
- Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
- Sólo requieren Mg++ como cofactor.
- No necesitan ATP.
Aplicaciones de las enzimas de restricción:
1.Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
2.Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.
3.Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y
“Northern” blotting.
4.Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de
DNA recombinante.
Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre
está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta
enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la
especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas
que se han aislado de esa cepa. Ej:
Eco RI à E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
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Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que
pueden afectar la actividad de las mismas:
1.Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza,
contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas
concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
2.Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que
respecta a su estabilidad y actividad.
3.DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .
4.Contaminantes con carga (-).
5.DNA contaminado con otro DNA.
6.Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
7.Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la
enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está
superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima).
8.Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en
condiciones óptimas.
Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita
para cortar 1µg de DNA en 1 hora.
El buffer siempre debe añadirse como un 10% de la reacción total de digestión.
http://es.scribd.com/doc/55232051/Enzimas-de-restriccion1
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Enzimas de restricción. Consultado el 30 de julio de 2012 en:
http://es.scribd.com/doc/55232051/Enzimas-de-restriccion