Vesículas Extracelulares (Exosomas)

Iden%ficación y Separación de Vesículas Extracelulares (exosomas) Mediante Citometría de Flujo Òscar Fornas Universitat Pompeu Fabra / Centre de Regulació Genòmica, PRBB, Barcelona [email protected] Vesículas Extracelulares Definición Definición: Las vesículas extracelulares (EV) son par6culas formadas por una bicapa lipídica que se originan tanto en el interior de las células como en la membrana plasmá@ca. CloAlde Théry et al, 2009 Robbins PD, Morelli AE. Vesículas Extracelulares Localización Las EV se han aislado de dis@ntos fluidos corporales: Las células de dis@ntos tejidos humanos secretan EV a fluidos corporales proximales. Las EV con@enen proteínas, lípidos y RNA que pueden afectar a la fisiología de células bañadas o reves@das por esos fluidos corporales. Yañez-­‐Mo M, et al. JEV, 2015 Review Vesículas Extracelulares Clasificación CloAlde Théry et al, 2009. Review Vesículas Extracelulares Clasificación JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES, 2015 Biological proper%es of extracellular vesicles and their physiological func%ons Yañez-­‐Mo M, Siljander PR, Andreu Z, et al. El contenido, tamaño y composición de la membrana de las EVs es muy heterogéneo y dinámico, y depende directamente del @po celular, estado y condiciones ambientales. Se clasifican básicamente por su tamaño en tres grandes grupos: -­‐  Cuerpos apoptó@cos (50-­‐1000nm) -­‐  Micropar6culas/micrvesículas celulares (ectosomas) (50-­‐1000nm) -­‐  Exosomas (30-­‐100nm) Existen grandes discrepancias en su clasificación a causa de la falta de un “gold standard” metodológico para su estudio. Esta tecnología de referencia podría ser la…. CITOMETRÍA DE FLUJO !!! Vesículas Extracelulares (Exosomas) Problemas: Su pequeño tamaño (30-­‐100nm) que las hace estar por debajo del rango de detección de las técnicas convencionales de análisis, incluso la Citometría de Flujo (teóricamente). Measurement Par@cle size, Par@cle concentra@on, Protein aggrega@on, Zeta poten@al Par%cle size range 10nm to 2000nm Technology Nanopar@cle Tracking Analysis, Electrophore@c Light Scaeering Measurement Rela@ve par@cle size, Par@cle concentra@on, mul@parametric analysis Par%cle size range > 40nm? qNano Gold by Izon NanoSight NS500 by Malven BD Influx High-­‐resolu@on FCM by Becton Dickinson Vesículas Extracelulares (Exosomas) Contenido Proteínas Su caracterización se ha realizado por immunobloing, immuno-­‐gold labelling combinado con microscopia electrónica y citometría de flujo (esferas acopladas a an@cuerpos o an@cuerpos asociados a fluorocromos). -­‐  Las EV con@enen “pan-­‐EV markers”, marcadores específicos de EV como son las tetraspaninas (CD9, CD63, CD81 and CD82). Sin embargo, las CD9, CD63 and CD81 también se han observado en los cuerpos apoptó@cos y microvesículas (… per podemos discriminarlas por tamaño) -­‐  También presentan altos contenidos de otras proteínas: -­‐  Del citoesqueleto. -­‐  Citosólicas, como las específicas de estrés (heat shock proteins; HSPs) -­‐  De membrana plasmá@ca. -­‐  Complejo Mayor de Histocompa@bilidad (MHC). -­‐  etc… Yañez-­‐Mo M, et al. JEV, 2015 Review Vesículas Extracelulares (Exosomas) Contenido Ácidos nucleicos (RNA) Mientras que el mRNA celular varia en tamaño de 400 to 12,000 nucleó@dos, el RNA de las EV es predominantemente <700 nucleó@dos. Existen numerosas formas de RNA: -­‐  mRNA intacto -­‐  Fragmentos de mRNA -­‐  long non-­‐coding RNA -­‐  miRNA -­‐  piwi-­‐interac@ng RNA -­‐  RNA ribosómico (rRNA): La mayoría de estudios reportan la ausencia o pequeñas can@dades de