alteraciones del aparato de golgi y del tráfico de membranas en un
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Wilson Orlando Rendón Rodríguez Beneficiario COLFUTURO 2008 UNIVERSIDAD DE MURCIA FACULTAD DE MEDICINA ALTERACIONES DEL APARATO DE GOLGI Y DEL TRÁFICO DE MEMBRANAS EN UN MODELO CELULAR DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON Wilson Orlando Rendón Rodríguez 2011 Agradecimientos La fe es el don más grande que puede recibir el ser humano, y justamente yo me siento un privilegiado por ese regalo de Dios. Por tanto, mi agradecimiento inicial y el más enorme es para Dios en quien confío, porque los planes que tiene preparados para mí son mejores que los que yo mismo puedo elegir. Yo solo quiero poder alcanzar la capacidad de seguir enteramente sus pasos, porque su guía, protección y cuidados son verdaderos; sólo Dios puede revelar el camino. Recuerdo que cuando era un niño mi madre siempre rellenaba la primera página en mis cuadernos de escuela, y en uno de los guiones, por debajo de mi nombre expresaba una frase de petición, de alabanza y de amor a Dios; palabras que sin lugar a dudas llegaron a oídos de Dios. SU respuesta siempre me acompaña a pesar de mi condición tan mundana. Te doy gracias Dios mío por mantenerme siempre en tus brazos, por darme un corazón feliz, por brindarme lo que es mejor para mi, por mi familia y por todo lo que has creado. Quiero agradecer a mi familia, en especial a mis padres, que darían su vida sin dudas por la felicidad de sus hijos. Por la entrega de mi madre, su entereza, grandeza, voluntad de acero, energía, nobleza, bondad, humildad, amor y por su estrategia para criar a sus hijos, jejeje, aunque le haya resultado un hijo un poco relajado. A mi padre por soportar las adversidades del pasado, pero sobre todo por tener las agallas de perseverar por su familia. Agradezco a mis hermanos y hermanitas que me quieren incondicionalmente, los amo con todo mi corazón, a Jhon “tacajhon”, a Luchito mijo, a las “barbas” Giovi y Yeimi. A toda mi familia, mi abuela mis tías, tíos, primos y primas, quienes siempre me recuerdan y me tienen en sus pensamientos y oraciones. También agradezco a Lilia, mi suegra, una mujer que me quiere más que a su hija, a Mauro y a toda su familia que en todo momento están pendientes de nuestro bienestar. A mi esposa que tomó la difícil decisión de acompañarme en el camino de la vida, aunque no lo tuviese fácil. Lily muchas gracias por tu apoyo y amor. Agradezco a mi gran amigo Victor, simplemente por ser un verdadero amigo. Además quiero dar las gracias a Angelita por hacer de su casa un segundo hogar para mí, por su amor y por sus oraciones a mi nombre. Agradezco al doctor Gustavo Del Valle, quien confió en mi, impulsándome y dándome la oportunidad de lanzarme al mundo de la transferencia del conocimiento. Agradezco al Dr. José Ángel Martínez por darme la oportunidad de pertenecer a tan excelente grupo de investigación, por confiar en mi, por escuchar mis humildes opiniones científicas y por su ayuda profesional. Quiero agradecer a la Dra. Mónica Tomás y a la Dra. Emma Martínez por su gran apoyo, pero en especial por abrirme las puertas de la formación doctoral. Nunca olvidaré la oportunidad que me han dado mis tutores para hacer posible tan magnífica meta. Doy gracias, por su compañía y apoyo, a todas las personas que componen el Departamento de Biología Celular e Histología, a Teresa Zomeño, Luis Miguel, Irene Stenson, Vicente, Carlita, Salvador, mi compañerita Narci, María del Carmen, Blanca y Esther; también a los Drs. Manuel Avilés, Juan Francisco Madrid, Francisco Hernandez José Ballesta, Luis Miguel Pastor, y a las Dras. María José, María Jiménez, Concepción y Adelina. Mis sinceros agradecimientos para el Servicio de Apoyo a la Investigación de la Universidad de Murcia, en especial a Fara, Antonio, Teresa, Maruja, Manuela y Francisco. También a la gente del Departamento de Bioquímica por su ayuda técnica. Jesús le dijo: Yo Soy el Camino, la Verdad y la Vida San Juan, 14:6 ABREVIATURAS 6-OHDA 6-hidroxidopamina AG Aparato de Golgi ARN Ácido ribonucleico ATP Adenosín trifosfato ATV Área tegmental ventral del cerebro BFA Brefeldina A BH Barrera hematoencefálica BSA Albúmina sérica bovina CG Complejo de Golgi CGN Red del cis-Golgi COMT Catecol-O-metiltransferasa DA Dopamina EP Enfermedad de Parkinson ERGIC Compartimento intermedio entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi FBS Suero bovino fetal GAP Proteína activadora de las GTPasas GDF Factor de disociación del GDI GDI Factor inhibidor de la disociación del GDP ligado a Rab GEF Factor de intercambio de nucleótidos de guanina GFP Proteína verde fluorescente GSH Glutatión IT Intermediario de transporte KDEL r Receptor de la secuencia KDEL (lys-asp-glu-leu) MAO Monoamino oxidasa MAO-B Monoamino oxidasa tipo B MET Metanfetamina ABREVIATURAS MPDP 1-metil-4-fenil 2,3, dihidropiridínico MPP+ 1-metil-4-fenilpiridinio (producto de la oxidación del 1-metil-4-fenil-2,3, dihidropiridínico (MPDP) MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina MTs Microtúbulos NDMA Metilenedioximetanfetamina o “Ecstasy” NEM N-etilmaleimida NGF Factor de crecimiento nervioso NMDA Receptor ionotrópico de glutamato que responde al agonista N-metil D-aspartato NOS Oxido nítrico sintasa NSF Factor sensible a NEM PFA Paraformaldehído RE Retículo endoplásmico REt Retículo endoplásmico transicional ROS Especies reactivas de oxigeno siRNA Ácido ribonucleico de interferencia SNAP Proteína soluble de unión a NSF SNARE Receptor de las proteínas SNAP SNC Sistema nervioso central SNc Sustancia negra pars compacta SNr Sustancia negra pars reticularis SOD Superóxido dismutasa SUP Sistema ubiquitina-proteasoma TBS-T Tampón salino tris con tween® 20 TGN Red del trans-Golgi TH Tirosina hidroxilasa t-SNARE SNARE ligada a la membrana diana VND Vesículas de núcleo denso ABREVIATURAS v-SNARE SNARE ligada a la membrana vesicular VSVg Proteína G del virus de la estomatitis vesicular ÍNDICE I. RESUMEN --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 II. INTRODUCCIÓN ----------------------------------------------------------------------------------------------- 7 III. OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 13 IV. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA---------------------------------------------------------------------19 1 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA ------------------------------------------ 19 1.1 Sintomatología de la enfermedad de Parkinson ----------------------------------------- 19 1.2 Aspectos generales sobre la dopamina ---------------------------------------------------- 20 1.3 Etiología de la enfermedad de Parkinson -------------------------------------------------- 22 1.4 Fisiopatología de la enfermedad de Parkinson ------------------------------------------ 25 1.5 Citopatología de la enfermedad de Parkinson ------------------------------------------- 27 1.6 Terapéutica para la enfermedad de Parkinson ------------------------------------------ 29 1.6.1 Tratamiento convencional con fármacos antiparkinsonianos ---------------- 29 1.6.2 Cirugía versus tratamiento farmacológico ------------------------------------------- 32 1.6.2.1 Cirugía de estimulación subtalámica bilateral (STN-DBS)-------------- 32 1.6.2.2 Palidotomía y Talamotomía -------------------------------------------------------- 32 1.6.3 Futuras dianas terapéuticas en la enfermedad de Parkinson ---------------- 33 1.6.3.1 Sobre mecanismos específicos del tráfico intracelular ------------------- 33 1.6.3.2 Incremento de señales sobre receptores cannabinoides --------------- 33 1.6.3.3 Vacuna para modificar el sistema inmunitario ------------------------------- 34 1.6.3.4 Fármacos para contrarrestar la citotoxicidad de α-sinucleína --------- 34 1.6.3.5 Vacuna que contiene α-sinucleína ----------------------------------------------- 34 1.6.3.6 Medicina regenerativa ---------------------------------------------------------------- 35 1.6.3.7 Terapia génica -------------------------------------------------------------------------- 35 1.6.4 Terapias alternativas para la enfermedad de Parkinson ----------------------- 36 1.6.4.1 Relacionadas a los aspectos nutricionales: ---------------------------------- 36 1.6.4.2 Biomarcadores en la enfermedad de Parkinson---------------------------- 36 1.6.4.3 Fisioterapia ------------------------------------------------------------------------------- 37 1.6.4.4 Terapia ocupacional------------------------------------------------------------------- 37 1.6.4.5 Estimulación eléctrica transcraneal --------------------------------------------- 37 1.6.4.6 Estímulo sensorial repetitivo ------------------------------------------------------- 37 1.6.4.7 Calidad de vida y eficacia ----------------------------------------------------------- 38 2 α-SINUCLEÍNA Y PARKINSON ------------------------------------------------------------------------ 39 2.1 Localización de la proteína α-sinucleína --------------------------------------------------- 43 2.2 Papel fisiológico de la proteína α-sinucleína ---------------------------------------------- 43 ÍNDICE 2.3 Bioquímica de la proteína α-sinucleína ----------------------------------------------------- 45 2.4 Posibles alteraciones que dan lugar a la agregación de α-sinucleína ----------- 46 2.5 Papel citopatológico de la agregación de α-sinucleína ------------------------------- 48 3 MODELOS EXPERIMENTALES UTILIZADOS PARA ENFERMEDAD DE PARKINSON --------------------------------------------------------------------------------------------------- 50 3.1 Modelos animales ----------------------------------------------------------------------------------- 50 3.1.1 3.1.1.1 6-hidroxidopamina --------------------------------------------------------------------- 51 3.1.1.2 1-metil-4-fenil-1,2,3,6 tetrahidropiridina ---------------------------------------- 54 3.1.1.3 Rotenona, moneb y paraquat ----------------------------------------------------- 58 3.1.2 3.2 Parkinsonismo inducido por neurotoxinas ------------------------------------------- 50 Otros modelos experimentales ---------------------------------------------------------- 59 3.1.2.1 Animales deficientes en un gen específico o transgénico -------------- 59 3.1.2.2 Neuroinflamación en modelos de enfermedad de Parkinson ---------- 60 Modelos Celulares ---------------------------------------------------------------------------------- 61 3.2.1 Modelo con células PC12 ----------------------------------------------------------------- 61 3.2.1.1 Tratamiento con 6-hidroxidopamina en células PC12 -------------------- 63 3.2.1.2 Tratamiento con metanfetamina en células PC12 ------------------------- 64 3.2.1.3 Tratamiento con MPTP en células PC12-------------------------------------- 65 3.2.2 Otros modelos celulares utilizados para enfermedad de Parkinson ------- 66 4 TRÁFICO FUNCIONAL EN NEURONAS ---------------------------------------------------------- 67 4.1 Transporte intracelular ---------------------------------------------------------------------------- 67 4.2 Organización estructural y transporte de la vía secretora---------------------------- 68 4.2.1 Retículo Endoplásmico --------------------------------------------------------------------- 69 4.2.2 Compartimento intermedio o ERGIC -------------------------------------------------- 70 4.2.3 Complejo de Golgi---------------------------------------------------------------------------- 72 4.2.4 Red del trans-Golgi -------------------------------------------------------------------------- 73 4.2.5 Neuroexocitosis ------------------------------------------------------------------------------- 74 4.3 Proteínas reguladoras del transporte -------------------------------------------------------- 76 4.3.1 4.4 Proteínas Rab GTPasas ------------------------------------------------------------------- 76 Proteínas de anclaje y fusión ------------------------------------------------------------------- 78 4.4.1 Proteínas SNARE ---------------------------------------------------------------------------- 79 4.4.2 Proteínas de aproximación---------------------------------------------------------------- 81 4.5 Citoesqueleto ----------------------------------------------------------------------------------------- 81 4.5.1 Microtúbulos ------------------------------------------------------------------------------------ 82 ÍNDICE 4.5.2 Actina --------------------------------------------------------------------------------------------- 83 5 TRAFICO ALTERADO EN MODELOS DE ENFERMEDAD DE PARKINSON ------- 84 V. MATERIALES Y MÉTODOS ---------------------------------------------------------------------------- 91 1 REACTIVOS UTILIZADOS -------------------------------------------------------------------------------- 91 2 CULTIVO CELULARES ------------------------------------------------------------------------------------- 98 3 TRATAMIENTOS --------------------------------------------------------------------------------------------- 99 4 ENSAYOS DEL TRANSPORTE ---------------------------------------------------------------------- 100 4.1 Análisis del transporte retrogrado y anterógrado mediante el uso de BFA ------ 100 4.2 Ensayos del transporte utilizando la proteína G del VSV (VSVg-GFP) ----------- 101 5 INMUNOFLUORESCENCIA-------------------------------------------------------------------------- 101 6 ENSAYOS DE VIABILIDAD CELULAR ----------------------------------------------------------- 103 7 INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOTTING --------------- 103 7.1 Extracción de proteínas ---------------------------------------------------------------------------- 103 7.2 Electroforesis ------------------------------------------------------------------------------------------- 104 7.3 Western Blot -------------------------------------------------------------------------------------------- 105 7.4 Inmunodetección-------------------------------------------------------------------------------------- 105 8 AMPLIFICACIÓN, PURIFICACIÓN Y TRANSFECCIÓN DE PLÁSMIDOS---------- 106 8.2 Transformación de bacterias competentes y cultivo en placas ---------------------- 107 8.3 Multiplicación de bacterias ------------------------------------------------------------------------ 107 8.4 Purificación del ADN plasmídico ---------------------------------------------------------------- 108 8.5 Transfección transitoria----------------------------------------------------------------------------- 109 9 ARNs DE INTERFERENCIA (siRNA) -------------------------------------------------------------- 111 10 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN --------------------------------------- 111 10.1 Microscopía convencional ----------------------------------------------------------------------- 111 10.2 Crioultramicroscopía ------------------------------------------------------------------------------- 112 10.3 Crioinmunocitoquímica --------------------------------------------------------------------------- 113 11 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ------------------------------------------------------------------------------ 114 VI. RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------------------- 117 1 MECANISMOS DE NEUROTOXICIDAD ---------------------------------------------------------- 118 2 CAMBIOS EN LA DISTRIBUCIÓN DE LA PROTEÍNA α-SINUCLEÍNA ---------------- 118 3 ESTUDIO DE VIABILIDAD CELULAR-------------------------------------------------------------- 126 4 FRAGMENTACIÓN DEL COMPLEJO DE GOLGI --------------------------------------------- 126 5 RELACIÓN ENTRE LA FRAGMENTACIÓN DEL COMPLEJO DE GOLGI Y FORMACIÓN DE AGREGADOS--------------------------------------------------------------------- 137 ÍNDICE 6 MECANISMOS DE FRAGMENTACIÓN DEL COMPLEJO DE GOLGI --------------- 141 7 ESTUDIO DE LA ALTERACIÓN DEL TRANSPORTE INTRACELULAR ------------ 150 8 BÚSQUEDA DE PROTEÍNAS IMPLICADAS EN LA FRAGMENTACIÓN DEL COMPLEJO DE GOLGI --------------------------------------------------------------------------------- 168 9 EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIÓN O DEPLECIÓN DE PROTEÍNAS RAB GTPasas ESPECÍFICAS Y LA SNARE SINTAXINA-5 SOBRE LA MORFOLOGÍA DEL COMPLEJO DE GOLGI -------------------------------------------------------------------------- 173 10 EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIÓN DE RAB GTPasas SOBRE LA FORMACIÓN DE INCLUSIONES INTRACELULARES ------------------------------------- 180 VII. DISCUSIÓN ------------------------------------------------------------------------------------------------ 185 1 Línea celular PC12 como modelo neuronal de enfermedad de Parkinson ----------- 185 2 Mecanismo citopático de la proteína α-sinucleína--------------------------------------------- 186 3 Fragmentación del complejo de Golgi: ¿consecuencia de apoptosis? ---------------- 188 4 La fragmentación del complejo de Golgi precede a los daños en el citoesqueleto 189 5 Alteraciones del tráfico intracelular ----------------------------------------------------------------- 191 6 Fragmentación del complejo de Golgi y niveles de expresión de proteínas --------- 194 7 Relación entre la fragmentación del complejo de Golgi, inclusiones intracitoplasmáticas y alteración del tráfico celular -------------------------------------------- 198 8 Consideraciones finales --------------------------------------------------------------------------------- 202 XIII. CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------- 205 IX. ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------------------------------- 209 X. BIBLIOGRAFÍA--------------------------------------------------------------------------------------------- 213 RESUMEN I. RESUMEN El sello citopatológico de la enfermedad de Parkinson (EP) es la formación de inclusiones intracelulares conocidas como cuerpos de Lewy, de los cuales la proteínaα -sinucleína (αs) es el principal componente. En los últimos años ha quedado claro que el principal efecto de la sobreexpresión de αs y/o su agregaci ón es la alteración de los primeros estadíos de la vía secretora. Los agregados de la proteínaαs puede n inhibir el transporte entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi (AG), lo cual se refleja en una reducción de los niveles del transportador de monoamina vesicular a la sinapsis. Esto se traduce en la acumulación tóxica de dopamina libre en el citosol, provocando estrés oxidativo, y finalmente, la muerte celular. En levadura, la sobreexpresión de proteínas Rab específicas, proteínas SNARE y otras relacionadas con la cubierta de vesículas tipo COPII, protegen contra el daño inducido porαs. Por lo tanto, las proteínas que median la unión específica entre los intermediarios del transporte y las membranas de destino en la vía secretora temprana son la clave para entender los mecanismos moleculares que desencadenan neurodegeneración en la EP. Una de las consecuencias de las alteraciones del transporte entre el retículo endoplásmico y AG, inducido por la sobreexpresión y/o agregación de la proteína αs, puede ser la fragmentaci ón del AG. La fragmentación de este orgánulo se ha descrito en muchas enfermedades neurodegenerativas. Se ha postulado que el desequilibrio entre el transporte anterógrado y retrógrado podría conducir a la fragmentación del AG en las neuronas dopaminérgicas. En el presente estudio se analizan los mecanismos implicados en la fragmentación del AG en células neuronales PC12 tratadas con las neurotoxinas 6-hidroxidopamina o metanfetamina como modelos celulares de enfermedad de la EP. Nuestros datos demuestran que la fragmentación del AG precede y podrían dar lugar a la agregación de la proteína αs, con la subsecuente formación de inclusiones, conduciendo a alteraciones en el transporte anterógrado y retrógrado entre el retículo endoplásmico y el AG, y daño en el citoesqueleto. Por el contrario, la fragmentación del AG está 3 RESUMEN directamente relacionada con alteraciones en los niveles de expresión de las GTPasas Rab1, 2 y 8 y la proteína SNARE sintaxina 5. Así, la sobreexpresión de las proteínas Rab1 y 8 y la depleción de Rab 2 y sintaxina 5 restauran la morfología del AG. En conclusión, la homeostasis de un número limitado de proteínas Rab y SNARE es importante para la comprensión de la citopatología de la EP. La fragmentación del AG puede ser una especie de señal indicativa de que algo en la célula está mal y que el mecanismo de defensa celular se debe iniciar, lo que podría inducir la formación de cuerpos de inclusión del tipo agresomas, que funcionarían como un sistema de adaptación y “supervivencia” celular. 4 INTRODUCCIÓN II. INTRODUCCIÓN Entre los trastornos neurodegenerativos en humanos, la enfermedad de Parkinson es la segunda en presentación, patología que afecta variadas conductas del individuo en las que se ven involucrados primariamente diversos programas motores, aunque tiene la capacidad de provocar demencia en fases tardías de la entidad. Es aún más preocupante en términos de salud pública que el parkinsonismo se incremente en la población más joven, como efecto de factores psicosociales asociados al abuso y dependencia de drogas. El estudio sobre la enfermedad de Parkinson se desarrolla desde varios frentes, como son la identificación de genes implicados y su comportamiento, el estudio de patrones sintomáticos, ensayos farmacológicos, análisis de los cambios en el ADN mitocondrial, estudios anatomopatológicos, estudio con biomarcadores que revelan el desarrollo de la enfermedad y estudios sobre factores neurotróficos. Asimismo, entre estas líneas de investigación también se encuentra el estudio del tráfico intracelular, el cual tiene un papel relevante en los últimos años gracias al avance del conocimiento de los mecanismos citotóxicos que se presentan en la enfermedad. Estos hallazgos apuntan a que las alteraciones producidas en el transporte, son clave en el proceso citopático y la subsecuente muerte celular. En la enfermedad de Parkinson se producen daños en algunos de los pasos de la vía secretora, aunque no se conocen con detalle los fenómenos subyacentes y el mecanismo molecular de este proceso. El uso de nuevas herramientas y modelos de investigación ha proporcionado importantes pistas sobre los mecanismos de neurodegeneración desencadenados por la alteración en el tráfico. El sello citopatológico de la enfermedad de Parkinson es la formación de agregados proteicos intracelulares conocidos como cuerpos de Lewy, cuyo componente principal es la proteína α-sinucleína. En los últimos años se ha puesto de manifiesto que el efecto principal de la sobreexpresión de α7 INTRODUCCIÓN sinucleína y/o su agregación es la alteración en los pasos iniciales de la vía secretora. Se ha postulado que los agregados de α-sinucleína pueden inhibir el transporte entre el retículo endoplásmico (RE) y el aparato de Golgi (AG), reduciendo los niveles del transporte vesicular de monoaminas a las sinapsis, dando como resultado la acumulación tóxica de dopamina libre en el citosol, que induce la formación de ROS, causando estrés oxidativo y finalmente la muerte de la célula (Lashuel y Hirling, 2006). En levaduras, la sobreexpresión de específicas proteínas Rab, SNARE y proteínas de cubierta tipo COPII, protegen contra los daños inducidos por αsinucleína (Cooper et al., 2006). La GTPasa RE/Golgi Ypt1p/Rab1 parece tener un papel clave en este proceso. Estudios posteriores apoyan que Rab3A y Rab8A, implicados en pasos tardíos de la vía secretora, participan también en la neurodegeneración inducida por α-sinucleína (Gitler et al., 2008). En células de mamífero la sobreexpresión de α-sinucleína, sus formas aberrantes o mutadas asociados a los casos familiares de enfermedad de Parkinson, retrasan el transporte entre el RE y el AG, conforme con los resultados obtenidos en levadura (Thayanidhi et al., 2010). Esta alteración puede invertirse al sobreexpresar proteínas SNARE implicadas en el transporte entre RE-Golgi, demostrando que el efecto tóxico de α-sinucleína puede ser antagonizado por estas proteínas reguladoras. También se sabe que αsinucleína, proteína de modulación sináptica, secuestra ácido araquidónico, lo cual se traduce en el bloqueo de la activación de proteínas SNARE (Darios et al., 2010). Así, las proteínas que median la unión específica entre los intermediarios de transporte y las membranas de destino en la vía secretora temprana son claves para comprender los mecanismos moleculares que desencadenan neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson. Una de las consecuencias de las alteraciones del tráfico entre el RE y el AG inducida por la sobreexpresión y/o agregación de α-sinucleína puede ser la fragmentación del AG. El desequilibrio entre el transporte anterógrado y retrógrado podría conducir a la fragmentación del AG en neuronas dopaminérgicas (Lashuel y Hirling, 2006). De hecho, se trata de un mecanismo común de fragmentación del AG (Mironov y Beznoussenko, 2011). La 8 INTRODUCCIÓN fragmentación de este orgánulo se ha descrito en muchos trastornos neurodegenerativos (Gonatas et al., 2006; Fan et al., 2008), incluyendo la enfermedad de Parkinson (Fujita et al., 2006). Es un evento temprano en el proceso de neurodegeneración no asociado con muerte apoptótica (Gonatas et al., 2006). Además, la fragmentación del AG puede estar relacionada con la formación de agregados prefibrilares de α-sinucleína pero es independiente de inclusiones (Gosavi et al., 2002). En el presente estudio, analizamos en un modelo neuronal de enfermedad de Parkinson, los mecanismos moleculares involucrados en la fragmentación del AG y su relación con la formación de inclusiones reactivas para la proteína α-sinucleína. Nuestros resultados demuestran que la fragmentación del AG no es provocado por el desequilibrio en el transporte o alteraciones del citoesqueleto, sino que más bien, se trata de una consecuencia debida a las alteraciones en la homeostasis de proteínas Rab y SNARE especificas. La sobreexpresión o depleción de estas proteínas, implicadas en el tráfico intracelular, pueden prevenir la fragmentación del AG, lo cual es muy útil para que la célula recobre su capacidad de supervivencia y función. El AG es considerado la estación central de la vía secretora, donde llegan las proteínas recién sintetizadas desde el RE y son clasificadas para ser transportadas hacia su destino final (Farquhar y Palade, 1981; Farquhar y Hauri, 1997). Nuestros resultados sugieren que, en neuronas, es necesario que este orgánulo mantenga sus características morfológicas y funcionales, para frenar la aparición de inclusiones intracelulares. 9 OBJETIVOS III. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Identificar en un modelo celular para la enfermedad de Parkinson la arquitectura del aparato de Golgi y su relación con las alteraciones del tráfico intracelular y citoesqueleto con la agregación de la proteína α-sinucleína. Puesto que el estudio del comportamiento de fragmentación del complejo de Golgi y del tráfico intracelular alterado, puede ser crucial para entender el mecanismo de defensa de las neuronas ante el estrés oxidativo (patrón común para todos los factores causales de la enfermedad de Parkinson), postulamos que la recuperación de las características morfológicas y funcionales del aparato de Golgi y del tráfico podría evitar la aparición de inclusiones intracelulares y en general restaurar el funcionamiento celular, lo que disminuiría el ciclo de ataque oxidativo y por tanto la pérdida de neuronas. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Optimizar las condiciones de proliferación y diferenciación neuronal de la línea celular PC12. • Utilizar las neurotoxinas 6-hidroxidopamina y metanfetamina para simular las alteraciones celulares que de forma natural se producen en la enfermedad de Parkinson. • Inducir la aparición de inclusiones intracelulares mediante la utilización de las sustancias 6-hidroxidopamina y metanfetamina como agentes neurotóxicos. • Análisis de la dinámica de formación de las inclusiones intracelulares. 13 OBJETIVOS • Análisis morfológico de los componentes de la vía secretora e intermediarios de transporte en células PC12 después de diferentes tiempos de tratamiento. • Comparar los cambios morfológicos que se puedan observar entre los tratamientos con 6-OHDA, 6-OHDA más catalasa y metanfetamina. • Caracterización morfológica del complejo de Golgi en condiciones neurotóxicas. • Estudio de la cinética de distribución de proteínas del aparato de Golgi en células neuronales PC12 bajo condiciones de tratamiento. • Comparación de la cinética de fragmentación del complejo de Golgi entre las neurotoxinas 6-OHDA y MET. • Realizar ensayos a corto y largo plazo que permitan relacionar la generación de inclusiones celulares y las lesiones en la arquitectura del aparato de Golgi y del sistema de transporte intracelular. • Analizar el tipo de proteínas del citoesqueleto que podrían resultar alteradas con el tratamiento y su posible agregación. • Realizar el análisis cinético del transporte anterógrado y retrógrado mediante el uso de la droga brefeldina A. • Análisis del transporte del mutante sensible a temperatura ts045 de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSVg) en células neuronales PC12, para el estudio de la cinética del transporte anterógrado. • Evaluar el nivel de sobreexpresión de la proteína α-sinucleína en células neuronales PC12 después del tratamiento neurotóxico. • Análisis bioquímico de los niveles de expresión de proteínas Rab, SNARE y otras proteínas relevantes implicadas en el transporte REGolgi y en el mantenimiento de la organización del aparato de Golgi. • Utilizar técnicas inmunohistoquímicas, crioinmunocitoquímicas y de western blotting, para dilucidar el mecanismo citopático implicado en la fragmentación del complejo de Golgi y del tráfico intracelular. 14 OBJETIVOS • Utilizar las técnicas de sobreexpresión y depleción para las posibles proteínas halladas implicadas en el desorden del tráfico, con el fin de evaluar la capacidad de restauración del complejo de Golgi, del transporte y de la formación de inclusiones intracelulares. El propósito final de esta tesis doctoral es aportar nuevos datos que ayuden a explicar el papel del aparato de Golgi en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. 15 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA Tras el Alzheimer, la enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda entidad neurodegenerativa más común en humanos, patología de evolución progresiva que causa primariamente trastornos del movimiento, afectando la postura y la locomoción. En fases tardías de la enfermedad puede producir variadas alteraciones del comportamiento e incluso demencia, y suele acabar con una invalidez permanente del paciente. La prevalencia de la enfermedad es del 1% a nivel mundial y se presenta principalmente en personas mayores de 50 años (Polymeropoulos et al., 1996; Lang y Lozano, 1998a, b; Savitt et al., 2008). En España afecta a dos de cada cien personas mayores de 65 años y en Europa del 0,6 al 3,6 % de la población comprendida entre los 65 y 80 años de edad (de Lau y Breteler, 2006). Aunque un 20% de los enfermos con Parkinson están por debajo de los 50 años, la predominancia en adultos jóvenes es considerablemente menor y muy rara la aparición en niños; asimismo es poco prevalente en negros y japoneses. En la actualidad existe una extensa batería terapéutica paliativa para una enfermedad que aún no tiene cura. 1.1 Sintomatología de la enfermedad de Parkinson El tratado “Parálisis Temblorosa”, incorpora el término acuñado por el médico británico James Parkinson en 1817 cuando describió la enfermedad. Hoy en día se conocen posiblemente todas las variaciones sintomatológicas y los cambios que sufren durante la progresión de las diferentes fases de la enfermedad. La sintomatología primaria comprende las diferentes formas de disfunción motora, que se producen por el descenso en los niveles de dopamina (DA) sobre el estriado, reflejándose en los siguientes signos: acinesia (ausencia de movimiento), hipocinesia (disminución de la capacidad motriz), bradicinesia (lentitud en los movimientos voluntarios), rigidez muscular, tremor sin intención (en especial de las extremidades superiores), discinesia 19 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA (alteración del movimiento), acatisia (incapacidad de mantenerse quieto), voz monótona (a menudo entrecortada), aumento en la apertura de los párpados, amimia facial (pérdida de la capacidad gestual) y en general alteración de la postura (Oertel y Ellgring, 1995). También se pueden presentar otros síntomas asociados como síndrome emético, dolor testicular, síndrome abdominal, estreñimiento, signo de Meyerson o reflejo glabelar positivo, trastornos cognitivos e incluso demencia en fases terminales de la enfermedad (Pfeirffer, 2005; NINDS, 2009). 1.2 Aspectos generales sobre la dopamina La DA es una amina biógena cuya nomenclatura es “4-(2-aminoetil) benzeno-1,2 diol”, y al igual que las otras catecolaminas son sintetizadas a partir del aminoácido L-tirosina (Figura 1). La tirosina hidroxilasa (TH), la primera enzima en la ruta biosintética, limita la cantidad de catecolaminas producidas a través de un mecanismo fisiológico conocido como retroalimentación negativa por concentración de sustrato. La TH cataliza la adición de un grupo hidroxilo a la tirosina, formando 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina, conocida como L-DOPA. La siguiente reacción está catalizada por la DOPA descarboxilasa, que pasa L-DOPA a dopamina (Bäck et al., 1987). Una vez se ha sintetizado, se produce el almacenamiento en el interior de vesículas sinápticas conocidas como vesículas granulares o de núcleo denso. La DA es metabolizada por los sistemas enzimáticos monoamino-oxidasa (MAO) y catecol-O-metiltransferasa (COMT), siendo la enzima MAO tipo A, quien caracteriza a las neuronas dopaminérgicas (Finberg y Youdim, 1983). La acción enzimática de MAO-A sobre la DA resulta en la formación del ácido 3,4dihidroxifenilacético (DOPAC). Su administración sistémica mimetiza la acción simpática, pero como no atraviesa la barrera hematoencefálica (BH) carece de efectos centrales. Un precursor de la dopamina que atraviesa la BH es la sustancia denominada levodopa. De las catecolaminas presentes en el sistema nervioso central (SNC) 20 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA la DA representa más del 50%. Se encuentra en mayor abundancia en la sustancia negra del mesencéfalo, pero también está presente a otros niveles y especialmente en el sistema límbico. Los tractos dopaminérgicos en SNC son: vía nigroestriada (el mayor, 80% de toda la DA del cerebro, que se proyecta desde la pars compacta de la sustancia negra a los núcleos caudado y putamen del estriado), vía mesolímbica, vía mesocortical y vía tuberoinfundibular. La información emitida por las señales dopaminérgicas son traducidas en función de las áreas superiores de integración neuronal. Se le relaciona con diversas funciones motoras, neuroendocrinas, con la expresión de estados afectivos y la capacidad de juicio. En lóbulos frontales controla el flujo de información proveniente de otras áreas del cerebro. Los desordenes asociados con este transmisor en esta región del cerebro pueden causar alteración de funciones cognitivas como memoria, atención y resolución de problemas. La DA es liberada en situaciones de agrado y placer, por lo que se argumenta que las vías dopaminérgicas están alteradas en las personas adictas a la cocaína, anfetaminas y nicotina, las cuales incrementan los niveles de DA en estas áreas (Bahema et al., 2000). Figura 1. Ruta simplificada de la síntesis y metabolismo de catecolaminas (modificado de Erdelyi et al., 2011). 