Diferenciación genética de Ilex perado ssp. lopezlilloi y su

González-González, E. A.1; M. A. González-Pérez1; E. Rivero1, M.J.B. Texeira-Pereira2; M. Moura2, L. Silva2 y P.A. Sosa1*
1Departamento
de Biología, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Campus de Tafira, 35017 Las Palmas de Gran Canaria, España.
de Biologia, Universidade dos Açores, Rua Mãe de Deus 58, Apartado 1422, 9501-801, Ponta Delgada, Portugal.
2Departamento
Introducción
Descripción
El género Ilex L. (Aquifoliacaea) exhibe 4 taxa en La Macaronesia: Ilex azorica Gand. endémico de Azores;
Ilex canariensis Poir. (Aceviño) endémico de Canarias y Madeira e Ilex perado Aiton endemismo macaronésico
presente en Canarias con dos subespecies - Ilex perado ssp. platyphylla (Webb & Berthel.) Tutin e Ilex perado
ssp. lopezlilloi (G. Kunkel) A. Hansen & Sunding - este último, endemismo exclusivo de la isla de La Gomera en
la categoría de “En Peligro de Extinción” (Fig. 1).
92
I. azorica
I. perado ssp.
platyphylla
Distancia Genética de Nei
p.
I. perado ss
lopezlilloi
Fig. 2 UPGMA basa de la Distancia Genética de Nei
Análisis de Componentes Principales (ACP)
El ACP separa las poblaciones de I. azorica e I. canariensis del resto de las poblaciones y la integración de
ambas subespecies de I. perado (a excepción de siete individuos de CAFO-P muy cercanos a la población de
I. canariensis anteriormente). La separación de los individuos obedece al lugar de procedencia de las muestras
más a que a su categoría taxonómica (Fig. 3).
Análisis de Componentes Principales
Análisis de Componentes Principales
Eje 1 (9,23%)
Eje 1 (9,23%)
Materiales y Métodos
-3,5
-3,5
0
-3
-3
-2,5
-2,5
-2
-2
-1,5
-1,5
-1
-1
-0,5
-0,5
Muestreo
Muestras de 126 individuos [I. perado ssp. lopezlilloi (32), I. perado ssp. platyphylla (93), I. azorica (39) e I.
canariensis (9)] fueron analizadas (Tabla 1).
Microsatélites
La extracción del ADN se hizo siguiendo el protocolo de Doyle y Doyle (1987) y la posterior purificación con
Gene Elute PCR Clean-Up Kit (SIGMA). Las cargas para las amplificaciones incluían 20 ng de ADN, 10 pmol de
cada cebador y 24 µl de solución Master Mix para PCR (Reddy-Mix, ABGENE, Surrey, UK). El protocolo de
amplificación fue el mismo para todos los cebadores: 3’ a 94°C; 30 ciclos de 45” a 94°C, 45” a 56°C y 45” a
72°C; y 5’ a 72°C. Los productos de la amplificación fueron detectados usando un Analizador Genético ABI
3100 y el tamaño de los fragmentos fue determinado utilizando los programas GENSCAN 2.02 y GENOTYPER
1.1 (Applied Biosystems, Inc.).
Análisis de Datos
Los datos obtenidos se introdujeron en el software TRANSFORMER 3B.01 (Caujapé-Castells y BaccariRosas, 2005) que permite exportar los valores a otros programas: POPGENE 3.2 (Yeh et al., 1997) para la
estadística elemental de variabilidad genética (A, Ho, He y P), la identidad y la distancia genética de Nei (Nei,
1973); POPULATION 1.2.30BETA (Langella, 2005) para las distancias entre poblaciones y la construcción de
un dendrograma UPGMA visualizados en MEGA4 (Kumar et al., 2001); STRUCTURE 2.2 (Pritchard et al., 2000)
para inferir la estructura de las poblaciones mediante un análisis Bayesiano implementado y GENETIX 4.05.2
(Belkir et al., 2004) para el análisis de componentes principales (ACP) a partir de la matriz de frecuencia alélica.
Tabla 1 Poblaciones analizadas e índices de diversidad genética obtenidos.
LOCALIDAD
La Gomera
Ancule, Bailadero y Reventón Oscuro
Zona de Parcelas
Apartacaminos
Ilex perado ssp. platyphylla El Moquinal
Casa Forestal
Cruz de Taganana
Ilex azorica
Ilex canariensis
TOTAL
1
0,5
0,5
Fig. 1 Procedencia de las muestras y estructura de las poblaciones
TAXON
Ilex perado ssp. lopezlilloi
1
CÓDIGO
ENGO-L
SUGO-P
PARC-P
APAT-P
MOQU-P
CAFO-P
CRTA-P
Troqueira
Lago de Fogo
TROQ-A
LAFO-A
La Galería del Barbusano
y Valle Hermoso
JACA-C
ISLA
La Gomera
La Gomera
La Gomera
La Gomera
Tenerife
Tenerife
Tenerife
Nº
5
4
5
8
28
17
31
93
San Miguel
10
San Miguel
10
20
Gran Canaria
8
y La Gomera
8
126
A
2,13
2,25
2,50
1,63
3,25
4,13
3,00
5,37
3,75
4,13
5,62
2,38
2,38
Ho
He
P
0,50
0,34
0,38
0,47
0,42
0,43
0,44
0,42
0,25
0,28
0,26
0,48
0,48
0,48
0,42
0,43
0,28
0,50
0,61
0,48
0,60
0,33
0,36
0,35
0,42
0,42
100,00%
100,00%
87,50%
62,50%
100,00%
100,00%
100,00%
100,00%
62,50%
75,00%
75,00%
75,00%
75,00%
Número medio de alelos por locus (A), Heterocigosidad observada (Ho), Heterocigosidad esperada (He) y Proporción de loci polimórfico (P). “Nº” es el número de individuos analizados por localidad.
