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Tierra Tropical (2011) 7 (2): 229-238
Streptomyces griseoviridis CEPA MOG01 ANTAGÓNICO DE OJO DE
GALLO (Mycena citricolor) EN EL CAFETO (Coffea arabica)
V. Hidalgo, A. Paredes, E. Alvarado1
Universidad EARTH
Las Mercedes de Guácimo, Limón, Costa Rica
Recibido 12 de diciembre 2010. Aceptado 25 de agosto 2011.
RESUMEN
En este estudio se evaluó el comportamiento de la bacteria Streptomyces griseoviridis como
antagonista del hongo Mycena citricolor causante de la enfermad ojo de gallo del cafeto. Para
ello se realizó un experimento donde se buscó determinar si la bacteria tiene efecto antagónico
sobre el desarrollo del hongo. También se realizó un ensayo a nivel de campo en una finca
cafetalera ubicada en Turrialba, Costa Rica. En este estudio se evaluaron tres tratamientos, uno
utilizando S. griseoviridis, un tratamiento con el fungicida ciproconazol, más un tratamiento
testigo. El ensayo se realizó usando un diseño de bloques al azar con cuatro repeticiones. Cada
repetición consistió de cuatro plantas y a cada planta se le identificaron cuatro bandolas, las que
se evaluaron en el tiempo. Se realizaron tres aplicaciones en los meses de mayo a agosto, así
como cuatro evaluaciones para detectar porcentaje de hojas enfermas y severidad de la
enfermedad. El ciproconazol realizó mejor efecto en el control de ojo de gallo en comparación
con los otros dos tratamientos. S. griseoviridis no manifestó antagonismo a la dosis evaluada.
Palabras clave: antagonismo, cafeto, ciproconazol, Mycena citricolor, ojo de gallo,
Streptomyces griseoviridis.
ABSTRACT
In this study, the antagonistic effect of the bacteria Streptomyces griseoviridis on the fungi
Mycena citricolor, which causes the American leaf spot disease on coffee plants, was evaluated.
The purpose of experiment was to determine if the bacteria had any antagonistic effect over the
growth of the fungi. As well, as part of the study, a field experiment was conducted in a coffee
plantation in Turrialba, Costa Rica. In this study three treatments were evaluated; the first
treatment using S. griseoviridis, the second using the fungicide cyproconazole, and the third a
control treatment. The experiment used a randomized block statistical design with four
repetitions. Each repetition consisted of four coffee plants, each having four branches, which
were evaluated during the experiment. Three applications were made between May and August,
and at the same time four evaluations were made to determine the percentage of infected leaves
and the severity of the disease. Cyproconazole was the treatment that had the best at controlling
the American leaf spot disease of coffee compared to the other treatments. S. griseoviridis did
not show any antagonistic effect at the evaluated dosage.
Key words: antagonism, coffee plantations, cyproconazole, Mycena citricolor, coffee American
leaf spot disease, Streptomyces griseoviridis.
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Contacto: Edgar Alvarado ([email protected])
ISSN: 1659-2751
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INTRODUCCIÓN
La enfermedad conocida como ojo de gallo, causada por el hongo Mycena citricolor, se
considera una de las más importantes en la caficultura en Costa Rica. Esta enfermedad afecta
más del 10 % de las zonas cafetaleras. Cultivos de cafeto bajo condiciones de alta precipitación
pluvial, alta humedad relativa, y baja luminosidad, ofrece condiciones que favorecen las epifitas
de este hongo (Mora, 2000). Según Avelino et al. (2007), el desarrollo de M. citricolor es
altamente dependiente de la precipitación; una reducción en la precipitación refleja una baja en el
proceso epidémico de la enfermedad. El efecto de la enfermedad sobre los rendimientos se debe
principalmente a la defoliación. El ojo de gallo se caracteriza por la formación de pequeñas
manchas en las hojas, lesiones que pueden ser ovaladas debido a la limitación con las venas, o
algo irregulares cuando dos o más manchas se fusionan, que con la llegada de la época seca el
tejido enfermo se cae (Wang y Avelino, 1999).
Según Barquero (2010), la alta incidencia de la enfermedad en el año 2010 en las zonas altas
costarricenses ha hecho que las estimaciones de producción para la cosecha 2010-2011 se vean
reducidas. La primera estimación de la cosecha realizada por el ICAFE (Instituto del Café de
Costa Rica) fue por 864 millones de kilogramos que representan un incremento del 12 % con
respecto a las 772 millones de kilogramos con las cuales cerro el 2009-2010 para el mismo
periodo. Una segunda estimación de la cosecha había aumentado las proyecciones en 8000
fanegas2, pero ahora se prevé una reducción por el daño del ojo de gallo.