21 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.3 Etiología de la enfermedad de Parkinson En general el deterioro del movimiento que se presenta en esta enfermedad se produce por pérdida o disfunción del 60% al 80% de las neuronas de la sustancia negra pars compacta (SNc) (Bezard et al., 2010), estructura mesencefálica productora de dopamina (DA), una sustancia fundamental en los circuitos cerebrales implicados en el control del movimiento. Los síntomas asociados se producen por lesiones en otros centros neurales superiores, que incluyen al locus coeruleus, estructuras olfatorias anteriores, partes inferiores del tronco del encéfalo y daño de las terminales nerviosas productoras de noradrenalina. Las posibles causas de deterioro que predominan y precipitan selectivamente la pérdida neuronal en la EP serían las siguientes: • Factores tóxicos: tasas elevadas de incorporación de aluminio o cobre, ciertos pesticidas (como los organofosforados que son los más claramente relacionados con el Parkinson), algunos herbicidas y neurotoxinas endógenas que producen disfunción mitocondrial. • Factores nutricionales: Consumo elevado de hierro con su incremento paralelo en neuronas dopaminérgicas (Jenner y Olanow, 1996), dietas bajas en vitamina C y antioxidantes como el selenio y la vitamina E. • Factores genéticos: Mutación de genes: α-sinucleína (αs), fue el primer gen descubierto ligado a la enfermedad de Parkinson (Golbe et al., 1990), del cual se han identificado tres puntos de mutación: A53T, A30P y E46K (Lashuel et al., 2002). Otros genes identificados son: SOD1, PARK9, DJ-1 ó PARK-7 (Waragai et al., 2006), PINK-1 (Marongiu et al, 2009), LRRK2 ó PARK-8. PARK-2, que es la mutación más común hallada en la enfermedad de Parkinson, la cual genera un desorden en la función de la proteína parkina (Apartado 1,5) e induce parkinsonismo juvenil de carácter autosómico recesivo (Cookson et al., 2003; Cookson et al., 2005). Otras mutaciones se han hallado para UCH-L1 ó PARK-5 (Hattori et al., 2000; Leroy et al., 1998), así 22 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA como la mutación del gen para la proteína DT-diaforasa (Paris et al., 2009). También se pueden hallar mutaciones de otras proteínas, como la ubiquitina C, en una población específica de individuos con EP. Polimorfismos: gen que codifica para el receptor D2 de la dopamina, gen que codifica para la enzima DT-diaforasa (necesaria para evitar el ataque de metabolitos neurotóxicos generados específicamente por la oxidación de la dopamina). Adicionalmente, se ha comprobado que cuando la DT- diaforasa está inactiva debido a un polimorfismo o mutación genética, aumenta en 3,8 % la posibilidad de desarrollar Parkinson (Cárdenas et al., 2008). Variaciones específicas del ADN mitocondrial: de forma poco precisa se han descrito variaciones específicas del ADN de las mitocondrias, las cuales podrían tener la capacidad potencial de modificar el riesgo de aparición de la enfermedad (Gaweda et al., 2010). Otros trabajos no son tan consistentes pero, según los indicios encontrados, no descartan la posibilidad que variantes hereditarias del ADN mitocondrial en grupos poblacionales puedan contribuir al riesgo de aparición del Parkinson familiar (Simon et al., 2010). Se sigue trabajando para definir cómo estas posibles variaciones pueden conducir a la enfermedad de Parkinson. • Daño excitotóxico: se debe al incremento de la actividad glutaminérgica ante el descenso de la dopamina, provocando disfunción mitocondrial en neuronas dopaminérgicas (Antkiewicz, 2002). • Estrés oxidativo: supone el exceso de producción de radicales libres o el fallo en su eliminación. El estrés oxidativo es una característica común en la patogénesis de la lesión neural, en especial de las neuronas dopaminérgicas (Jenner y Olanow, 1996). Es de gran importancia la enzima DT-diaforasa, que bajo ciertas condiciones puede verse alterada su actividad y tal efecto se refleja en el incremento de especies reactivas de oxigeno (ROS), en su incapacidad de antagonizar el efecto negativo de la quinona (metabolito de la hidrólisis de la dopamina) y en la formación de αs protofibrilar (Cárdenas et al., 2008; Paris et al., 2009). 23 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA De la misma forma, otras enzimas con acción reductora y que se encuentran mutadas en el Parkinson no tienen la capacidad de prevenir el ataque oxidativo al que están expuestas de manera natural las neuronas nigrales. • Perturbación inflamatoria local: la neuroinflamación puede ser inducida por una variedad de sustancias que dañan zonas específicas del cerebro. De hecho, la acumulación de agentes pro-inflamatorios ha sido implicada como factor de riesgo medioambiental para la EP (Liu et al., 2003). Asimismo, se ha demostrado que las neuronas dopaminérgicas en los cerebros de los pacientes con Parkinson tienen niveles más altos de una enzima inflamatoria llamada COX-2 (Minghetti, 2004). Estos hallazgos sugieren que la inflamación puede estar involucrada en la pérdida de neuronas dopaminérgicas (Cicchetti et al., 2002; Hald y Lotharius, 2005; Etminan et al., 2008). En un modelo murino para la EP utilizando la neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), se observó un incremento en la activación del factor de transcripción para COX-2, lo que aumentó la síntesis de la enzima con posterior pérdida de neuronas productoras de DA. Por el contrario la inactivación del factor de transcripción para COX-2 mitigó la pérdida de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra (Wang et al., 2009). Adicionalmente, otros estudios alrededor de la neuroinflamación aseguran que los niveles cerebrales de AMP cíclico juegan un papel importante en la neuroprotección y en la respuesta neuroinflamatoria (Lonze y Ginty, 2002; Volakakis et al., 2010; Morales et al., 2011). • Tráfico intracelular alterado: nuevos hallazgos científicos ofrecen pruebas sólidas de que la enfermedad de Parkinson se origina por la alteración en el transporte de proteínas y lípidos dentro de la célula (Cooper et al., 2006; Lashuel y Hirling, 2006; Fan et al., 2008; Gitler et al., 2008), lo que se antepone a la aparición del estrés oxidativo o durante su presentación; fenómeno que también se relaciona con la alteración y posterior agregación de la proteínaαs (Lashuel y Hirling, 2006). 24 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Se piensa que las enfermedades neurodegenerativas pueden ser generadas por mecanismos comunes y en las cuales se comparten muchos aspectos en sus manifestaciones más tardías. En todas ellas se producen depósitos anormales de proteínas y déficit funcionales dramáticos de naturaleza progresiva, debidos a la pérdida de neuronas y a las alteraciones sinápticas (Hardy y Gwinn-Hardy, 1998). Probablemente el origen es multifactorial y son diversos los factores intrínsecos y extrínsecos que se asocian para ser posible su aparición. Asimismo, la aparente selectividad neuronal podría deberse a que cada enfermedad afecta en grado variable a poblaciones distintas de neuronas a lo largo del tiempo durante el que se desarrolla la enfermedad. La plasticidad propia del sistema nervioso permitiría una cierta compensación funcional hasta que se produce una cantidad de daño tan grande que genera un fallo catastrófico en la población neuronal más susceptible o afectada. Es de anotar que ciertamente la EP todavía es poco conocida a nivel científico y resulta muy difícil de prevenir, no obstante, los investigadores están haciendo grandes progresos para entender y tratar la enfermedad. 1.4 Fisiopatología de la enfermedad de Parkinson La lesión fundamental en la EP se produce sobre la sustancia negra pars compacta, un centro de comando neural implicado en funciones motoras, que ante su deceso progresivo disminuye su influencia dopaminérgica sobre el sistema estriatal (estructuralmente denominado el neoestriado, compuesto por los núcleos subcorticales: caudado y putamen) (Figura 2A, B). Esto genera una información errónea mediada por alteración de las eferencias de este sistema con proyección talámica, lo que conlleva a una disminución de señales excitatorias desde el tálamo sobre la corteza motora. Asimismo, desde el núcleo caudado y putamen, existe una vía inhibitoria hacia la sustancia negra mediada por el neurotransmisor GABA (ácido gamma-aminobutírico), esta interacción fisiológica mantiene cierto grado de inhibición de las dos áreas. No obstante, en la EP predominan los estímulos excitatorios sobre el estriado 25 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA (Figura 2A, B), ya que las fibras provenientes de la corteza cerebral segregan acetilcolina, neurotransmisor excitatorio, y la pérdida selectiva de neuronas nigrales ocasiona una importante deficiencia del neurotransmisor dopamina sobre el mismo sistema (Gerfen et al., 1990; Harrison et al., 1990), fenómeno que explica de forma general los referidos trastornos del movimiento (Lang y Lozano, 1998; Gerfen, 2006). A B Figura 2. Mecanismo fisiopatológico de la enfermedad de Parkinson. (A) Muestra las interconexiones fisiológicas y alteradas del control motriz entre la sustancia negra pars compacta y corteza cerebral. Las flechas azules representan los estímulos excitatorios y en rojo los inhibitorios. (B) Resume las vías de información motora alteradas en la EP. El signo “+” representa las señales excitatorias y el “-” las inhibitorias. La línea roja expresa bloqueo. 26 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Adicionalmente, hallazgos recientes han puesto de manifiesto que el axón de la neurona de la sustancia negra que se proyecta hacia el estriado puede ramificarse a lo largo de su recorrido, pudiendo así modular la actividad de otros centros neurales superiores, estructuras cerebrales cuya funcionalidad no es únicamente motora y que intervienen en la inteligencia del aprendizaje, memorización y representación de movimientos asociados a las diferentes conductas del individuo. Por otra parte, se ha demostrado que las neuronas de la sustancia negra más severamente afectadas en la EP tienen axones muy ramificados (Prensa, 2009). 1.5 Citopatología de la enfermedad de Parkinson Los cuerpos de Lewy (CL) son la principal característica neuropatológica de esta enfermedad (Forno et al., 1988). Friederich Heinrich Lewy en 1912 fue quien observó por primera vez estas estructuras en cerebros de pacientes con EP (Lewy, 1912), y se piensa que representan el mecanismo de adaptación y “supervivencia” con el cual las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta encierran a moléculas anormales, que de otra manera serían perjudiciales (Harrower et al., 2005; Uversky, 2007, Wakabayashi et al., 2007). Sin embargo, otros estudios sugieren que estas estructuras son un subproducto de procesos degenerativos dentro de las neuronas. El principal componente de los cuerpos de Lewy es la proteínaαs , la cual se encuentra incrementada en la fracción insoluble de cerebros procedentes de individuos con esta enfermedad (Spillantini et al., 1997). En la actualidad no cabe duda que esta proteína está íntimamente relacionada con el daño de las neuronas nigrales y que los mecanismos en los que puede participar en el proceso citopatológico son muy variados. Uno de estos mecanismos se describe por su interacción con la proteína parkina (Shimura et al., 2001), la cual de forma normal protege a las neuronas de una variedad de amenazas, como en la citotoxicidad de alfa-sinucleína. Sin embargo, en la mutación del gen PARK-2 en el individuo autosómico recesivo (la mutación más común en pacientes adultos jóvenes con EP) se genera una proteína con función alterada. Como 27 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA otras proteínas con dominios “RING-finger”, la parkina funciona como una E3 ligasa (Hattori et al., 2000; Shimura et al., 2000; Zhang et al., 2000), formando parte de la maquinaría celular que liga a otras proteínas con ubiquitina, como la αs, y las marca para su degradación por el proteasoma (Zhang et al., 2000). El efecto final observado de su modificación es un incremento en el metabolismo del transmisor dopamina, induciendo estrés oxidativo (Winner, 2008), muy posiblemente por la disfunción y el acúmulo progresivo de αs que provoca la retención intracitoplasmática de dopamina o su incorrecta incorporación en las vesículas. El defecto en el sistema de degradación interna de proteínas genera agregación de proteínas, exceso de toxinas y otras sustancias que podrían acumularse hasta niveles peligrosos, llevando a la muerte celular (Ciechanover y Brundin, 2003; Giasson y Lee, 2003; Moore et al., 2003). El sistema ubiquitina proteasoma (SUP) requiere interacciones entre varias proteínas, incluidas la parkina y UCH-L1. Por ello, la alteración en la funcionalidad de este sistema por diferentes fenómenos o por mutaciones de los genes anteriormente mencionados, puede explicar parcialmente como se origina la enfermedad de Parkinson. En el caso anteriormente descrito se produce estrés oxidativo seguido de agregación de la proteína αs, pero se sabe que su ac ú mulo, producto de la codificación del gen mutante o sobreexpresión de la misma, también produce estrés oxidativo (Gao, 2008), que a su vez genera una grave alteración del sistema ubiquitina proteasoma (Chen et al., 2005; Kawahara, 2008) y de la actividad mitocondrial (la disfunción mitocondrial es un participante importante en las enfermedades neurodegenerativas). Asimismo, existen actualmente fuertes evidencias que consideran la agregación y la alteración del metabolismo de la αs como los principales promotores de una grave disfunción en el tráfico intracelular, el cual conduciría a la degeneración y posterior muerte neural (Lee et al., 2006; García-Reitböck et al., 2010 Thayanidhi et al., 2010). Es por esto que presentes estudios se centran en investigar las rutas del deterioro celular asociadas con la proteína αs, sus funciones, interacciones con otras moléculas y la secuencia de eventos nocivos desde la agregación, con el propósito de intentar explicar el fenómeno que subyace desde la agresión hasta la degeneración y deceso de las neuronas dopaminérgicas. Es 28 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA de resaltar que ciertos estudios han demostrado que en ratones mutantes nulos para αs presentan resistencia total a la enfermedad donde no se presentan signos de agregación proteica (Dauer et al., 2002). 1.6 Terapéutica para la enfermedad de Parkinson Pese a que no existe cura para esta entidad neurodegenerativa y los tratamientos que se encuentran disponibles se limitan a paliar los síntomas, se ofrecen cada día métodos más sofisticados que intentan mejorar la calidad de vida del enfermo. Las investigaciones se suceden sin parar y en la actualidad hay ensayos preclínicos con numerosos fármacos y diferentes técnicas terapéuticas (Savitt et al., 2008). 1.6.1 Tratamiento convencional con fármacos antiparkinsonianos En la EP se produce una desaparición progresiva de las neuronas nigrales, generando una disminución de los estímulos dopaminérgicos sobre el sistema estriatal, lo que hace que el circuito responsable de modular el movimiento se vuelva superactivo. Por tal motivo se trata de forma lógica, restablecer el agonismo dopaminérgico a través de terapia farmacológica. Una de las formas clásicas, que se utiliza desde principios de la década de los sesenta, es la administración de levodopa (L-DOPA, 3,4-dihidroxi-L- fenilalanina) (Carlsson et al., 1957), una sustancia que las neuronas pueden usar para fabricar y reponer la dopamina que falta (Kitamura et al., 2003). La levodopa, funciona por lo general muy bien cuando aparecen los síntomas y durante un número de años que varía en función del paciente, pero al cabo de un tiempo suele dejar de ser efectiva y hay que buscar terapias alternativas. No obstante, algunos estudios apuntan a que medicamentos como la seleginina o rasagilina (inhibidores de la enzima monoamino-oxidasa tipo B, MAO-B, ver 29 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA apartado 3.2.1.1), administrados al principio de la enfermedad, podrían retrasar la necesidad del paciente de tratarse con levodopa (Clarke, 2008). Además del tratamiento con levodopa se han utilizado otros medicamentos agonistas de la dopamina, que comprenden los derivados de la ergolina (alcaloides del ergot) tal como bromocriptina (Foley et al., 2004), pergolina, cabergolina y dihidroergocriptina. Así como los no derivados de la ergolina, entre los que se encuentran el pramipexol, ropinirol y la apomorfina (Radad et al., 2005). Estos últimos desarrollados con la esperanza de ofrecer los beneficios de las ergolinas, pero sin sus efectos colaterales. Es de notar que cada fármaco posee efectos que están en función de otras condiciones presentes en cada paciente (Bonuccelli, 2003). Por ejemplo, se ha sugerido que enfermos con una variante de poca actividad del gen para COMT (enzima que metaboliza la dopamina) tienen peores resultados que otros en pruebas cognitivas, donde los medicamentos dopaminérgicos pueden empeorar la cognición en estas personas, tal vez porque la actividad reducida de la COMT hace que se acumule dopamina hasta niveles perjudiciales en algunas partes del cerebro. En el futuro, podría ser posible examinar tales diferencias genéticas individuales con el fin de mejorar el tratamiento de la enfermedad. Otros fármacos utilizados convencionalmente en el tratamiento del Parkinson son los siguientes: inhibidores de la COMT (entacapona y tolcapona), amantadina (promueve la liberación de DA y funciona como antagonista de receptores NMDA) (Sullivan y Toulouse, 2011) y anticolinérgicos (trihexifenidil, profenamina, benztropina y etopropazina) (Kitamura et al., 2002). Se encuentran en ensayos clínicos una variedad de nuevos tratamientos farmacológicos para la enfermedad de Parkinson, entre ellos: • Gangliósido GM1, que aumenta los niveles de dopamina cerebral. Se está estudiando si este farmaco puede reducir los síntomas, retardar la evolución de la enfermedad, o restablecer parcialmente las células cerebrales dañadas en el Parkinson (Schneider et al., 2010). 30 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA • Istradefilina, que podría mejorar la función motora en la enfermedad (Mizuno et al., 2010; Knebel et al., 2011). • ACP-103, es un potente agonista inverso de receptores para el neurotransmisor serotonina (5-HT/2A), donde su efecto disminuiría la gravedad de los síntomas parkinsonianos y las complicaciones asociadas con la administración de levodopa. Este fármaco fue evaluado en modelos animales para EP, consiguiendo resultados prometedores al reducir síntomas motrices como el tremor o las discinesias (Vanover et al., 2008). • Potenciales medicamentos neuroprotectores para ver si pueden retrasar la evolución de la enfermedad, como la creatina, coenzima Q10 (Yang et al., 2009), minociclina y GPI-1485 (Abdel-Salam, 2008), así como varios inhibidores de la MAO-B, incluidos la selegilina, lazabemida y rasagilina (Kitamura et al., 2002). • Factores neurotróficos, que respaldan la supervivencia, crecimiento y desarrollo de las células cerebrales (Korsching, 1993), son otro tipo de terapia potencial para la enfermedad de Parkinson. Se ha demostrado que un medicamento de éstos, el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF, Glial cell-derived neurotrophic factor) (Lin et al., 1993), protege las neuronas productoras de dopamina y promueve su supervivencia en modelos con MPP+ y 6-OHDA para enfermedad de Parkinson (Hou et al., 1996; Egger et al., 1999; Ma et al., 2000). Otros factores neurotróficos que pueden ser útiles para tratar la enfermedad comprenden la neurotrofina-4 (NT-4), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, Brain-derived neurotrophic factor), y el factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF-2, Fibroblast growth factor) (Sullivan y Toulouse, 2011). • Un tratamiento que puede mejorar algunos de los síntomas secundarios de la enfermedad de Parkinson, como la depresión y los trastornos de la deglución, es la quetiapina (Weintraub et al., 2011), además puede reducir la psicosis o la agitación en los pacientes parkinsonianos con demencia. 31 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA • Levetiracetam, un medicamento aprobado para tratar la epilepsia, podría reducir las discinesias en los pacientes con Parkinson sin interferir con otros medicamentos para la enfermedad (Stathis et al., 2011). 1.6.2 Cirugía versus tratamiento farmacológico 1.6.2.1 Cirugía de estimulación subtalámica bilateral (STN-DBS) La estimulación profunda del cerebro es una terapia aprobada por la Agencia del medicamento estadounidense (FDA, Food and Drug Admionistration). Consiste en implantar en el cerebro electrodos conectados a un dispositivo eléctrico que puede ser programado externamente y que funciona con baterías. Los electrodos estimulan las regiones del cerebro implicadas en el control del movimiento, bloqueando las señales que causan los temblores (Esselink et al., 2009). Sin embargo, la técnica es muy invasiva, requiere cirugía intracraneal y no funciona bien en todos los casos. No obstante, en un estudio dirigido por Francesc Valldeoriola del Servicio de Neurología del Hospital Clínico de Barcelona, se asegura que el mejor tratamiento para los afectados del Parkinson es la intervención quirúrgica, tanto desde el aspecto económico como en el de calidad de vida; además de poderse mantener en el tiempo a diferencia del tratamiento clásico con levodopa (Valldeoriola et al., 2007) 1.6.2.2 Palidotomía y Talamotomía Son métodos de destrucción cerebral selectiva, el más común de los dos procedimientos es la palidotomía, en el cual se destruye el globo pálido. La palidotomía puede mejorar los síntomas de temblor, rigidez y bradicinesia, posiblemente al interrumpir las conexiones entre el globo pálido y el cuerpo estriado o el tálamo. 32 Por el contrario en la talamotomía se destruye REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA quirúrgicamente parte del tálamo con el fin principal de reducir el temblor. Debido a que estos procedimientos causan la destrucción permanente de tejido cerebral, han sido mayormente reemplazados por la estimulación cerebral profunda en el tratamiento de la EP (Esselink et al., 2009). 1.6.3 Futuras dianas terapéuticas en la enfermedad de Parkinson 1.6.3.1 Sobre mecanismos específicos del tráfico intracelular El descubrimiento de la alteración del tráfico en la EP y de su relevancia en el subsecuente deceso neural ha abierto una nueva vía al desarrollo de fármacos contra el Parkinson. Estos hallazgos proporcionan una base para descubrir nuevas estrategias terapéuticas, y acelerar el descubrimiento de tratamientos más efectivos contra esta enfermedad. Una de las causas que desencadenaría el Parkinson podría ser el fallo en el transporte de proteínas entre dos compartimentos claves de la célula, el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi. Se trata de un hallazgo importante ya que hasta ahora la causa de la enfermedad de Parkinson se desconoce, y cualquier avance en esta línea es muy relevante. Una o varias proteínas diana que pudieran restablecer ese tráfico interrumpido o al menos reparar parte del problema podrían ser la base para nuevos tratamientos (Cooper et al., 2006). 1.6.3.2 Incremento de señales sobre receptores cannabinoides Investigaciones recientes sugieren que ciertas sustancias que provocan efectos similares a los del cannabis podrían servir para iniciar nuevas vías de tratamiento contra la enfermedad de Parkinson (Morgese et al., 2007). El fármaco experimental llamado URB597, que ralentiza la disolución de los endocannabinoides en el cerebro, conjuntamente a la terapia de agonismo 33 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA dopaminérgico mostró en un modelo de ratón, una recuperación sorprendente, básicamente de normalidad (Kreitzer y Malenka, 2007; Rodríguez et al., 2011). 1.6.3.3 Vacuna para modificar el sistema inmunitario El objetivo de esta terapia es buscar un mecanismo que pueda proteger a las neuronas productoras de dopamina. En un modelo de ratón para la enfermedad de Parkinson, se utilizó una vacuna conteniendo células inmunitarias tratadas con una droga llamada copolímero-1, la cual incrementa el número de células T inmunitarias secretoras de citocinas antiinflamatorias y factores de crecimiento. La vacuna modificó la conducta de las células gliales en el cerebro para que sus respuestas fueran beneficiosas en lugar de perjudiciales. Se redujo la inflamación, el grado de neurodegeneración y aumentó la producción de factores de crecimiento nervioso (Laurie et al., 2007). 1.6.3.4 Fármacos para contrarrestar la citotoxicidad de α-sinucleína Los investigadores han empezado ya a probar compuestos que revierten la citotoxicidad de la proteína αs. Se han analizado más de 150.000 fármacos. 1.6.3.5 Vacuna que contiene α-sinucleína La vacuna, conocida como PD01, ha sido objeto de numerosos ensayos preclínicos, que han confirmado su principio de acción. Esta vacuna podría ofrecer por primera vez la oportunidad de tratar las causas de la enfermedad de Parkinson, actuando específicamente contra la proteínaαs humana, la cual está fuertemente asociada al perfil clínico de la patología. Así, la reducción en la concentración de αs en el cerebro se reflejaría en un efecto positivo sobre la progresión del Parkinson (Schneeberger et al., 2010). Igualmente, un ensayo de inmunización con αs humana, realizado en un modelo de ratón transgénico 34 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA para EP, mostró producción de anticuerpos con alta afinidad relativa que se asociaron a la disminución en la agregación αs de en soma y sinapsis neuronal. Además, los niveles de neurodegeneración fueron mucho menor y los anticuerpos producidos reconocieron la proteína αs aberrante asociada a la membrana de las neuronas promoviendo su degradación (Masliah et al., 2005). 1.6.3.6 Medicina regenerativa En un plazo difícil de establecer, el trasplante de células madre embrionarias para reemplazar las neuronas perdidas en la enfermedad podrían transformarse en generadoras inagotables de dopamina. En un modelo de rata de la enfermedad se trasplantaron células progenitoras neurales derivadas de células madre embrionarias. Las células parecieron desencadenar una mejoría en varias pruebas de conducta, aunque relativamente pocas células trasplantadas se convirtieron en neuronas productoras de dopamina (Torres et al., 2007). Sin embargo, se están desarrollando nuevos métodos para mejorar el número de células productoras de dopamina que pueden formarse de células madre embriónicas en cultivo, asimismo, también se está explorando si las células madre de cerebros de adultos pueden ser útiles para tratar la enfermedad de Parkinson (Fricker-Gates y Gates, 2010). Se ha demostrado que el cerebro de humanos adultos contiene células progenitoras multipotentes que pueden multiplicarse y formar todos los tipos celulares principales del cerebro, incluso neuronas (Moe et al., 2005; Siebzehnrubl et al., 2011). 1.6.3.7 Terapia génica Es otro enfoque para tratar la enfermedad de Parkinson. En estudios de terapia genética en modelos animales de la enfermedad se están probando distintos genes y técnicas de suministro de genes en un esfuerzo por refinar este tipo de tratamiento (Burton et al., 2003). 35 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.6.4 Terapias alternativas para la enfermedad de Parkinson 1.6.4.1 Relacionadas a los aspectos nutricionales: • Aunque actualmente no existe evidencia de que los suplementos dietéticos pueden retrasar la enfermedad de Parkinson, varios estudios están examinando si puede ser útil la complementación con vitaminas del complejo B (Jia et al., 2010). • Mantenimiento del balance energético, ya que el desequilibrio dietético afecta la actividad de la dopamina en el cerebro. • Consumo adecuado de sustancias dietéticas con alto poder antioxidante en el organismo (Perumal et al., 1992). 1.6.4.2 Biomarcadores en la enfermedad de Parkinson Los biomarcadores para enfermedad Parkinson poseen características mensurables que pueden revelar si la enfermedad está desarrollándose o evolucionando. Tales biomarcadores pueden ayudar a los médicos a detectar la enfermedad antes de que aparezcan los síntomas y mejorar su diagnóstico. También mostrarían si los medicamentos y otros tipos de terapia tienen un efecto positivo o negativo sobre el curso de la enfermedad. Uno de los biomarcadores más promisorios para la enfermedad son las técnicas con imágenes cerebrales. Por ejemplo, algunos investigadores están usando la Tomografía con Emisión de Positrones (PET) cerebral para tratar de identificar cambios metabólicos en los cerebros de personas con Parkinson y para determinar cómo estos cambios se relacionan con los síntomas de la enfermedad (Savitt et al., 2006). Otros biomarcadores potenciales para la enfermedad son las alteraciones en la expresión genética. 36 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.6.4.3 Fisioterapia La rehabilitación física es esencial para que la persona mantenga su autonomía. Los ejercicios más indicados son los que mejoran el equilibrio, aquellos que trabajan la coordinación de movimientos y los ejercicios respiratorios, siempre en función de la situación particular y de modo progresivo. 1.6.4.4 Terapia ocupacional Trata de conseguir que la persona tenga la máxima independencia funcional en el desarrollo de las actividades de la vida cotidiana, ello permite una mejor adaptación e integración social. 1.6.4.5 Estimulación eléctrica transcraneal Estudios clínicos están tratando de probar si la polarización eléctrica transcraneal o la estimulación magnética transcraneal puede reducir los síntomas de Parkinson. En la polarización eléctrica transcraneal, se usan electrodos colocados en el cuero cabelludo para generar una corriente eléctrica que modifica las señales en la corteza cerebral, y en la estimulación magnética transcraneal se usa una espiral de alambre aislado en el cuero cabelludo para generar una corriente eléctrica breve. 1.6.4.6 Estímulo sensorial repetitivo El Parkinson se caracteriza porque quienes lo padecen sufren temblores. Sin embargo, cuando la medicación habitual deja de surtir efecto se produce en ellos un fenómeno casi opuesto, su marcha se bloquea y quedan inmóviles, 37 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA fenómeno conocido como 'crisis de bloqueo'. No obstante, si a estos pacientes se les marca un ritmo sensorial pueden salir de esta crisis relativamente fácil, lo que mejora la vida cotidiana de los enfermos. En los años sesenta ya se había observado que a muchos enfermos les ayuda a 'desbloquearse' la simple visión de una franja de rayas coloreadas, también son satisfactorios otros estímulos visuales, la música y variados estímulos sonoros, así como sensaciones táctiles; pero es el estímulo sonoro el que mejor funciona, ayudando a salir de sus bloqueos hasta a un 80% de pacientes. En todos los casos, la frecuencia de los estímulos y el ritmo, deben ser ajustados para cada paciente, no es curativo, no suple el tratamiento farmacológico ni evita el avance de la enfermedad, solo se considera una terapia de apoyo (del Olmo y Cudeiro, 2005; Arias y Cudeiro, 2008). 1.6.4.7 Calidad de vida y eficacia La valoración de la terapéutica se puede contrastar mediante escalas que valoran la actividad motora de la enfermedad, o escalas de medición genéricas de calidad de vida asociado a la salud en general. 38 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2 α-SINUCLEÍNA Y PARKINSON La principal característica neuropatológica de la EP la constituyen las inclusiones proteicas intracelulares conocidas como cuerpos de Lewy (Lewy, 1912; Forno et al., 1988; Savitt et al., 2008; Kosaka, 2010), agregados fibrilares donde se han identificado más de 70 moléculas (Tabla 1), considerados marcadores de neurodegeneración. Se han descrito dos tipos: troncoencefálico, que es una masa eosinófila simple o múltiple esférica o elongada con núcleo denso y halo periférico; y el cortical, que también es eosinófilo pero irregular en su forma, estructura pobremente definida y a menudo sin halo o centro denso (Wakabayashi et al., 2007) (Figura 3). Figura 3. Cuerpos de Lewy (CL) y neuritas de Lewy en pacientes con enfermedad de Parkinson (A,C,E,F), con demencia de CL (B) y enfermedad de CL (D). (A) CL concéntrico en una neurona pigmentada de la SN. H&E. (B) CL tipo cortical en corteza temporal. H&E. (C) Típico CL en una neurona pigmentada de la SN inmunomarcado con anti-αs. Note que el núcleo central no es inmunoreactivo. (D) Múltiples neuritas de Lewy en el núcleo vagal dorsal inmunomarcados con anti- αs. (E) Cuerpo pálido en una neurona pigmentada de la SN. H&E. (F) Co-ocurrencia de un cuerpo pálido y dos CLs en una neurona pigmentada de la SN. H&E. Barra de calibrado, 10 µm. (Wakabayashi et al., 2007). 39 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 1. Componentes moleculares de los cuerpos de Lewy (Wakabayashi et al., 2007). COMPONENTES MOLECULARES DE LOS CUERPOS DE LEWY MOLECULA TIPO DE CUERPO DE LEWY Troncoencefálico Cortical Agrina + ND Activadores del proteasoma (PA700, PA28) + + αβ-cristalina - +/- α2-macroglobulina + ND α-sinucleína + + ND +/- β -TrCP + + Calbindina-D + ND Ciclina β + ND Citocromo c + - +/- + Cromogranina A + + Culina-1 + + +/- - Dorfina + + Enzima (E1) activadora de ubiquitina + + Enzima UbcH7 (E2) de conjugación a ubiquitina + ND +/- - - +/- +/- ND Heme oxigenasa-1 + + Histona deacetilasa 4 + + Immunoglobulina (IgG) + ND I kBα + + Kinasa 2 rica en leucina + + Kinasa 5 dependiente de ciclina + + kinasas reguladas por señal extracelular + - Lipidos + + NEDD8 + + Neurofilamentos + + NFk B + + NUB1 + + Omi/HtrA2 + ND Pael-R + ND Parkina + + ATPasa de la subunidad 26S del proteasoma Clusterina/apolipoproteina J DJ-1 Factor de crecimiento de fibroblastos Fosfolipasa C-δ Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa 40 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA COMPONENTES MOLECULARES DE LOS CUERPOS DE LEWY MOLECULA TIPO DE CUERPO DE LEWY Troncoencefálico Cortical Proteína 1 asociada a microtúbulos + - Proteína 1B asociada a microtúbulos (MAB 5) + + Proteína 2 asociada a microtúbulos + + Proteinasa multicatalítica +/- + Proteína MxA Protein kinasa II dependiente de calcio/calmodulina Proteína 14-3-3 +/- ND + + + + Proteína-G acoplado al receptor de kinasa 5 + - proteínas del amiloide relacionadas a la gelsolina Proteínas de choque de calor (Hsp 27, 40, 60, 70, 90 y 110) Proteína de interacción al COOH-terminal de Hsp70 Proteínas del complemento (C3d, C4d, C7 y C9) + + + + + ND +/- +/- Proteína del retinoblastoma Proteína/25 que promueve la polimerización de tubulina Proteína precursora del amiloide + - + + + +/- Proteínas relacionadas al agresoma/centrosoma + + Proteoglicanos del condroitín sulfato + + Productos terminales de la glicación avanzada + + p35 + + p38 + ND Prolil-isomerasa Pin 1 + ND Proteasoma + + p62/sequestrosoma 1 + ND PINK1 +/- - ROC1 + + Sept4/H5 + + SIAH-1 Superóxido dismutasa 1 (Cu/Zn superoxido dismutasa) Superóxido dismutasa 2 (Mn superoxido dismutasa) Sinfilina-1 + ND + ND +/- ND + + +/- +/- + ND +/- +/- Transglutaminasa tisular + ND Torsina-A + + Tropomiosina - + Sinaptofisina Sinaptotagmina XI Tau 41 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA COMPONENTES MOLECULARES DE LOS CUERPOS DE LEWY MOLECULA TIPO DE CUERPO DE LEWY Troncoencefálico Cortical Tubulina + ND Transportador vesicular de monoaminas 2 + - Tirosina hidroxilasa + ND Ubiquitina + + ND + Ubiquitina C-terminal hidrolasa +, positivo; +/-, débilmente positivo; -, negativo; ND= no descrito. Ultraestructuralmente los cuerpo de Lewy están compuestos de estructuras filamentosas que se asemejan a neurofilamentos, pero más gruesos y sin ramificaciones; además en el tipo troncoencefálico se observa en el núcleo estructuras tipo vesicular o circular (Wakabayashi et al., 2007). El principal componente de estas inclusiones es la proteína αs que se acumula en regiones corticales y subcorticales en la EP, lo que la hace clave de estudio en esta enfermedad y en las llamadas sinucleopatías. Además siempre está presente en las formas raras de presentación familiar y en los casos esporádicos de la EP (Spillantini et al., 1998). Los cuerpos pálidos son estructuras menos eosinófilas que los cuerpos de Lewy y coexisten frecuentemente con estos en la misma neurona, siendo los cuerpos de Lewy más pequeños (Figura 3). Tienen áreas hialinas pero sin halo; ultraestructuralmente tienen material granular o vesicular esparcido junto con filamentos. Los cuerpos pálidos son débilmente positivos a ubiquitina e intensamente inmunoreactivos para αs. En la fase temprana de la EP son más abundantes los cuerpos pálidos, lo que se puede demostrar por la fuerte correlación de immunoreactividad a ubiquitina entre cuerpos pálidos y cuerpos de Lewy; este fenómeno sugiere que los cuerpos de Lewy se forman a partir de los cuerpos pálidos (Olanow et al., 2004; Wakabayashi et al., 2007). 42 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 Localización de la proteína α-sinucleína Está ampliamente distribuida por todo el sistema nervioso, pero es especialmente tóxica para las células dopaminérgicas (Rochet et al., 2004; Yasuda et al., 2007). Inicialmente se identificó como una proteína asociada a las vesículas sinápticas pero también se localiza en el citosol y en el núcleo (Uversky, 2007). Tiene la capacidad de asociarse en un 50% con fosfolípidos de membrana y el otro 50% es fundamentalmente citosólico (Lotharius y Brundin, 2002). 