rRNA 18S y 28S en EV, opuestamente a las altas can@dades presentes intracelularmente. Pero algunos estudios reportan mediante (next-­‐generaAon sequencing–NGS) muy altas can@dades. -­‐  Fragmentos de tRNA Yañez-­‐Mo M, et al. JEV, 2015 Review Vesículas Extracelulares (Exosomas) Contenido Ácidos nucleicos (DNA) A diferencia del RNA, el DNA en EV ha sido menos estudiado, pero igualmente se ha visto que con@enen: -­‐  DNA oncogénico en cuerpos apoptó@cos. -­‐  DNA mitocondrial (mtDNA): La migración de mtDNA podría darse vía EVs y así representar una vía alterna@va mediante la cual el mtDNA podría entrar en otras células favoreciendo la difusión de algunas patologías. -­‐  DNA de cadena única. -­‐  DNA de doble cadena (dsDNA) representando al DNA genómico. Yañez-­‐Mo M, et al. JEV, 2015 Review Vesículas Extracelulares (Exosomas) Contenido Lípidos La metabolómica de lípidos en EV está suscitando mucho interés y se empieza a atribuyéndoles funciones fisiológicas. Comparado con las células parentales de EV, éstas generalmente están enriquecidas en esfingomielina, colesterol y glicosesfingolípidos. EV de placenta con@enen elevadas proporciones de esfingomielina y colesterol. Algunos lípidos podrían estar implicados en la regulación, la formación y liberación de EV. El Colesterol, es también importante para la liberación de virus empaquetados, como HIV-­‐1 y influenza virus, así como también u@lizan zonas enriquecidas en tetraspaninas como plataformas para la salida de la célula huésped. Yañez-­‐Mo M, et al. JEV, 2015 Review Vesículas Extracelulares (Exosomas) Funciones e interés cien\fico EV par@cipan en la comunicación intercelular transfiriendo a otras células proteínas y material gené%co de la célula de origen. Sin embargo, a pesar del potencial diagnós@co y terapéu@co que presentan como biomarcadores de patologías o como herramienta terapéu@ca “per se”, la metodología para estudiarlas no está lo suficientemente desarrollada. •  Comunicación celular (transportador de: proteínas, ADN, ARN, etc.) •  Relacionadas con inducción de metástasis. •  Interés cien6fico •  Uso diagnós@co ( biomarcadores de cáncer) •  Uso terapéu@co EV portadoras de DNA podrían ser usadas para iden@ficar mutaciones presentes en las células tumorales parentales y u@lizarlas como biomarcadores tumorales. El problema es que su carga de DNA es aun incierta y desconocida. También se les asigna la capacidad de eliminar material molecular indeseable como proceso de limpieza o mantenimiento celular. Vesículas Extracelulares (Exosomas) Funciones -­‐ Cáncer EV contribuyen a la transformación de células normales a células tumorales (mediante el transporte de materiales diversos desde la célula tumoral a otra a cierta distancia) METÁSTASIS !!! Estudios recientes han mostrado como en células de carcinoma de mama, las EV transfieren transgluta-­‐
minasa Asular (TG2 o tGT) a fibroblastos normales y células epiteliales. (La tGT une proteínas entre un grupo amino de lisina y el grupo carboxiamina de glutamina creando un enlace altamente resistente a la proteólisis. La tTG es el autoan^geno de la enfermedad celíaca). Por tanto, se están centrando los esfuerzos en estudiar las EV en estos mecanismos y así conocer: -­‐  Iniciación del cáncer -­‐  Progresión del cáncer -­‐  Angiogénesis -­‐  Metástasis Penfornis P, et al. InternaAonal Journal of Cancer, 2015 Review Vesículas Extracelulares (Exosomas) Otras funciones REVIEW ARTICLE: J Extracell Vesicles. 