La dificultad para controlar esta enfermedad radica en que no existen variedades especificas
resistentes ya que el hongo, de origen americano, y el cafeto, de origen africano, no
evolucionaron juntos (Avelino et al., 2010). El ojo de gallo se mantuvo bajo control durante
30 años (1957-1987) con la ayuda del fungicida arseniato de plomo. Luego de que se prohibió el
arseniato de plomo, debido a que se encontraban residuos de arsénico tanto en las hojas como en
frutos, la enfermedad ha comenzado a recobrar relevancia. Actualmente el control de
M. citricolor es a base de fungicidas químicos sintéticos, con aplicaciones iniciales de un
producto sistémico al inicio de la época lluviosa, seguido de aplicaciones con fungicidas
protectores (Wang y Avelino, 1999).
En Costa Rica, el Instituto de Café, con base a estudios desarrollados, brinda sus
recomendaciones al uso de productos químicos principalmente el captan. Éste es un fungicida
protector y erradicante, el cual ha debe ser aplicado desde etapas juveniles de la plantación para
evitar incidencias de la enfermedad o eliminar un inoculo residual muy alto (ICAFE, 1995). El
uso de este fungicida se ha generalizado, y aunque es efectivo, la rentabilidad de la producción
está dependiente de los precios de este producto, así como la aceptación del café en los
mercados. Sin embargo, los mercados ya están exigiendo producción más sostenible, asociada
con la salud del medio ambiente.
El impacto que tiene el uso generalizado de plaguicidas químico sintéticos se puede observar en
todos los aspectos de la producción cafetalera en general, siendo importantes los efectos de éstos
sobre el grano. Además del grano, importa el alcance que el uso de estos productos tiene sobre
las personas que laboran en la producción, así como también la contaminación puede afectar la
demanda del café costarricense. Esa demanda afecta de manera negativa su precio en los
mercados. Independiente a la parte de ingreso para los productores, existen las externalidades
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Una fanega = 240 kg
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debido a los impactos sobre mantos acuíferos, considerando que más del 56 % del área ocupada
por cafetales en Costa Rica está en la cuenca hidrográfica del río Tárcoles, donde también vive el
27 % de la población del país (Boyce et al., 1994).
La caficultura mundial ha estado cambiando en los últimos años, principalmente como
consecuencias de la caída de los precios del grano. Ante esta situación, y tomando en cuenta que
el rubro café es de gran importancia socioeconómica y ambiental para las zonas cafetaleras, es
urgente que esta actividad se trasforme para una excelente calidad de taza, de una transformación
productiva de manera sostenible, de la conservación de la flora, fauna, del mantenimiento de las
cuencas hidrográficas, y sobre todo en cuanto a nuevos rubros agrícolas asociados con el
agroecosistema café (Pohlan et al., 2006). El combate que se le da actualmente a esta
enfermedad de M. citricolor se basa en el uso de cultivares tolerantes al hongo, el control
mediante prácticas culturales enfocadas en bajar la humedad dentro de la plantación y el control
químico, sin que existan métodos curativos alternativos a los químicos como el control biológico
(ICAFE, 1998).
El uso de Streptomyces griseoviridis ha dado resultados positivos en control de enfermedades
fungosas en cereales, mostrando actividad en pruebas in vitro y consecuentemente en
experimentos en plantas en campo mostrando un valor potencial como antagonista de
Pseudocercosporella herpotrichoides, agente causal del ojo de gallo en cereales (Clarkson y
Lucas, 1993). De la misma manera, según Gyenis et al. (2003), el uso de distintas cepas de
Streptomyces como controladores biológicos para la enfermedad ojo de gallo en álamos causado
por hongos ascomicetos. Los Streptomicetos son miembros del orden de bacterias
Actinomycetales. Estas bacterias parecen hongos por su estructura de ramificaciones
filamentosas; sin embargo, son verdaderas bacterias debido a ser procariontes. Así como crecen
los Actinomycetes, éstas forman ramificaciones celulares que se constituyen en un micelio como
el de los hongos. También producen esporas, así como innumerables antibióticos. El género más
exitoso es el Streptomyces que posee más de 500 especies.