2.2 Papel fisiológico de la proteína α-sinucleína Estudios histoquímicos han demostrado que αs está asociada con vesículas presinápticas, lo que sugiere funcionalidad de esta proteína en aspectos relacionados con la transmisión sináptica (Maroteaux et al., 1988; Polymeropoulos et al., 1997), así como en el mantenimiento del reservorio de vesículas sinápticas (Cabin et al., 2002). Aunque se desconoce el mecanismo exacto, se ha postulado que la proteína αs podría cumplir un papel importante en la función neuronal al regular la formación de las vesículas sinápticas desde endosomas tempranos a través de interacciones con la fosfolipasa D2 (PLD2) (Cockcroft, 2001), regulación en el transporte de vesículas sinápticas (Gitler et al., 2008) y modulación del reciclaje de las mismas al inhibir PLD2 (Jenco et al., 1998; Ahn et al., 2002). PLD2 es la enzima que cataliza la hidrólisis de fosfatidilcolina para producir ácido fosfatídico y colina (Cockcroft, 2001; Lotharius y Brundin, 2002). El ácido fosfatídico es un lípido crucial en los procesos de unión y fusión de vesículas (Riebeling et al., 2009). Así, está implicado en reclutar moléculas adaptadoras que disparan la gemación de vesículas de la membrana donadora y también en reclutar proteínas de fusión a la membrana (Cockcroft, 2001). Así, el efecto de la modulación de la actividad de PLD2αspor podría ser un mecanismo importante de regulación del ciclo de vesículas sinápticas (Figura 43 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4). A pesar de estos hallazgos, en un reciente estudio donde se utilizaron diferentes líneas celulares, incluyendo la línea celular PC12, se demostró que αs no generaba inhibición significativa de la actividad de PLD2, más bien podría ser un efecto de la citotoxicidad general causada por sobreexpresión o expresión de las formas anormales de αs (Rappley et al., 2009). Se sugiere que αs podr ía servir como chaperona para el correcto plegamiento de proteínas SNARE ligadas al proceso sináptico (Chua y Tang, 2006; Cooper et al., 2006). Además, estudios con ratones transgénicos involucran la proteína αs en el ensamblaje de complejos de proteínas SNARE, las cuales son necesarias para la fusión de vesículas con la membrana plasmática (Gitler et al., 2008). Hay evidencias que prueban que esta proteína está implicada en la producción, almacenamiento y liberación de dopamina (Cabin et al., 2002; Lotharius y Brundin, 2002; Shun et al., 2005; Larsen et al., 2006; Larsen et al., 2006). Al influenciar la actividad de la enzima tirosina hidroxilasa (TH) se modula la producción de ésta catecolamina (ver apartado 3.2.1.1). Como ejemplo, se ha observado que al silenciar la síntesisαs dese produce un incremento de la actividad TH aumentando la producción de dopamina (Liu et al., 2008). El papel de αs ser ía el de molécula reguladora en la síntesis de dopamina, evitando que concentraciones elevadas de esta amina se oxide en el citosol y provoquen estrés oxidativo, que daría lugar a múltiples consecuencias patogénicas, incluyendo la formación de αs protofibrilar (Volles, et al., 2001). Su función en la plasticidad neural se ha demostrado analizando el aprendizaje motor del trino, en una especie de canario donde incrementa la inmunoreactividad del análogo a αsla en el proceso de aprendizaje y disminuye después de éste (George y Clayton, 1988). 44 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Figura 4. Papel fisiológico de la proteína α -sinucleína. Terminal presináptica de neurona dopaminérgica que representa la función potencial de la proteína αs en la regulación del almacenamiento de la DA. La DA se sintetiza en el citoplasma e inmediatamente pasa a vesículas monoaminérgicas. La proteína αs al unirse a fosfolípidos de membranas cambia de su estructura secundaria, en espiral aleatoria, a un 83% en α-hélice. Las mutaciones enαs podrían resultar en una reducción del número de vesículas que están disponibles para el almacenamiento de dopamina, lo que lleva a una acumulación de dopamina libre en citosol y el aumento de los niveles de estrés oxidativo (Julie Lotario y Patrik Brundin, 2006). 2.3 Bioquímica de la proteína α-sinucleína El gen de αs fue por primera vez identificado en la raya eléctrica Torpedo californica, cuyos órganos eléctricos están inervados por grandes terminales colinérgicas (Maroteaux et al., 1988). La substancia P, un péptido neurotrasmisor y neuromodulador generado a partir del mismo precursor, preprotakinina, se detectó también en la raya Rajabatis (Dahlstedt, 1959). De esta sustancia igualmente deriva otro péptido, la substancia K y probablemente la sinucleína. La familia de las sinucleínas, además de αs, incluye a las 45 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA proteínas beta-sinucleína (βs) y γ-sinucleína (γs). Entre las características más notables destaca que αs y βs, a diferencia de γs, se localizan en las terminales nerviosas presinápticas, y que βs y γs no aparecen en los cuerpos de Lewy ni poseen propiedades agregativas in vitro. Se ha demostrado que la proteína βs es capaz de inhibir la agregación (fibrilación) de αs in vitro, observándose un comportamiento similar en estudios in vivo sobre cerebro de ratones. Los miembros de esta familia de sinucleínas contienen entre 127 y 140 aminoácidos, con un 55 y 62% de homología de secuencia (Clayton y George 1998). La proteínaαs contiene 140 amino ácidos y aparece en el material genético del cromosoma 4q21. La βs contiene 134 aminoácidos, aparece en el material genético del cromosoma 5q55 y no se conoce en la actualidad alguna patología neurogenética asociada a ella (Spillantini et al., 1998). La conformación nativa de αs es auto -inhibitoria de su agregación, mientras que las formas mutantes de αs ligadas al inicio temprano de la EP desestabilizan interacciones terciarias específicas que son esenciales para que αs adopte su conformación nativa (Lotharius y Brundin, 2002; Mandal et al., 2006; Waxman y Giasson, 2009). Se ha demostrado que se puede unir a vesículas in vivo e in vitro a través de fosfolípidos de membrana por interacción de dos terceras partes de su dominio amino terminal. Esta interacción induce un dramático cambio de su estructura secundaria, pasando de una estructura espiral aleatoria a una en α-helix (Davidson et al., 1998) en más de un 80% de su estructura. En la mutación Ala30Pro de αs se altera la capacidad de interaccionar con la membrana de las vesículas (Jensen et al., 1998; Jo et al., 2002). En la mutación Ala53Thr no se afecta la unión a vesículas pero si a membranas planas (Jo et al., 2000). 2.4 Posibles alteraciones que dan lugar a la agregación de αsinucleína Mutaciones del gen de la proteína αs en A30P, A53T (principal mutación) y E46K, inducen su propia agregación (forma familiar autosómico dominante). 46 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA También la duplicación y triplicación del gen provocan agregación αs, de conduciendo a la presentación de la EP (Polymeropoulos et al., 1997; Kruger et al., 1998; Singleton et al., 2003; Chartier-Harlin et al., 2004; Ibanez et al., 2004; Zarranz et al., 2004). La cinética de fibrilación αs de depende de factores tales como la temperatura, pH e interacción con poliaminas e iones metálicos. Se ha demostrado que una variación grave del pH y eventos de estrés oxidativo a nivel celular producen cambios de la conformación de la proteína αs, proteína que en su forma normal nativa carece de una estructura estable. La disminución en el pH celular transforma la proteínaαs, en un periodo corto de tiempo, a una conformación parcialmente plegada, potenciando formaciones oligoméricas prefibrilares que terminan en agregados fibrilares (Uversky et al., 2001). Este fenómeno también ocurre cuando la proteína αs es sometida a incrementos de temperatura de forma continua. La conformación parcialmente plegada puede ser transitoria, pero ante la presencia crónica de estos factores (cambio de pH y ROS), se hace estable y da lugar a los pasos subsecuentes hasta la forma fibrilar. Más del 90% de la forma insoluble deαs en sinucleopatías es fosforilada en serina 129 (Anderson et al.,2006), de forma normal sólo el 4% de Ser 129 esta fosforilada. Esta fosforilación promueve la oligomerización y agregación, fenómeno demostrado in vitro con αs recombinante fosforilada en dicho aminoácido (Fujiwara et al., 2002). Existen diferentes mecanismos patogénicos que guían la agregación de la αs, como se ha demostrado a través del estudio de los casos familiares versus los no familiares, donde en los primeros la mutación de αs promueve su propia agregación, aunque en los no relacionados con mutaciones también presentan agregación (Spallantini et al, 1997). El cobre se une específicamente al extremo N-terminal de αs, induciendo su agregación bajo condiciones que podrían ser relevantes para la EP (Wright et al., 2009; Binolfi et al., 2010). Asimismo el papel del cobre en otros desórdenes neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, sugiere 47 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA que las perturbaciones en la homeostasis de este ion metálico podrían constituir un elemento común en la etiología de estos desordenes neurodegenerativos (Feaga et al., 2011). Como conclusión se piensa que la agregación de proteínas impide la actividad protectora en las terminales sinápticas, lo que causa una lesión retrógrada por efecto tóxico, lo que desencadena la apoptosis o muerte celular por necrosis. 2.5 Papel citopatológico de la agregación de α-sinucleína Una cuestión innegable para la proteínaαs es que sus formas alteradas tienen un efecto devastador sobre la integridad de las neuronas nigrales dopaminérgicas. Estas formas alteradas de αs generan dos rutas citopáticas: una de ellas desencadenada por la función anormal de la proteína y la otra por el efecto tóxico de la forma aberrante. La modificación deαs causa defectos en el transporte de vesículas. La clave citopatológica de esta proteína puede recaer sobre su efecto tóxico en la alteración del transporte de vesículas desde el retículo endoplásmico (RE) (Cooper et al., 2006; Gitler et al., 2008). Las vesículas del RE emergen pero su acoplamiento o fusión al Golgi esta inhibido. La sobreexpresión de la GTPasa Rab1 (ver apartado 4.3.1, funciones de las proteínas Rab GTPasas) reconstituye este tráfico (Cooper et al., 2006). Estos hallazgos sugieren que αs altera la maquinaria de transporte. Se sabe además que la agregación de αs genera estrés del RE, promoviendo la acumulación de otras proteínas mal plegadas (Gitler et al., 2008), lo que exacerba el daño en el transporte. Hay estudios que demuestran que la agregación de αs afecta el reciclaje de vesículas sinápticas, generando una acumulación de dopamina en el citoplasma, lo que desencadena estrés oxidativo. (Lotharius y brundin, 2002). Esta hipótesis se basa en la alteración de dos funciones importantes de la proteína αs (ver apartado 2.2), una de ellas a través de la modulación de la 48 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA actividad de la enzima tirosina hidroxilasa (Liu et al., 2008) y la otra que presenta a αs como reguladora del ciclo de ves ículas sinápticas. En neuronas dopaminérgicas las formas aberrantes, sobreexpresada o mutada podrían generar una reducción del número de vesículas, principalmente en la reserva de vesículas sinápticas localizadas en los botones axónicos (Murphy et al., 2000; Cabin et al., 2002). Este fenómeno provocaría un incremento progresivo en los niveles de dopamina citosólica, especialmente si la retroalimentación negativa de TH por αs se encuentra alterada. El efecto subsecuente es un incremento del estrés oxidativo dependiente de dopamina libre en citosol (Lotharius et al., 2002; Xu et al., 2002; Zhou et al., 2002). Asimismo, la producción de ROS a nivel intracelular induce que más αs pase a la forma protofibrilar, produciendo permeabilización de vesículas dopaminérgicas, lo que exacerba el estrés oxidativo en estas neuronas. Un incremento de αs induce la acumulación de αs fibrilar, de parkina y α tubulina, afectándose su solubilidad. Como consecuencia decrece la ubiquitización deα -tubulina, lo que produce la alteración del citoesqueleto (Kawahara et al., 2008). La proteína parkina es la E3 ligasa paraα - tubulina y αs, entre otras (Hattori et al., 2000), pero αs insoluble afecta a su ligasa. Se ha demostrado que la sobreexpresión de αs aumenta los niveles de parkina, encontrándose de forma anormalmente incrementada en la fracción insoluble; el mismo fenómeno ocurre si se utiliza un inhibidor del sistema proteasoma (Kawahara et al., 2008). α -sinucleína agregada altera de forma perjudicial la expresión genética, lo que puede generar daños graves de las funciones internas de la célula. 49 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3 MODELOS EXPERIMENTALES ENFERMEDAD DE PARKINSON El desarrollo de modelos UTILIZADOS experimentales neurodegenerativa se ha encaminado en reproducir para PARA esta aquellas entidad alteraciones histológicas y neuroquímicas que se producen por daño y pérdida de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta. Aunque los modelos animales y celulares son de gran beneficio para el entendimiento de la patogénesis, solo pueden abarcan parcialmente algunos de los frentes fisiopatológicos y citopatológicos que se desarrollan de forma natural en la EP. No obstante, brindan información valiosa de mecanismos implicados y son el primer paso para evaluar posibles tratamientos. 3.1 Modelos animales Existe mucha variabilidad entre modelos, pero el propósito de un buen modelo animal es lograr reproducir, a través de procedimientos estandarizados, el mayor acercamiento a los eventos citopáticos que ocurren de forma natural en la EP. Esto permite entenderla mejor y brinda mayor posibilidad de asociarlos a nuevas terapias. 3.1.1 Parkinsonismo inducido por neurotoxinas Las sustancias 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y 1-metil-4-fenil-1,2,3,6 tetrahidropiridina (MPTP) han sido utilizadas de forma clásica para reproducir los desórdenes neurológicos que se presentan en la EP (Dauer y Przedborski, 2003). Ambas actúan de forma selectiva como agentes que perturban o destruyen el sistema catecolaminérgico. Además existen otras sustancias como rotenona (Norazit et al., 2010), maneb y paraquat que administradas 50 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA sistémicamente pueden inducir ciertas características particulares de la EP (Dauer y Przedborski, 2003; Schober, 2004; Duty y Jenner, 2011). 3.1.1.1 6-hidroxidopamina 6-OHDA, sustancia aislada y conocida desde la década del 60 (Ungerstedt, 1968), análogo hidroxilado de la dopamina natural que compite de forma dominante por los receptores que captan catecolaminas. Es considerada la neurotoxina más utilizada en el desarrollo de modelos experimentales en roedores, aunque también resulta ser un tóxico efectivo en gatos y primates, produciendo degeneración y muerte de la sustancia negra (Beal, 2001). No atraviesa la barrera hematoencefálica, por lo que carece de acción neurotóxica sobre el sistema nervioso central si es administrada sistémicamente; no obstante, puede ser inyectada a nivel intracerebral logrando lesionar de forma selectiva todos los sistemas catecolaminérgicos del encéfalo, observándose cambios trascurridas 12 horas (Faull y Laverty 1969). Este fenómeno lesivo se debe a su alta afinidad por el sistema de transporte de aminas biógenas (Luthman et al., 1989), lo que explica el daño severo y destructivo de esta sustancia sobre neuronas adrenérgicas simpáticas postganglionares cuando es administrada de forma sistémica. En 1968, Ungerstedt describió que la inyección estereotáxica (técnica neuroquirúrgica que posibilita el acceso a zonas profundas del cerebro mediante una aguja de biopsia) de 6-OHDA en el haz nigroestriado inducía un daño selectivo de las neuronas productoras de dopamina de la sustancia negra. Seguidamente, se demostró bajo la misma técnica que 6-OHDA inducía degeneración tanto en las neuronas de la SNc que proyectan al estriado como las del área tegmental ventral (ATV) que forman parte del sistema dopaminérgico mesolímbico, y las cuales no se afectan en los pacientes con Parkinson. Estos hallazgos indican que histopatológicamente la lesión producida por 6-OHDA a este nivel es más extensa que en los pacientes con EP de ocurrencia natural, por lo cual muchos de los modelos con esta 51 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA sustancia se han limitado a inducir la lesión directamente, inyectando sólo en zonas específicas que involucran la SN pars compacta, para evitar de esta manera la afectación de las neuronas dopaminérgicas del área ATV. Sin embargo, esta técnica tiene el problema de inducir degeneración, muerte rápida y extensa de casi todas las neuronas productoras de DA, manifestando eventos citopatogénicos que difieren sustancialmente de aquellos que ocurren de forma lenta y progresiva en la EP. Por el contrario, la inyección estriatal de 6-OHDA reproduce una degeneración lenta y progresiva de las neuronas productoras de DA de la sustancia negra ipsilateral a la lesión, debido posiblemente a la degeneración neuronal retrógrada secundaria a la lesión de terminales de DA estriatales, las cuales presentan pérdida neuronal dependiente de la dosificación administrada de la neurotoxina (Sauer y Oertel, 1994; Przedborski et al., 1995). Desde el punto de vista de la sintomatología motora se sabe que al inyectar unilateralmente 6-OHDA directamente sobre la SN se produce un desequilibrio en los niveles de DA entre los 2 lados del encéfalo a nivel del sistema estriatal. Este fenómeno se presenta inmediatamente después de la cirugía y el cual genera de forma espontánea una conducta motriz alterada donde el animal rota de forma ipsilateral a la lesión. Asimismo, estos animales con lesión unilateral de la vía nigroestriada siguen presentando el mismo patrón de rotación cuando seguidamente se les administran sustancias que estimulan la producción y liberación de dopamina (Przedborski et al., 1995). No obstante, cuando reciben estímulos agonistas dopaminérgicos muestran rotación contralateral a la lesión, que se explica como consecuencia de la denervación, induciendo una regulación positiva en el número de receptores para DA en el estriado del mismo lado a la lesión, contrario a las anfetaminas que estimulan la liberación de dopamina en las terminales presinápticas aumentando la concentración de DA únicamente en el estriado contralateral a la lesión, lo que produce un desequilibrio funcional a favor de éste (Schober, 2004). Neuroquímicamente, las neuronas dopaminérgicas aún funcionales tratan de compensar el déficit de dopamina inducido por la lesión. Así, cuando se pierden más del 90% de las neuronas nigrales se produce un incremento de la 52 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA actividad de la enzima tirosina hidroxilasa, lo cual genera una mayor cantidad de dopamina liberada en el estriado por las terminales dopaminérgicas existentes, que se acompaña de una regulación positiva de los receptores postsinápticos. El incremento de receptores dopaminérgicos estriatales D2 es mucho más elevado que para los receptores D1, el cual solo se incrementa levemente. En estos casos la frecuencia de descarga de las neuronas dopaminérgicas de la SNc se incrementa, pero no es suficiente para compensar el déficit de DA. Se ha postulado que la muerte de las neuronas dopaminérgicas debido al efecto toxico de 6-OHDA se produce principalmente por un daño generado en la cadena respiratoria de la mitocondria, donde se disminuye la actividad enzimática de glutatión (GSH) y superóxido dismutasa (SOD) (Perumal et al., 1992), con posterior alteración del complejo I mitocondrial, lo que bloquea la fosforilación oxidativa y formación de ATP (Betarbet et al., 2002), disparando la cascada apoptótica. Aunque existen estudios que indican que 6-OHDA posee una potente acción inhibidora sobre este mecanismo mitocondrial, evidencias recientes demuestran que la inhibición del complejo I no es suficiente para desencadenar la muerte neuronal por apoptosis (Choi et al., 2011) También se ha demostrado que la muerte de neuronas productoras de DA inducida por 6-OHDA está ligada fundamentalmente a la formación de metabolitos generadores de estrés oxidativo como peróxido de hidrogeno (H2O2), radicales libres del tipo hidroxilo (OH-) y quinonas producto de su metabolismo (Perumal et al., 1992). Asimismo, la oxidación de 6-OHDA por la monoamino-oxidasa y la auto-oxidación favorecida por la presencia de Fe++ fomentan la producción de estos radicales. Por tal motivo, sustancias antioxidantes como vitamina E ó N-acetil-cisteína, inhibidores de la MAO y quelantes de hierro protegen a las neuronas dopaminérgicas de la acción neurotóxica de la 6-OHDA (Cadet et al., 1989; Perumal et al., 1992). Con este modelo no se producen cuerpos de inclusión y su acúmulo causa la muerte celular sin características de tipo apoptótica (Jeon et al., 1995; Woodgate, et al., 1999). No obstante otros autores manifiestan que 6-OHDA si produce apoptosis (Burton et al., 2003), aunque en bajo porcentaje, que está 53 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA mediado en parte por la activación de la cascapa 3 y la proteasa lisosomal catepsina D. 3.1.1.2 1-metil-4-fenil-1,2,3,6 tetrahidropiridina La neurotoxina selectiva para estructuras dopaminérgicas MPTP, es un análogo lipofílico del narcótico meperidina. Descubierta accidentalmente en 1982 (Langston et al., 1983), cuando adictos heroinómanos que se inyectaron heroína sintética contaminada con esta sustancia desarrollaron síntomas idénticos a los enfermos con Parkinson, que insólitamente revertían su sintomatología en totalidad con tratamientos clásicos antiparkinsonianos como L-dopa o agonistas dopaminérgicos. A diferencia de 6-OHDA, esta neurotoxina si puede atravesar la barrera hematoencefálica como protoxina e inducir manifestaciones de la EP de forma irreversible en ciertas especies animales incluyendo al humano (Markey et al., 1984). De hecho, la utilización de esta sustancia de forma experimental se debe hacer con precaución ya que ingresa a través de varias vías y su exposición puede dar lugar a un síndrome parkinsoniano crónico. Es la neurotoxina de elección en modelos animales, siendo en primates el mejor caracterizado (Beal, 2001). En estas especies se usan dosis crónicas para parecerse más a la EP, ya que los síntomas parkinsonianos son inicialmente transitorios, pero se hacen permanentes con la administración repetida de la toxina, semanas y meses, logrando reproducir todos los signos clave de la enfermedad de Parkinson, incluyendo la formación de agregados intracelulares (Forno et al., 1993). También es usada eficientemente en perros, gatos, ovejas, y desafortunadamente, con menos eficiencia en roedores, especialmente en ratón, al tener menor afinidad por el transportador de DA. En general para todas estas especies, se produce un síndrome parkinsoniano asociado a una degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la SNc (Schober, 2004). No obstante, a pesar de su eficiencia, la administración de MPTP entre las diferentes especies estudiadas induce respuestas con distintas características, y se ha postulado que esta variabilidad en las 54 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA respuestas puede estar relacionada con diferencias en el metabolismo de MPTP, y en la distribución y retención cerebral de su metabolito MPP+. Incluso, se ha descrito que la neurotoxicidad del MPTP es dependiente del contenido en neuromelanina debido a la alta afinidad del MPP+ por este pigmento, presente en las neuronas productoras de DA (Herrero et al., 1993), mientras que para otros está relacionada con la actividad monoamino-oxidasa tipo B a nivel de la microvasculatura cerebral. Una vez administrada la toxina es rápidamente metabolizada en astrocitos por acción de la monoamino oxidasa tipo B, convirtiéndose en 1-metil-4-fenil 2,3, dihidropiridínico (MPDP), el cual de forma espontánea se oxida a MPP+; dado que las neuronas dopaminérgicas tienen una baja actividad MAO-B, se cree que la transformación del MPTP ocurre en estas células gliales, las cuales son responsables de regular el ambiente bioquímico que rodea a las neuronas (Przedborski y Vila, 2003). La oxidación de MPTP puede ser bloqueada cuando se utilizan inhibidores de la MAO-B como deprenil y pargilina, lo que demuestra que son los metabolitos polares de esta sustancia los que poseen efectos perjudiciales y no el agente lipofílico MPTP como tal. Posiblemente de forma pasiva, el MPP+ se transpola al líquido extracelular y en su forma catiónica ingresa activamente al interior de la neurona dopaminérgica al competir por el transportador de DA. Se mueve al interior de las vesículas sinápticas por unión al transportador de monoaminas vesicular, aunque puede ingresar a mitocondrias o encontrarse libre en citosol, de hecho es un mecanismo protector el paso a vesículas sinápticas (Klaidman et al., 1993). El efecto tóxico de esta sustancia en neuronas dopaminérgicas ha sido atribuido a su capacidad de producir daños a nivel mitocondrial (Nicklas et al 1985). Se ha comprobado que MPP+ es transportado activamente desde el citoplasma al interior de la mitocondria en contra de un gradiente de concentración. Una vez en la mitocondria inhibe el complejo multienzimático I de la cadena transportadora de electrones, alterando la fosforilación oxidativa. El efecto de este fenómeno se refleja en un descenso en la producción de ATP (Fabre et al., 1999); adicionalmente se genera un exceso de radicales libres provocado por la alteración en los potenciales transmembrana y la depleción 55 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA del glutation reducido (GSH) (Hasegawa et al., 1997). Los efectos de MPP+ sobre la mitocondria pueden también estimular indirectamente la producción de ROS, al promover la fuga de DA libre al citosol desde las vesículas sinápticas, debido a la incapacidad del transportador vesicular de monoaminas para mantener el gradiente de concentración por falta de ATP (Johnson, 1988). Otros estudios sugieren que el mecanismo patogénico generado por + MPP , en el cual se perturba la función mitocondrial, se debe a cambios bioquímicos las que afectan severamente concentraciones de calcio intracelular, fenómeno que precede a la degeneración y muerte celular. En este proceso lesivo, inicialmente ocurre una depleción de Ca++ mitocondrial que es seguida de un incremento de las concentraciones de Ca++ citosólico, el cual ingresa desde el líquido extracelular por activación de canales NMDA (receptor ionotrópico de glutamato que responde al agonista N-metil D-aspartato) dependientes de ligando. Este incremento de calcio activa una enzima específica dependiente Ca++ denominada oxido nítrico sintasa (NOS), produciendo óxido nítrico, el cual a su vez puede inducir una inhibición directa de la cadena respiratoria mitocondrial (Przedborski y Vila, 2003) o dar lugar a la formación de peroxinitritos, que son potentes inductores de estrés oxidativo. De hecho, se ha obtenido neuroprotección frente a MPP+ con antagonistas NMDA, lo cual se interpreta por el bloqueo en la entrada del calcio. Asimismo, la mutación específica en ratones que da lugar a la carencia de expresión para el gen que codifica a NOS, fueron significativamente más resistentes al tratamiento con MPTP, lo que demuestra la implicación crucial de NOS en el proceso neurotóxico mediado por MPTP y posiblemente en la EP (Liberatore et al., 1999). A pesar de todas las evidencias que hacen pensar que el proceso citopático mediado por esta neurotoxina, es debido principalmente a los daños generados en la mitocondria, nuevos hallazgos bastante sólidos han demostrado que el daño y posterior deceso de neuronas dopaminérgicas de la SNc no es producido por el efecto directo sobre la mitocondria, si no que ocurre por otros mecanismos no ligados a este orgánulo. De hecho se piensa que es por el efecto perjudicial de la toxina sobre el citoesqueleto de la neurona, lo que 56 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA afecta el transporte y liberación de DA; la inhibición del complejo I mitocondrial potenciaría el problema al inducir una disminución en la producción de ATP celular, que daría lugar a una alteración en la organización de los microfilamentos (Choi et al., 2011). Se piensa que el estrés oxidativo inducido por MPP+ en el interior de la neurona puede contribuir a la acción tóxica del MPTP. Se sugiere entonces que el daño celular se origina por la sobreproducción intraneuronal de radicales superóxido y otros radicales libres originados por la inducción oxidativa del MPP+, también por la disminución en los niveles intracelulares de glutatión y el incremento en la auto-oxidación de la DA. Asimismo, se ha demostrado que el MPP+ induce peroxidación lipídica en cultivos de células productoras de DA (Rojas y Rios, 1993; Obata, 2003). Sin embargo, el daño inducido por esta neurotoxina no es antagonizado por sustancias antioxidantes como el ácido ascórbico ó el tocoferol, ni potentes quelantes de metales de transición pueden proteger de su efecto dañino, al contrario exacerban su toxicidad. Estos hallazgos justifican por que muchos estudios con MPTP no centran la muerte de neuronas dopaminérgicas inducida por la formación de radicales libres. Ciertas sustancias conocidas como factores tróficos neuronales podrían tener la capacidad de frenar la degeneración de neuronas dopaminérgicas inducida por MPP+, como es el caso del factor neurotrófico derivado de las células gliales (GDNF), un poderoso protector que ha sido probado con éxito en modelos animales para esta neurotoxina (Gash et al., 1996). Neuroquímicamente, la acción tóxica del MPTP a nivel de la sinapsis dopaminérgica se caracteriza por una reducción de la concentración de DA y de sus metabolitos. También se ha demostrado que se produce alteración en la densidad de receptores dopaminérgicos e inhibición de las enzimas implicadas en la síntesis de DA. Al contrario de lo que sucede en la EP, donde la depleción de DA es más intensa en el putamen que en núcleo caudado, los primates expuestos de forma crónica a la acción del MPTP muestran una disminución homogénea y no selectiva del contenido de DA en el sistema estriatal. Sin embargo, los estudios realizados a bajas dosis en estas especies exhiben 57 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA degeneración preferencialmente sobre el putamen, como en la EP (Moratalla et al., 1992). Histopatológicamente los estudios realizados en primates han demostrado que la lesión inducida por MPTP afecta, además de las neuronas nigrales, otras poblaciones de neuronas dopaminérgicas como son las neuronas del ATV. No obstante, la pérdida neuronal es de mayor intensidad en las neuronas productoras de DA de la SNc (Sirinathsinghji et al., 1992; Varastet 1994) 3.1.1.3 Rotenona, moneb y paraquat Rotenona, moneb y paraquat son pesticidas orgánicos de uso común que administrados sistémicamente en animales producen una sintomatología homologa a la que presentan los pacientes con enfermedad de Parkinson, en especial, rigidez, bradicinesia y temblores. De hecho el paraquat presenta una estructura con similaridad a la de MPP+, y la rotenona se une a los mismos sitios de unión del MPP+. Estas características habilitan a estas sustancias como modelos neurotóxicos útiles para el estudio del Parkinson (Dauer y Przedborski, 2003; Nisticò et al., 2011). En roedores se ha encontrado que la exposición a estos pesticidas agrícolas puede causar cambios celulares y de conducta que imitan a aquellos observados en la enfermedad de Parkinson. Además, la exposición crónica de rotenona en animales se relaciona con un daño en el sistema dopaminérgico, donde se produce degeneración progresiva de células nigroestriatales e inclusiones citoplasmáticas similares a los cuerpos de Lewy, los cuales son ricos en la proteína αs (Betarbet et al., 2000). Asimismo, estudios de campo sugieren que la exposición crónica ambiental a pesticidas como el paraquat podría contribuir a la aparición de esta patología en humanos (Liou et al., 1997). 58 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Se piensa que el efecto tóxico general de estas sustancias se produce sobre la mitocondria afectando la cadena transportadora de electrones; rotenona y paraquat inhiben el complejo I y moneb el complejo III. 3.1.2 Otros modelos experimentales 3.1.2.1 Animales deficientes en un gen específico o transgénico Las nuevas técnicas de biología molecular han permitido obtener cepas de ratones en los que se ha eliminado la expresión de determinados genes. Para el estudio de la EP se dispone en la actualidad de ratones que carecen específicamente de un subtipo de receptor para DA, lo cual ha ayudado a conocer su verdadera función en las respuestas motoras mediadas por este transmisor, así como su posible acción moduladora en el funcionamiento de los ganglios basales. Por ejemplo, el análisis histológico de ratones que carecen de receptores DA-D1, receptor más abundante y ampliamente distribuido en el estriado (Jaber et al., 1995), no muestra diferencias anatómicas en relación con los animales control. Sin embargo, estos animales muestran de forma espontánea una marcada hiperactividad motora que no se modifica por la acción de agonistas o antagonistas D1. Estos resultados sugieren que la expresión de receptores D1 resulta crítica para el desarrollo de una conducta motora normal. Por el contrario, ratones que no expresan receptores DA-D2 muestran una marcada rigidez, hipocinesia, alteraciones posturales y una actividad motora espontánea reducida, que se asemeja a la sintomatología descrita en los pacientes con EP (Baik et al., 1995). En base a estos hallazgos parece claro que la estimulación de receptores D2 es responsable de la mejoría clínica de los pacientes con EP tratados con L-dopa, y cuestionan la utilidad del tratamiento con agonistas selectivos D1. En modelos de ratones transgénicos para enfermedad de Parkinson se han observado alteraciones relacionadas con el tráfico intracelular, donde la liberación de dopamina es afectada por el efecto dañino de la agregación de 59 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA las formas aberrantes de αs sobre las proteínas SNARE involucradas en el proceso de la neuroexocitosis (Garcia-Reitböck et al., 2010). También se han desarrollado modelos animales con alteraciones de los genes de parkina. La forma más común de parkinsonismo familiar se debe a la mutación del gen que codifica para la parkina y este fenómeno se asocia con la agregación de esta proteína y deα -sinucleína (Palacino et al., 2004; Lu et al., 2009). Se han creado modelos murinos basados en la sobreexpresión, mutaciones específicas (responsables de los casos familiares autosómicos dominantes) o Knock outs genéticos para la proteínaαs (Poon et al., 2005; Wakamatsu et al., 2008; Zhou et al., 2008). En los dos primeros se reproduce de forma inconstante la sintomatología de la EP, incluyendo la formación de inclusiones intraneuronales. No se producen signos de agregación proteica para el nulo en αs, siendo lo más destacado que presentan resistencia total a la enfermedad (Dauer et al., 2002). Otros investigadores han usado la ingeniería genética para desarrollar modelos invertebrados como el de Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans, donde se han realizado modificaciones para la expresión de proteínas humanas asociadas con EP (Link, 2001). 3.1.2.2 Neuroinflamación en modelos de enfermedad de Parkinson Nuevas investigaciones se están concentrando en cómo la inflamación puede participar en la aparición del Parkinson, ya que esta respuesta fisiológica es común en una variedad de enfermedades neurodegenerativas. Se sabe que las neuronas dopaminérgicas en los cerebros de los pacientes con EP tienen niveles más altos de una enzima inflamatoria llamada COX-2 que aquellos de personas sin la enfermedad (Minghetti, 2004). Igualmente varios estudios han mostrado que las moléculas promotoras de la inflamación aumentan el nivel de muerte celular después del tratamiento con ciertas neurotoxinas. Como 60 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ejemplo, en un modelo de ratón para la enfermedad de Parkinson, la disminución en los niveles de COX-2 duplicó el número de neuronas que sobrevivieron (Wang et al., 2009). 