2015 May 14;4 Biological proper%es of extracellular vesicles and their physiological func%ons. Yáñez-­‐Mó M, et al. EV tracto reproduc@vo masculino y plasma seminal: -­‐  Transfieren proteínas para la maduración de células espermá@cas. -­‐  Interactúan con células espermá@cas en el tracto reproduc@vo femenino facilitando el encuentro del oocito. EV en el sistema inmune: Nuevas visiones para la presentación de an6genos y por tanto adquisición de inmunidad Metodológicamente no hay consenso…. Orozco AF, et al. 2010 Cytometry part A 77A: 502-­‐514 Merino A, et al. 2014. Front Immunol. Oct 1;5:525 ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH alliance hep://www.evflowcytometry.org JEV: Journal of Extracellular Vesicles. The official journal of ISEV We start on June 2015 At CYTO 2015 -­‐ Glasgow AIMS OF THE WORKING GROUP: Only 5-­‐10% of EV papers are acceptable, the rest are junk!!! •  Define friendly methods • 
• 
• 
• 
Establish guidelines and recommenda@ons Establish standard materials Define proper and mandatory controls. Etc… References from ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH Jan Lötvall et al. (2014) Witwer K, et al. (2013) Diseño experimental: 1.  Preparación de muestras 2.  Controles analí@cos necesarios e indispensable 3.  Controles experimentales 4.  Análisis de datos. References from ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH Mecanismo dual de regeneración de tejidos dañados mediados por exosomas/microvesículas de stem cells. (A)  Microvesículas y exosomas pueden ser liberadas por tejidos dañados e inducir a las stem cells a liberar exosomas/microvesículas con un contenido con funciones reparados y regeneradoras directamente. (B)  Microvesiculas y exosomas pueden ser liberados por un tejido dañado y actuar en las stem cells. Estas stem cells podrían diferenciar células vecinas de una zona dañada para reponer las células dañadas. References from ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH NATURE PROTOCOLS Fluorescent labeling of nano-­‐sized vesicles released by cells and subsequent quan%ta%ve and qualita%ve analysis by high-­‐resolu%on flow cytometry. Els J van der Vlist, Esther N M Nolte-­‐'t Hoen, Willem Stoorvogel, Ger J A Arkesteijn & Marca H M Wauben Flow diagram outlining the vesicle isola@on, labeling and gradient density ultracentrifuga@on , as well as the flow cytometer setup and data acquisi@onº van der Vlist et al Nature Protocols 7, 1311–1326 (2012) References from ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH HIGH-­‐ RESOLUTION FLOW CYTOMETRY (special instrument setup) Overview of the BD Influx cell sorter. (b) Original FSC obscura@on bar (2 mm in width). (c) Adapted obscura@on bar (5 mm in width) placed over the original obscura@on bar. (d) Adapted obscura@on bar (indicated with white arrow) Reduced wide-­‐angle FSC van der Vlist et al Nature Protocols 7, 1311–1326 (2012) References from ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH HIGH-­‐ RESOLUTION FLOW CYTOMETRY (special instrument setup) Nano-­‐sized vesicles released by nonac@vated or LPS-­‐
ac@vated mouse DCs and labeled with PKH67 were addi@onally stained with fluorochrome-­‐labeled specific an@bodies or isotype control an@bodies van der Vlist et al Nature Protocols 7, 1311–1326 (2012) References from ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH CYTOMETRY Part A Prerequisites for the analysis and sor%ng of extracellular vesicle subpopula%ons by high-­‐resolu%on flow cytometry Tom Groot Kormelink1,‡, Ger J. A. Arkesteijn1,2,‡, Frans A. Nauwelaers3, Ger van den Engh4,†, Esther N. M. Nolte-­‐'t Hoen1 and Marca H. M. Wauben1,* Cytometry A. 2015 Feb 16. doi: 10.1002/cyto.a.22644 References from ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH A altas concentraciones la detección de EV puede fácilmente detectar coincidente-­‐