Actualmente el uso de bacterias competidoras como S. griseoviridis, no ha sido considerado por
los productores como una alternativa de control de M. citricolor de los cafetales. El presente
trabajo tuvo como propósito evaluar el efecto de la bacteria S. griseoviridis sobre la enfermedad
esa enfermedad en el cafeto. Para tal fin, inicialmente se evaluó el efecto de S. griseoviridis
sobre colonias de M. citricolor in vitro, para analizar antagonismo y parasitismo. De igual
manera, se estableció un experimento en una plantación de cafeto ubicada en el cantón de
Turrialba, Cartago, Costa Rica, la cual se encontraba bajo las condiciones óptimas para el
desarrollo de la enfermedad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Este trabajo tuvo una fase de laboratorio para pruebas in vitro y una fase de campo realizado en
una plantación comercial de cafeto. El experimento en el laboratorio se realizó con el fin de
observar el comportamiento de S. griseoviridis sobre el hongo M. citricolor en pruebas de
antagonismo y en pruebas de competencia. Los materiales a usar se obtuvieron de una placa de
inoculo de M. citricolor y otra de S. griseoviridis. Se realizaron cuatro repeticiones para cada
prueba. Las cajas de Petri fueron colocadas bajo luz directa por 11 horas, a 25 °C. Las
mediciones de crecimiento se realizaron a los ocho días y 16 días después de inoculados los
medios.
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Para ambos organismos se utilizó un medio de cultivo a base de papa, dextrosa y agar (PDA). El
medio fue preparado con una disolución de 15 g de PDA en 300 mL de agua destilada, el cual
fue luego autoclavado. El medio fue colocado en cajas de Petri y se esperó hasta que se enfriara
para lograr la gelificación. Estas actividades se realizaron en una cámara de flujo laminar para
evitar que el medio se contaminara con algún otro microorganismo.
El método de antagonismo in vitro es la búsqueda de oposición de microorganismos en medios
de cultivo. En una placa petri, con la ayuda de un bisturí esterilizado se colocaron dos pequeños
trozos de agar infectado con M. citricolor en los puntos cardinales este y oeste. Acto seguido se
colocó dos trozos del agar infectado por S. griseoviridis en los puntos norte y sur. El fin de esta
prueba era determinar si la bacteria S. griseoviridis tiene la capacidad de crear algún metabolito
que le impida crecer al hongo M. citricolor.
Para evaluar la competencia in vitro, se tomó una caja de Petri con medio de PDA y se hizo
rayado de las dos cepas a evaluar. Con el auxilio de un asa estéril, se rayó el medio de cultivo
con la cepa de M. citricolor en la mitad de la placa de Petri. De igual manera, se hizo sobre la
otra mitad del medio con la cepa de S. griseoviridis. Este ensayo fue realizado para determinar si
se manifestaba dominancia de crecimiento ya sea del hongo o de la bacteria.
El experimento de campo se realizó con el fin de evaluar el efecto de la bacteria sobre
M. citricolor en hojas de cafeto, en una plantación comercial. La fase de campo se llevó a cabo
en la finca cafetalera Aquiares, ubicada en el cantón de Turrialba, provincia de Cartago, Costa
Rica. Esta finca se encuentra a 09°94’0,94” norte y 83°72’0,17” oeste, a una altura de 950 msnm,
con precipitación pluvial promedio anual de 3000 mm, y temperatura promedio anual de de
22 °C. Según la clasificación de zonas de vida de R. L. Holdridge, la finca se encuentra en la
zona de bosque muy húmedo premontano (Barroso, 1991). El experimento se realizó durante los
meses de mayo a agosto, época que concentra la mayor incidencia de precipitación pluvial.
Se utilizó Coffea arabica L., cultivar Caturra CR-95, material genético que es susceptible a la
enfermedad ojo de gallo. La plantación fue sembrada en el año 1998, con una distancia de
siembra de 2,0 m entre hileras por 1,0 m entre plantas y tres ejes por planta. Se trabaja con el
sistema de poda selectiva por rama y con un programa de fertilización, por año, que consiste en
272 kg/ha de N, 0 kg/ha de P2O5, 144 kg/ha de K20, 40 kg/ha de MgO y 5 kg/ha de B.
Este estudio constó de tres tratamientos. Tratamiento 1 (T1) consistió en el uso de
S. griseoviridis. Para tratamiento 2 (T2), se utilizó el fungicida ciproconazol. El tratamiento 3
(T3), que fue el testigo absoluto, se le hizo ninguna aplicación. Se trabajó con un diseño
experimental de bloques completamente al azar, de los tres tratamientos con cuatro repeticiones
por tratamiento.