3.2 Modelos Celulares 3.2.1 Modelo con células PC12 La línea celular de feocromocitoma de rata, PC12, deriva de tejido cancerígeno de la medula adrenal (Greene y Tischler, 1976). Estas células en cultivo sometidas al factor de crecimiento nervioso se polarizan y desarrollan extensiones de tipo neuríticas (Greene y Tischler, 1976; Greene y Rein 1977; Teng et al., 1998), proceso de diferenciación que es acompañado de cambios dramáticos en la reorganización de la ruta biosintética temprana, los cuales son necesarios para dar lugar al crecimiento de sus prolongaciones (Sannerud, et al., 2006). En este estado de diferenciación, las células PC12 mantienen un fenotipo neuroendocrino productor, almacenador y liberador de aminas biógenas (Malagelada y Greene, 2008), con capacidad de excitabilidad eléctrica en respuesta a neurotransmisores específicos (Teng et al., 1998; Martin y Grishanin, 2003). Desde hace varios años, las células del parénquima adrenomedular constituyen un modelo ampliamente utilizado en estudios sobre la neurosecreción (Tooze, 1998; Chanat y Tooze 1998; Martin y Grishanin, 2003). Específicamente estas células cromafines comparten origen embrionario y múltiples propiedades funcionales con las neuronas autonómicas simpáticas postganglionares liberadoras de catecolaminas (Green y Rein 1977; Teng et al., 1998), lo que las convierte en un modelo celular útil para el estudio de la EP. Estas cualidades beneficiosas han sido ampliamente utilizadas para probar el efecto de sustancias o condiciones ambientales y genéticas que potencialmente pueden causar EP, así como para el estudio de compuestos que podrían ser usados en el tratamiento de ella (Gassen et al., 1998; Mayo et 61 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA al., 1998; Tanaka et al., 2001; Nie et al., 2002; Am et al., 2004; Wang et al., 2005; Malagelada et al., 2006; Meuer et al., 2006; Xu et al., 2007). Las toxinas más utilizadas en el modelo celular de PC12 para EP han sido 6-OHDA y MPP+ (1-metil-4-fenilpiridina), este último un metabolito activo neurotóxico del 1-metil4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (Hartley et al., 1994; Blum et al., 2001), como se ha explicado previamente. Sustancias como rotenona, paraquat, dieldrin, dopamina. L-DOPA, peróxido de hidrógeno y anfetaminas han sido otros agentes también utilizados en esta línea celular (Fleming et al., 1994; Walkinshaw y Waters, 1995; Drukarch et al., 1996; Yang y Sun, 1998; Panet et al., 200; Chen et al., 2003; Hirata y Nagatsu, 2005; Yoshimoto et al., 2004; Gesi et al., 2006; Saito et al., 2007). En la membrana de estas células se expresan receptores colinérgicos de tipo nicotínico, que median la secreción de catecolaminas en respuesta a la acetilcolina, la cual en condiciones naturales es liberada por las terminaciones nerviosas autonómicas presinápticas del nervio esplácnico. Asimismo, esta línea sintetiza, almacena y libera preferencialmente la catecolamina denominada dopamina (Greene y Tischler, 1976). La DA es una amina biógena que es metabolizada por los sistemas enzimáticos MAO y COMT, como se describió en el apartado 1.2. De forma especial, las células PC12 contienen la isoforma MAO tipo A, la cual caracteriza también a las neuronas dopaminérgicas (Finberg y Youdim, 1983), lo que contrasta con la establecida prevalencia del tipo B en las células cromafines de la médula adrenal (Youdim, 1991). Asimismo, la acción enzimática de MAO-A sobre la DA resulta en la formación del ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC), metabolito que se encuentra en mayor concentración en células PC12 indiferenciadas, si se comparan con las terminales nerviosas de neuronas dopaminérgicas que se proyectan al neoestriado (núcleos caudado y putamen). Este fenómeno puede ser debido a una menor eficiencia para almacenar DA en las células PC12 indiferenciadas (Fornai, 2007). 62 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3.2.1.1 Tratamiento con 6-hidroxidopamina en células PC12 Igual que en los modelos animales para enfermedad de Parkinson, la 6OHDA es la neurotoxina más comúnmente usada en la degeneración de neuronas catecolaminérgicas derivadas de líneas celulares. Las neuronas dopaminérgicas son ricas en ROS como anión superóxido, peróxido de hidrogeno y radicales hidroxilo, producto del metabolismo enzimático y no enzimático de dopamina. Los eventos citopáticos inducidos por 6-OHDA pueden ser producidos entonces por factores mediadores de estrés oxidativo que incrementan la oxidación de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (Lotharius y Brundin, 2002; Jenner, 2003). El mecanismo de ataque tóxico de 6-OHDA comienza sobre el cultivo celular, con la producción exógena de sustancias perjudiciales para la célula debido a la auto-oxidación de la misma. Esta reacción mediada por oxigeno molecular ambiental resulta rápidamente en la generación de anión superóxido, peróxido de hidrogeno y p-quinona (2 hidroxi-5-(2 aminoetil)-1,4benzo quinona), ROS que inician un ambiente hostil de tipo oxidativo continuo, diezmando a las células PC12 de sus capacidades naturales de defensa. Adicionalmente se ha descrito que p-quinona media la muerte celular inducida por 6-OHDA (Saito et al., 2007). 6-OHDA también puede actuar como agente clastogénico (sustancia que puede producir roturas en los cromosomas, dando lugar a pérdidas, ganancia o reordenamiento) y como mutágeno (Glinka et al., 1997). Se han demostrado dos aspectos importantes relacionados al mecanismo de acción producido por 6-OHDA en las células PC12. Uno de ellos elimina la posibilidad de participación del transportador de dopamina como mediador en la incorporación de la toxina al interior de la célula (Woodgate et al., 1999), y el segundo señala que la muerte inducida por esta toxina es independiente de la actividad metabólica que involucra a las mitocondrias (Wu et al., 1996). En base a estos hallazgos se sugiere que el mecanismo citopático inducido por 63 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 6-OHDA puede diferir con el que sucede en los modelos animales o que simplemente no está bien clarificado (Woodgate et al., 1999). Ciertas investigaciones revelan que 6-OHDA induce muerte celular apoptótica en células PC12 (Walkinshaw y Waters, 1994; Ochu et al., 1998; Ryu et al., 2005), la cual se desencadena tras la inducción de daños mitocondriales desencadenados por la toxina (inhibición del complejo I y IV mitocondrial) (Glinka y Youdim, 1995). A continuación, se produce liberación de citocromo c, y en consecuencia, activación de la caspasa 9 que da lugar a la formación de apoptosomas en presencia de ATP, fenómeno que promueve la activación de la caspasa 3; la aparición de caspasa 8 activada se relaciona con señales de activación extramitocondrial (Hanrott, et al., 2006). Otros autores señalan que además de la muerte por apoptosis, las células PC12 tratadas con 6-OHDA sufren hinchazón celular por pérdida de la homeostasis iónica, daño de organelas y por último lisis, ruta considerada como muerte necrótica, la cual supera significativamente a la muerte por apoptosis en este modelo. Estos hallazgos indican que 6-OHDA induce primariamente necrosis en línea celular PC12 (Woodgate, et al., 1999). 3.2.1.2 Tratamiento con metanfetamina en células PC12 La metanfetamina (MET) es un agonista dopaminérgico indirecto que incrementa las concentraciones de DA al estimular su síntesis, adicionalmente, incrementa la liberación, inhibe su captación y disminuye su degradación. El incremento de las concentraciones citosólicas de DA inducidas por MET en PC12 ocasionan daños metabólicos de tipo oxidativo que alteran la estabilidad de la proteína parkina inactivando su función (LaVoie et al., 2005). Además la DA-quinona, producto del metabolismo de la DA, tiene la capacidad de ligar a la proteína α -sinucleína en forma protofibrilar provocando su precipitación y posterior agregación (Conway et al., 2000; Conway et al., 2001; Norris et al., 2005). 64 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Se puede reproducir la formación de inclusiones intracelulares en células PC12 tratadas con MET (Cubells et al., 1994; Fornai et al., 2004). Esta droga y su derivado MDMA (metilenedioximetanfetamina) (ecstasy), son tóxicas en las terminales nerviosas monoaminérgicas como resultado de la formación de radicales libres producidos a partir del exceso de DA citosólica. Este fenómeno genera un incremento de ROS que perturba el ambiente redox a nivel intracelular (Battaglia et al., 2002), provocando alteración funcional del sistema ubiquitina-proteasoma, daño que se piensa es fundamental en la génesis de los cuerpos de inclusión en este modelo. Asimismo, la formación de inclusiones puede ser prevenida si se eliminan los radicales libres, si se inhibe la producción de dopamina o si se realiza un pretratamiento con S-apomorfina (antioxidante-agente quelante del Fe++), razón por la cual se piensa que el trastorno causado sobre el SUP es debido al desorden intracelular en el ambiente redox (Lazzeri et al., 2007). La muerte de las células PC12 como efecto del tratamiento con MET se produce tanto por necrosis como por apoptosis (Panet, et al., 2001; Lazzeri et al., 2007). 3.2.1.3 Tratamiento con MPTP en células PC12 El metabolito activo del MPTP, MPP+, es tóxico en cultivos de células productoras de DA. Las bases moleculares de 6-OHDA son frecuentemente comparadas con las de MPTP, ya que ambas inhiben el complejo I mitocondrial y son destructivas para neuronas dopaminérgicas. Sin embargo, existen evidencias que sugieren que los mecanismos de acción por los que actúa la neurotoxina MPTP difieren sustancialmente de los observados para 6-OHDA (Woodgate et al., 1999). El metabolito activo MPP+ en cultivos celulares es selectivamente incorporado a la célula por medio del transportador de dopamina, y una vez en el interior ejerce sus efectos tóxicos a través de la inhibición del complejo I mitocondrial y de la inhibición de enzimas implicadas en la síntesis de DA. A diferencia del mecanismo de acción de 6-OHDA, el bloqueo del transportador 65 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA de dopamina en el modelo de MPP+ atenúa la toxicidad ejercida por esta sustancia (Heikkila et al., 1984; Javitch et al., 1985; Mayer et al., 1986; Sonsalla et al., 1987). Adicionalmente la inhibición de la glicolisis en células PC12 exacerba el daño producido por MPP+, evidenciando que el mecanismo de acción de esta sustancia esta mediado por el metabolismo energético (Basma et al., 1992). Asimismo, se postula que la alteración del SUP en el modelo de MPTP, es producido por depleción de ATP, causado por el bloqueo del complejo I mitocondrial, y en este caso contrario a lo que ocurre en el modelo con MET, la agregación de αs podría ocurrir como un factor accidental debido al deterioro del SUP. El tratamiento con MPP+ en células PC12 posee la capacidad de reproducir inclusiones intracelulares, las cuales son semejantes en aspecto, aparición y evolución en el tiempo si se comparan con aquellas generadas por tratamientos con MET en esta misma línea celular (Gesi et al., 2006). Se ha demostrado que los cuerpos de inclusión inducidos por esta toxina son estructuras dinámicas, las cuales modifican su aspecto en función del tiempo. Pasan de una estructura limitada por membrana, cuando la célula es sometida a tratamiento por corto tiempo, a una altamente condensada con un núcleo central electrodenso en tratamientos prolongados. Estos hallazgos sugieren que la formación de las inclusiones intracelulares es un proceso que involucra múltiples pasos, en el cual de forma inicial diferentes mecanismos tóxicos convergen para desencadenar la misma respuesta biológica, con un mismo efecto final (Gesi et al., 2006). 3.2.2 Otros modelos celulares utilizados para enfermedad de Parkinson Células dopaminérgicas MN9D Células dopaminérgicas MES23.5 Células dopaminérgicas B65 de neuroblastoma 66 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y): usadas como modelo para formar inclusiones (Smith et al., 2005). Es una línea neuronal dopaminérgica en la cual se ha demostrado citotoxidad inducida por 6OHDA. P19: son células de una línea de carcinoma embrionario murino, las cuales se diferencian en células neurales bajo tratamiento con ácido retinoico, a diferencia de las células PC12 no requieren sustancias para la adhesión (Woodgate et al., 1999). Cultivo neuronal primario de células estriatales y del cerebro medio. Estas células responden al tratamiento con metanfetamina o dopamina. Tratamiento con MET (dosis de 0,001-10 µM) o dosis de DA (0,1-1000 µM) Neuronas granulosas cerebelares de rata (CGNs). Células B103: linea neuronal derivada de neuroblastoma de rata. 4 TRAFICO FUNCIONAL EN NEURONAS 4.1 Transporte intracelular Las neuronas son células polarizadas, especialidad estructural y funcional que les permite llevar a cabo su propósito intercomunicador. Esta organización concreta del tráfico intracelular en las neuronas les brinda la capacidad de organizar diferentes actividades en distintas regiones celulares, lo que hace posible que un alto rango de interconexiones sinápticas puedan llevar al interior o al exterior de la célula la señal o señales correctas, efecto que se refleja en una correcta función fisiológica del tejido nervioso y por tanto del organismo en general, al ser el centro de control y regulación. El hecho de que estas células exhiban polarización como característica fenotípica, implica que una amplia gama de maquinaria especializada se organice asimétricamente. Estas simples variaciones dan como resultado una 67 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA eficiente capacidad para la clasificación de proteínas intrínsecas, cuyos códigos son reconocidos y separados por complejos adaptadores, regulando el tráfico de proteínas a dominios concretos de membrana. De esta forma el andamiaje diferencialmente asociado con la cara citosólica de la membrana, define y estabiliza las características bioquímicas de los dominios resultantes, donde la señalización específica se traduce en una correcta orientación en el espacio tridimensional y da lugar a respuestas funcionales. En neuronas, como en el resto de células eucariotas, existe un dinamismo estructural, donde continuos intercambios suceden entre compartimentos intracelulares. Este dinamismo impulsado por el tráfico bidireccional entre membranas permite conservar la identidad y estructura de cada compartimento. Para poder mantener el equilibrio homeostático intracelular, las células transportan proteínas y lípidos a través de las vías secretora y endocítica, proceso que implica la participación de una compleja maquinaría de transporte, donde se generan intermediarios de transporte, movimiento del cargo entre diferentes compartimentos y la fusión específica de estos transportadores con su correspondiente membrana diana. A continuación presentaré un breve repaso de los procesos involucrados en el transporte funcional, lo que podrá permitir un mejor entendimiento de los hallazgos en la alteración del transporte en modelos de enfermedad de Parkinson. 4.2 Organización estructural y transporte de la vía secretora La ruta secretora está constituida por el transporte de proteínas y lípidos recién sintetizados en el retículo endoplásmico (RE), hacia diversos destinos como orgánulos, membrana plasmática o medio extracelular (Palade, 1975). Este tráfico está altamente organizado y se mueve en un patrón bidireccional; el transporte anterógrado que va desde el origen de síntesis hasta su destino final, mientras que el transporte retrógrado que se mueve en sentido contrario. 68 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4.2.1 Retículo Endoplásmico El RE es el compartimento más grande de la célula, el cual está compuesto por una red membranosa de cisternas y túbulos interconectados que se distribuyen a través de todo el citoplasma. Es la estructura clave del punto de partida de la vía secretora, donde las proteínas recién sintetizadas experimentan un correcto plegamiento. Adicionalmente está implicado en funciones como la N-glicosilación, oligomerización de proteínas, metabolismo de lípidos, detoxificación y mantenimiento del equilibrio de ciertos iones. Además suceden fenómenos complejos de control de calidad, así las proteínas mal plegadas son retenidas hasta su adecuado plegamiento o son translocadas al citosol para su posterior degradación. El RE se divide en retículo endoplásmico rugoso y en retículo endoplásmico liso, según tengan o no, ribosomas asociados a su cara citoplasmática. En regiones especializadas del RE, denominados elementos transicionales o RE transicional, son separadas las proteínas que continúan la vía secretora de aquellas que específicamente residen en el RE (Palade, 1956). Adyacente a las áreas de mayor concentración de elementos transicionales se encuentra un complejo sistema túbulo-vesicular llamado compartimento intermedio, VTCs ("vesicular tubular clusters") o ERGIC ("ERGolgi-intermediate compartment") (Saraste y Kuismanen, 1992; Bannykh et al., 1996; Hauri et al., 2000; Klumperman, 2000; Hauri y Schweizer, 1992). En estas estructuras especializadas del RE con aspecto evaginante se produce el ensamblaje de las proteínas de cubierta tipo COPII (Schekman y Orci, 1996), de las cuales depende la salida de la carga (Barlowe, 1998), o bien, mediante la formación de estructuras tubulares que son también dependientes de COPII (Mironov et al., 2003). Algunas proteínas son entonces concentradas selectivamente en estas zonas de salida del RE, por un proceso de reconocimiento de una secuencia señal que interacciona directamente con los componentes de COPII (Kuehn y Schekman, 1997; Klumperman, 2000), mientras otras proteínas lo hacen de un 69 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA modo no selectivo. Se cree que una vez las vesículas COPII se han formado se mueven hasta fusionarse para formar el ERGIC. El complejo de componentes de la cubierta tipo COPII está formado por una serie de proteínas solubles que se encuentran en el citosol, las cuales se ensamblan en la membrana del RE para dar lugar a la biogénesis de intermediarios del transporte de tipo vesicular y muy probablemente también de tipo tubular (Kaiser y Schekman, 1990; Rexach et al., 1994). La formación de estas estructuras permite la selección y concentración de algunos tipos de carga mediante la interacción con las secuencias señal (Aridor y Balch, 1996; Springer y Schekman, 1998). Por otro lado, permiten la deformación física de la membrana donadora dando lugar a la gemación de una vesícula (Barlowe et al., 1994). La cubierta COPII está formada por dos heterodímeros Sec23p/24p y Sec13p/31p (Barlowe et al., 1994) y una proteína con capacidad de unir GTP, llamada Sar1p, la cual es activada por Sec12p, una proteína integral de membrana del RE, la cual tiene función GEF ("guanine nucleotide exchange factor", cataliza el intercambio de GDP por GTP) (Barlowe y Schekman, 1993). Sar1p-GTP, unido a los elementos transicionales, recluta al complejo Sec23p/24p y éste a su vez al Sec13p/31p (Schekman y Orci, 1996). Asimismo Sec23p actúa como una proteína GAP (“GTPase-activating proteins"), induciendo la hidrólisis del GTP unido a Sar1p, lo que desencadena la disociación de la cubierta (Yoshihisa et al., 1993). 4.2.2 Compartimento intermedio o ERGIC El compartimento intermedio o ERGIC se identifica por la presencia del marcador ERGIC-53/58. Es una estación transitoria de clasificación entre el RE y la cara cis del aparato de Golgi, donde el movimiento de la carga se realiza de forma bidireccional según corresponda (Hauri y Schweizer, 1992). 70 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Desde esta estructura las proteínas residentes del RE y aquellas mal plegadas unidas a chaperonas, pueden ser devueltas por trasporte retrógrado al RE a través de vesículas revestidas tipo COP I (Tang et al., 1995; Klumperman et al., 1998; Martínez-Menárguez et al., 1999), asimismo, la transferencia de la carga hacia el Golgi también depende de este mismo intermediario de transporte (Tang et al., 1995; Scales et al., 1997; Klumperman et al., 1998; Warren y Mellman, 1999; Stepehens et al., 2000), el cual puede ser de naturaleza vesicular (Bannykh et al., 1996; Orci et al, 1991; Pagano et al., 1999) o tubular (Clermont et al., 1994; Krinjnse-Locker et al., 1994; Mironov et al., 2003). En todos los casos el movimiento de estas estructuras es dependiente de microtúbulos (Presley et al., 1997; Scales et al., 1997; Ben Tekaya et al., 2005). El complejo COP I está formado por siete subunidades peptídicas (coatómero) y una proteína con actividad GTPasa, ARF1 ("ADP-ribosylation factor 1") (Malhotra et al., 1989; Waters et al., 1991). Los siete polipéptidos son a, ß, ß', γ, d, e, ζ -COP, los cuales se encuentran asociadas, total o parcialmente, durante su permanencia en el citosol. El ensamblaje del complejo sobre la membrana donadora se inicia cuando un GEF específico activa a ARF1, al catalizar el cambio de GDP por GTP, estado en el cual la GTPasa puede unirse a la membrana. Se han descrito diferentes GEFs para ARF1, lo que podría incrementar el rango de especificidad en el transporte (Lee et al., 2004). Una vez activado ARF1-GTP, recluta el coatómero pre-ensamblado en el citosol, lo que origina la deformación y gemación de la membrana (Orci et al., 1993; Zhao et al., 1997). Cuando una proteína GAP específica activa la actividad GTPasa de ARF1 (Lee et al., 2004), se produce la hidrólisis de GTP, señal que dispara la disociación de la cubierta. El complejo entre ARF1/GEF y su actividad GTPasa, es sensible a la sustancia brefeldina A (BFA). BFA es un ácido graso derivado de hongos que inactiva a la GTPasa y como consecuencia se produce una inhibición de la biogénesis de vesículas tipo COPI (Lee et al., 2004). Así, el efecto del tratamiento con BFA produce la fusión de las membranas del aparato de Golgi con el RE (Lippincott-Schwartz et al., 1990; Klausner et al., 1992). 71 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4.2.3 Complejo de Golgi El aparato de Golgi (AG) es una estructura de alto dinamismo estructural, el cual está organizado en forma de cisternas membranosas aplanadas que se ordenan en apilamientos alineados, donde cada uno de estos es llamado dictiosoma. Varios de estos dictiosomas en células de mamíferos se conectan entre sí para formar una estructura reticular acintada, que se mantiene activamente alrededor del centrosoma en una posición perinuclear gracias a la interacción con el sistema de microtúbulos (Egea et al., 2006; Kepes et al., 2005). El conjunto de cisternas puede dividirse en tres compartimentos morfológica y funcionalmente diferentes, la red del cis-Golgi (CGN, "cis-Golgi network"), la red intra Golgi o red media-Golgi y la red del trans-Golgi (TGN, "trans-Golgi network"). En el área que rodea el aparato de Golgi se encuentran numerosas vesículas revestidas tipo COPI. El complejo de Golgi es la estación central y distribuidora final de la vía secretora, cuya organización estructural es mantenida por una matriz proteica, componentes del citoesqueleto y la participación del fosfolípidos tipo inositoles (Zhiping, et al., 2008). Las macromoléculas sintetizadas en RE, tanto en el rugoso como en el liso, llegan a él mediante transporte túbulo-vesicular y son recibidas en la cara cis del AG. El AG no se limita al transporte de las sustancias recibidas, por el contrario, le da la forma final a las moléculas que ingresan para su posterior clasificación y distribución, proceso en el cual tienen lugar múltiples reacciones. La modificación de la carga sucede mediante su paso a través de las cisternas, en las cuales se produce modificación secuencial, por eliminación y adición de monosacáridos de las glicoproteínas sintetizadas en el RE rugoso, adición de nuevos bloques oligosacarídicos, síntesis de heteropolisacáridos que se unen a proteínas específicas para formar moléculas más complejas, síntesis de glucolípidos, reacciones de fosforilación, sulfatación y proteólisis (Farquhar y Palade, 1998). Las enzimas residentes del AG son a menudo utilizadas como marcadores de subcompartimentos concretos del complejo de Golgi, ya que se distribuyen de manera polarizada sobre las cisternas. 72 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA El complejo COPI media tanto en el transporte intra-Golgi (anterógrado y retrogrado) como el transporte retrógrado desde el aparato de Golgi hacia el RE (Storrie et al., 1998; Martínez-Menárguez et al., 2001; Lippincott-Schwartz, 2001). Asimismo a partir de la red del trans Golgi, brotan diferentes tipos de vesículas que contienen los productos definitivos, lugar donde son clasificados y empaquetados para su destino final (Mellman y Simons, 1992). El transporte a través del complejo de Golgi se ha explicado a partir de dos modelos, el primero se apoya en el transporte vesicular, donde las cisternas del Golgi son estructuras individuales estáticas y la carga debe ser movida entre ellas mediante vesículas (Palade 1975; Orci et al., 1996). El segundo es el modelo de maduración de cisternas, donde la carga se transporta en cisternas con dinamismo estructural, las cuales progresan en el Golgi en dirección cis-trans (Grassé, 1957) y el reciclaje selectivo de las proteínas residentes en el Golgi y el RE se reciclan al ser concentradas en vesículas tipo COP I (Love et al., 1998; Lanoix et al., 2001, MartínezMenárguez et al., 2001; Mironov et al., 2001). También, se han propuesto nuevos modelos que son una mezcla de los dos anteriores (Pelham y Rothman, 2000; Orci et al., 2000), y otros donde conexiones tubulares participan al igual que las vesículas como intermediarios del transporte (Griffiths, 2000; Mironov et al., 2003; Trucco et al., 2004; Martínez-Alonso et al., 2005; Martínez-Alonso et al., 2007; Vivero-Salmerón et al., 2008) 4.2.4 Red del trans-Golgi La red del trans-Golgi es un compartimento túbulo reticular localizado en la cara de salida del AG, está formado por una gran cantidad de membranas de tipo vesicular y tubular (Ladinsky et al., 1994). Es morfológica y funcionalmente diferente del conjunto de cisternas que forman el AG, y como se mencionó anteriormente, a partir del cual la carga es clasificada y transportada hasta diversos destinos de la vía secretora. Se ha descrito que las membranas del TGN se pueden dividir en diferentes dominios dando lugar a regiones 73 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA especializadas. Sub-dominios que vendrían dados por la diferencia en la localización de proteínas de cubierta y factores de aproximación; residiendo en cada uno una función diferente en la clasificación y transporte de la carga (Gleeson et al., 2004). Adicionalmente el TGN recibe material de la vía endocítica, reciclando varias proteínas endosomales y de membrana plasmática (Farquar y Palade, 1981; Simons y van Meer, 1988), lo que convierte a esta estructura en un sitio de intersección entre las vías secretora y endocítica. Las vesículas cubiertas de clatrina que emergen del TGN transportan la carga hasta el sistema endosoma/lisosoma. Otro tipo de intermediario de transporte son los gránulos de secreción que son los responsables de la secreción regulada en células especializadas. Además se ha demostrado que una gran variedad de cargo es transportado hacia la membrana plasmática en grandes estructuras túbulo-vesiculares (Hirschberg et al., 1998; Toomre et al., 1999; Polishchuk et al., 2003). Estos intermediarios del transporte se mueven a lo largo de microtúbulos e interaccionan con actina durante el proceso de formación y movimiento (Gleeson et al., 2004). 4.2.5 Neuroexocitosis La neuroexocitosis es un mecanismo fundamental para la liberación de sustancias que modulan las respuestas de comunicación interneuronal. El proceso implica la fusión de la membrana de la vesícula sináptica con la membrana plasmática, lo que da lugar a la exposición del contenido de la vesícula con el líquido extracelular presente a nivel de la hendidura sináptica. Para llevar a cabo este cometido la neurona cuenta con una maquinaria especializada, que actúa con alta regulación y rapidez en respuesta a una orden espacial y temporal. El control espacial se ejerce sobre regiones con microdominios específicos que se denominan zonas activas, en el cual los complejos SNARE (ver apartado 4.4.1) son los responsables de ejecutar la 74 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA orden, al conseguir aproximar y fusionar las membranas destinadas específicamente para tal efecto. Ocurren tres etapas secuenciales en la neuroexocitosis. La primera es el acercamiento intimo o la unión de la vesícula sináptica con la membrana plasmática; la segunda requiere un proceso de maduración vesicular para poder alcanzar la competencia secretora o “priming” (capacidad de ensamblaje de los complejos SNARE) (Chen et al., 2001; Sorensen, 2003) y estar listas para ser liberadas (Artalejo, 2005); y por último, el desarrollo de la fusión como tal entre membranas, que se desencadena por el incremento local de la concentración citosólica de calcio en respuesta a un potencial de acción (Südhof, 2000). En este proceso se precisan proteínas de la maquinaria de fusión, proteínas Rab de control y regulación (ver apartado 4.3.1), además de proteínas específicas tales como complexinas (se unen al complejo transSNARE estabilizándolo en la fase de “priming”, lo que impide la fusión hasta la llegada del potencial de acción) (Reim et al., 2001; Tang et al., 2006), sinaptotagminas (funcionan como sensores de la concentración de calcio libre en el citosol, disparando la fusión) (Südhof, 2002) y munc13 (implicada en la adaptación a la frecuencia de descarga) (Ashery et al., 2000; Rosenmund et al., 2002; Artalejo, 2005). La neuroexocitosis involucra tres proteínas SNARE específicamente neuronales, sintaxina1A y SNAP-25 ligadas a la membrana plasmática, y sinaptobrevina 2 ó VAMP 2 (“vesicle-associated membrane protein”) en la membrana de la vesícula sináptica (Bennet et al., 1992; Trimble et al., 1998; Südhof, 2004). Sinaptotagmina 7 actúa como sensor de calcio en la exocitosis de las células cromafines de la medula adrenal, pero no en la neuronal donde participan las sinaptotagminas 1, 2 (Schonn et al., 2008) y 4 (Tsuboi, 2008). Las catecolaminas son específicamente almacenadas en el interior de vesículas sinápticas conocidas como vesículas de núcleo denso (VND). En el interior de estas vesículas se encuentran unas sustancias llamadas cromograninas, las cuales forman complejos con las catecolaminas. Un regulador crítico en el proceso de anclaje y unión de las VND a la membrana plasmática es la GTPasa Rab27A. Se ha demostrado que la sinaptotagmina75 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA a, también conocida como granufilina-a, y la rabfilina son proteínas efectoras de Rab27A. Ambas necesarias para anclar las VND a la membrana plasmática, al interactuar con la maquinaria de fusión. Además, la importancia de granufilina-a y rabfilina radica en que también tienen la capacidad de unirse a las GTPasas Rab8, que regula el transporte post-Golgi, y Rab3 que se encuentra involucrada junto con Rab27A en el proceso de exocitosis. La interrupción del ciclo GDP/GTP debido a las formas mutadas de Rab27A inhibe la capacidad de liberación de las vesículas de núcleo denso, lo que demuestra la importancia de esta Rab GTPasa en el proceso de la neuroexocitosis (Tsuboi, 2008). 4.3 Proteínas reguladoras del transporte 4.3.1 Proteínas Rab GTPasas Las proteínas Rab son una familia de GTPasas que se encuentran implicadas en el control y regulación del tráfico intracelular a todos sus niveles (Figura 5). El efecto de las Rab GTPasas se produce por activación de sus proteínas efectoras, las cuales traducen la señal de la proteína Rab que se refleja en la destinación correcta del cargo. Las siguientes son las funciones de regulación mediadas a través de las proteínas Rab GTPasas: Reclutamiento del cargo en forma específica Empaquetamiento selectivo del cargo Formación de las vesículas Gemación de las vesículas Desensamblaje de la cubierta proteica de las vesículas Regulación direccional del movimiento de los intermediarios de transporte Regulación del acercamiento de los intermediarios de transporte Control de la unión y fusión del intermediario de transporte 76 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Dentro de los efectores de las Rab GTPasas, se incluyen las proteínas adaptadoras, proteínas de cubierta, factores de acercamiento, ciertas kinasas y fosfatasas y proteínas motoras. El correcto mantenimiento del dinamismo en el tráfico, se debe a la capacidad celular de mantener intercomunicadas a las proteínas Rab GTPasas, función vital que es modulada por las mismas Rabs mediante la activación de sus proteínas efectoras (Segev, 2001). Esta intercomunicación entre proteínas Rab permite regular el tráfico en el espacio y en el tiempo. Las proteínas Rab GTPasas pueden ejercer funciones de control y regulación, al ser una familia numerosa, más de 60 identificadas en mamíferos, con diferentes localizaciones (Somsel-Rodman y Wandinger-Ness, 2000) (Figura 5). El principio regulador de las proteínas Rab estriba en el continuo intercambio entre la forma activa unida a membrana (Rab-GTP) y la forma soluble inactiva (Rab-GDP), esta última estabilizada por el GDI que es un factor inhibidor de la disociación del GDP ligado a Rab. Por tanto, son los GEF las moléculas responsables de catalizar el intercambio de GDP/GTP y las proteínas GAP las que estimulan la actividad GTPasa intrínseca de las Rab. Asimismo, proteínas GDF específicas (GDI displacement factor (GDI) Rab GDP dissociation inhibitor), GEF y más de 38 proteínas GAP regulan la acción de las Rab, lo que da lugar a eventos concretos en diferentes membranas con identidad propia, sobre microdominios específicos de una misma membrana o en un paso determinado del transporte. El reclutamiento selectivo de una proteína Rab sobre una determinada membrana es dependiente del factor GDF específico para esa Rab. Este desplaza a la proteína GDI y permite el anclaje de Rab a la membrana, seguidamente, al unirse a su GEF específico libera el GDP y se activa al ligar GTP (adquiere una conformación estructural definida) (González y Scheller, 1999). Así, con esta estructura tridimensional la proteína Rab-GTP puede reclutar a sus efectores, los cuales ejecutan actividades específicas del tráfico. 77 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Figura 5. Distribución de las proteínas Rab GTPasas. (Stenmark, 2009). 4.4 Proteínas de anclaje y fusión Durante el proceso del tráfico de membranas, los intermediarios de transporte deben ser direccionados, acercados y unidos a la membrana receptora antes de su fusión. Igualmente, la célula cuenta con mecanismos que aseguran por medio de acciones combinadas el acercamiento y la fusión, donde inicialmente el transportador es conducido y mantenido próximo a la membrana diana mediante las proteínas de aproximación. Seguidamente, entre membrana donadora y receptora se da el acoplamiento específico de proteínas SNAREs, 78 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA las cuales interaccionan para anclar el transportador a la membrana diana y promover el último paso del proceso, el cual consiste en el acercamiento íntimo entre las membranas promoviendo su fusión. 4.4.1 Proteínas SNARE Las SNAREs ("soluble NSF attachment protein receptors") (Söllner et al., 1993) son proteínas integrales de membrana, presentes tanto en las membranas donadoras (v-SNAREs) como en las receptoras (t-SNAREs) (Block et al., 2001). Su función es realizar el anclaje específico del transportador a la membrana diana y facilitar el posterior proceso de fusión de ambas membranas. Su nombre deriva de la interacción con dos componentes. Uno de ellos, es una ATPasa sensible a la sustancia N-etilmaleimida (NEM), por lo que fue llamada factor sensible al NEM (NSF, N-ethylmaleimide-sensitive factor) (Block et al., 1988). El otro, es una proteína que interacciona con esta ATPasa y se llamó proteína de unión al NSF (SNAP, "soluble N-ethylamleimidesensitive factor attachment protein") (Clary et al., 1990). Por lo tanto las SNAREs son los receptores de las proteínas SNAP. Para que el proceso de anclaje y fusión se realice correctamente primero la v-SNARE es reclutada y empaquetada junto con la carga en el transportador, fenómeno que es posible debido a la interacción de la v-SNARE con las proteínas de cubierta COP I y COP II (Miller et al., 2003; Mossessova et al., 2003; Rein et al., 2002). Seguidamente el transportador es aproximado a la membrana receptora por diferentes factores de anclaje, que interaccionan facilitando el adecuado emparejamiento de la v-SNARE con la t-SNARE. Posteriormente, la interacción de ambas SNARE, en membranas opuestas, lleva a la formación del complejo trans-SNARE que hace que las membranas se sitúen muy próximas entre sí permitiendo la fusión de ambas (Fasshauer, 2003). Tras la fusión, el complejo cis-SNARE es desensamblado gracias a la intervención de las proteínas NSF y SNAP, donde la hidrólisis del ATP provoca el desacoplamiento entre SNAREs (Söllner et al., 1993) y garantiza la 79 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA generación de sus formas monoméricas para próximas reacciones (Figura 6). Todas estas acciones actúan de manera controlada en el espacio y el tiempo, haciendo que la unión y la fusión se realicen de forma específica Figura 6. Formación de los complejos SNARE y su regulación. (modificado de Bassham y Blatt, 2008). El complejo formado por Syntaxina5/Membrina(GS27)/Bet1/Sec22b parece mediar en la fusión homotípica de los intermediarios de transporte derivados de COPII que dan lugar a la formación del ERGIC. El complejo formado por Syntaxina5/GS28/Bet1/Ykt6 se ha sugerido que interviene en el transporte tardío desde el RE hasta el aparato de Golgi y probablemente medie en la fusión del ERGIC con la cara cis del complejo de Golgi. Un tercer complejo formado por Syntaxina5/GS28/GS15/Ykt6 sería responsable del transporte intraGolgi y mediaría también en el transporte retrógrado desde los endosomas hasta el aparato de Golgi (Hong, 2005). 80 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4.4.2 Proteínas de aproximación Las proteínas de aproximación "Tethering" típicamente son moléculas alargadas que interactúan con la membrana a través de sus colas o complejos de múltiples subunidades proteicas (Pfeffer, 1999; Waters y Pfeffer, 1999). Se trataría de una interacción débil "a larga distancia" que permitiría la acción posterior de las proteínas SNARE. El proceso de anclaje de los transportadores es mediado por las familias de pequeñas GTPasas Rab y Arl, al regular la actuación de los factores de aproximación, los cuales se comportan como sus efectores. Estas proteínas parecen tener una localización determinada, cada una de ellas daría especificidad y selectividad a este proceso (Lupashin y Sztul, 2005); además de tener otras funciones como son el ensamblaje del complejo transSNARE, la selección de la carga e interacción con el citoesqueleto. Algunas de las proteínas de aproximación más conocidas son la proteína p115 en mamíferos, la cual interviene en el transporte RE-Golgi, posiblemente promoviendo la fusión de las vesículas COPII (Allan et al., 2000). p115 puede tener actividad como modulador de la función de las SNAREs, así como factor de aproximación para el mantenimiento de la estructura y función del complejo de Golgi (Hong, 2005). La proteína Giantina y GM130 al interactuar con p115, intervienen en la aproximación de las vesículas COPI a las membranas cis del aparato de Golgi (Linstedt et al., 2000). Golgina-84 es una proteína integral de membrana, involucrada en la generación y mantenimiento de la arquitectura del complejo de Golgi (Satoh et al., 2003; Diao et al., 2003). 