Resultados
Se ensayaron un total de 18 cebadores descritos para I. leucoclada (Torimaru et al. 2004) de los cuales,
ocho (ILE03-01, ILE03-38, ILE03-53, ILE03-86b, ILE04-02, ILE04-06, ILE04-10 e ILE05-81) generarón
productos de amplificación polimórficos y fueron seleccionados para posteriores análisis.
Nivel de Variabilidad Genética
Ilex perado fue el taxón que presentó mayores niveles de variabilidad genética (Tabla 1).
El dendrograma UPGMA basado en las distancias genética de Nei (Fig. 2) muestra las poblaciones de I.
perado ssp. lopezlilloi más relacionadas con las de I. perado spp. platyphylla de La Gomera.
0
-0,5
-0,5
Ilex
Ilexcanariensis
canariensis
0
0,5
0,5
0
1
1
Eje 2 (12,28%)
Eje 2 (12,28%)
I. canariensis
-1
-1
Ilex
Ilexazorica
azorica
-1,5
-1,5
-2
-2
ENGO‐L
ENGO‐L
SUGO‐P
SUGO‐P
PARC‐P
PARC‐P
APAT‐P
APAT‐P
MOQU‐P
MOQU‐P
CAFO‐P
CAFO‐P
CRTA‐P
CRTA‐P
TROQ‐A
TROQ‐A
LAFO‐A
LAFO‐A
JACA‐C
JACA‐C
Fig. 3 Análisis de Componentes Principales
Conclusiones
• El análisis genético ha revelado la naturaleza clónica de la mayor parte de los individuos etiquetados como
I. perado ssp. lopezllioi y la existencia de tan sólo 5 genotipos distintos entre los 32 individuos analizados.
• Tanto el UPGMA como el ACP separan de manera evidente las poblaciones e individuos de I. azorica e I.
canariensis del resto de las poblaciones y no hacen diferenciación entre los individuos de I. perado ssp.
platyphylla e I. perado ssp. lopezlilloi.
• La estructura de las poblaciones de Ilex perado está más relacionada con la isla de origen que con su
categoría taxonómica.
Agradecimientos
Este proyecto ha sido financiado por el Organismo Autónomo de Parques Nacionales (2/2005). Los estudios
de doctorado de Edna A. González G. han sido posibles gracias a la concesión de una Beca MAEC-AECID. Un
reconocimiento especial a Ángel Fernández y Cito Chinea (Parque Nacional Garajonay) por su asistencia en la
recolección de muestras.
Referencias
Belkhir, K.; Borsa, P.; Chikhi, L.; Raufaste, N. y F. Bonhomme 1996-2004 Genetix 4.05. Université de
Montpellier II, France.
Caujapé-Castells, J. y M. Baccarani-Rosas 2005 Transformer-3: a Program for Analysis of Molecular
Population Genetic Data. EXEGEN software, Jardín Botánico Canario “Viera y Clavijo”.
Doyle, J.J. y J.L. Doyle 1987 A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue.
Phytochemical Bulletin of the Botanical Society of America. 19: 11-15.
Kumar, S.; Tamura, K.; Jakobsen, I.B. y M. Nei 2001 MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis
Software. Bioinformatics 17: 1244-1245.
Langella, O. 2005 Populations 1.2.30. Laboratoire Populations, Gènètique et Evolution, Centre Nacional de
la
Recherche
Scientifique,
CNRS
UPR9034,
Gif
Sur
Yvette.
Disponible
en:
http://ftp.bioinformatics.org/pub/populations.
Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of
Science USA 70: 3321-3323.
Pritchard, J.K; Stephens, M; P. Donnelly 2000. Inference of population structure using multilocus genotype
data. Genetics 155: 945-959.
Torimaru, T.; Tani, N.; Tsumura, Y.; Hiraoka K. y N. Tomaru 2004 Development and Polymorphism of
Simple Sequence Repeat DNA Markers for the Evergreen Shrub Ilex leucoclada M. Molecular Ecology
Notes 4: 531-533.
Yeh, F.C.; Yang R.C.; Boyle T.; Ye Z.H. y J.X. Mao 1997 Popgene, the User-Friendly Shareware for
Population Genetic Analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Alberta.