Después de seleccionar un área uniforme dentro de la finca que presentara problemas de ojo de
gallo, se hicieron cuatro aplicaciones de cada tratamiento, cada una con cuatro semanas de
diferencia entre sí. El tamaño de cada parcela fue de 16 plantas, de las cuales se evaluaron las
cuatro plantas centrales de cada una. Del tercio medio de cada una de estas cuatro plantas se
muestrearon cuatro bandolas, cada una dirigida a una punto cardinal.
En total se evaluaron 192 bandolas. A cada una se le midió el número total de hojas y el número
de hojas enfermas. Se contaron como hojas todos los foliolos que medían más de 2 cm de ancho.
Adicionalmente, se midió el número de lesiones causadas por la enfermedad en las hojas, para
poder determinar la severidad del daño del hongo en la bandola. En total se hizo una evaluación
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cada cuatro semanas, por un total de 12 semanas. Se analizó el porcentaje de hojas enfermas,
severidad de la enfermedad determinado por el número de lesiones en cada hoja enferma, y el
comportamiento de la enfermedad a través de las cuatro mediciones realizadas. Para todas estas
evaluaciones, se comparó el control biológico de S. griseoviridis con el tratamiento químico de
ciproconazol y el testigo absoluto.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con el experimento en laboratorio, se buscó observar el comportamiento de S. griseoviridis
sobre M. citricolor, en platos Petri. En el caso de este estudio, por medio de pruebas in vitro, se
buscó observar si existía algún tipo de interacción entre S. griseoviridis y M. citricolor.
En las mediciones de crecimiento realizadas a los ocho días y 16 días después de inoculados los
medios, específicamente en las pruebas de competencia, se logró observar que M. citricolor
presentó un desarrollo leve y lento en comparación a S. griseoviridis. En la repetición 1, se pudo
observar claramente como la bacteria parasitó al hongo, impidiéndole su desarrollo; sin embargo
en la repetición 2, 3 y 4, esto no sucedió.
En cuanto a las pruebas de antagonismo, el crecimiento de la bacteria en el medio PDA fue más
rápido y dominante en comparación al crecimiento del hongo. Esto se logra apreciar tanto a una
como a dos semanas después de la inoculación. En las repeticiones 3 y 4, S. griseoviridis logró
invadir la mitad superior ocupada por M. citricolor, lo que refleja una competencia directa por
espacio de la bacteria sobre M. citricolor.
El objetivo de la experimentación en campo fue evaluar si la bacteria M. citricolor tenía algún
efecto como controlador de la enfermedad ojo de gallo en hojas de cafeto después de tres
aplicaciones. Para esto se analizó el porcentaje de hojas enfermas, severidad de la enfermedad
determinado por el número de lesiones en cada hoja enferma, y el comportamiento de la
enfermedad a través de las cuatro mediciones realizadas.
Dado que los tratamientos mostraron, inicialmente, diferente número de hojas totales, se trabajó
con el porcentaje de hojas dañadas respecto al total; de esta manera se eliminaron las diferencias
iniciales. A partir del análisis del porcentaje de hojas enfermas se observó que antes de iniciar
con los tratamientos (Evaluación 1), se apreció como las plantas a evaluar con la bacteria tenía
mayor porcentaje de hojas enfermas, seguido de las plantas que no se les dio ningún tipo de
control, y por último las del control químico sintético (Figura 1).
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Hojas enfermas (%)
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T1 (biológico)
T2 (químico)
T3 (testigo)
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
Evaluación
Figura 1. Porcentaje de hojas enfermas según tres tratamientos de control del ojo de gallo en
cuatro momentos de evaluación.
Los resultados sugieren que hay diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos
(p<0,01). Sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los
tratamientos testigo y S. griseoviridis, siendo el tratamiento de ciproconazol el de menor
porcentaje de hojas dañadas (22 %), mientras que los otros dos tratamientos mostraron más del
40 % de las hojas dañadas.
La evolución de los tratamientos se vio afectado por factores externos, donde se atribuye que el
clima tuvo un impacto significativo sobre el estudio siendo evidente entre la tercera y cuarta
evaluación, donde se muestra un aumento del porcentaje de hojas enfermas (Figura 1). Esto pudo
afectar especialmente al tratamiento con S. griseoviridis al momento de su establecimiento en la
parcela. Por lo que se considera que un aumento en la dosis de aplicación y un mayor tiempo de
estudio para asegurar el establecimiento de la bacteria hubiera dado al tratamiento con
S. griseoviridis resultados más favorables.
La severidad del daño se refiere al número de lesiones causadas por M. citricolor en cada una de
las hojas enfermas. Para la variable severidad por hoja, no hubo diferencias estadísticamente
significativas entre tratamientos (p<0,05). Además de evaluar la severidad por tratamiento, se
evaluó el comportamiento de la severidad con en cada una de las cuatro evaluaciones. Aunque no
se presentaron diferencias estadísticamente significativas (p<0,01), se observó que el efecto del
tratamiento con ciproconazol sobre las hojas dañadas fue mejor en comparación al tratamiento
con S. griseoviridis y testigo (Figura 2). Los factores externos (clima) tuvieron un impacto sobre
el efecto de los tratamientos, particularmente entre la tercera y cuarta evaluación donde la
intensidad de lluvia contribuyó al lavado de la bacteria del tratamiento biológico (Figura 2).