4.5 Citoesqueleto Todos los elementos del citoesqueleto junto con sus proteínas motoras y no motoras, tienen un papel fundamental en el posicionamiento de las 81 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA estructuras subcelulares, así como en la biogénesis y función de la mayoría de las organelas. 4.5.1 Microtúbulos Los microtúbulos (MTs) son estructuras cilíndricas que se originan en el centrosoma. Están formados por dímeros de α y ß tubulina. En las células de mamíferos, los MTs intervienen en diversos procesos celulares como el movimiento de membranas y orgánulos, el posicionamiento de compartimentos y división celular. Los MTs son elementos dinámicos que crecen y decrecen mediante la polimerización y despolimerización de los heterodímeros de tubulina. Una de las características de los MTs es que están polarizados, posen un extremo "+" o de crecimiento rápido y un extremo "-" o de crecimiento lento. Este último es el que se encuentra unido al centrosoma. En células de mamíferos la posición yuxtanuclear del AG está correlacionada con el centrosoma. Así, mediante la despolimerización de los microtúbulos el AG se fragmenta y se produce la formación de los llamados mini-dictiosomas cercanos a los sitios de salida del RE. También se han implicado los MTs en el transporte a diferentes niveles en la vía secretora. Así, el extremo "-" direcciona mediante proteínas motoras tipo dineínas el movimiento de las estructura pre-Golgi en su camino hasta la cara cis del AG (Presley et al., 1997). El transporte desde el TGN hasta la membrana plasmática es dependiente de MTs (Toomre et al., 1999). Y también se han relacionado con el transporte retrógrado desde el aparato de Golgi al RE (Sciaky et al., 1997). Existe un conjunto de proteínas que regulan las funciones de los MTs. Las proteínas motoras que utilizan la hidrólisis del ATP para desplazarse a lo largo de los MTs, siendo las kinesinas las que se mueven hacia el extremo "+" de los MTs, mientras que las dineínas lo hacen hacia el extremo "-". Las proteínas reguladoras no motoras denominadas MAPs ("Microtubule associated proteins") interaccionan con los MTs actuando como estabilizadoras y 82 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA moduladoras de la unión de estos con otros componentes celulares, participando como ejemplo en el posicionamiento del aparato de Golgi (Rios et al., 2004). 4.5.2 Actina La actina es una proteína monomérica globular (G-actina) cuya polimerización va a dar lugar a los microfilamentos de actina (F-actina), que junto con lo microtúbulos y filamentos intermedios van a formar el citoesqueleto celular. El citoesqueleto de actina va a intervenir en procesos de mantenimiento de la forma, soporte estructural, movimiento celular así como en el movimiento de orgánulos y membranas. Esta proteína se encuentra relacionada con el mantenimiento de la forma de cisternas aplanadas del AG (Egea et al., 2006). Los filamentos de actina son estructuras muy dinámicas y polarizadas. Poseen un extremo "+" por donde tiene lugar la polimerización y un extremo "-" de despolimerización, proceso que depende de la hidrólisis de ATP. Existen un conjunto de proteínas que van a ser las encargadas de regular la polimerización de actina y su interacción con otros elementos de la célula. Así, se describen las proteínas de unión a actina o ABPs ("actin binding proteins") que van a regular el crecimiento neto del filamento de actina. Asociadas a los filamentos actina existen una serie de proteínas motoras que pertenecen a la familia de las miosinas. Su desplazamiento a lo largo de los filamentos depende de ATP. Dentro de esta familia encontramos las miosinas tipo I, V y VI y la miosina tipo II que se ha relacionado con el tráfico de membranas (DePina y Langford, 1999; Steimle et al., 2005). 83 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 TRÁFICO ALTERADO EN MODELOS DE ENFERMEDAD DE PARKINSON Las entidades neurodegenerativas típicamente se caracterizan por pérdida neuronal progresiva que se extiende hasta hacerse patente los síntomas de la enfermedad. Asimismo, existen evidencias que demuestran que la fragmentación del AG (Fujita et al., 2006; Gonatas et al., 2006; Fan et al., 2008) y la alteración del tráfico en general contribuyen sustancialmente en la patogénesis de estas enfermedades (Zhiping et al., 2008). En neuronas, el AG está involucrado en el flujo axoplásmico de numerosas proteínas endógenas y del transporte de variadas moléculas exógenas a través de rutas trans-sinápticas y del transporte axoplásmico retrógrado (Zhiping et al., 2008). Igualmente, como hemos revisado en el apartado del tráfico funcional, son muchas las funciones que se llevan a cabo en esta organela, reacciones que son vitales para mantener la funcionalidad neuronal. Por tanto es fácil deducir que cualquier trastorno en el funcionamiento del complejo de Golgi puede repercutir en consecuencias graves para la estabilidad y desempeño normal de la neurona como unidad y del tejido nervioso en conjunto. Asimismo, se ha evidenciado que ciertas condiciones patológicas o la sobreexpresión de proteínas asociadas al AG, pueden alterar su estructura apilada. Aunque la disociación de organelas es una característica clásica en enfermedades neurodegenerativas, algunos experimentos demuestran que la fragmentación del AG es un estado preclínico de la neurodegeneración (Karecla y Kreis, 1992; Mourelatos et al., 1996), lo que la convierte en un indicador fiable de actividad degenerativa (Stieber et al., 1996). La fragmentación del AG en enfermedades neurodegenerativas es probablemente causada por una gama amplia de mecanismos. Dentro de estos mecanismos pueden estar implicadas proteínas que mantienen la estructura del AG, alteraciones del tráfico entre el RE-AG, desequilibrio entre la salida y llegada de intermediarios de transporte (Lashuel y Hirling, 2006; Mironov y 84 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Beznoussenko, 2011), así como el acúmulo y formación de agregados proteicos en el soma celular, que conducen a un deficiente transporte axonal. No existe una idea clara si estas inclusiones representan una reacción protectora por parte de la célula o si son una señal de daño neuronal irreversible. Se ha postulado que las inclusiones intracelulares juegan un papel crucial en la patogénesis de la fragmentación del AG (Zhiping et al., 2008). Es conocido que la integridad y principalmente la localización del AG se debe en parte a la interacción de esta organela con el sistema de microtúbulos, por tanto uno de los mecanismos que explicaría la fragmentación del AG y la alteración en la capacidad de secreción celular, es la perturbación del sistema de microtúbulos y sus proteínas asociadas. La agregación de proteínas afecta el sistema de microtúbulos y guía a la fragmentación del AG. Cuando se fragmenta el AG se hace ineficiente la capacidad de transportar moléculas desde el post-Golgi hacia las organelas, además en este estado, la maduración de la maquinaria de transporte se afecta produciendo variación en la segregación de sustancias hacia el axón o las dendritas. Sí el transporte hacia las dendritas o el axón está alterado en neuronas, la polaridad de la célula pierde su estabilidad y por tanto la capacidad de comunicación interneuronal (Zhiping et al., 2008). Como se ha mencionado en apartados anteriores, la EP se caracteriza por presentar agregados de la proteínaαs en neuronas de la sustancia negra, inclusiones que pueden causar daño al interferir con pasos particulares del tráfico de membranas (Zhiping et al., 2008; Lee et al., 2006). Se ha observado en desordenes neurológicos que presentan fragmentación del AG, como la proteína αs afecta el sistema de microtú bulos y los microfilamentos de actina, aunque el transporte no dependiente de microtúbulos permanece sin alteración (Lee et al., 2006). Además se ha demostrado en neuronas dopaminérgicas que la exposición αs a oligomérica disminuye la polimerización de tubulina, alterando la formación de microtúbulos (Chen et al., 2007). En los últimos años se han realizado estudios en modelos animales y celulares de la EP, arrojando aportes valiosos que ayudan a clarificar el papel primario de los efectos perjudiciales causados por la sobreexpresión, formas mutadas o agregación de 85 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA la proteína αs. Se sugiere que las formas alteradas de αs se comportan como el efector primario de los daños originados en pasos iniciales de la vía secretora. Se ha evidenciado que la respuesta seguida a la sobreexpresión de αs en levaduras induce un bloqueo del tráfico vesicular entre el RE -AG, lo que causa estrés a nivel del RE. Asimismo la toxicidad de αs puede ser bloqueada al inducir la sobreexpresión de la GTPasa Ypt1/Rab1 en el modelo de levadura (Cooper et al, 2006), o en modelos animales (Chua y Tang, 2006). Bajo condiciones normales en el lumen del RE, las chaperonas ayudan a plegar correctamente seguidamente las proteínas recién sintetizadas, las cuales serán translocadas a otros compartimentos, pero en ciertas condiciones de estrés celular puede haber un incremento de proteínas mal plegadas que se acumulan en el RE. Este fenómeno produce una activación de la expresión proteica que incrementa la carga funcional del RE y de la maquinaria celular de degradación de proteínas (Marciniak y Ron, 2006), lo que genera un equilibrio muy débil que se puede romper con facilidad si continúa el ataque por parte del agente agresor. La respuesta al estrés del RE en células neuronales PC12 inducido por 6-OHDA, fue confirmado al observar la activación de las kinasas PERK y IRE1 α, las cuales son sensores claves de estrés en RE; también se incrementó la chaperona HSP70 que se asocia con este tipo de estrés. Estos mismos hallazgos fueron encontrados en células PC12 y cultivos primarios de neuronas simpáticas tratadas con las toxinas MPP+ y rotenona (Ryu et al., 2002). Asimismo, se ha demostrado que la sobreexpresión del mutante de αs induce estrés del RE (Smith et al., 2005). Se puede considerar como conclusión, que una causa del bloqueo en el transporte entre el RE-Golgi es el estado alterado de la función del retículo endoplásmico. En otra investigación se demuestra como la toxicidad de αs reflejada en el bloqueo del tráfico entre el RE y el AG, puede ser suprimida al sobreexpresar las proteínas SNARE involucradas en el transporte RE-AG (Thayanidhi et al., 2010). Estos hallazgos sugieren que la expresión de las formas mutadas de la proteína αs antagonizan la correcta función de las proteínas SNARE, al inhibir el ensamblaje de los complejos. Visto de otra forma las vesículas se producen correctamente desde el RE, pero su unión o fusión a las membranas 86 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA receptoras esta inhibido. Igualmente se encontró que la sobreexpresión de la proteína SNARE Ykt6 fue la más eficiente en la labor de suprimir el bloqueo del transporte entre RE-Golgi (Thayanidhi et al., 2010). Curiosamente Ykt6 es la SNARE con mayor expresión en neuronas y en la línea celular PC12, aunque se desconoce la razón de este fenómeno (Hasegawa et al., 2006). Se sabe que el acúmulo de oligómeros de αs en las terminales sinápticas y axón juega un importante papel en el mecanismo de neurodegeneración (Iwatsubo et al., 1996; Hashimoto y Masliah, 1999; Trojanowski et al., 1998; Lansbury, 1999). En un reciente estudio donde se utilizó un modelo de ratón transgénico para EP, expresando una forma aberrante de la proteína αs, se observaron alteraciones relacionadas con el tráfico intracelular, donde la liberación de dopamina fue afectada por un fenómeno de redistribución de las proteínas SNARE involucradas en el proceso de neuroexocitosis. El efecto dañino de la agregación de αs causó la redistribución de SNAP25, sintaxina 1 y sinaptobrevina 2 (Garcia-Reitböck et al., 2010). Asimismo, la sobreexpresión de αs aberrante o de sus formas mutadas en células PC12, como modelo para EP, promueve el aumento citosólico de catecolaminas al interferir con su liberación, mecanismo mediado a través de la disfunción causada sobre los últimos pasos de la exocitosis (Larsen et al., 2006; Mosharov et al., 2006; Cookson y van der Brug, 2008). También se sabe que la sobreexpresión αs inhibe de la competencia de secreción o “priming” de las vesículas sinápticas (Fortin et al., 2005; Larsen et al., 2006; Nemani, 2010). Esto se puede explicar por el papel de la proteína αs, que puede actuar como chaperona para el correcto plegamiento de proteínas SNARE ligadas al proceso sináptico (Chua y Tang 2006; Cooper et al., 2006) o por su participación en el ensamblaje de estos mismos complejos, necesarios para la fusión de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática (Gitler et al., 2008). Gitler y colaboradores hallaron en modelos neuronales de EP que la sobreexpresión de las proteínas Rab3A (específica de neuronas) (Gurkan et al., 2005) y Rab8A (Rab más cercanamente relacionada con Rab1 en homología de secuencia), las cuales están involucradas en la regulación de pasos tardíos de la vía secretora, pueden tener efecto defensivo ante el 87 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA proceso de neurodegeneración inducido por los niveles tóxicos deαs (Gitler et al., 2008). 88 MATERIALES Y MÉTODOS V. MATERIALES Y MÉTODOS 1 REACTIVOS UTILIZADOS En las siguientes tablas se describen todos los materiales utilizados en las diferentes técnicas: Tabla 2. Anticuerpos primarios usados en inmunofluorescencia ANTICUERPO FUENTE Anti-Rab1A Conejo Anti-Rab2A Cabra Anti-Rab6 Conejo Anti-Rab8 Ratón Anti-Rab27A Conejo Anti-GS15 Ratón Anti-GS27 Ratón Anti-Membrina Ratón Anti-GS28 Ratón Anti-YKT6p Cabra Anti-rBet1 Ratón Anti-Sintaxina5 Ratón Anti-Sec22 Ratón Anti-Sintaxina6 Ratón Anti-p58 Ratón Anti-p115 Ratón PROCEDENCIA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium ProteinTech Group Inc., Chicago, EEUU BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Stressgen Bioreagents Victoria, Canadá BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA DILUCIÓN FIJADOR 1:25 PFA 4% 1:30 PFA 4% 1:30 PFA 4% 1:35 PFA 4% 1:80 PFA 4% 1:40 PFA 4% 1:40 PFA 4% 1:40 PFA 4% 1:40 PFA 4% 1:40 PFA 4% Stressgen Bioreagents Victoria, Canadá 1:40 PFA 4% Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA 1:25 PFA 4% 1:50 PFA 4% 1:40 PFA 4% 1:30 Metanol absoluto 1:60 PFA 4% Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Sigma Chemicals Co. St. Louis, USA BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium 91 MATERIALES Y MÉTODOS ANTICUERPO FUENTE PROCEDENCIA DILUCIÓN FIJADOR Anti-GM130 Ratón BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Anti-GRASP65 Conejo Abcam, Cambridge, UK 1:400 PFA 4% Anti-Golgina84 Conejo Dr. G. Warren. Yale University, USA 1:100 PFA 4% Anti-Giantina Ratón Alexis Biochemicals, San Diego, USA 1:40 PFA 4% Anti-Manosidasa II Conejo Dr. K. Moremen. University of Georgia, Atenas, Grecia 1:300 PFA 4% Anti-Manosidasa II Ratón BABCO, California, USA 1:200 PFA 4% Anti-TGN-38 Ratón 1:30 PFA 4% Anti-COP II (sec23) Conejo 1:7 PFA 4% 1.50 PFA 4% 1:50 PFA 4% 1:20 PFA 4% BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Affinity BioReagents, USA Anti-β-COP (M3A5) Ratón Anti-β'-COP (CM1A10) Ratón Anti-KDELr Conejo Anti-KDELr Ratón Anti-α-Tubulina Ratón Sigma Chemicals Co., St. Louis, EEUU Dr. A.A. Mironov. Mario Negri Sud, Italia Stressgen Bioreagents Victoria, Canadá Calbiochem, Darmstadt, Germany Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA Anti-α-Tubulina acetilada Ratón Abcam, Cambridge, UK Anti-β-Tubulina III Conejo 1:400 PFA 4% 1:70 PFA 4% 1:100 1:15 Metanol absoluto Metanol absoluto Metanol absoluto Metanol absoluto Metanol absoluto Metanol absoluto Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA 1:15 Ratón Abcam, Cambridge, UK 1:30 Anti-α-sinucleína Ratón Abcam, Cambridge, UK 1:100 PFA 4% Anti-α-sinucleína Ratón 1:30 PFA 4% Anti-α-sinucleína Conejo 1:40 Metanol absoluto Anti-Caspasa 3 activa Conejo GenWay Biotech, Inc., USA 1:120 PFA 4% Anti-Ubiquitina Ratón Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA 1:40 PFA 4% Anti-Dineína cadena pesada Anti-Kinesina cadena ligera Anti-Kinesina cadena pesada 92 Conejo Goat BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Sigma Chemicals Co., St. Louis, EEUU 1:80 1:25 MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 3. Anticuerpos primarios usados en Western Blot ANTICUERPO FUENTE Anti-Rab1A Conejo Anti-Rab2 Conejo Anti-Rab3A Conejo Anti-Rab6 Conejo Anti-Rab8 Ratón Anti-Rab27A Conejo Anti-GS15 Ratón Anti-Membrina Ratón Anti-GS28 Ratón Anti-YKT6p Cabra Anti-rBet1 Ratón Anti-Sintaxina5 Ratón Anti-Sec22 Ratón Anti-Sintaxina6 Ratón Anti-p58 Ratón Anti-p115 Ratón Anti-GM130 Ratón PROCEDENCIA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium ProteinTech Group Inc., Chicago, USA BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Stressgen Bioreagents Victoria, Canadá BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA LIFESPAN Biosciences, Inc., USA Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium Sigma Chemicals Co. St. Louis, USA BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium BD Transduction Laboratories Erembodegem, Belgium DILUCIÓN PM BLOQUEO GEL 1:100 23 kDa TBS-T/BSA 5% BisTris/ MOPS 1:100 24 kDa TBS-T/BSA 3% BisTris/ MOPS 1:100 25 kDa TBS-T/BSA 2% BisTris/ MOPS 1:100 25 kDa TBS-T/BSA 2% BisTris/ MOPS 1:200 24 kDa TBS-T/BSA 5% BisTris/ MOPS 1:300 27 kDa TBS-T/BSA 3% BisTris/ MOPS 1:50 15 kDa TBS-T/BSA 0,5% BisTris/ MOPS 1:1000 27 kDa TBS-T/BSA 5% BisTris/ MOPS 1:1000 28 kDa TBS-T/BSA 5% BisTris/ MOPS 1:100 23 kDa TBS-T/BSA 0,5% BisTris/ MOPS 1:150 17 kDa TBS-T/BSA 2% BisTris/ MOPS 1:100 34 kDa TBS-T/BSA 3% 1:100 24 kDa 1:100 35 kDa TBS-T/BSA 3% BisTris/ MOPS 1:100 58 kDa TBS-T/BSA 1% BisTris/ MOPS 1:2000 115 kDa Tris TBS-T/BSA 2,5% Acetato 1:150 130 kDa Tris TBS-T/BSA 1% Acetato BisTris/ MOPS TBS-T/BSA BisTris/ 1% MOPS 93 MATERIALES Y MÉTODOS ANTICUERPO FUENTE PROCEDENCIA DILUCIÓN PM BLOQUEO GEL TBS-T/BSA BisTris/ 46 kDa 3% MOPS TBS-T/BSA BisTris/ 85 kDa 1% MOPS TBS-T/BSA BisTris/ 110 kDa 1% MOPS 1:100 25 kDa TBS-T/BSA 1% 1:1000 50 kDa TBS-T/BSA 5% Anti-GRASP65 Conejo Abcam, Cambridge, UK 1:150 Anti-COP II (sec23) Conejo Affinity BioReagents, USA 1:200 Anti-β-COP (M3A5) Ratón Anti-KDELr Ratón Anti-α-Tubulina Ratón Anti-β-Tubulina III Conejo Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA 1:1500 50 kDa Antiα-sinucleína Ratón Abcam, Cambridge, UK 1:600 19 kDa Antiα-sinucleína Conejo Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA 1:800 19 kDa Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA Calbiochem, Darmstadt, Germany Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA 1.50 BisTris/ MOPS BisTris/ MOPS BisTris/ TBS-T/BSA 5% MOPS TBS-T/BSA BisTris/ 3% MOPS TBS-T/BSA BisTris/ 5% MOPS Tabla 4. Anticuerpos secundarios usados en inmunofluorescencia y Western Blot ANTICUERPO FUENTE PROCEDENCIA DILUCIÓN Anti-conejo IgG Alexa® 568 Cabra Molecular Probes, Eugene, USA 1:400 Anti-conejo IgG Alexa® 568 Burro Molecular Probes, Eugene, USA 1:400 Anti-conejo IgG Alexa® 488 Pollo Molecular Probes, Eugene, USA 1:400 Anti-conejo-TRICT Cabra Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA 1:300 Anti-Ratón IgG Alexa® 488 Cabra Molecular Probes, Eugene, USA 1:400 Anti-Ratón IgG Alexa® 568 Cabra Molecular Probes, Eugene, USA 1:400 Anti-Ratón IgG Alexa® 568 Conejo Molecular Probes, Eugene, USA 1:400 Anti-Cabra IgG Alexa® 488 Burro Molecular Probes, Eugene, USA 1:400 94 MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 5. Reactivos generales usados en este proyecto Dilución, cantidad o concentración de uso Catálogo 6-hidroxidopamina 100 μM H116-5MG Acetato de uranilo 4% 22400 Agua estéril - W1503 Alcohol absoluto - Reactivo B6542 BSA 0,1% A4503 BSA-acetilada 0,1% B2518 Catalasa de hígado de ratón 20 U C853110MG 20 μg/ml C1988 Formvar 1,2% 9823 Glutaraldehido 0,2% 1909 10 μl/cubre 10 mm S3023 Cicloheximida Medio de montaje para fluorescencia Metanol 99,5 % PS - Methamphetamine hydrochloride 50 μM Paraformaldehido 4% PBS 1X Poly-D-lysine hydrobromide 0.1 mg/ml Proteína A-oro 10 nm (1: 65) Proteína A-oro 15 nm (1: 70) Saponina 0,1% Tris 50 mM Tween®20 0.05% Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, EEUU Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA 131086.1611 Panreac, Barcelona, España 1 μg/ml Brefeldina A (BFA) Procedencia Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA Polysciences, Inc., Eppelheim, Alemania DAKO, Glostrup, Denmark 161090.0616 Panreac, Barcelona, España Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA Electron Microscopy 15710 Sciences, Hatfield, USA p4417Sigma-ALDRICH, Inc., St. 50TAB Louis, USA Sigma-ALDRICH, Inc., St. P7405-5MG Louis, USA Departamento Biología Celular. Universidad de Utrecht, Holanda Departamento Biología Celular. Universidad de Utrecht, Holanda 47036-50G- Sigma-ALDRICH, Inc., St. F Louis, USA M8750-5G 141940.1211 Panreac, Barcelona, España 152312 Panreac, Barcelona, España 95 MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 6. Productos utilizados en la amplificación, purificación y transfección de plásmidos Producto Ampicilina sódica Dilución o concentración de uso 100 μg/ml Bacterias competentes E.coli DH5-alpha Kanamicina Kit de purificación de plásmidos. Maxiprep Kit de purificación de plásmidos. Miniprep LB-agar (LENNOX) 20 μl/plásmido Lipofectamina™ 2000 Medio OPTI-MEM® I 1:4 Medio SOB Tubos para el cultivo de bacterias 40 μg/ml 3,5 g/100 ml Catálogo Procedencia Sigma-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA INVITROGEN, Carlsbad, 18263-012 USA 11815-024 Gibco,Paislley, UK Sigma-ALDRICH, Inc., St. NA0310-1KT Louis, USA Sigma-ALDRICH, Inc., St. NA0150-1KT Louis, USA 1083.00 Pronadisa, Basel , Suiza A0166 - P/N 52758 31985 3,07 g/100 ml 1541.00 - 62.515.028 INVITROGEN,Carlsbad,USA Gibco, Paislley, UK Pronadisa, Basel ,Suiza SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Alemania Tabla 7. Productos utilizados para Western Blot Producto Dilución, cantidad o concentración de uso Catálogo Procedencia Complete mini (inhibidor de proteasas) 1 tableta/ 10ml 11836-153001 Iodoacetamida BioUltra 10 mM I1149 NuPAGE® Agente reductor 1X NP0009 NuPAGE® Tampón LDS 1X NP0007 4-12 % NP0321 4-12 % EA0375 1X NP0001 ROCHE Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany Sigma-ALDRICH,Inc., St. Louis, USA INVITROGEN, PaisleyScotland, UK INVITROGEN, PaisleyScotland, UK INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA 1X LA0041 1X NP0006-1 4 μl LC5699 NuPAGE® Gel de BisTris NuPAGE® Gel de Trisacetato NuPAGE® Tampón de corrido MOPS SDS NuPAGE® Tampón de corrido Tris-Acetato SDS NuPAGE® Tampón de transferencia Marcador HiMarck™ 96 INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA MATERIALES Y MÉTODOS Dilución o concentración de uso Catálogo 4 μl LC5925 Pirce® BCA kit - 23225 Membrana de transferencia PVDF - IPVH00010 Producto Marcador SeeBlue® plus 2 Procedencia INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA Therno Scientific, Rockford, IL, USA Immobilon®- P; Millipore Corporation, Billerica, MA, USA Tabla 8. Productos utilizados en los cultivos celulares Producto Dilución, cantidad o concentración de uso Catálogo Penicilina-estreptomicina 100 U/ml : 100 μg/ml 15140-122 Medio DMEM+GlutaMAX™I 4,5g/L D glucosa 82,5 % - 99 % 31966 Gibco, Paislley, UK - 10010 Gibco, Paislley, UK 50 ng/ml 13257-019 15 % - 1 % B15-122 Suero fetal Bovino 2,50 % A15-151 Tripsina 0,05 % 15400-054 PBS pH 7.4 estéril Factor de crecimiento neural (NGF) Suero de caballo Procedencia INVITROGEN, Carlsbad, USA INVITROGEN, Carlsbad, USA PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Gibco, Paisley-Scotland, UK Tabla 9. Plásmidos y pequeños RNAs de interferencia Producto Resistencia Vector o catálogo Rab1A-GFP Kanamicina pEGFP-N1 Rab2-GFP Ampicilina Rab8A-GFP Ampicilina Rab27A-GFP Ampicilina pCMV6-ACGFP pCMV6-ACGFP pCMV6-ACGFP Procedencia Dr. García Borrón. Universidad de Murcia, España. OriGene Technologies,Inc., Maryland, USA OriGene Technologies,Inc., Maryland, USA OriGene Technologies,Inc., Maryland, USA 97 MATERIALES Y MÉTODOS Producto Resistencia Vector o catálogo VSVg-GFP Kanamicina pEGFP-N1 Syntaxin5-GFP Ampicilina pCMV6-ACGFP siRNA-Rab1A - sc-41809 siRNA-Rab2A - sc-41811 siRNA-Rab8A - sc-41828 Control-siRNA - sc-36869 Procedencia Addgene Inc., Cambridge Massachusetts, USA OriGene Technologies,Inc., Maryland, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA 2 CULTIVO CELULARES Células PC12 indiferenciadas (Greene y Tischler, 1976) fueron cultivadas en monocapa, utilizando frascos de 75 cm2 y 25 cm2 con superficie tratada para adhesión, procedentes de la casa comercial PAA (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria). Para la fase de proliferación, donde las células adquieren una morfología redondeada similar a células cromafines inmaduras procedentes de la médula adrenal (Figura 7), se utilizó medio DMEM 4,5 g glucosa/l enriquecido con suero de caballo al 15 % y suero fetal bovino al 2,5 %, ambos inactivados por calor (56 ºC durante 30 minutos); finalmente se agregó 100 UI/ml de penicilina más 100 µg/ml de estreptomicina (Tabla 8). Los pases se efectuaron tras alcanzar una confluencia del 85 % con la finalidad de mantener el clon, congelar células o continuar con la fase de diferenciación; además, el medio fue reemplazado cada 3 días para evitar cambios inadecuados de pH. Para la fase de diferenciación las células se expusieron durante 4 a 5 días, al factor de crecimiento nervioso (NGF, 50 ng/ml) para que cesaran su división celular y extendieran sus neuritas adoptando gradualmente características de neuronas dopaminérgicas maduras (Figura 7), en medio DMEM suplementado con suero de caballo al 1 % e igual concentración de los antibióticos anteriormente descritos. Tanto para la fase de proliferación como para la de diferenciación, las células fueron incubadas en un ambiente de 5 % 98 MATERIALES Y MÉTODOS de CO2, 95 % de humedad relativa y 37 °C en estufa INCO2-MEMMERT (MEMMERT, Bremen, Alemania). Todos los estudios fueron realizados con células PC12 en su estado neuronal. Para los estudios de microscopía óptica, las células fueron transferidas inicialmente a cubreobjetos de vidrio estériles de 10 mm de diámetro procedentes de la casa Nahita (Nahita-Auxilab S.L., Navarra, España), dentro de placas de Petri estériles (Nunc), doblemente tratadas con poli-D-lisina (PM>300.000) (1,5 ml/placa de petri de 35 mm), como sustrato para permitir su adhesión, siguiendo las condiciones del protocolo recomendado por la casa comercial. Para los estudios por microscopía electrónica y los ensayos de western blot las células se sembraron en frascos de 75 cm2 bajo las mismas condiciones de tratamiento mencionadas anteriormente. 3 TRATAMIENTOS El tratamiento con las diferentes drogas fue llevado a cabo con una confluencia entre el 70-80 % para conseguir la adecuada diferenciación celular. Se realizó tratamiento con las neurotoxinas 6-hidroxidopamina (6OHDA) a una concentración de 100 µM (250 mg/dl) más 20 U de catalasa murina o metanfetamina (MET) a la concentración de 50 µM (0,93 mg/dl). Ambas sustancias fueron agregadas al medio de cultivo de diferenciación conteniendo NGF (50 ng/ml), durante 3-5 días y bajo las mismas condiciones ambientales utilizadas para la proliferación y diferenciación celular. Igualmente, el medio de cultivo en esta fase fue reemplazado al segundo o tercer día para evitar cambios indeseables del pH. Estos parámetros de tratamiento fueron seleccionados basándose en resultados de estudios dosis respuesta con objeto de obtener la mayor cantidad de agregados intracelulares y el mínimo de muerte celular (Figura 7). 99 MATERIALES Y MÉTODOS A B C Figura 7. Cambios morfológicos en la línea celular PC12. A. Fase de proliferación celular. Se observan células redondas indiferenciadas en crecimiento hiperplásico B. Fase de diferenciación celular. Células después de 3 días de exposición al NGF (50 ng/ml), se observa abundante crecimiento de neuritas y formación de conexiones sinápticas sin cambios en la proliferación C. Fase de tratamiento con 6-OHDA (100 µM) más 20 U de catalasa murina o MET (50 µM). Células con aspecto robusto y con una microarquitectura menos angulosa, se pierde gran cantidad de conexiones sinápticas. 4 ENSAYOS DEL TRANSPORTE 4.1 Análisis del transporte retrogrado y anterógrado mediante el uso de brefeldina A La brefeldina A (BFA) es una herramienta muy utilizada para estudiar el transporte celular. La BFA es una droga fúngica que inhibe la actividad de la GTPasa Arf1, lo cual impide la generación de vesículas con cubierta tipo COP I, desencadenando la formación de túbulos del aparato de Golgi que terminan fusionándose con el RE. Para llevar a cabo el análisis del transporte retrogrado, las células PC12 fueron tratadas con BFA (1 μg/ml), fijadas durante diferentes intervalos de tiempo con paraformaldehído (PFA) 4 % e inmunomarcadas doblemente con manosidasa II y GM130. Asimismo, para el análisis del transporte anterógrado las células fueron incubadas a la misma concentración de BFA durante 40 100 MATERIALES Y MÉTODOS minutos, lavadas y nuevamente incubadas con medio completo previamente atemperado y sin la droga. Estas células fueron fijadas a intervalos diferentes de tiempo e inmunomarcadas de igual forma como se realizó en el estudio del transporte retrogrado. 4.2 Ensayos del transporte utilizando la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSVg-GFP) Adicionalmente en los ensayos del tráfico intracelular de membranas se utilizó como marcador del transporte anterógrado, el mutante de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (Tabla 9). En estos experimentos, las células PC12 en su estado neuronal, fueron tratadas con metanfetamina (50 µM) hasta el cuarto día, en este momento se quimiotransfectaron con el plásmido VSVg-GFP utilizando el método de Lipofectamina™ 2000 y siguiendo las recomendaciones del fabricante. Pasadas 18-24 horas, las células fueron incubadas en oscuridad durante una hora a 40ºC (temperatura no permisiva), impidiendo el plegamiento correcto de la proteína y por tanto su acumulación en el RE. A continuación permanecieron 30 minutos adicionales bajo las mismas condiciones en presencia de cicloheximida (20 μg/ml) para inhibir la síntesis proteica. Posteriormente fueron incubadas a 32ºC (temperatura permisiva) donde tiene lugar el plegamiento correcto de la proteína y su transporte a lo largo de la vía secretora. Finalmente, las células fueron fijadas a diferentes intervalos de tiempo. 5 INMUNOFLUORESCENCIA La inmunofluorescencia indirecta se realizó sobre la monocapa de células sembradas sobre cubreobjetos de vidrio estériles como se mencionó en el apartado 2, en confluencia final de entre el 60 al 80%. En función del tipo de anticuerpo a ensayar, se hicieron diferentes tipos de fijación y/o permeabilización. 101 MATERIALES Y MÉTODOS Inicialmente se eliminó cuidadosamente el medio de cultivo y las células fueron fijadas con PFA 4 % en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, excepto en los experimentos con brefeldina A, donde el fijador fue previamente atemperado. Seguidamente las células fueron lavadas 3 veces en PBS/BSA al 0,1 % durante 15 minutos y luego se bloquearon los grupos aldehídos con una solución filtrada de PBS/Glicina al 0,02 M durante 10 minutos, para ser posteriormente permeabilizadas con saponina al 0,1% diluida en PBS/BSA al 0,1 % durante 10 minutos. Por el contrario, otros inmunoensayos exigieron un método diferente de fijación, donde las células en monocapa sobre cubreobjetos de vidrio fueron simultáneamente fijadas y permeabilizadas con metanol absoluto durante 3 segundos a temperatura ambiente, a continuación, se lavaron en solución filtrada de PBS por 10 minutos y después se bloquearon las uniones inespecíficas con PBS suplementado al 1% con albúmina sérica bovina durante 20 minutos. Este método conjunto de fijación y permeabilización se utilizó básicamente para visualizar los microtúbulos, proteínas motoras asociadas al citoesqueleto y el inmunomarcaje para la proteínaα -sinucleína. Tras el último paso de los dos sistemas de fijación y permeabilización, las células fueron incubadas con el anticuerpo primario (Tabla 2) en un marcaje simple o bien con una mezcla de anticuerpos primarios en el caso de dobles marcajes, durante 60 minutos a temperatura ambiente o toda la noche a 4 ºC. Los anticuerpos fueron diluidos a la concentración de trabajo en una solución de BSA-acetilada al 0,1 % diluida en PBS/Glicina 0,02 M. Posteriormente las células fueron lavadas tres veces con PBS, para luego permanecer 45 minutos incubadas, en oscuridad y a temperatura ambiente, con el anticuerpo secundario específico, marcados con fluoróforos que emitían o bien en el espectro verde (AlexaFluor® 488) o bien en el rojo (AlexaFluor® 568). Por último, las células fueron lavadas en solución de PBS durante 15 minutos y las preparaciones en cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos utilizando 10 µl/ cubre del medio de montaje especial para fluorescencia DAKO. Para detectar el inmunomarcaje las preparaciones se visualizaron en el microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot con objetivo 100 X, acoplado a 102 MATERIALES Y MÉTODOS una cámara digital (Leica DC 500), y para su análisis se contaron, al menos 50 células en cinco replicas diferentes en los estudios sobre la fragmentación del aparato de Golgi y/o la formación de inclusiones intracelulares. También se utilizó el microscopio confocal Leica TCS SP2, utilizando el laser Ar/Vis a 488 nm para los AlexaFluor® 488 y el He/Ne a 561 nm para los AlexaFluor® 568. El procesamiento y análisis de imágenes se llevo a cabo utilizando el programa Adobe PhotoShop CS2 versión 9.0 (Adobe Systems, SanJose, CA) y el programa Imaris (Bitplane AG, Zurich, Switzerland) para obtener la reconstrucción en 3D del aparato de Golgi y de las inclusiones intracelulares. 6 ENSAYOS DE VIABILIDAD CELULAR Se realizaron ensayos de viabilidad celular a las 24, 48, 72, 96 y 120 horas desde el inicio de los tratamientos. Para determinar la viabilidad celular se empleó el método de inmunomarcaje para la proteína caspasa-3 activa, de una de las vías de apoptosis celular (Sesso et al 1999; Mancini et al., 2000; Walker et al 2004; Sutterlin et al., 2005), donde se cuantificaron las células con marcaje positivo y estos valores se compararon con aquellos obtenidos para las células controles en los tiempos correspondientes. 7 INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOTTING 7.1 Extracción de proteínas Las células PC12 fueron sembradas en frascos de 75 cm2 y al tercer y quinto día de tratamiento con metanfetamina, y/o transfectadas con pequeños RNAs de interferencia, fueron lavadas suavemente con una solución de PBS estéril atemperada a 4 ºC y seguidamente congeladas a -20 ºC en seco para ser homogeneizadas posteriormente. Las células, en un ambiente de 4 ºC, fueron rascadas del interior del frasco y solubilizadas en medio de tampón de 103 MATERIALES Y MÉTODOS lisis, consistente en Tris-HCl 50 mM pH 8.8, EDTA 1 mM pH 8.0, Igepal 1% y una mezcla de inhibidores de proteasas según la concentración especificada por el fabricante (Tabla 7). Cada lisado fue centrifugado durante 20 minutos a 15,000 g en una centrifuga Labofuge 400R (Heraeus, Buckinghamshire, England) a 4 ºC. La fracción soluble fue recogida y se cuantificó la concentración de proteínas utilizando el método colorimétrico del ácido bicinconínico-BCATM, siguiendo las recomendaciones de la casa comercial. Para la obtención de la fracción insoluble, el cual contiene principalmente los agregados proteicos, se recogió el precipitado y fue resuspendido en una solución al 2% de SDS en el tampón de solubilización anteriormente descrito, al que se le agregó adicionalmente iodoacetamida 10 mM y fue sonicado durante 10 segundos; todos estos pasos se realizaron en frío. Al igual que antes se utilizó el método de cuantificación proteica de BCA para medir la concentración de proteínas. La detección colorimétrica de las muestras se midió en el espectrofotómetro S-22 UV/Vis BOECO y su análisis en el programa GraphPad Prism® versión 4.0 (Graph Software, CA, USA). 