mente más de una EV como par6cula única. -­‐  High-­‐resou@on FCM (reduced wide-­‐
angle FSC). -­‐  EV de cul@vos condicionados durante 24h. -­‐  Uso de gradientes de centrifugación. -­‐  Tinción de EV con CFSE con CD9 y CD63 fueron detectadas usando an@cuerpos-­‐
APC o PE respec@vamente. -­‐  Diluciones seriadas de EV altamente concentradas se preparan para conseguir la mejor estequiometria de @nción. Tom Groot Kormelink, et al. Cytometry A. 2015 Feb 16 References from ISEV-­‐ISAC-­‐ISTH Controles necesarios e idispensables: -­‐Medio de suspensión de EV -­‐Medio más CFSE -­‐EV en medio de suspensión -­‐EV más CFSE -­‐etc….. -­‐ Con todos esos controles se debería poder establecer los criterios de “gaAng” para su correcto análisis y sor@ng. Tom Groot Kormelink, et al. Cytometry A. 2015 Feb 16 Vesículas Extracelulares (Exosomas) Nuestro método Obtención y análisis de EV: 1.  Protocolo de ultracentrifugación. 2.  Uso del pellet como fuente de EV. 3.  Tinción de las EV. 4.  Ajuste del equipo. 5.  Adquisición de controles. 6.  Adquisición de las muestras. 7.  Análisis y sor@ng de las EV. Vesículas Extracelulares (Exosomas) Nuestro método Immunology and Cell Biology (1999) 77, 499-­‐508 Fluorescent dyes for lymphocyte migra%on and prolifera%on studies Christopher R Parish. 5-­‐(and-­‐6)-­‐carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDASE) BD Influx: High-­‐Resolu%on Cell Sorter Characteris%cs: Analog System Lasers: •  350nm (100mW) •  457nm (300 mW) •  488nm (200 mW) •  561nm (75mW) •  640nm (50mW) Detectors: FSC+SSC (14 FL / PMTs) Flexible architecture Modular Flow Cytometry Unit Universitat Pompeu Fabra (UPF) / Centre de Regulació Genòmica (CRG) Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona (PRBB) Threshold en FITC Vesículas Extracelulares (Exosomas) Nuestro método STED 488/530 CFSE 488/530 CFSE CFSE + SSC-­‐log SSC-­‐log STED 200 nm beads
488/530 CFSE CFSE -­‐ SSC-­‐log Vesículas Extracelulares (Exosomas) Microscopía Confocal vs Súper resolución Super-­‐resolu@on Microscopy ELYRA Super-­‐resolu@on System (S@mulated emission deple@on, STED) (Structured Illumina@on Microscopy, SIM) Leica SP5-­‐STED at CRG, Barcelona. Carl Zeiss, at Carl Zeiss, Munich. Vesículas Extracelulares (Exosomas) Microscopía Confocal vs Súper resolución (STED) Confocal Super-­‐resolu@on (STED) Leica Xavier Sanjuan: Centro de Regulación Genómica, Barcelona. (SP5 confocal, Leica) Vesículas Extracelulares (Exosomas) Microscopía Confocal vs Súper resolución (SIM) Confocal Super-­‐resolu@on (SIM) Zeiss Yilmaz Niyaz (Carl Zeiss, Munich, Germany) Benjamín Torrejón-­‐Escribano (Centres Cien6fics i Tecnològics. Universitat de Barcelona) Vesículas Extracelulares (Exosomas) Microscopía Confocal vs Súper resolución (SIM) Laser Scanning Confocal Microscopy Structured Illumina@on Microscopy (SIM) ELYRA Superresolu@on system (SIM), from Carl Zeiss Par@cle size: (arrow) Confocal microscopy 304nm vs SIM 146nm Yilmaz Niyaz (Carl Zeiss, Munich, Germany) Benjamín Torrejón-­‐Escribano (Centres Cien6fics i Tecnològics. Universitat de Barcelona) Vesículas Extracelulares (Exosomas) Resumen Es indispensable seguir los criterios establecidos en los ar6culos de referencia mencionados. •  Correcto diseño experimental. •  U@lización de controles para el ajuste del análisis y so@ng. •  Controles experimentales. Indispensable confirmar los análisis con otras tecnologías como la microscopía.