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Severidad por hoja dañada
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T1 (biológico)
T2 (químico)
T3 (testigo)
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2
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0
1
2
3
4
Evaluación
Figura 2. Número de lesiones provocadas por la enfermedad ojo de gallo en las hojas enfermas
según tres tratamientos en cuatro momentos de evaluación.
Con el de análisis de regresión lineal, se buscó observar el comportamiento de la enfermedad a
través de las cuatro evaluaciones. Para ello, se ajustó un modelo de regresión lineal, con las
medias por tratamiento, para el porcentaje de hojas enfermas y para severidad por hoja (Figuras 3
y 4). Los tratamientos con S. griseoviridis y testigo absoluto, tanto en porcentaje de hojas
enfermas como severidad, mostraron un aumento de la enfermedad. El efecto que presentó el
control químico se aprecia con una disminución del porcentaje de hojas enfermas, y una
disminución leve en el número de lesiones por hoja enferma que representa la severidad
(Figuras 3 y 4).
Hojas enfermas (%)
80
70
T1 Biológico
T2 Químico
T3 Testigo
60
50
40
30
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0
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3
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1
2
3
4
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Evaluación
Figura 3. Modelo lineal del porcentaje de hojas enfermas de ojo de gallo en las hojas del cultivo
de cafeto, bajo los tratamientos.
Severidad por hoja dañada
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T1 Biológico
T2 Químico
T3 Testigo
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1
2
3
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1
2
3
4
1
2
3
4
Evaluación
Figura 4. Modelo lineal de la severidad de ojo de gallo en las hojas del cultivo de cafeto, bajo
los tratamientos.
Los tratamientos parecen mostrar un comportamiento cuadrático. Para el tratamiento con
S. griseoviridis al inicio disminuyeron las hojas enfermas y luego tendió a aumentar. Mientras
que para el tratamiento con ciproconazol, al inicio disminuyó el porcentaje de hojas enfermas y
lo mantuvo bajo a lo largo del tiempo. Para el tratamiento testigo el porcentaje de hojas enfermas
siempre aumentó (Figura 5).
Hojas enfermas (%)
80
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T1 Biológico
T2 Químico
T3 Testigo
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Evaluación
Figura 5. Modelo cuadrático del porcentaje de hojas enfermas de ojo de gallo en las hojas del
cultivo de cafeto, bajo los tratamientos.
En cuanto a severidad de los tratamientos, el tratamiento con la bacteria y con el testigo tendió a
disminuir en la segunda y tercera evaluación. Sin embargo, con estos tratamientos la severidad
aumentó considerablemente para la última medición (Figura 6). Lo que respecta al control con
ciproconazol, se presentó cierta estabilidad en cuanto al número de lesiones por hoja enferma
(Figura 6).
Severidad por hoja dañada
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T1 Biológico
T2 Químico
T3 Testigo
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0
1
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3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Evaluación
Figura 6. Modelo cuadrático de la severidad de ojo de gallo en las hojas del cultivo de cafeto,
bajo los tratamientos.
CONCLUSIONES
El comportamiento de la bacteria S. griseoviridis en la prueba de competencia fue más agresivo
que el hongo, M. citricolor. Sin embargo, no se pudo afirmar que la bacteria en la prueba de
antagonismo in vitro tuvo un efecto antagónico con el hongo.
El tratamiento químico con ciproconazol fue el que mejor resultados obtuvo al obtener menor
porcentaje de hojas enfermas y una severidad del daño baja. Los tratamientos con S. griseoviridis
y el testigo inicialmente tenían una reducción el porcentaje de hojas enfermas y severidad del
daño. Sin embargo, los factores externos (clima) tuvieron un impacto sobre el efecto de los
tratamientos y entre la tercera y cuarta evaluación se mostró un aumento en la enfermedad.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio se pudo realizar gracias al financiamiento brindado por la Administración
Académica y la Unidad de Investigación de la Universidad EARTH, Guácimo, Costa Rica.
LITERATURA CITADA
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[consultado
28
octubre
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Web:
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