7.2 Electroforesis La electroforesis de proteínas se efectuó siguiendo un protocolo estandarizado, según el manual de instrucciones que se reúne en la guía técnica de NuPAGE® versión E del 2003 (Invitrogen™) (Tabla 7). Las muestras solubilizadas de proteínas fueron mezcladas, siguiendo las proporciones indicadas y en condiciones reductoras a pH neutro, con el tampón de carga LDS, el agente reductor y en su caso agua deionizada. A continuación, fueron desnaturalizadas a 70 ºC en termobloque durante 10 minutos, y se cargó entre 15-25 μg de proteína en geles de Bis-Tris 4 –12% de 1,0 mm de grosor ó TrisAcetato 3-8% de 1,0 mm de grosor (NuPAGE® Novex®) acorde al peso molecular de la proteína de interés en detectar. Se utilizó un marcador de pesos moleculares preteñido (marcador SeeBlueplus® 2 para los geles de Bistris y marcador HiMark® para los geles de Tris-Acetato) con el fin de comparar las mediciones entre controles y tratamientos después del revelado. 104 MATERIALES Y MÉTODOS Posteriormente se cargó el sistema discontinuo de tampones NuPAGE® en el recipiente de electroforesis (XCellSureLock™ Electrophoresis Cell-Invitrogen), MOPS SDS 1X para los geles Bis-Tris y tampón de recorrido Tris-Acetato SDS 1X para los geles de Tris-Acetato; asimismo, en la cámara interna de la cubeta se adicionó 500 µl de antioxidante, para mantener las proteínas en forma reducida mientras migran a través del gel durante la electroforesis. Seguidamente se sometió a electroforesis, 200 voltios/50 minutos para el sistema de Bis-Tris y 150 voltios/1 hora para el sistema de tris-Acetato. 7.3 Western Blot Para la transferencia de proteínas a membrana se utilizó un sistema de transferencia electroforético de tipo húmedo siguiendo un protocolo estandarizado, según el manual de instrucciones que se reúne en la guía técnica de NuPAGE® versión E del 2003 (Invitrogen) (Tabla 7). Se utilizó una condición estándar de trabajo de 30 voltios durante 1 hora sobre membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con poro de 0.45µm, activadas por 30 segundos en metanol, lavadas en agua y mantenidas durante 5 minutos en tampón de transferencia NuPAGE®, añadiéndose 500 µl de antioxidante a la cámara interna (XCell II™ Blot Module-Invitrogen) de la cubeta de electroforesis. Posteriormente las membranas fueron bloqueadas en una solución salina de TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) conteniendo 3 % de albumina sérica bovina durante 2 horas a temperatura ambiente ó a 4 ºC toda la noche en agitación suave. 7.4 Inmunodetección Después del bloqueo, las membranas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente en agitación suave, con diferentes anticuerpos primarios (la casa comercial y sus diluciones se especifican en la Tabla 3). Todos los anticuerpos usados en esta técnica fueron diluidos en TBS-T. Tras la 105 MATERIALES Y MÉTODOS incubación con el anticuerpo primario se realizaron 4 lavados con TBS-T durante 20 minutos. Posteriormente, fueron incubadas con el respectivo anticuerpo secundario conjugado a AlexaFluor® 488 ó 568 durante 60 minutos a temperatura ambiente, en agitación suave y protegidas de la luz (Tabla 4). Finalmente, la detección de las proteínas inmunomarcadas se realizó en el aparato Typhoon 9410 Variable Mode Imager (Amersham Biosciences). La cuantificación específica de cada una de las bandas (intensidad de marcaje relativo) se llevo a cabo a través del programa ImageQuant TL. 8 AMPLIFICACIÓN, PURIFICACIÓN Y TRANSFECCIÓN DE PLÁSMIDOS 8.1 Transformación y multiplicación de bacterias Se prepararon con anterioridad las diluciones de antibióticos necesarias y la dilución y esterilización de los diferentes medios de cultivos a utilizar (Tabla 6), así: - Ampicilina: concentración de trabajo de 1 µl/ml de medio = 100 µg/ml - Kanamicina: concentración de trabajo de 4 µl/ml de medio = 40 µg/ml - Medio SOB (3,07 g/100 ml de agua MilliQ). Para el maxicultivo se emplearon 150 ml/plásmido en matraz-erlenmeyer de 500 ml tapados con torundas de algodón con gasa, y para los minicultivos se emplearon 4 ml/colonia. - LB-agar (3,5 g/100 ml de agua milliQ), tras autoclavar el medio fue llevado al baño a 50 ºC para disminuir la temperatura e impedir su solidificación (~ 45ºC). Se agregó la cantidad específica de antibiótico en el agar preparado y éste sobre cada placa cubriéndola, seguidamente, se dejó solidificar durante unos minutos. Una vez en las placas con su respectivo antibiótico, se guardaron para su posterior uso 106 a 4ºC, MATERIALES Y MÉTODOS invertidas, para evitar su contaminación por condensación, y selladas con parafilm. 8.2 Transformación de bacterias competentes y cultivo en placas 1. Se descongelaron las bacterias E. coli cepa DH5-α en hielo. Se mezcló 2,5 ng del plásmido más 20 μl de bacterias. 2. Se dejó 30 minutos en hielo la mezcla anterior con el tapón del tubo cerrado. 3. Se realizó choque térmico durante 45 segundos a 42 ºC. 4. Se dejaron los tubos después del choque térmico durante 2 minutos en hielo. 5. Se añadieron a cada tubo 180 µl del medio SOC. 6. La recuperación de las bacterias se realizó a 37 ºC durante 1 hora, en agitador a 225 rpm con el tapón de tubos en posición intermedia para permitir la oxigenación. En este paso se introdujeron las placas de cultivo a 37 ºC en estufa. 7. Posteriormente, 90 a 200 µl de bacterias fueron sembradas en placa e incubadas en posición invertida a 37 ºC toda la noche. 8.3 Multiplicación de bacterias Al segundo día, posterior al crecimiento en placas, se realizaron los cultivos para la amplificación de las bacterias transformadas, así: 1. Al medio SOB previamente preparado y autoclavado se le agregó el antibiótico específico dependiente de la resistencia transferida por cada plásmido. 4 ml de medio SOB fueron utilizados por colonia y fueron cultivadas por duplicado. 107 MATERIALES Y MÉTODOS 2. Se picó con palillo, previamente autoclavado, una colonia/tubo, que estuviera separada y con buena apariencia. La multiplicación de bacterias se llevo a cabo en agitador a 280 rpm y 37 ºC toda la noche. 3. Para el maxicultivo se utilizaron 1,5 ml de medio provenientes del minicultivo, los cuales fueron agregados a 150 ml del medio SOB previamente autoclavado, al que se le adicionó la cantidad requerida y específica del antibiótico al que el plásmido le confiere resistencia. Todos estos procedimientos anteriormente mencionados se efectuaron bajo la llama. 8.4 Purificación del ADN plasmídico La purificación de los plásmidos se realizó mediante el uso específico de kits comerciales para extracción en bacterias E.coli. Se utilizó especialmente el kit denominado Maxiprep, siguiendo las recomendaciones aconsejadas por la casa comercial (Tabla 6), así: 1. Se centrifugó durante 10 minutos cada 50 ml del medio SOB del maxicultivo con las bacterias hasta completar los 150 ml totales y se eliminó el sobrenadante. 4. El precipitado final de bacterias fue resuspendido a través de agitación tipo vórtex, en la dilución de resuspensión + ARNasa a razón de 12ml por tubo (ARNasa 60,8 µl/12 ml de solución de resuspensión). 5. Preparación de la solución de lavado dos del kit comercial (1 ml de etanol 95-100 % por cada 0,25 ml de solución de lavado dos). 6. Las bacterias fueron lisadas al agregarles a cada tubo 12 ml de solución de lisis. 7. Se realizó el neutralizado de lisis agregando a cada tubo 12 ml de solución neutralizante previamente atemperada a 4 ºC. 108 MATERIALES Y MÉTODOS 8. Tras el paso anterior se agregó a cada tubo 9 ml de solución de unión. Inmediatamente fueron puestos en la jeringa con sus filtros y se dejó asentar durante 5 minutos. 9. En falcón nuevo estéril se puso la columna y se agregaron 12 ml de la solución de preparación de columna. Se sometió a centrifugación 3000 g durante 2 minutos y se descartó el efluente. 10. Posteriormente se ubicaron la jeringa sobre la columna y se comprimió suavemente con el émbolo para aplicar una presión que permitió el paso del líquido aclarado sobre la columna. Se llevó a centrifugación 3000 g por 2 minutos y se descartó el efluente. 11. Se realizó el primer lavado al agregar a cada tubo 12 ml de solución de lavado uno sobre la columna y se centrifugó a 3000 g por 2 minutos; se descartó el efluente. 12. El segundo lavado se llevo a cabo al agregar a cada tubo 12 ml de solución de lavado dos, previamente preparado, sobre la columna y se centrifugó a 3000 g durante 2 minutos; se descartó el efluente. 13. Por último las columnas fueron transferidas a tubos nuevos para la colección del ADN plasmídico, a los que fue agregado 3 ml de solución de elución por columna, a continuación, se centrifugó a 1000 g durante 5 minutos para obtener la máxima concentración, se recobró el efluente y luego se centrifugó una segunda vez a 3000 g durante 5 minutos para obtener el máxima volumen de plásmido. La medición del ADN plasmídico se realizó en el instrumento cuantificador de ADN/ARN GeneQuant II (PharmaciaBiotech Europe GmbH, Sevilla, España), y el valor de concentración promedio arrojado fue de 530 ng/µl y entre 1,7 - 1,78 los valores del Ratio. 8.5 Transfección transitoria Para las transfecciones se utilizaron cuatro vectores de expresión de ADNc (Tabla 9). Tres de ellos codificaban para unas proteínas específicas, todas unidas a GFP y pertenecientes a la familia de las Rab GTPasas, que 109 MATERIALES Y MÉTODOS regulan el tráfico entre los diferentes compartimentos celulares. Otro de los vectores utilizados codificaba para la sintaxina-5, proteína SNARE que participa en la mediación de procesos de fusión de membranas en la vía secretora temprana. La concentración y pureza obtenida de estos plásmidos esta especificada en la tabla 10. El método utilizado de quimiotransfección se realizó a través del sistema de Lipofectamina™ 2000 y para tal efecto se siguieron las recomendaciones sugeridas por la casa comercial. Para ello, las células fueron transfectadas al cuarto día de tratamiento con una confluencia promedio del 75 % y en una proporción de Lipofectamina™ 2000, ADN de 3:1 respectivamente. Después de 6-8 horas de incubación con las células se retiraron los complejos de transfección y se añadió medio fresco a las mismas, y en el caso de los tratamientos, la droga se añadió a las concentraciones de rutina. Los experimentos se realizaron 18-24 horas después de la expresión proteica específica, tras lo cual las células fueron fijadas en PFA 4 % o metanol absoluto e inmunomarcadas con anti-GM130, anti-GRASP65 ó anti-αsinucleína. Tabla 10. Concentración y purificación de plásmidos CONCENTRACIÓN ng/µl RATIO Rab1A-GFP 646,0 1,781 Rab2-GFP 675,6 1,783 Rab8A-GFP 695,0 1,799 Rab27A-GFP 315,0 1,765 Sintaxina5-GFP 321,0 1,758 PLÁSMIDO 110 MATERIALES Y MÉTODOS 9 ARNs DE INTERFERENCIA (siRNA) Tanto el control siRNA (conjugado a fluoresceína) como los siRNA para Rab1A, Rab2A, Rab8A y syntaxin-5 (Tabla 9) se transfectaron al cuarto día de tratamiento con metanfetamina (50 µM) en una concentración final de 80 pmoles, utilizando el sistema del agente de transfección Lipofectamine™ 2000 y siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células fueron sembradas en frascos de cultivo de 75 cm2 o en cubreobjetos, dependiendo si eran para técnicas de western blot o inmunocitoquímica, respectivamente. Fueron mantenidas hasta el quinto día de tratamiento con la neurotoxina MET, donde fueron lisadas y procesadas para técnicas de western blot ye inmunocitoquímica. Para el análisis inmunohistoquímico, las células en cubreobjetos de vidrio fueron fijadas y doblemente inmunomarcadas, con su respectivo anti-Rab o anti-sintaxina-5 más un marcador de Golgi o alternadamente con α-sinucleína. 10 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN 10.1 Microscopía convencional Las células PC12 fueron sembradas en frascos de cultivo de 75 cm2 al 70% de confluencia, y mantenidas durante las fases de proliferación, diferenciación y tratamiento de acuerdo a las condiciones de rutina. Tras un lavado rápido, con tampón de PBS previamente atemperado a 37 ºC, fueron fijadas con glutaraldehído al 2% en tampón cacodilato 0,2M durante 2h. Seguidamente se levantaron del interior del frasco en un medio soluble de PBS-Glicina 0,02M y gelatina al 1% mediante la ayuda de un rascador de células. Estas muestras fueron centrifugadas, y el precipitado celular obtenido se post-fijó con una mezcla de tetraóxido de osmio al 2% y ferricianuro potásico al 3% en una relación (1:1) durante 2 horas a 4ºC. Posteriormente, las muestras fueron lavadas en tampón cacodilato 0,2M y procesadas para su posterior inclusión en Epon-812. Se contrastaron con acetato de uranilo veronal 111 MATERIALES Y MÉTODOS a 0ºC durante 1 hora, luego se deshidrataron mediante concentraciones crecientes de etanol durante 10 minutos en cada solución, se bañaron en alcohol absoluto y sulfato de cobre, 10 minutos en cada uno. Tras esto, las muestras fueron tratadas con óxido de propileno durante 15 minutos. Por último, se incluyeron en una mezcla de Epon y óxido de propileno (1: 1) durante 1 hora, y en la misma mezcla pero en proporción (2:1) una hora adicional, para ser incluidas en resina de Epon puro toda la noche, y al día siguiente fabricar los bloques. Las secciones ultrafinas, 40 a 60 nm, fueron cortadas en un ultramicrótomo (Ultracut Reichert Jung) y depositadas en rejillas de cobre que se contrastaron posteriormente con acetato de uranilo durante 4 minutos y citrato de plomo durante 1 minuto. La observación de las secciones se realizó en un microscopio de transmisión JEOL 1011 operado a 80 kV y conectado a cámara CCD Gatan BioScan 792 ó en el microscopio Philips Tecnai 12 acoplado a cámara MegaView III, propiedad del Servicio de Microscopía de la Universidad de Murcia. 10.2 Crioultramicroscopía Las células fueron fijadas con una mezcla de paraformaldehido al 2% y glutaraldehido al 0,2% diluidos en tampón fosfato 0,1M y pH 7,4 durante 2h. Tras lavar suavemente con PBS, las células fueron levantadas en un medio soluble de PBS-Glicina 0,02M y gelatina al 1%, mediante la ayuda de un rascador. El precipitado de células obtenido mediante centrifugación se incluyó en una solución acuosa de gelatina al 10% que se enfrió a 4ºC durante un periodo de 30 minutos a 1 hora para que la gelatina se solidificara. Con la ayuda de un bisturí y bajo la lupa se cortó el precipitado de células hasta obtener bloques de 1 mm3 aproximadamente. Estos bloques se embebieron en una solución de sacarosa 2,3 M al menos durante 2 horas a 4 ºC. Finalmente, los bloques se montaron sobre portamuestras ("pins") especiales y se congelaron en nitrógeno líquido donde permanecen almacenados hasta que fueron cortados en un crioultramicrótomo (Leica Ultracut T/FCS) a -120 ºC con cuchilla 112 de diamante (Druker). Se obtuvieron cortes ultrafinos de MATERIALES Y MÉTODOS aproximadamente 50 nm. El procedimiento para recogerlas se realizó con un asa impregnada en una mezcla 1:1 de metilcelulosa 2 % y sacarosa 2,3 M siguiendo las recomendaciones descritas por Liou et al, 1996. Las criosecciones fueron depositadas sobre rejillas de cobre recubiertas con una película de formvar y carbón (Carbon Coater CC7650). 10.3 Crioinmunocitoquímica Para la inmunolocalización ultraestructural de ciertas proteínas involucradas en el tráfico intracelular, las criosecciones se procesaron para técnicas inmunocitoquímicas de dos o tres capas, según el anticuerpo primario fuera policlonal o monoclonal respectivamente. Inicialmente, las rejillas se trataron con PBS-Glicina 0,02 M durante 5 minutos. Tras bloquear los posibles puntos de unión inespecífica del anticuerpo con PBS-BSA 0,1 % durante 5 minutos se incubaron las muestras con el anticuerpo primario durante 30 minutos. Los anticuerpos fueron diluidos a la concentración de trabajo en una solución de BSA-acetilada 0,1 % y glicina 0,02 M en PBS. Tras esta incubación, las muestras fueron lavadas 3 veces en PBS y se volvieron a incubar 5 minutos con PBS-BSA 0,1 %. Seguidamente, se incubaron con la proteína A-oro (10 nm) durante 20 minutos. En el caso de las técnicas de tres capas, previo a la proteína A-oro se incubó con un anticuerpo secundario conejo anti-ratón. Tras lavar las muestras exhaustivamente con PBS se trataron con glutaraldehido al 1 % durante 5 minutos. Posteriormente, se lavaron las muestras en agua durante 20 minutos y finalmente las secciones fueron contrastadas con acetato de uranilo a pH 7.0 y protegidas con una película de metilcelulosa y acetato de uranilo a pH 4.0 (9:1) (Slot et al, 1991; Martínez-Menárguez et al, 1999). 113 MATERIALES Y MÉTODOS 11 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se aplicó la prueba paramétrica del test t de Student, así como la de ANOVA (analysis of variance) para el estudio comparativo entre diferentes grupos. En general para todas las pruebas se utilizaron valores de P<0,05 para determinar la significatividad estadística. 114 RESULTADOS VI. RESULTADOS Como se ha descrito en apartados anteriores, la línea celular PC12 representa un modelo válido para el estudio de enfermedades neurodegenerativas (Malagelada y Greene, 2008). Con el fin de reproducir, lo más cercanamente posible, las alteraciones del tráfico celular que puedan ocurrir de forma natural en la EP, nos hemos valido de una de las propiedades de estas células, su capacidad de respuesta al estímulo del factor de crecimiento nervioso. Este desencadena una cascada de eventos que se reflejan en mecanismos específicos de diferenciación celular, permitiéndole a estas células adoptar muchas de las características que definen a las neuronas adrenérgicas del sistema nervioso autónomo simpático. Asimismo, en su estado de diferenciación neuronal, las células PC12 adquieren propiedades relevantes que se asimilan a las de las neuronas dopaminérgicas del sistema nervioso central, incluyendo la producción y liberación de dopamina como su principal catecolamina (Fornai et al., 2007). Además, como neuronas, las células PC12, incrementan su capacidad endógena de expresión de αs (Larsen et al., 2006), cualidad inherente que hemos aprovechado para poder relacionar los daños en el tráfico intracelular con la sobreexpresión y/o agregación de esta proteína. 117 RESULTADOS 1 MECANISMOS DE NEUROTOXICIDAD En el presente estudio se utilizó la capacidad neurotóxica que poseen las sustancias 6-OHDA y MET, con el propósito de mimetizar los rasgos citopáticos de la EP. Debido a las similitudes con la dopamina, la toxina 6-OHDA se acumula en el citoplasma promoviendo la generación de altos niveles de radicales libres con gran contenido de H2O2 (Blandini et al., 2008). En los ensayos preliminares la muerte celular masiva inducida por esta neurotoxina nos impidió realizar ensayos crónicos, pero la administración de catalasa murina al medio de cultivo nos permitió aumentar la supervivencia celular, al anular en grado variable los efectos citotóxicos del peróxido de hidrógeno (Saito et al., 2007). Al remontar este obstáculo, se nos posibilitó el desarrollo de experimentos en periodos prolongados de tiempo, hasta de 8 días. La administración de MET al medio de cultivo induce un incremento en la concentración de dopamina libre en citosol, la cual a su vez, puede generar un desequilibrio de la capacidad celular para responder al ataque de radicales libres. Además, el aumento de los niveles de dopamina citosólica, incrementa las probabilidades de esta amina biógena para acoplarse a la forma protofibrilar de la proteína αs, lo cual promueve la formación de inclusiones intracelulares (Lazzeri et al., 2007). 2 CAMBIOS EN LA DISTRIBUCIÓN DE LA PROTEÍNA αSINUCLEÍNA Para identificar los posibles cambios que pudiera sufrir la proteína αs, monitorizamos los efectos de ambas neurotoxinas, en su distribución. En las células no tratadas esta proteína fue localizada en pequeños puntos distribuidos de forma difusa por todo el citoplasma, incluyendo las proyecciones neuríticas de las células PC12 diferenciadas (Figura 8A, B). 118 RESULTADOS Como hemos indicado anteriormente, en los ensayos realizados con la neurotoxina 6-OHDA se utilizó catalasa murina, la cual fue agregada al medio de cultivo desde el comienzo de la fase de diferenciación, tanto para las células control como en las tratadas. Según lo esperado, no se encontró alteración en el patrón de distribución de la proteína αs en células control, a las cuales se les agregó 20 unidades de catalasa murina (Figura 8A). Tras cuatro días de tratamiento, se empezaron a observar grandes agregados citoplasmáticos, aunque tenían una menor intensidad de inmunomarcaje fluorescente comparados con aquellos presentes en células tratadas por 5 ó más días. Al quinto día de incubación con las neurotoxinas 6OHDA o MET, se indujo la formación de inclusiones yuxtanucleares compactas (Figura 9A, B), este efecto tóxico se observó en ~30 % de la población celular tratada (Figura 10). Tanto para el tratamiento con 6-OHDA como para el de MET, el número de células que presentaban inclusiones intracelulares, no aumentó después de períodos más prolongados de exposición a estas neurotoxinas. También pudimos observar que en ambos tratamientos, un elevado número de células presentó agregados en las terminales neuríticas (correspondiente a una terminal axónica), los cuales podían estar o no acompañados de una gran inclusión yuxtanuclear (Figura 11A, B). Estos hallazgos están acorde con los datos descritos en la literatura (Kawahara et al., 2008), donde refieren la formación de oligómeros de la proteína α -sinucleína y sus forma protofibrilares, como las precursores de lesión retrograda con posterior agregación de αs filamentosa, inc luyendo el desarrollo de neuritas de Lewy. Por motivos técnicos no se realizó el estudio cuantitativo de las inclusiones análogas a los neuritas de Lewy, dado que la manipulación de estas células durante las fases de diferenciación y tratamiento, fijación y marcaje, producen el desenganche de las ramificaciones con su posterior ruptura, lo que deja visible solo pocas células con estas características para su evaluación. 119 RESULTADOS En una manera dependiente del tiempo, ambos tratamientos indujeron la formación de inclusiones intracelulares similares en aspecto cuando las células fueron inmunomarcadas para la proteína α-sinucleína. A nuestro conocimiento (ver también Schober et al., 2004), esta es la primera descripción de inclusiones intracelulares en células neuronales PC12 tratadas con 6-OHDA, probablemente debido a la utilización de catalasa que permitió realizar ensayos en períodos más prolongados. Interesantemente, el momento de inicio de formación de inclusiones y el porcentaje de células afectadas que mostraron este fenómeno, fueron muy similares para ambas neurotoxinas a los cinco días de tratamiento (Figura 10). En ambos casos, las inclusiones reaccionaron al inmunomarcaje contra la proteínaα s, proteínas del citoesqueleto y proteínas motoras asociadas al citoesqueleto (ver apartado 6), indicando ciertas similitudes con los cuerpos de Lewy, los cuales se encuentran presentes de forma natural en la EP. Asimismo, a nivel ultraestructural estas inclusiones fueron ocupadas por un fino material granular y rodeadas por numerosos lisosomas (Figura 12). 120 RESULTADOS Figura 8. Distribución de la proteína α -sinucleína en células control de tratamientos con 6-OHDA (A) y MET (B). (A) Esta proteína muestra un patrón de distribución punteado difuso por todo el citoplasma, que no se modificó tras añadir 20 unidades de catalasa murina, al compararla con la figura B. Barra de calibrado 25 µm. 121 RESULTADOS Figura 9. Cambios en la distribución de la proteína α-sinucleína en células PC12 expuestas durante 5 días a la acción neurotóxica. (A) Tratamiento con 6-OHDA + 20U de catalasa. Se observa la formación de grandes agregados yuxtanucleares de alta intensidad fluorescente (B) Tratamiento con MET. Se aprecia la similitud de rasgos entre tratamientos, donde la distribución de αs está claramente afectada, agregándose en una región compacta adyacente al núcleo. Barra de calibrado 25 µm. 122 RESULTADOS 40% 6-OHDA MET 30% 20% * 10% 0% DÍAS 1 2 3 4 5 Figura 10. Análisis cuantitativo de la aparición de inclusiones en el tiempo. Se puede apreciar que al cuarto día de tratamiento con 6-OHDA o MET, se hace patente la aparición de agregados inmunomarcados para la proteína α s, aunque, el porcentaje de células con inclusiones es significativamente mayor en el tratamiento con 6-OHDA. Sin embargo, no se hallaron diferencias significativas entre ambos tratamientos en el quinto día. El asterisco indica que las diferencias son significativas (ANOVA, p < 0.05). 123 RESULTADOS Figura 11. Cambios en la distribución de la proteína α-sinucleína en células PC12 tratadas durante 5 días bajo la acción neurotóxica de ambas sustancias. (A) Tratamiento con 6-OHDA + 20U de catalasa. Se mantiene el patrón típico de punteado difuso en el soma neuronal, sin embargo a nivel de la terminal nerviosa, se observa αs de forma agregada extendiéndose a lo largo de la proyección axonal. (B) Tratamiento con MET. Esta imagen muestra grandes similitudes con los cambios observados en la distribución de αs para el tratamiento con 6 -OHDA. En este caso se puede ver la presencia de ambos tipos de inclusiones. Barra de calibrado 25 µm. 124 RESULTADOS Figura 12. Ultraestructura de células PC12 como modelo de enfermedad de Parkinson. Se muestra después de 5 días de tratamiento con MET una gran inclusión yuxtanuclear (asterisco). N = núcleo. Barra de calibrado 0,2 µm. 125 RESULTADOS 3 ESTUDIO DE VIABILIDAD CELULAR Apoyados en los hallazgos obtenidos de los ensayos efectuados en un periodo de 8 días de tratamiento con ambas neurotoxinas, concluimos que 5 días correspondía al tiempo ideal para realizar todos los experimentos, periodo en el cual se produjo el mayor número de células con inclusiones intracelulares, mientras que tratamientos más prolongados no aumentaban la tasa de agregación. Adicionalmente observamos que después de 6 días de tratamiento con 6-OHDA o MET se comprometía seriamente la viabilidad celular, apareciendo un nivel progresivo de muerte celular con características necróticas. Células PC12 en su estado neuronal (células diferenciadas), fueron tratadas con diferentes concentraciones y tiempo de exposición con las neurotoxinas 6-OHDA y MET, a fin de inducir un fenotipo de EP (es decir, sobreexpresión y agregación de la proteína α -sinucleína con formación de inclusiones citoplasmáticas), sin comprometer la viabilidad celular. Bajo las condiciones de trabajo previamente establecidas, las células mostraron una morfología sin signos de muerte celular por apoptosis o necrosis, incluso después del tratamiento crónico llevado a cabo durante cinco o más días (ver apartado 4). Estas observaciones fueron confirmadas por el estudio de viabilidad realizado a través del inmunomarcaje para caspasa 3 activa, donde el número de células que sufrieron muerte por apoptosis presentó valores muy bajos (menos de 0,1%) en el período de estudio. 4 FRAGMENTACIÓN DEL COMPLEJO DE GOLGI Para realizar un estudio detallado de los cambios en la arquitectura del AG en células PC12 sometidas al tratamiento con las neurotoxinas 6-OHDA y MET, inicialmente realizamos un análisis morfológico mediante técnicas de inmunofluorescencia. Ambas toxinas indujeron la fragmentación del AG 126 RESULTADOS rápidamente, proceso que fue progresando drásticamente en función del tiempo (Tabla 11). Así, tras cinco días de tratamiento, más del 80% de las células mostraron un complejo de Golgi alterado. De nuevo, el patrón de alteración fue similar para ambas toxinas, aunque la fragmentación del AG comenzó antes en las células tratadas con MET (Tabla 11). Para comprobar la fragmentación del AG utilizamos una batería de anticuerpos contra marcadores específicos del AG, como son, enzimas de glicosilación, proteínas de matriz, proteínas SNARE, proteínas Rab GTPasas, entre otras, confirmando que esta fragmentación afecta a todas las cisternas de este orgánulo, aunque menos dramático a nivel del TGN (Figura 13). No observamos modificaciones en la distribución (deslocalización) de estas proteínas. Asimismo, el análisis morfológico mediante inmunofluorescencia de las proteínas seleccionadas, no mostró indicios de agregación citoplasmática. A nivel ultraestructural, los complejos de Golgi de células PC12 no tratadas mostraron una morfología típica, es decir, cisternas apiladas rodeadas por elementos tubulovesiculares (Figura 14A). El AG de células tratadas también presenta esta morfología (Figura 14B), demostrando que la fragmentación del AG no es consecuencia de la muerte inducida por apoptosis. A diferencia de los dictiosomas que se observaron en las células control, en las células tratadas, estos apilamientos presentaban una reducción significativa en la longitud de las cisternas, formando lo que se denominan minidictiosomas (“ministacks”) (Figura 14B). El patrón general de la morfología del aparato de Golgi en células tratadas con ambas neurotoxinas, fue similar a minidictiosomas, como aquellos descritos después de la despolimerización de microtúbulos mediante la droga nocodazole (Storrie et al., 1998). Igualmente, la distribución de estos minidictiosomas presentó un patrón disperso, ocupando en citoplasma aproximadamente el doble o el triple del área de un complejo de Golgi normal. También observamos en un porcentaje bajo de células tratadas, que los dictiosomas estaban dispersos por el citoplasma. Mediante técnicas de crioinmunocitoquímica para microscopía electrónica, observamos que el inmunomarcaje contra GM130 estaba 127 RESULTADOS restringido a la cara cis del AG en células tratadas, confirmando que la polarización de estos minidictiosomas no se había alterado por el tratamiento (Figura 15). Estos hallazgos permanecieron en coherencia con estudios previos, donde se demuestra que la fragmentación del AG, debido al ataque de formas alteradas de la proteína α s, no induce cambios en la polaridad cis-trans de este orgánulo (Gosave et al., 2002). FRAGMENTACIÓN DEL GOLGI Días de Tratamiento 6-OHDA MET 1 0 14.0 ± 0.7 2 2.0 ± 0.6 30.0 ± 0.4 3 11.0 ± 1.3 40.5 ± 0.5 4 62.0 ± 1.9 72.5 ± 0.3 5 83.0 ± 2.2 82.5 ± 0.6 Tabla 11. Análisis de la cinética de fragmentación del complejo de Golgi en el presente modelo celular de enfermedad de Parkinson. Valoración de la morfología del AG realizado por inmunofluorescencia utilizando GM130 como marcador. La fragmentación del AG sucede más tempranamente bajo el tratamiento con MET. Sin embargo, no se presentan diferencias significativas entre neurotoxinas después del cuarto día de exposición. Los datos representan el porcentaje (media ± SEM) de las células con AG fragmentados. Se contaron al menos 300 células para cada tiempo y tratamiento. 128 RESULTADOS Figura 13. Análisis comparado de la morfología del Golgi entre células control y tratadas durante 5 días con las neurotoxinas 6-OHDA o MET. Las células fueron inmunomarcadas para GM130, GRASP65, manosidasa II, GS28, β-COP, p115, p58, Rab1, GS15, sintaxina 6, KDELr y TGN38. Se muestran los cambios en la distribución típica compacta del AG, donde el patrón de fragmentación prevalece en ambos tratamientos. KDELr se observa disperso, con distribución homogénea por todo el citoplasma en ambos tratamientos. Los cambios para el inmunomarcaje contra la proteína TGN38 son menos dramáticos, si se comparan con los demás marcajes. Barra de calibrado 25 µm. 129 RESULTADOS Figura 13. Continuación. 130 RESULTADOS Figura 13. Continuación. 131 RESULTADOS Figura 13. Continuación. 132 RESULTADOS Figura 13. Continuación. 133 RESULTADOS Figura 13. Continuación. 134 RESULTADOS Figura 14. Ultraestructura de células PC12 como modelo de enfermedad de Parkinson. (A) Células control, donde el complejo de Golgi muestra el típico apilamiento de cisternas. (B) células tratadas con MET durante 5 días. En neuronas PC12 tratadas, el AG es mucho más pequeño, formando minidictiosomas, en comparación a las células control. G = complejo de Golgi, N = núcleo. Barra de calibrado 0,2 µm. 135 RESULTADOS Figura 15. Crioinmunocitoquímica ultraestructural de células PC12 tratadas con metanfetamina como modelo de enfermedad de Parkinson. Se observa como el marcador de la cara cis del Golgi, GM130, está restringido a un lado del minidictiosoma. G = complejo de Golgi, N = núcleo. Barra de calibrado 0,2 µm. 136 RESULTADOS 5 RELACIÓN ENTRE LA FRAGMENTACIÓN DEL COMPLEJO DE GOLGI Y FORMACIÓN DE AGREGADOS Seguidamente, analizamos la relación entre la fragmentación del AG y la formación de inclusiones inmunoreactivas para la proteína α s. Como puede verse en la figura 16, la aparición del AG fragmentado precedió a la formación de inclusiones intracelulares. Los hallazgos encontrados en este estudio confirman investigaciones previas (Gosavi et al., 2002). Sin embargo, en contraste con este estudio, hemos encontramos que el 100% de las células que contenían inclusiones mostraban un AG fragmentado (Figura 16 y 17). A diferencia de los hallazgos descritos en el estudio llevado a cabo en células de riñón (COS-7) (Gosavi et al., 2002), no observamos agregados prefibrilares de la proteína αs con ninguno de los dos tratamientos. Los experimentos de doble inmunomarcaje mostraron claramente que las inclusiones ricas en α-sinucleína aparecieron rodeadas por fragmentos del complejo de Golgi (Figura 17). Esto fue especialmente evidente tras la reconstrucción tridimensional de las imágenes de microscopía confocal mediante deconvolución (Figura 18). Así pues, nuestros resultados indican que la formación de inclusiones se produce dentro del área del AG, probablemente debido a que tanto la localización de este orgánulo como la posición de las inclusiones son dependientes del centrosoma (ver discusión). 137 RESULTADOS GOLGI FRAGMENTADO INCLUSIONES 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% DÍAS 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Figura 16. Análisis cuantitativo de los efectos neurotóxicos de 6-OHDA y MET a lo largo del tiempo. Los datos están expresados como el porcentaje (± SEM) de las células que exhiben fragmentación del complejo de Golgi o formación de inclusiones intracelulares inmunoreactivas para α-sinucleína. 300 células fueron contadas por ensayo de toxina específica en cada día de tratamiento. 138 RESULTADOS Figura 17. Evaluación morfológica de la relación entre la fragmentación del AG y la formación de inclusiones intracelulares. Células neuronales PC12 tratadas durante 5 días con las neurotoxinas 6-OHDA o MET. Las células fueron doblemente inmunomarcadas para GM130 (rojo) y αs (verde). Ambos tratamientos indujeron la formación de inclusiones yuxtanucleares y fragmentación del AG. El AG presentó modificaciones en su patrón típico perinuclear, pasando de una estructura compacta a estar organizada por pequeños fragmentos dispersos alrededor de las inclusiones. Barra de calibrado 25 µm. 139 RESULTADOS Figura 18. Reconstrucción en tres dimensiones (3D) del complejo de Golgi e inclusiones intracelulares, mediante la técnica de deconvolución a partir de imágenes obtenidas por microscopía confocal. El AG fue inmunomarcado contra GM130 (rojo), y las inclusiones contra la proteína α -sinucleína (verde). Las imágenes del doble inmunomarcaje, muestran que el AG en células tratadas con MET está compuesto de múltiples fragmentos distribuidos alrededor de una gran inclusión citoplasmática. En la figura inferior se observa una célula sin alteración (flecha) con el AG intacto y múltiples fracciones de la proteína α -sinucleína distribuidas por todo lo que sería el citoplasma. Al contrario, las células con presencia de agregados muestran alteración en la distribución de la αproteína -sinucleína, donde disminuye considerablemente su presencia punteada en citoplasma (cabeza de flecha). 140 RESULTADOS 6 MECANISMOS DE FRAGMENTACIÓN DEL COMPLEJO DE GOLGI Hay muchas alteraciones que pueden inducir la fragmentación del AG (revisado por Mironov y Beznoussenko, 2011). Se ha postulado que la alteración del citoesqueleto de microtúbulos y el desequilibrio entre el transporte anterógrado y retrógrado son posibles causas de este fenómeno en los modelos de la EP. En primer lugar analizamos por inmunofluorescencia la apariencia de la red de microtúbulos en las células tratadas con las neurotoxinas 6-OHDA y MET en un periodo de 1 a 5 días. Hasta la formación de grandes inclusiones al cuarto día de tratamiento (4 º día), el citoesqueleto aparentemente permaneció intacto (Figuras 19 y 20). Lo mismo pasó también para microtúbulos estables (Figura 21). Los datos bioquímicos también mostraron que la agregación de la proteína α-tubulina se produce en etapas posteriores (ver más adelante). Las inclusiones intracelulares inmunoreactivas para la proteína α s, también reaccionaron con anticuerpos contra α -tubulina. El tratamiento durante 5 días con ambas neurotoxinas produjeron las mismas características. En las células tratadas se observó un gran agregado yuxtanuclear, mostrando el resto del citoplasma una menor intensidad de marcaje, lo cual indica que la distribución de α -tubulina se afecta en alto grado (Figura 19). Además, la morfología externa de un alto porcentaje de células que presentaban inclusiones citoplasmáticas, se tornó de un aspecto redondeado, perdiendo así, las características arquitectónicas de las células PC12 en su estado neuronal (Figuras 9, 17, 19 y 20). También realizamos un estudio morfológico del patrón de distribución de la proteínaβ -tubulina, en células PC12 con diferenciación neuronal bajo tratamiento con ambas neurotoxinas. Al igual de lo que ocurre con las proteínas αs y α-tubulina, β-tubulina se agrega, siendo el inmunomarcaje menos intenso por fuera del espacio de agregación yuxtanuclear (Figura 20), lo que puede estar indicando que un nivel significativo de la proteína sintetizada está siendo secuestrada por algún mecanismo en el área que corresponde al centrosoma, 141 RESULTADOS lo que dejaría menos cantidad de proteína para dar lugar a la organización de la red de microtúbulos. Asimismo, realizamos ensayos de doble inmunomarcaje para las proteínas del citoesqueleto de microtúbulos y αs, con el fin de evaluar la posible colocalización en los agregados. Como era de esperar estas proteínas estaban presentes en la misma localización yuxtanuclear (Figuras 22 y 23). Adicionalmente en el estudio de proteínas asociadas al citoesqueleto, encontramos que las proteínas motoras kinesina de cadena pesada y dineína de cadena pesada también se agregaban (Figura 24), pero no así, con kinesina y dineína de cadena ligera. Además, realizamos ensayos de doble inmunomarcaje para estas proteínas αs, y con el prop ósito de evaluar su posible colocalización en los agregados. Igual que para las proteínas del citoesqueleto de microtúbulos estas también estaban presentes en la misma localización yuxtanuclear (Figura 25). Dado que la fragmentación del AG comenzó tan pronto como el primer día, parece muy poco probable que la formación de minidictiosomas se deba a una alteración sobre el sistema del citoesqueleto. 142 RESULTADOS Figura 19. Efectos del tratamiento neurotóxico sobre el citoesqueleto de microtúbulos. Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la distribución de la proteína α-tubulina en células control y células tratadas durante 3 y 5 días. No se observan diferencias en la distribución de α-tubulina a los tres días de tratamiento con las neurotoxinas. Sin embargo, después de cinco días de tratamiento, los componentes microtubulares se concentran en una gran inclusión yuxtanuclear. Barra de calibrado 25 µm. 143 RESULTADOS Figura 20. Efectos del tratamiento neurotóxico sobre el citoesqueleto de microtúbulos. Las imágenes de inmunofluorescencia muestran la distribución de la proteína β-tubulina en células control y células tratadas con MET durante 5 días. Se observan diferencias en la distribución deβ -tubulina a los 5 días de tratamiento con MET, donde al igual de lo que ocurre con α-tubulina, aparece agregada en un área limitada al espacio yuxtanuclear. Barra de calibrado 25 µm. 144 RESULTADOS Figura 21. Efectos del tratamiento neurotóxico sobre el citoesqueleto estable de microtúbulos. Imágenes de inmunofluorescencia que muestran la distribución de la proteína α-tubulina acetilada en células control y células tratadas durante 3 y 5 días. No se observan diferencias en la distribución de α-tubulina acetilada a los tres días de tratamiento. En el quinto día de tratamiento se incrementa la compactación de esta proteína del citoesqueleto en la región perinuclear. Barra de calibrado 25 µm. 145 RESULTADOS Figura 22. Distribución comparada de las proteínas del citoesqueleto de microtúbulos y α -sinucleína. Las imágenes del doble inmunomarcaje muestran la distribución de las proteínas αs (verde) y α -tubulina (rojo), en células control y células tratadas durante 5 días con MET. Es evidente el cambio en la distribución de ambas proteínas al quinto día de tratamiento, donde ambas proteínas colocalizan en la formación de agregados yuxtanucleares. Se observa como en una de las células inmunoreactiva para la proteína α s (flecha) se está iniciando la formación de un agregado, el cual no muestra aún citoesqueleto. Barra de calibrado 25 µm. 146 evidencias de agregación de proteínas del RESULTADOS Figura 23. Distribución comparada de las proteínas del citoesqueleto de microtúbulos y α -sinucleína. Las imágenes del doble inmunomarcaje muestran la distribución de las proteínas α s (verde) y β-tubulina (rojo), en células control y células tratadas durante 5 días con MET. Se muestra el cambio en la distribución de ambas proteínas al quinto día de tratamiento, donde ambas proteínas colocalizan en agregados yuxtanucleares. Barra de calibrado 25 µm. 147 RESULTADOS Figura 24. Efectos del tratamiento neurotóxico sobre proteínas motoras asociadas al citoesqueleto. Las imágenes de inmunofluorescencia muestran la distribución de las proteínas dineína de cadena pesada (DHC), kinesina de cadena pesada (KHC) y kinesina de cadena ligera (KLC), en células control y células tratadas durante 5 días con MET. Las proteínas DHC y KHC aparecen formando agregados yuxtanucleres. Sin embargo, después de cinco días de tratamiento, no se observan diferencias en la distribución de KLC. Barra de calibrado 25 µm. 148 RESULTADOS Figura 25. Distribución comparada de las proteínas motoras asociadas al citoesqueleto y α-sinucleína. Las imágenes del doble inmunomarcaje muestran la distribución de las proteínasα -sinucleína (verde) y KHC (rojo), en células control y células tratadas durante 5 días con MET. La imagen inferior, donde se muestra la mezcla de ambos inmunomarcajes, hace visible el hecho de que tanto αs como KHC colocalizan en la gran inclusión que se ha formado adyacente al núcleo. Véase además el cambio en la morfología externa de la célula, donde ese aspecto de contorno redondeado como reflejo del efecto citopático de MET, no afectó la continuidad de las proyecciones celulares. Barra de calibrado 25 µm. 149 RESULTADOS 7 ESTUDIO DE INTRACELULAR LA ALTERACIÓN DEL TRANSPORTE A continuación, exploramos una segunda hipótesis, donde se postula que la alteración del tráfico induce la fragmentación del AG. De acuerdo con este argumento analizamos la cinética del transporte en las vías secretoras tempranas después de tres y cinco días de tratamiento con la neurotoxina MET. Hemos seleccionado estos tiempos porque a los tres días de tratamiento se generó fragmentación del AG pero no inclusiones, mientras que a los cinco días, se desarrollo fragmentación extensa del AG y se formaron agregados intracelulares. De este modo, podríamos analizar estos fenómenos de forma independiente. El ensayo del transporte retrógrado, el cual se evalúa después de agregar al medio de cultivo BFA, fue monitorizado a través de la aparición de la enzima del AG manosidasa II en retículo endoplásmico. Es bien sabido que esta droga induce la fusión del AG en el RE, un fenómeno que se cree es representativo del tráfico retrógrado entre estos compartimentos (Klausner et al, 1992). También estudiamos el reensamblaje del AG después del lavado de BFA, como indicativo del transporte anterógrado. Con el propósito de analizar el transporte anterógrado, las células neuronales PC12 fueron incubadas con BFA durante 40 minutos, posteriormente la droga fue retirada al lavar y cultivar las células en medio fresco, punto desde el cual se realizó de forma seriada en el tiempo la fijación e inmunomarcaje para manosidasa II. En ambos casos las células neuronales PC12 fueron tratadas con 1 μg/ml de BFA. La droga se utilizó al final de los periodos de tratamiento con MET, los cuales fueron realizados al tercer y quinto día de exposición a la neurotoxina. Tras la fijación, las células fueron inmunomarcadas doblemente para las proteínas del AG GM130 y manosidasa II. El análisis del tiempo transcurrido desde la aparición de la enzima del AG en el RE (transporte retrógrado) y reensamblaje del AG (transporte anterógrado) en las células control y tratadas durante 3 días con metanfetaminas, demostró que el transporte no está alterado bajo esta 150 RESULTADOS condición (Figuras 26, 27 y 28A). Así, los valores obtenidos en cada punto específico de tiempo fueron muy similares entre células control y tratadas (el 40% de las células tratadas había fragmentado el complejo de Golgi para este momento, figura 16). Estos datos demuestran que tras 3 días de tratamiento, ni el transporte retrógrado ni el anterógrado están alterados. Dado que la fragmentación del AG ocurre desde el primer día de tratamiento con la neurotoxina, nuestros resultados indican que esta fragmentación no se debe al efecto directo de alteraciones importantes en el transporte entre el RE-Golgi. Al contrario de lo ocurrido en los ensayos del transporte retrógrado a 3 días de exposición a la neurotoxina, la cinética del transporte después de cinco días presentó marcadas alteraciones. El transporte retrógrado resultó significativamente retrasado en células tratadas durante 5 días con la neurotoxina MET. El análisis cuantitativo demuestra que el transporte retrógrado medido por el uso de BFA, presentó un retraso significativo en células tratadas en comparación con las células control (Figuras 28B y 29), donde el marcaje con manosidasa II alcanzó el RE en todas las células control entre 25-30 minutos, mientras que necesitó más de 40 minutos en las células tratadas con metanfetamina durante cinco días (Figura 29), lo que demuestra la presencia de un retraso significativo en este modelo neuronal de EP. Asimismo, los resultados del análisis cuantitativo demostraron que el transporte anterógrado fue significativamente más acelerado en las células tratadas con MET durante 5 días. Al contrario de lo que ocurre con las células tratadas durante 3 días con MET, al quinto día de tratamiento el transporte anterógrado fue alterado por el efecto citopático de la neurotoxina, siendo ligeramente más rápido en comparación con las células control (Figuras 30 y 31). Este resultado contrasta con estudios previos realizados en otros modelos donde el transporte se ve retrasado (Cooper et al., 2006; Thayanidhi et al., 2010) (ver discusión). Para confirmar el estado alterado del transporte anterógrado en nuestro modelo en el quinto día de tratamiento con la neurotoxina MET, recurrimos al análisis del transporte del mutante sensible a temperatura ts045 de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSVg) (Figura 32). El transporte 151 RESULTADOS anterógrado, después del quinto día de tratamiento, fue monitorizado a través del análisis en el tiempo de la aparición en el AG de la señal fluorescente emitida por la molécula GFP unida a la proteína VSVg. El transporte de esta proteína desde RE hasta el aparato de Golgi fue iniciado al cambiar las condiciones de incubación de las células transfectadas con VSVg-GFP, desde la temperatura no permisiva (40 ºC), a la temperatura permisiva (32 ºC). La proteína se trasladó desde el RE al compartimento intermedio y, a continuación, al AG. Medimos en diferentes tiempos el porcentaje de células en las que la proteína viral había alcanzado el complejo de Golgi (Figura 32). En las células control, la proteína viral necesitó 15 minutos para alcanzar el AG, mientras que en las células tratadas se observa su aparición después de 5 minutos de incubación a la temperatura permisiva (Figura 33), confirmando los resultados obtenidos en los ensayos realizados con la droga BFA. Considerando que nuestros resultados demuestran claramente que el transporte anterógrado está afectado tras cinco días de tratamiento, postulamos que estas alteraciones podrían deberse a cambios en las vesículas revestidas de COP II. Para analizar esta hipótesis realizamos inmunomarcaje contra la proteína Sec13 como marcador de las cubiertas de vesículas tipo COP II. Los resultados revelaron que al minuto 25 después del lavado de brefeldina A (-BFA), en un 25% de las células se producía el acúmulo de vesículas COP II alrededor de lo que posiblemente es una gran inclusión yuxtanuclear, área que representa el sitio donde se tendría que dar la organización del compartimento intermedio y posterior ensamblaje de la cara cis del AG (Figura 34). Esta acumulación de vesículas alrededor de la zona donde se localiza el aparato de Golgi y las inclusiones podría explicar la aceleración del transporte anterógrado. 152 RESULTADOS Figura 26. Ensayos del transporte retrógrado al tercer día de tratamiento con MET. Se muestra el marcaje con manosidasa II. La cinética de fusión AG-RE fue similar en células control y tratadas con la neurotoxina. La fusión completa AG-RE se alcanzó, tanto para células control como para células tratadas, entre 25 a 30 minutos de exposición a BFA. Barra de calibrado 25 µm. 153 RESULTADOS Figura 26. Continuación. 154 RESULTADOS Figura 27. Ensayos del transporte anterógrado al tercer día de tratamiento con metanfetamina. Se muestra el marcaje con manosidasa II. La cinética de recuperación, del AG tras eliminar la BFA, fue similar en células control y tratadas con la neurotoxina. Barra de calibrado 25 µm. 155 RESULTADOS Figura 27. Continuación. 156 RESULTADOS Figura 27. Continuación. 157 RESULTADOS Control 3 días A Tratamiento 3 días 100% + BFA 80% * 60% 40% 20% 0% 5' B 10' 15' 20' Control 5 días 25' 30' 35' 40' Tratamiento 5 días 100% * + BFA 80% * 60% 40% 20% * * * 15' 20' * 0% 5' 10' 25' 30' 35' 40' Figura 28. Análisis cuantitativo del transporte retrógrado al tercero y quinto día de tratamiento con la neurotoxina MET. Se muestra el porcentaje (±SEM) de las células inmunomarcadas para manosidasa II, después de la adición de brefeldina A (+BFA) que muestra un patrón citoplasmático (distribución en RE). (A) Al tercer día de tratamiento, el transporte retrógrado está prácticamente inalterado. (B) El análisis cuantitativo demuestra que el transporte retrogrado al quinto día de tratamiento está significativamente alterado. 300 células fueron contadas para cada periodo de tiempo. El asterisco indica que las diferencias son significativas (ANOVA, p < 0.05). 158 RESULTADOS Figura 29. Ensayos del transporte retrógrado al quinto día de tratamiento con la neurotoxina MET. Se muestra el marcaje con manosidasa II. Se observan aparatos de Golgi intactos después de 25 minutos de exposición a BFA en células tratadas, mientras que en este punto específico de tiempo, el marcaje con manosidasa II está presente en el RE de células control, indicando que el transporte retrógrado AG-RE está retrasado en el modelo de Parkinson. Barra de calibrado 25 µm. 159 RESULTADOS Figura 29. Continuación. 160 RESULTADOS 100% Control Tratamiento 80% 60% 40% * 20% 0% 2' 5' 10' 15' - BFA 3 días 20' 2' 5' 10' 15' - BFA 5 días Figura 30. Análisis cuantitativo del transporte anterógrado. Se evalúa el porcentaje (±SEM) de células con patrón citoplasmático (distribución en retículo endoplasmático) inmunomarcadas para manosidasa II, tras la eliminación de la droga BFA (-BFA). Al tercer día de tratamiento el transporte retrógrado permanece intacto. Sin embargo, el análisis demuestra que el transporte anterógrado está afectado significativamente después de cinco días de tratamiento. 300 células fueron contadas en cada espacio de tiempo. Los asteriscos indican que las diferencias son significativas (ANOVA, p < 0.05). 161 RESULTADOS Figura 31. Ensayos del transporte anterógrado al quinto día de tratamiento con la neurotoxina metanfetamina. Se muestra el inmunomarcaje para manosidasa II. Destacar que esta enzima del AG, después de 10 minutos sin BFA se encuentra en el AG, mientras que en las células control permanece aún en el RE. Después de 35 minutos del lavado de BFA, las células tratadas empiezan a mostrar signos de fragmentación que se presenta al quinto día de tratamiento, mientras que las células control recuperan progresivamente la arquitectura normal del AG. Barra de calibrado 25 µm. 162 RESULTADOS Figura 31. Continuación. 163 RESULTADOS Figura 31. Continuación. 164 RESULTADOS Control Tratamiento 100% 80% * 60% * 40% 20% * 0% 5' 10' 15' 20' Figura 32. Análisis cuantitativo del transporte anterógrado al quinto día de tratamiento con metanfetamina mediante el uso del VSVg-GFP. Los valores representan el porcentaje (± SEM) de las células en las que se identificó fluorescencia en el área perinuclear, como indicativo que la proteína viral alcanzó el AG. El análisis demuestra claramente que el transporte anterógrado esta acelerado tras 5 días de exposición a la neurotoxina MET. 300 células fueron contadas en cada espacio de tiempo. El asterisco indica que las diferencias son significativas (ANOVA, p < 0.05). 165 RESULTADOS Figura 33. Ensayos del transporte anterógrado en el quinto día de tratamiento con MET usando VSVg-GFP. Se observa la fluorescencia de la proteína g del virus de la estomatitis vesicular unida a GFP. A los 5 minutos, posteriores a la incubación en la temperatura permisible, aparece un punteado disperso de mayor intensidad fluorescente en células tratadas, que se corresponden con el compartimiento intermedio. A los 10 minutos, esta proteína viral ya se encuentra localizada en un área perinuclear (AG), mientras que en las células control se presenta como un patrón disperso por todo el citoplasma. Barra de calibrado 25 µm. 166 RESULTADOS Figura 34. Ensayos del transporte anterógrado en el quinto día de tratamiento con la neurotoxina MET. Se muestra inmunomarcaje para Sec13 (COP II) a los 25 minutos sin BFA en células tratadas. (A) Célula PC12 que muestra una acumulación de vesículas tipo COP II (cabeza de flecha), alrededor de un espacio no reactivo. (B) El área no reactiva (flecha doble), posiblemente ocupada por un agregado yuxtanuclear, donde a su alrededor se agrupan las vesículas tipo COP II. Barra de calibrado 25 µm 167 RESULTADOS 8 BÚSQUEDA DE PROTEÍNAS IMPLICADAS FRAGMENTACIÓN DEL COMPLEJO DE GOLGI EN LA Se ha descrito que la fragmentación del AG puede ser debida a la sobreexpresión o depleción (disminución en la expresión) de proteínas específicas (Mironov y Beznoussenko, 2011). En el presente estudio medimos en células control y células tratadas a diferentes intervalos de tiempo, los niveles de expresión de proteínas de importancia relevante en las funciones de mantenimiento de la estructura del AG, así como aquellas involucradas en los procesos de regulación del tráfico intracelular. De especial interés fue el análisis, a través del perfil bioquímico, de las proteínas Rab GTPasas y SNARE asociadas al transporte RE-Golgi, ya que existen fuertes evidencias que las involucra en la génesis del desarrollo citopático que se presenta en la EP. El análisis cuantitativo resultó de la medición de las señales emitidas en cada inmunoblot, donde el nivel de expresión proteica fue comparado entre células control y células tratadas con la neurotoxina MET durante tres y cinco días (Tabla 12). Para confirmar la utilidad de nuestro modelo, primero medimos los niveles relativos de expresión de la proteínaα s en las fracciones soluble e insoluble (véase materiales y métodos), indicativos de no agregación y de la presencia de componentes de inclusión, respectivamente (Figura 35). Tras tres días de tratamiento el nivel de expresión de α -sinucleína reflejada en la fracción soluble, se incrementó aproximadamente un 50% en comparación a las muestras control, demostrando que la neurotoxina induce sólo una limitada sobreexpresión de esta proteína. Tras cinco días de tratamiento, los niveles de α-sinucleína decrecieron en la fracción soluble, sin embargo, de forma concomitante se produjo un aumento en la fracción insoluble. Este resultado corrobora que la agregación de αs no se genera al tercer día de tratamiento, lo que concuerda con nuestros datos de inmunofluorescencia. Igualmente, como se ha descrito para los cuerpos de Lewy (Wakabayashi et al., 2007), la proteína del citoesqueleto de microtúbulosα -tubulina estuvo presente en la fracción insoluble al quinto día de tratamiento. 168 RESULTADOS Los niveles de expresión de muchas de las proteínas analizadas, cambiaron tras de cinco días de tratamiento con MET (Figura 35). Rab1A, Rab27A, GS15, YKT6, el componente de cubierta COPII Sec13, el receptor de KDEL (KDELr) y la proteína de matriz del AG GM130 aumentaron, mientras que Rab2A, las proteínas SNARE rBet1, sintaxinas 5 y 6 y el componente de cubierta COP I β-COP disminuyeron. Sin embargo, Rab3A y 6, las SNARE GS27, GS28 y sec22B, el marcador de ERGIC p58, la proteína de acercamiento p115 y la proteína de AG GRASP65, no cambiaron. Interesantemente, después de tres días de tratamiento, sólo las proteínas Rab 1A, 2A y 8 y la Golgi SNARE sintaxina-5 estaban alteradas. De estas últimas proteínas mencionadas, sólo Rab1A aumentó su nivel. Dado que en este momento, existe fragmentación del AG pero no agregación proteica, estas cuatro proteínas fueron buenas candidatas para ser responsables del efecto dañino observado en la arquitectura del AG. Como control en los ensayos bioquímicos, realizamos una prueba sobre las muestras control (que resultaron de la incubación paralela de células PC12 con diferenciación neuronal durante los ensayos de tratamiento a 1, 3 y 5 días), donde usamos el inmunomarcaje para la GTPasa Rab1A como indicadora de error en nuestros experimentos. Rab1A fue seleccionada como la proteína a evaluar, ya que ésta presenta cambios drásticos desde el primer día y valores con diferencias significativas desde el tercer día de tratamiento. El resultado de la cuantificación de Rab1A no mostró diferencias significativas entre los tres grupos controles (Figura 36), revelando que los datos obtenidos en los diferentes experimentos poseen la suficiente seguridad para continuar con análisis posteriores en la búsqueda de proteínas involucradas en la alteración del transporte en este modelo de EP. 169 RESULTADOS PROTEÍNA 3 DÍAS 5 DÍAS α-sinucleína/fracción soluble banda 19 kDa 148±4,8 75±3,0 116±4,1 91±2,1 - 164±5,4 - 77±7,4 - 140±4,7 63±2,3 62±9,7 89±2,3 - 126±2,3 66±3,4 79±6,8 155±6,8 139±9,6 115±0,9 62±8,2 75±4,7 36±10,0 160±8,7 117±3,1 129±6,6 66±11,7 180±6,7 α-sinucleína/fracción soluble banda ~70-75 kDa α-sinucleína/fracción insoluble α-tubulina β-tubulina Rab1A Rab2A Rab3A Rab6 Rab8 Rab27A GS27 GS28 GS15 YKT6p rBet1 Sintaxina5 Sec22B Sintaxina6 p58 p115 GM130 GRASP65 Sec13 (COP II) β-COP (COP I) KDELr Tabla 12. Resultados del análisis bioquímico por western blotting. Se muestran los datos de todos los tratamientos realizados durante 1, 3 y 5 días, los cuales son comparados con las muestras control, es decir, aquellas provenientes de células no tratadas (valor arbitrario del 100%). Los valores representan la cuantificación densitométrica (expresada como el porcentaje ± SEM). No se muestran los porcentajes con valores estadísticamente no significativos, los cuales son reemplazados en la tabla por un guión (ANOVA, p<0.05). FS = fracción soluble, FI = fracción insoluble. A la derecha se muestran las inmunodetecciones más representativas por western blotting. C= control, T= tratamiento. 170 RESULTADOS 200% 3 DÍAS 5 DÍAS 180% 160% 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% Figura 35. Análisis cuantitativo de niveles de expresión de proteínas relevantes involucradas en el transporte entre el RE-AG. Los valores representan la cuantificación densitométrica (expresada como el porcentaje ± SEM) obtenida para cada proteína a través de ensayos bioquímicos por western blot. Se evalúan los cambios al tercer y quinto día de tratamiento en comparación con las muestras provenientes de células no tratadas (valor arbitrario del 100%). Los datos estadísticamente no significativos fueron excluidos de la gráfica (ANOVA, p<0.05). FS = fracción soluble, FI = fracción insoluble. 171 RESULTADOS Rab1A/CONTROLES 1 DÍA 3 DÍA 5 DÍAS Figura 36. Inmunodetección por western blotting comparado de las muestras control. El inmunomarcaje para Rab1A no reveló diferencias significativas entre controles a tiempos variables de cultivo. ANOVA (p=0,67). 172 RESULTADOS 9 EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIÓN O DEPLECIÓN DE PROTEÍNAS RAB GTPasas ESPECÍFICAS Y LA SNARE SINTAXINA-5 SOBRE LA MORFOLOGÍA DEL COMPLEJO DE GOLGI Nuestros resultados sugieren que la fragmentación del AG puede ser debida a niveles alterados de las proteínas reguladoras del tráfico Rab1A, 2A y 8, así como la proteína SNARE sintaxina 5. Para comprobar esta hipótesis sobreexpresamos estas proteínas y analizamos si eran capaces de restaurar la morfología del aparato de Golgi (Figuras 37, 38 y 39). El uso del plásmido de fusión de estas proteínas con GFP permitió analizar específicamente las células que sobreexpresaron la proteína de interés. En experimentos paralelos, inducimos la depleción de estas proteínas mediante el uso de sus correspondientes ARNs de interferencia (Figuras 37, 41 y 42). El porcentaje de depleción medido por Inmunodetección por western Blot, resultó entre el 30 al 50% (Figura 40). Para el análisis de depleción, usamos la técnica de inmunofluorescencia contra las referidas proteínas, lo que nos permitió identificar exclusivamente las células con ausencia de expresión específica (Figuras 41 y 42). En ambos experimentos, la morfología del AG se comprobó mediante el uso de inmunomarcaje para GM130. Los resultados obtenidos demuestran una amplia correlación entre los niveles de estas proteínas y la morfología del AG. Interesantemente, la sobreexpresión de las GTPasas Rab1A y 8, así como la depleción de Rab2 y sintaxina-5 tenían la capacidad de restaurar la morfología del AG (Figuras 37, 38 y 41). También, hallamos que la depleción de Rab1A y Rab8 (Figura 42), así como la sobreexpresión de Rab2 y sintaxina5 (Figura 39) generaban fragmentación del AG (Figura 37). Los niveles de restauración fueron muy altos, llegando a 90% en el caso de sobreexpresión de la GTPasa Rab1A. En conjunto, nuestros datos apoyan que el desequilibrio entre proteínas Rab y SNARE, inducido por el efecto neurotóxico, es responsable de la fragmentación del AG. 173 RESULTADOS SOBREEXPRESIÓN (GFP) DEPLECIÓN (siRNA) 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Control Rab1A Rab2A Rab8A Sintaxina5 Figura 37. Análisis cuantitativo de la sobreexpresión y depleción de Rab GTPasas y SNARE en la morfología del complejo de Golgi. Las células PC12 con diferenciación neuronal fueron tratadas durante 5 días con MET. La transfección transitoria se realizó al cuarto día de tratamiento. Los valores representan el porcentaje (± SEM) de las células que exhibieron un AG con morfología normal y que mostraron expresión de la proteína específica unida a GFP, o al contrario, mostrando depleción para esas mismas proteínas. El control representa los experimentos realizados sobre células tratadas con MET durante 5 días pero no transfectadas. 174 RESULTADOS Figura 38. Efectos de la sobreexpresión de la GTPasas Rab1A y 8 sobre la morfología del complejo de Golgi en células tratadas. Tratamiento con MET durante 5 días. Transfección transitoria al cuarto día con los plásmidos específicos para Rab1A y 8 unidos a GFP. Al quinto día de tratamiento las células fueron fijadas e inmunomarcadas para GM130 como marcador de Golgi. Se observa claramente que la sobreexpresión de Rab1A y 8 restaura la morfología del AG. Barra de calibrado 25 µm. 175 RESULTADOS Figura 39. Efectos de la sobreexpresión de la GTPasa Rab2A y la SNARE sintaxina-5 sobre la morfología del complejo de Golgi en células tratadas con metanfetamina durante 5 días. Transfección transitoria al cuarto día con los plásmidos específicos para Rab2A y sintaxina-5 unidos a GFP. Al quinto día de tratamiento las células fueron fijadas e inmunomarcadas para GM130 como marcador del AG. La sobreexpresión de Rab2A y sintaxina 5 en células tratadas aumenta la fragmentación del AG. Barra de calibrado 25 µm. 176 RESULTADOS CONTROL TRATAMIENTO Control de carga siRab1A siRab2A siRab8 siSintaxina 5 Figura 40. Inmunodetección por western blotting para determinar el porcentaje de depleción de las proteínas a evaluar. Tratamiento con MET durante 5 días. Transfección transitoria al cuarto día con el siRNA específico. Se muestran 4 columnas para los controles (izquierda) e igual número de columnas para los tratamientos (derecha). Se cuantifica mediante densitometría y se comparan los controles con sus respectivos tratamientos. 177 RESULTADOS Figura 41. Efectos de la depleción de Rab2A y la SNARE sintaxina-5 sobre la morfología del complejo de Golgi en células tratadas con metanfetamina durante 5 días. Transfección al cuarto día con su específico siRNA. Al quinto día las células fueron fijadas y doblemente inmunomarcadas para su correspondiente proteína silenciada (para identificar las células con depleción) y con GM130 como marcador de Golgi. La depleción de Rab2A y sintaxina 5 en células tratadas restaura la morfología del AG. Barra de calibrado 25 µm. 178 RESULTADOS Figura 42. Efectos de la depleción de las GTPasas Rab1A y 8 sobre la morfología del complejo de Golgi en células tratadas con metanfetamina durante 5 días. Transfección al cuarto día con su específico siRNA. Al quinto día las células fueron fijadas y doblemente inmunomarcadas, para su correspondiente proteína silenciada y con GM130 como marcador del AG. La depleción de Rab1A y 8 en células tratadas aumenta la fragmentación del AG. Barra de calibrado 25 µm. 179 RESULTADOS 10 EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIÓN DE RAB GTPasas SOBRE LA FORMACIÓN DE INCLUSIONES INTRACELULARES La formación de agregados podría estar, al menos en parte, promovida por la fragmentación del AG. Más aún, este fenómeno podría ser explicado por los niveles alterados de las proteínas GTPasas reguladoras del tráfico Rab 1, 2 y 8, así como de la proteína SNARE sintaxina 5. En consideración a los resultados tan sorprendentes obtenidos con Rab1A, respecto a su capacidad en la restauración del AG en células PC12 tratadas con MET, decidimos enfocar primariamente nuestros esfuerzos en este estudio con esta proteína. Por tanto, para comprobar esta hipótesis sobreexpresamos Rab1A y analizamos si era capaz de bloquear o incrementar la producción de agregados citoplasmáticos (Figura 43). El uso del vector de expresión de esta proteína unido a GFP permitió analizar específicamente las células que la sobreexpresaron. Asimismo, usamos la técnica de inmunofluorescencia contra la proteína αs, lo que nos permitió identificar las células transfectadas con ausencia o presencia de acúmulos proteicos. La sobreexpresión de la GTPasa Rab1A, posee la capacidad de bloquear completamente la formación de los grandes agregados yuxtanucleares en este modelo de EP, lo que demuestra que esta GTPasa, además de rescatar la morfología del AG, también bloquea la agregación proteica (Figura 43). 180 RESULTADOS Figura 43. Efectos de la sobreexpresión de la GTPasa Rab1A sobre el desarrollo de inclusiones intracelulares en células tratadas con metanfetamina durante 5 días. Transfección transitoria al cuarto día con el plásmido específico Rab1A unido a GFP. Al quinto día de tratamiento las células fueron fijadas e inmunomarcadas para α sinucleína como marcador de agregados. Se observan células sobreexpresando Rab1A, las cuales no presentan formación de inclusiones yuxtanucleares. Barra de calibrado 25 µm. 181 DISCUSIÓN VII. DISCUSIÓN 1 Línea celular PC12 como modelo neuronal de enfermedad de Parkinson Los resultados que hemos obtenido utilizando el presente modelo neuronal de enfermedad de Parkinson, han aportado información crucial para el entendimiento de eventos citopatogénicos concernientes a los daños generados sobre el tráfico intracelular. Entre las toxinas disponibles para inducir neurodegeneración, las elegidas promovieron efectos citopáticos sorprendentemente similares, de hecho, fue para nosotros destacable poder reproducir inclusiones intracelulares en células PC12 a través de la exposición crónica a la toxina 6-OHDA, en contraste con estudios previos (Schober et al., 2004), pese a que es una de las sustancias más utilizadas en modelos animales y celulares de EP. La formación de inclusiones en células PC12 mediante la neurotoxina MET no fue un hallazgo sorpresa para nosotros, porque conocíamos la capacidad de esta sustancia para reproducir agregados en la línea celular. Sin embargo, nos llamó la atención el hecho de que en algunos estudios los investigadores describen la aparición eventual de un gran agregado perinuclear (Gosavi et al., 2002; Fornai et al., 2003), cuando en nuestros experimentos la reproducción de este patrón de inclusión se mostró de forma constante, sin producir cambios aparentes en la cinética de formación, incluso para el tratamiento con 6-OHDA. Asimismo, la integridad morfológica del AG se altera en enfermedades neurodegenerativas, un proceso que también se observó en el presente modelo, y el cual nos permitió analizar la relación entre la fragmentación del AG y la formación de agregados intracelulares. 185 DISCUSIÓN 2 Mecanismo citopático de la proteína α-sinucleína Se ha demostrado que animales nulos para la proteína αs son resistentes a la acción tóxica de sustancias como MPTP y 6-OHDA (Dauer et al., 2002; Alvarez-Fischer et al., 2008), sugiriendo que esta proteína es un efector primario de los eventos citopáticos que se pueden presentar de forma natural en todas las denominadas sinucleopatías. Gitler y colaboradores (2008) demostraron que niveles tóxicos de la proteína αs se relacionan con una marcada disminución en la liberación de vesículas sinápticas. Estos autores observaron que el incremento anormal de αs indujo colocalización de la misma con vesículas secretoras, indicando efectos de inactivación neuroexocítica por alteración de la maquinaria del transporte (Gitler et al., 2008). Además, tanto la sobreexpresión (Larsen et al., 2006) como la carencia (Abeliovich et al., 2000) de esta proteína causan alteración en la liberación de catecolaminas, fenómeno que también se ha demostrado en células PC12. La sobreexpresión, la expresión de formas alteradas y la agregación de αs se acompañan de lesiones graves a nivel de las terminales nerviosas, fenómeno que es promovido por una redistribución de las proteínas SNARE sinápticas SNAP-25, sintaxina-1 y sinaptobrevina (García-Reitböck et al., 2010). En general esta cascada de eventos anómalos se traduce en la liberación alterada de dopamina, arrastrando a la célula a un desbalanceado nivel de ROS. En nuestro modelo la neurotoxina MET, indujo un incremento potencialmente tóxico en los niveles de expresión de αs, tal y como se ha descrito previamente en este tipo celular (Mauceli et al., 2006), incremento que se podría asociar con alteraciones del transporte y liberación de las vesículas de núcleo denso, al afectar su unión y fusión. En consecuencia, el acúmulo anormal de estas vesículas podría inducir un incremento en la auto-oxidación de la dopamina retenida a nivel intracelular. Esta secuencia de eventos citopáticos, que incluye la alteración temprana de la morfología del AG, podrían ser el desencadenante de la aparición de inclusiones intracelulares, observados después del cuarto día de tratamiento. Es importante recordar que la neurotoxicidad de MET esta mediada por la dopamina endógena producida, almacenada y liberada por la célula; así el bloqueo de la síntesis de ésta amina protege contra la toxicidad de MET 186 DISCUSIÓN (Mauceli et al., 2006). La cinética de fibrilación deαs depende de múltiples factores, los cuales muy seguramente en este modelo de EP, sean la variación grave del pH y los eventos de estrés oxidativo inducidos por el tratamiento neurotóxico. Así, ante el incremento de los niveles de expresión de αs y del cambio dañino en el ambiente redox intracelular, esta proteína altera su función y modifica su forma nativa que carece de una estructura estable (plegamiento anormal), lo cual desencadena el proceso de oligomerización y fibrilación. En nuestro modelo hemos demostrado después del cuarto día de tratamiento evidencias de agregación, tanto en forma de un gran acúmulo yuxtanuclear como agregados a nivel neurítico, estos últimos análogos a los neuritas de Lewy. Dichos factores producen cambios de la conformación de la proteína αs. La conformación parcialmente plegada puede ser transitoria pero ante la presencia crónica de estos factores se hace estable y da lugar a los pasos subsecuentes hasta la forma fibrilar; de hecho se sabe que en un periodo corto de tiempo pasa de una conformación parcialmente plegada a formaciones oligoméricas prefibrilares que terminan en agregados fibrilares (Uversky et al., 2001). Es sabido que NGF en células PC12 incrementa, a través de mecanismos de diferenciación, los niveles de expresión de la proteína αs, aunque sin afectar la funcionalidad celular ni hacerlas más propensas a morir (Stefanis et al., 2001). Hemos encontrado que las células PC12 en su estado neuronal responden a los efectos citotóxicos de ambas neurotoxinas con un incremento de la expresión de αs hasta niveles verdaderamente óxicos t para la célula, lo cual puede ser demostrado por las graves alteraciones del transporte celular en el quinto día de tratamiento, que coinciden en el tiempo con la formación de grandes agregados inmunoreactivos para αs, así como en la alteración en los niveles de expresión de un alto número de proteínas involucradas en el tráfico intracelular. Aunque sólo hemos realizado ensayos bioquímicos para MET, es fácil deducir que este fenómeno también se está reproduciendo bajo el tratamiento con 6-OHDA, ya que en los ensayos realizados con esta neurotoxina encontramos un patrón morfológico de distribución de αs idéntico al hallado 187 DISCUSIÓN para MET, donde se produce un gran agregado yuxtanuclear inmunoreactivo para αs en el quinto día de tratamiento. También en ambos casos se observan células con agregados de αs en las terminales neuríticas de las células PC12, y su marcaje disperso en citoplasma se ve disminuido para cualquiera de los dos tratamientos. 3 Fragmentación del complejo de Golgi: ¿consecuencia de apoptosis? La fragmentación del AG es un signo temprano de neurodegeneración no asociado a muerte apoptótica (Gonatas et al., 2006). Hasta ahora existe gran controversia respecto al mecanismo que genera el efecto letal de células PC12 sometidas a la acción tóxica de las sustancias 6-OHDA y MET (ver apartados 3.2.1.1 y 3.2.1.2 de la revisión bibliográfica). No obstante, nuevos hallazgos apuntan a que la muerte inducida por apoptosis es mínima (Woodgate, et al., 1999). En el presente estudio los resultados obtenidos apoyan que el proceso degenerativo induce un mínimo de muerte por apoptosis. Cuando se desencadena el mecanismo fisiológico de la apoptosis, el AG sufre fragmentación de forma irreversible (Aslan y Thomas, 2009), proceso que involucra la acción de varias caspasas que rompen la matriz proteica asociada al AG (Sesso et al 1999; Mancini et al., 2000; Walker et al 2004; Sutterlin et al., 2005; Mukherjee y Shields, 2009). Por el contrario, nuestros hallazgos demuestran que la fragmentación del AG en células tratadas es un fenómeno reversible, dado que la modificación en los niveles de expresión de ciertas proteínas específicas induce su recuperación (ver apartado 5: fragmentación del complejo de Golgi). Los experimentos de viabilidad celular realizados mediante el uso de caspasa 3 activa confirman las observaciones anteriormente descritas, puesto que el número de células que sufrieron muerte por apoptosis presentó valores inferiores al 0,1%. 188 DISCUSIÓN Durante la apoptosis se pueden observar cambios morfológicos como crenación celular con preservación de organelas, compactación de cromatina (Stefanis et al., 2001) y eventual aparición de cuerpos apoptóticos (Woodgate et al., 1999). La fragmentación del AG coincide con la aparición de estructuras apoptóticas en el centro organizador de microtúbulos, lo cual se debe a la acción de proteínas motoras asociadas al citoesqueleto (Aslan y Thomas, 2009). Como efecto de este proceso, aparecen fragmentos de organelas apoptóticas como mitocondrias que coalescen en la proximidad del AG, induciendo importantes modificaciones morfológicas de este orgánulo, donde el apilamiento de cisternas desaparece y es reemplazado por agrupaciones de vesículas idénticas a las observadas en la división mitótica (Gonatas et al., 2006). Examinamos pues, los cambios morfológicos del AG a nivel ultraestructural, encontrando que los complejos de Golgi, aunque más pequeños, permanecieron aparentemente normales, es decir, dictiosomas apilados rodeados por elementos tubulovesiculares. Igualmente, no descubrimos cambios a nivel nuclear o indicios de fragmentos de organelas apoptóticas. Estos hallazgos confirman que la fragmentación del complejo de Golgi no fue consecuencia de la muerte inducida por apoptosis. 4 La fragmentación del complejo de Golgi precede a los daños en el citoesqueleto Se ha postulado que la sobreproducción de αs y su posterior agregación induce alteración del citoesqueleto de microtúbulos, al promover co- agregación con las tubulinas y otras proteínas como parkina (Kawahara et al., 2008), lo que se traduce en fragmentación del AG y deterioro del tráfico celular (Lee et al., 2006). Los datos obtenidos en este estudio revelan diferencias significativas en el número de células con presencia de agregados yuxtanucleares inmunoreactivos para la proteína α -tubulina, comparados con aquellos reactivos para αs. Esta observaci ón se repiti ó para las proteínas motoras asociadas al citoesqueleto dineína y kinesina ambas de cadena 189 DISCUSIÓN pesada. En todos los casos fue mucho mayor el número de células con agregados inmunoreactivos para αs, lo que sugiere al menos en este modelo celular de EP que primero ocurre la agregación deαs y posteriormente la de otras proteínas. Este resultado se confirmó en experimentos de doble inmunomarcaje para αs y cada una de las proteínas del sistema de citoesqueleto o sus proteínas motoras asociadas, obteniendo que el 100% de las inclusiones inmunoreactivas para las proteínas del citoesqueleto también lo fueron para αs, sin embargo esto no ocurri ó al contrario. También hemos observado que un alto porcentaje de células que han desarrollado inclusión citoplasmática, presentan un cambio drástico en su morfología. Este fenómeno se observa después del cuarto día de tratamiento con las neurotoxinas 6OHDA y MET, aunque es más evidente al quinto día, donde los agregados son más compactos y de mayor intensidad de inmunomarcaje. Estos resultados pueden estar indicando que el acúmulo primario de la proteína α s induce alteración de diferentes sistemas, entre estos el citoesqueleto, fomentando la agregación de tubulinas. Estas observaciones sobre la morfología alterada, se relacionan a su vez con los datos obtenidos en el estudio bioquímico de las proteínas del citoesqueleto. Como mencionaremos más a fondo en apartados siguientes, estas estructuras anómalas de agregación están asociadas al centrosoma (Horton et al., 2005), lo que trae consigo efectos devastadores para la función y salud celular. Estos trastornos son mucho más graves para neuronas de tipo dopaminérgicas, las cuales están expuestas a la acción autooxidativa de la dopamina, que da lugar a la formación de radicales libres en niveles difíciles de antagonizar, los cuales pueden ser los iniciadores de una cascada de eventos citopáticos con posibilidades limitadas de reversión. En nuestro modelo la fragmentación del AG precedió cualquier aparición anormal en la distribución de la trama microtubular, lo que sugiere que la posible despolimerización de microtúbulos por agregación proteica desencadenada por αs u otros fenómenos, no fue la causa principal de fragmentación. Las neurotoxinas utilizadas en este estudio fomentaron un incremento significativo de la expresión endógena de la GTPasa Rab1. Aunque es conocido que las proteínas Rab GTPasas están involucradas en muchos eventos celulares incluyendo la interacción del citoesqueleto a las membranas, 190 DISCUSIÓN donde específicamente esta GTPasa guarda relación con el citoesqueleto, la alteración en sus niveles de expresión no indujo cambios observables en la arquitectura del citoesqueleto. Sin embargo, no se puede excluir por completo que la alteración producida sobre proteínas Rab pueda inducir modificaciones locales del citoesqueleto que son indetectables a través de las técnicas utilizadas en el presente estudio. Nuestro modelo demuestra que en un momento determinado del proceso citopático, desencadenado por un efecto neurotóxico, se inducen lesiones neuronales que alteran de forma inevitable la organización del AG y su polarización, así como daños en el sistema del citoesqueleto, que a su vez aumenta el desperfecto causado sobre la maquinaria de transporte intracelular. 5 Alteraciones del tráfico intracelular Los resultados obtenidos al quinto día de tratamiento, demuestran claras evidencias de alteración en el transporte. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio donde se describe alteración del transporte retrógrado en un modelo de EP. Adicionalmente, el presente modelo también muestra que el transporte anterógrado se encuentra acelerado como efecto del tratamiento con la neurotoxina. Hasta ahora, los estudios del tráfico han sido enfocados en el transporte anterógrado de levadura y de células de mamíferos no neuronales, las cuales no expresan αs end ógena y no poseen las peculiaridades del transporte presente en las neuronas (Outeiro y Lindquist, 2003; Cooper et al., 2006). Por tanto, las diferencias obtenidas pueden deberse a los modelos utilizados. Por otra parte, los niveles de sobreexpresión de αs podrían afectar significativamente los ensayos del transporte en esos modelos. En trabajos publicados recientemente se ha logrado restablecer el tráfico entre el RE-AG (alterado por sobreexpresión o expresión de formas aberrantes de la proteínaαs ) al sobreexpresar las proteínas SNARE implicadas en el transporte RE-AG. Sin embargo la SNARE más efectiva en este rescate fue 191 DISCUSIÓN YKT6 (Thayanidhi et al., 2010), SNARE que en nuestro modelo no encontramos alterada en el periodo de estudio. Sin embargo, el resultado del análisis de los niveles de expresión reveló una alteración importante de sintaxina-5, SNARE presente en todos los pasos que median el transporte vesicular de la ruta secretora temprana. Por tanto, como se ha sugerido para las proteínas SNARE, no es de extrañar que los niveles alterados o la forma anormal inducida por tratamiento neurotóxico de sintaxina-5, contribuyan de manera importante en la fragmentación del AG en etapas tempranas del proceso citopático, trayendo consigo en etapas posteriores, alteraciones graves del transporte en la ruta secretora temprana. El otro mecanismo que podría explicar las alteraciones en el transporte sería por un efecto de tipo mecánico, donde obstáculos físicos generados por el desarrollo de una gran inclusión yuxtanuclear producirían un impedimento físico, que afectaría el proceso de acercamiento de vesículas, así como su posterior unión y fusión. Esta teoría en nuestro modelo no puede explicar por completo este fenómeno, dado que los resultados obtenidos muestran formación de agregados a partir del cuarto día de tratamiento, mientras que solo al quinto día de exposición a la neurotoxina se induce alteración del transporte. Aún más, la aparición de inclusiones yuxtanucleares no supera el 30% de las células en el quinto día de tratamiento, sin embargo para este tiempo, el porcentaje de células con fragmentación del AG o patrón alterado de distribución de vesículas con cubierta tipo COP II está por encima del 80%. Por tanto, sugerimos que para estas células, muy probablemente posterior a la formación de las inclusiones, se establecen nuevas autopistas por donde discurren los elementos vesiculares, dándole un nuevo respiro a la función celular. Por otra parte, la formación de la cubierta vesicular orquesta una secuencia de eventos que incluyen su propio ensamblaje, selección del cargo y moléculas SNARE, así como la deformación de la membrana hasta la gemación de la vesícula. Es interesante notar que después de cinco días de tratamiento con la neurotoxina MET, disminuyen los niveles de la proteína de cubierta β-COP (COP I), la cual está implicada en el transporte retrógrado; 192 DISCUSIÓN contrariamente, Sec13 (COPII), que participa en el transporte anterógrado REAG se encuentra incrementada. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el tercer día de tratamiento, coincidiendo con un transporte normal. Por tanto, las modificaciones en el transporte observadas para este modelo podrían estar directamente relacionadas con los niveles de expresión de proteínas de cubierta. Rab1 es una GTPasa crucial en los procesos que implican la regulación del tráfico entre el RE-AG, y de especial interés en este apartado el direccionamiento de las vesículas producidas desde el REt. La interacción entre Rab1 y p115 permite el acercamiento de vesículas con cubierta tipo COP II, así como la subsecuente asociación entre v y t SNARE, para dar lugar a la formación del ERGIC (Short et al., 2005). El nivel alterado de expresión de la proteína de acercamiento p115, causa fallos graves en el transporte anterógrado (Álvarez et al., 1999) y fragmentación del AG (Sohda et al., 2005). El análisis del perfil bioquímico no exhibió alteración en los niveles de expresión para esta proteína, descartando cualquier participación de p115 en los desordenes causados a la morfología del AG o del transporte. Sin embargo, la expresión de la pequeña GTPasa Rab1 sí mostró incremento significativo desde el tercer día de tratamiento. Aparentemente, bajo el microscopio de fluorescencia y electrónico, la morfología del RE, vesículas tipo COP II y compartimento intermedio no resultaron afectadas por el tratamiento, aunque si se produjo una alteración en su distribución. Las vesículas tipo COP II se organizaron alrededor de las inclusiones citoplasmáticas, distribución que fue acompañada a su vez con la formación de pequeños dictiosomas aislados. Por tanto, estos hallazgos sugieren que las vesículas con cubierta tipo COP II están emergiendo desde RE y que en grado variable alcanzan sus membranas dianas, aunque es posible que se produzca una reducción en la capacidad de reclutamiento de estas. Muy probablemente la célula intenta superar esta deficiencia en el transporte incrementando los niveles de Rab1, aunque parece que esta respuesta fisiológica no es suficiente para antagonizar el efecto citotóxico al que se encuentra sometida. 193 DISCUSIÓN En nuestro estudio no hemos analizado el transporte post-Golgi, sin embargo, en el quinto día de tratamiento con la neurotoxina MET, encontramos una represión importante en la expresión de sintaxina-6, SNARE que interactúa con golginas específicas del TGN, la cual no presentó signos de agregación. Es conocido que la interacción de golginas específicas del TGN con sintaxina-6 permite mantener la estabilidad estructural y la dinámica del TGN (Luke et al., 2003). Así que estos hallazgos se interpretan como mecanismo de alteración del tráfico en la porción del AG encargada de recibir y clasificar cargo en envíos específicos. No obstante, sabemos que al quinto día de tratamiento el daño en el tráfico puede ser desencadenado por un efecto multifactorial, debido a la gran alteración que sucede sobre diferentes proteínas que se encuentran implicadas en el mantenimiento y regulación del transporte intracelular de membranas. 6 Fragmentación del complejo de Golgi y niveles de expresión de proteínas El análisis de las células tratadas con las neurotoxinas 6-OHDA y MET a lo largo del tiempo nos ha permitido identificar de forma independiente los cambios en la morfología del AG y del transporte RE-AG, así como la cinética de agregación de la proteína αs. De hecho, los resultados obtenidos a través del estudio morfológico, nos brindo la información de partida para emprender la búsqueda de posibles proteínas involucradas en este fenómeno. Es conocido que numerosos factores pueden alterar la estructura en cinta del AG, una de estas condiciones es la alteración en los niveles de expresión de determinadas golginas (Satoh et al., 2003; Horton et al., 2005; Puthenveedu et al., 2006; Marra et al., 2007). Los datos obtenidos demuestran fragmentación del AG desde el primer día de tratamiento con MET, siendo mucho más llamativo después de tres días de exposición. No obstante, al tercer día de tratamiento el análisis del perfil bioquímico no arrojó valores alterados en el nivel de expresión de golginas evaluadas durante el tiempo de exposición a la 194 DISCUSIÓN neurotoxina, apuntando que la fragmentación del AG se debe a otras causas. Sin embargo, en células tratadas durante 5 días con MET, sí se observó alteración significativa para este tipo de proteínas. También se ha postulado que durante el desarrollo de inclusiones citoplasmáticas se produce un secuestro importante de proteínas (Waxman y Giasson, 2009), que incluyen aquellas reguladoras del tráfico, así como de proteínas de acercamiento y proteínas SNARE (Lashuel y hirling, 2006), fenómeno que podría inducir fragmentación del AG, además de una grave deficiencia para llevar a cabo los procesos normales del transporte. Sin embargo, nuestros resultados muestran ausencia de signos de agregación para este tipo de proteínas durante todo el período de tratamiento con ambas neurotoxinas, por lo que pensamos que la fragmentación del AG no es provocado por el efecto del secuestro de proteínas involucradas en el transporte, además como profundizaremos más adelante la fragmentación precede a la formación de inclusiones intracitoplasmáticas. Los datos resultantes demuestran que, en nuestro modelo, la morfología de este compartimiento está directamente relacionada con los niveles de expresión de un número limitado de proteínas reguladoras del tráfico denominadas Rab GTPasas, así como de la proteína SNARE sintaxina-5. La sobreexpresión de Rab1A y 8 y la depleción de Rab2 y sintaxina-5 restituyeron la morfología del AG. Por el contrario, la sobreexpresión de Rab2 y sintaxina-5 y la depleción de Rab1 y Rab8 incrementaron el daño de este orgánulo. Las GTPasas Rab1, 2 y 8 se localizan en el AG, aunque no se limitan a esta estructura. Rab1 y 2 regulan el transporte entre RE-AG. La GTPasa Rab 2, abundantemente identificada en células neuronales PC12 (Tachibana et al., 1992), juega un importante papel en los procesos de diferenciación neuronal (Ayala et al., 1990). Rab8, GTPasa enriquecida en el cerebro y la cual es esencial en el control del transporte en células polarizadas como las neuronas (Ng y Tang, 2008), está involucrada en el tráfico post-Golgi (Stenmark, 2009). En nuestro modelo, no se encontró participación en el proceso citopatogénico de otras proteínas Rab residentes del AG como Rab6 ó involucradas en la exocitosis neuronal como Rab3A. Estos experimentos demuestran claramente 195 DISCUSIÓN que Rab1, 2 y 8 son importantes en éste y otros modelos de la EP. Rab1 y 8 han sido implicados anteriormente en la citopatología de la enfermedad de Parkinson; sin embargo, esto no puede excluir el papel de otras proteínas Rab. Pese a la ausencia de alteración en los niveles de expresión de otras proteínas Rab en este modelo, no podemos asegurar que la función de estas no está afectada, ya que dichas proteínas dependen de modificaciones especiales desencadenadas por activación o inhibición. Nuevos estudios serán necesarios para rechazar esta posibilidad. Nuestros hallazgos demuestran que estas proteínas Rab están involucradas en otros procesos celulares no descritos anteriormente, asociados a la referida entidad patológica. A nuestro entender, no hay precedentes que impliquen a la proteína Rab2 en la EP, debido muy posiblemente a que esta GTPasa no está presente en la levadura (Pereira-Leal y Seabra, 2001) o tal vez porque juega un papel diferente a los de Rab1 y 8. Es notorio que la sobreexpresión de Rab2, en contraste con los de Rab1 y 8, tenga un efecto tóxico sobre las células tratadas con la neurotoxina MET, lo que puede explicar en parte porque su papel ha sido enmascarado. Igualmente, nuestros resultados muestran claramente que los experimentos de sobreexpresión no son suficientes para analizar las proteínas potencialmente implicadas en la patología de la EP, por lo que fue necesario realizar un estudio de comprobación mediante depleción, a través de ensayos con específicos ARNs de interferencia. El efecto más potente en la morfología del AG se ha observado con Rab1, proteína necesaria para el mantenimiento de la arquitectura y función del AG (Haas et al., 2010). Nuestros resultados sugieren que el correcto balance de estas proteínas Rab es necesario para mantener la morfología normal de este orgánulo. Las proteínas Rab GTPasas son interruptores moleculares que controlan el tráfico de membranas mediante la interacción con sus proteínas efectoras, incluyendo proteínas de matriz del AG, que participan directamente en la unión lateral de los dictiosomas. Este es el caso de p115, Giantina o Golgina-84 (Mironov y Beznoussenko, 2011) que interactúan con Rab1 (Stenmark et al, 2009). La interacción Rab1/Golgina-84 es crucial en el 196 DISCUSIÓN mantenimiento de la estructura del AG (Satoh et al., 2003). Asimismo, Rab1 es importante para mantener la estructura del AG, al permitir que los componentes propios de este orgánulo, así como el cargo puedan ser transferidos desde el RE. Es fácil pues imaginar que la disfunción de proteínas Rab o la variación anormal en los niveles de estas proteínas, provocados por diferentes causas, puede afectar seriamente la arquitectura del AG. La implicación de la sobreexpresión de Rab2 en la fragmentación del AG o la depleción en su restauración, puede ser explicada analizando el mecanismo de su propio funcionamiento. La pequeña GTPasa Rab 2, participa activamente en el reclutamiento del coatómero a intermediarios pre-Golgi (Tisdale y Balch, 1996; Tisdale y Jackson, 1998; Tisdale, 2000), indicando que Rab2 es esencial para la correcta maduración de los intermediarios pre-Golgi. Por tanto, nuestros resultados sugieren que la acción sostenida de Rab2 en la forma sobreexpresada causa un persistente reclutamiento de COP I en intermediarios pre-Golgi, los cuales en última instancia secuestrarían el cargo debido a la inhabilidad de estas membranas para desensamblar su cubierta. Esta alteración del transporte induciría la fragmentación del AG. En el presente estudio también examinamos el perfil bioquímico de las proteínas SNARE que pudieran estar implicadas en la fragmentación del AG por inducción neurotóxica. Dos complejos SNARE operan en la vía secretora temprana (Volchuk et al., 2004). De las siete proteínas que forman estos complejos, sólo sintaxina-5 mostró alteración después del tercer día de tratamiento. Curiosamente, sintaxina-5 participa en los dos complejos SNARE asociados con el transporte entre RE-AG y el transporte intra-Golgi. Por tanto, se convierte en un elemento necesario para mantener la funcionalidad del transporte y la morfología del AG. Como hemos descrito para la proteína GTPasa Rab2, también la depleción de sintaxina-5 restaura la morfología del AG, mientras que un exceso de esta induce fragmentación. Niveles normales de expresión de su forma aberrante inhiben el proceso de ensamblaje de los complejos SNARE (Thayanidhi et al, 2010). Los niveles de sintaxina-5 después del tercer día de tratamiento con MET, fueron significativamente inferiores comparados con las muestras control, lo que sugiere el intento celular de 197 DISCUSIÓN adaptación fisiológica como mecanismo protector de concentraciones nocivas de sintaxina-5, bajo estas condiciones específicas de inducción citopática. Estudios previos han revelado que dominios específicos de las proteínas SNARE sintaxina 1 y 5, actúan como potentes inhibidores del proceso de ensamblaje de los complejos SNARE, tanto a nivel de la exocitosis (Calakos et al., 1994; Nicholson et al., 1998), como en el transporte RE-AG (Xu et al., 2000). Igualmente es conocido que la célula requiere de mecanismos específicos para el bloqueo de estos dominios con capacidad de regulación inhibitoria, sin embargo, es posible que bajo ciertas condiciones citopatológicas este proceso se vea alterado, funcionando deficientemente. Nuestro modelo demuestra que de alguna forma la actividad de sintaxina-5 está actuando negativamente en células tratadas. Es así como el 100 % de las células que sobreexpresaron la proteína sintaxina-5 mostraron un AG fragmentado, por tanto la sobreexpresión de esta importante SNARE incrementa la fragmentación del AG. Quizás debido a este fenómeno, igual que hemos mencionado anteriormente, la célula responde disminuyendo los niveles de expresión de sintaxina 5 como señal de adaptación. 7 Relación entre la fragmentación del complejo de Golgi, inclusiones intracitoplasmáticas y alteración del tráfico celular Estudios anteriores han mostrado que el efecto primario de la agregación de la proteína αs se relaciona con la alteración del transporte entre el RE y el AG, debido a la inhibición del proceso de ensamblaje de complejos SNARE, el cual es dependiente de la proteína Rab1. El efecto tóxico de αs se puede bloquear al inducir la sobreexpresión de las GTPasas Rab3A y 8, lo que sugiere alteración del transporte a niveles post-Golgi (Gitler et al., 2008). En general, la sobreexpresión de estas pequeñas GTPasas tiene la capacidad de restaurar el transporte RE-AG en el modelo de levadura y otros modelos animales (Cooper et al, 2006; Gitler et al, 2008). Por otra parte, se ha postulado que la fragmentación del AG es el resultado de la formación de agregados 198 DISCUSIÓN prefibrilares de αs (Gosavi et al., 2002) y/o el desequilibrio del tráfico entre REAG (Lashuel y Hirling, 2006). En contraste con estos estudios, hemos descubierto en este modelo neuronal de EP, que la fragmentación del AG es un evento que ocurre en etapas tempranas del proceso citopático, el cual precede a la agregación de la proteína αs, así como cualquier daño del citoesqueleto de microtúbulos o alteración del tráfico celular. Esto no es sorprendente, dado que el mantenimiento en la funcionalidad del AG en estado fragmentado se ha demostrado en células tratadas con el agente despolimerizante de microtúbulos nocodazol (Storrie et al., 1998). De hecho, no está claro por qué la mayoría de las células de mamíferos contienen un AG en cinta, esto es, dictiosomas unidos lateralmente. En neuronas esta estructuración podría estar relacionada con el mantenimiento de la polarización (Horton et al., 2005). La fragmentación del AG fue significativamente mayor después del tercer día de tratamiento con ambas neurotoxinas, lo que puede ser explicado por el avance en la alteración de los niveles de expresión de un alto número de proteínas asociadas al transporte entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi y viceversa, así como de proteínas implicadas en el mantenimiento de la arquitectura de este orgánulo. Nuestros resultados sugieren adicionalmente que las formas insolubles de la proteína αs, halladas al quinto día de tratamiento, tienen un efecto mucho más dañino sobre la maquinaria del transporte que el incremento en los niveles de expresión de su forma monomérica, puesto que el nivel de expresión de αs resultó incrementado al tercer día de tratamiento con la neurotoxina MET, aunque el transporte no presentó alteraciones significativas. Sin embargo, teniendo en cuenta las alteraciones observadas en el transporte en el quinto día de tratamiento con ambas neurotoxinas, apoyamos la idea donde se considera que el acúmulo de αs, as í como el incremento en sus niveles de expresión son nefastos, en un momento determinado del proceso citopatogénico, para la función correcta del tráfico intracelular. Para poder correlacionar los daños en el transporte con la formación de inclusiones, realizamos experimentos usando la droga BFA, donde inmunomarcamos contra la proteína αs para identificar la formación de agregados intracelulares y con un marcador del AG para examinar los cambios en la cinética de reensamblaje del AG (-BFA) en presencia de este gran 199 DISCUSIÓN obstáculo mecánico. Los ensayos realizados sobre células expuestas durante tres días con la neurotoxina MET, no mostraron cambios comparados con las células control, guardando concordancia con los datos a tres días que muestran ausencia de inclusiones. Sin embargo, al quinto día de tratamiento se observaron grandes diferencias en la cinética de reensamblaje del AG entre las células que presentaban inclusiones y las que tenían ausencia de estas. En contraste con el estudio realizado por Gosavi y colaboradores (Gosavi et al., 2002), nuestros resultados muestran que el 100 % de las células que desarrollaron agregados, exhibieron un patrón de Golgi en pequeños fragmentos alrededor de una gran inclusión. Estos hallazgos indican que el daño en el transporte o la respuesta celular se produce de forma concomitante con la aparición de inclusiones intracelulares. Por otra parte, en nuestros resultados hemos mencionado la presencia de agregados a nivel de las terminales axónicas o en las proyecciones neuríticas de las células PC12 tratadas con 6-OHDA y MET, lo cual se podría asociar a eventos citopáticos lesivos que obedecen a un fenómeno retrógrado que comienza con un grave daño a nivel de las terminales axónicas y se extiende hasta el soma causando alteraciones serias del transporte y de la función celular, como se ha sugerido extensamente en estudios previos (Iwatsubo et al., 1996; Trojanowski et al., 1998; Hashimoto y Masliah, 1999; Lansbury, 1999; Orimo et al., 2008; Greffard et al., 2010). Sin embargo, el presente estudio reveló que fue mucho mayor el número de células tratadas que presentaron inclusiones citoplasmáticas no acompañadas de agregados a nivel de la terminal axónica, lo que sugiere que la lesión producida en las neuronas dopaminérgicas, no depende necesariamente de una secuencia de eventos citopatogénicos generados por un proceso retrogrado. No obstante, nuestros hallazgos apoyan la idea que el daño inducido por el tratamiento neurotóxico puede reflejarse en alteraciones sobre la maquinaria del transporte a nivel de la vía de secreción temprana y tardía concomitantemente, como se ha descrito anteriormente pero de forma aislada (Cooper et al., 2006; Thayanidhi et al., 2010; García Reitböck et al., 2011). 200 DISCUSIÓN En conclusión, nosotros consideramos que hay una correlación entre fragmentación del AG, inclusiones intracitoplasmáticas y alteración del tráfico intracelular en células neuronales PC12 tratadas con 6-OHDA ó MET. La fragmentación del AG, reflejo en la alteración de las proteínas reguladoras del transporte Rab1, 2 y 8, así como la SNARE sintaxina-5, es la puerta que permite la aparición de cuerpos de inclusión, daño del sistema del citoesqueleto y generación de alteraciones del tráfico intracelular. Un hallazgo muy significativo, fue el efecto positivo de la sobreexpresión de la GTPasa Rab1A sobre el desarrollo de inclusiones intracelulares, ya que nuestros resultados sugieren que la fragmentación del AG, entre otras causas, facilita la formación de agregados. Los datos demuestran que la GTPasa Rab1A posee la capacidad de bloquear la formación de agregados celulares, indicando que esta GTPasa, además de rescatar la morfología del AG, también bloquea la agregación proteica. Aunque αs está presente en muchas partes del cerebro (Lashuel y Hirling, 2006), la agregación de esta proteína en la EP ocurre primariamente sobre neuronas dopaminérgicas, por lo que αs por ís sola, no puede explicar la degeneración selectiva de este tipo de neuronas; por tanto, el efecto tóxico de la sobreexpresión, expresión de formas aberrantes o mutadas de la proteína αs, viene acompañado de condiciones que facilitan la aparición de los daños provocados a nivel celular. Específicamente, en este modelo neuronal de EP, inducido por el tratamiento neurotóxico, se produjo sobreexpresión de αs, lo que estimuló una serie de cambios adaptativos en un intento por superar el ataque tóxico. Muy probablemente el incremento en los niveles de expresión de la proteína Rab1, fue clave de este mecanismo de defensa, aunque no fue lo suficientemente potente como para impedir por completo el desarrollo de inclusiones citoplasmáticas. Sin embargo, la sobreexpresión de Rab1 por inducción exógena, por si sola, tuvo la capacidad de restaurar la morfología del AG e impedir la formación de agregados proteicos. Postulamos que la sobreexpresión de Rab1 puede frenar el ataque de las formas oligoméricas y protofibrilares de la proteína αs, ya que es conocido que estas formas anómalas de αs pueden ser mucho más críticas que las mismas inclusiones en 201 DISCUSIÓN la patogénesis de la EP (Wakabayashi et al., 2007). Así, las células sobrevivientes serían aquellas con mejor respuesta adaptativa o simplemente desarrollarían inclusiones como parte del proceso, donde éstas últimas están destinadas igualmente a morir, lo cual puede ser demostrado por el número tan constante de neuronas dopaminérgicas de la SNc con presencia de cuerpos de Lewy de cerebros de pacientes parkinsonianos comprendidos entre variadas edades y diferentes estadios de la enfermedad. 8 Consideraciones finales De alguna manera la fragmentación del AG y la agregación de αsinucleína están relacionadas. Obsérvese que en el doble inmunomarcaje αs/GM130, todas las é c lulas con presencia de inclusiones mostraron un AG fragmentado, el cual estaba ubicado alrededor del agregado. Puesto que la fragmentación del AG precede a la formación de las inclusiones yuxtanucleares, parece muy probable que los agregados se desarrollan en el centro de organización de la cinta de dictiosomas. Considerando que la biogénesis de los cuerpos de Lewy es un evento relacionado con agresomas (McNaught et al., 2002), muy posiblemente la posición del AG e inclusiones está determinada por el centrosoma. Se ha postulado que la agregación de γtubulina en los cuerpos de Lewy, así como el reclutamiento de proteínas anormales en el centrosoma puede provocar la desorganización del mismo con la subsecuente alteración en sistema del citoesqueleto y desensamblaje posterior del AG (Díaz-Corrales et al., 2005). Sin embargo, nuestros resultados apuntan en otra dirección, donde explicamos como la rotura del AG puede ser una especie de señal indicativa de algún tipo de lesión intracelular, lo que activa la maquinaria celular de defensa, la cual incluye la formación de cuerpos intracelulares semejantes a agresomas. Así, la fragmentación de este compartimiento facilitaría la agregación de αs, y detrás de esta el acúmulo de muchas otras, lo que seguidamente provocaría las alteraciones en el transporte. 202 CONCLUSIONES XIII. CONCLUSIONES 1. La línea celular de feocromocitoma de rata PC12, en su estado neuronal, es un excelente modelo para reproducir las alteraciones de la ruta secretora temprana que se presentan de forma natural en la enfermedad de Parkinson. 2. Los eventos citopáticos de las neurotoxinas 6-hidroxidopamina y metanfetamina conducen a la sobreexpresión y fibrilación de la proteínaα sinucleína y a la formación de agregados citoplasmáticos en células PC12 diferenciadas, lo que permitió relacionarlos con las alteraciones de la morfología del aparato de Golgi y del tráfico celular. 3. El tratamiento prolongado con neurotoxinas induce graves alteraciones del transporte anterógrado y retrógrado en la vía secretora temprana, desorganización del citoesqueleto y modificaciones importantes en el nivel de expresión de proteínas asociadas con el aparato de Golgi. 4. La fragmentación del complejo de Golgi es un indicador temprano de neurodegeneración, que precede a las alteraciones del transporte en la ruta secretora temprana y del citoesqueleto. 5. La arquitectura del aparato de Golgi en células tratadas con neurotoxinas depende de los niveles de expresión de unas pocas moléculas reguladoras del tráfico intracelular, como son Rab1, 2 y 8 y sintaxina-5, confirmando la estrecha relación entre éste y el desarrollo de la enfermedad de Parkinson. 6. La integridad morfofuncional del aparato de Golgi y el desarrollo de inclusiones citoplasmáticas están íntimamente relacionadas, siendo la proteína Rab1 clave en la regulación de este proceso. 205 CONCLUSIONES 7. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que la fragmentación del aparato de Golgi es una señal que indica que la maquinaria de defensa de la célula debe activarse, incluyendo la formación de agregados citoplasmáticos del tipo agresoma. 206 ABSTRACT IX. ABSTRACT The pathological hallmark of PD is the formation of intracellular protein inclusions known as Lewy bodies, of which α-synuclein (α-syn) is the major component. In recent years it has become clear that the primary effect of α-syn overexpression and/or aggregation is the alteration of early events of the secretory pathway. Aggregates of α-syn may inhibit ER-to-Golgi transport, reducing the levels of vesicular monoamine transporter to synapse. This results in the accumulation of toxic dopamine in the cytosol, causing oxidative stress, and finally cell death. In yeast, the overexpression of specific Rab, SNARE and COPII coat-related proteins protects against α-syn-induced damage. Thus, proteins mediating the specific binding between transport carriers and target membranes in the early secretory pathway are the keys to understanding the molecular mechanisms that trigger PD neurodegeneration. One of the consequences of alterations in the ER-to-Golgi trafficking induced by α-synoverexpression/aggregation may be breakage of the Golgi ribbon. Fragmentation of this organelle has been reported in many neurodegenerative disorders. The imbalance of incoming and outgoing transport could lead to Golgi fragmentation in dopaminergic neurons. In the present study we analyze the mechanisms involved in Golgi fragmentation in differentiated PC12 cells treated with 6-hydroxidopamine or methamphetamine as cellular models of Parkinson´s disease. Our data demonstrate that Golgi fragmentation precedes and might trigger aggregation of -synuclein and the formation of inclusions, alterations in anterograde and retrograde transport between the endoplasmic reticulum and Golgi complex, and cytoskeleton damage. In contrast, fragmentation is directly related with alterations in the levels of Rab1, 2 and 8 and the SNARE protein syntaxin 5. Thus, overexpression of Rab1 and 8 and depletion of Rab 2 and syntaxin 5 rescue Golgi morphology. In conclusion, the homeostasis of a limited number of Rab and SNARE proteins is important for understanding cytopathology of Parkinson´s disease. The breakage of the Golgi ribbon may be a sort of signal 209 ABSTRACT indicative that something in the cell is amiss, so that the cell defense machinery must be started, which could include the formation of aggresome-like bodies. 210 BIBLIOGRAFÍA X. BIBLIOGRAFÍA Abdel-Salam OM (2008). Drugs used to treat Parkinson's disease, present status and future directions. 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