Especialización en Reproducción bovina IRAC 2011 - IRAC

Especialización en Reproducción bovina 2011
IRAC
CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE
EMBRIONES BOVINOS
Fecha: 30Ago11
Nombre y Apellido: Martin Atilio LAZARTE
Objetivo:
1. Transferir lo estudiado a lo largo del curso en la resolución de las actividades
presentadas.
Criterios de evaluación:
1. Manejo conceptual, nivel de profundización y capacidad para establecer
relaciones.
2. Capacidad crítica y posibilidad de realizar análisis personales.
3. Integración y transferencia de lo estudiado a situaciones concretas.
1. Observe las fotografías de embriones y en base al Sistema de Evaluación de
embriones de la Sociedad Internacional de Embriones (IETS) haga una
clasificación de los embriones según:
a. el estadio de desarrollo
b. la Calidad (grado 1,2,3,4).
c. Explique para cada fotografía la/s característica/s que tuvo en cuenta
para calificar los embrión.
Código de Estadio 4 (Mórula)
Código de Calidad 1 más del 85 % de la masa celular intacta, simétrico,
células de tamaño y color uniforme. Zona pelúcida lisa.
Código de Estadio 3 (Mórula Temprana)
Código de Calidad 1 más del 85 % de la masa celular intacta color uniforme
de la masa celular
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Código de estadio 7 Blastocito expandido
Código de calidad 2 entre el 50 y 84 % de las células intactas. Forma
irregular de la masa celular y algunas blastómeras sueltas.
Código de Estadio 4
Código de Calidad 3 entre el 25 y el 49 % de células normales.
Blastomeras sueltas , células degeneradas
Código de estadio 2
Código de calidad 4 Blastomeras desorganizadas y sueltas, células de
apariencia granular
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Embrión Nro 1 : Código de Estadio 4 Mórula- Código de Calidad 2 entre el
50 y el 84% de la masa celular intacta, blastómeras sueltas.
Embrión Nro 2 : Código de Estadio 4 Mórula -Código de Calidad 3 entre el
25 y el 49 % de la masa celular intacta, blastómeras sueltas y células
degeneradas
Embrión Nro 3 : Código de Estadio 4 Mórula- Código de Calidad 2 entre el
50 y el 84 % de la masa celular intacta, blastómeras sueltas.
Embrión Nro 4 : Código de Estadio 4 Mórula- Código de Calidad 1 más del
85 % de la masa celular intacta, simétrico y células de tamaño y color
uniforme.
Embrión Nro 5 : Código de Estadio 6 Blastocito- Código de Calidad 1 más
del 85 % de la masa celular intacta, simétrico y células de tamaño y color
uniforme, zona pelucida lisa.
Embrión Nro 6 : Código de Estadio 7 Blastocito expandido- Código de
Calidad 1 más del 85 % de la masa celular intacta, simétrico y células de
tamaño y color uniforme, zona pelucida lisa.
Embrión Nro 7 : Código de Estadio 4 Mórula -Código de Calidad 2 entre el
50 y el 84 % de la masa celular intacta, blastómeras sueltas y células
degeneradas
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Código de Estadio 4 Mórula
Código de Calidad 2 entre el 50 y el 84 % de la masa celular intacta. Forma
irregular de la masa celular y el color no es uniforme
Código de Estadio 4 Mórula
Código de Calidad 2 entre el 50 y el 84 % de la masa celular intacta
Blastómeras sueltas y masa celular de forma irregular
Código de Estadio 1(Infertilizado)
Grado de Calidad 4 (Infertilizado .Apariencia granular con puntillado)
2. Realice una comparación entre el método de congelado de embriones con
etilenglicol y la vitrificación teniendo en cuenta: medios de congelado, toxicidad,
curva de congelado, método de descongelado y practicidad (costos,
entrenamiento, etc).
Congelación -Transferencia Directa
Principio: Proceso físico - químico
complejo de intercambio de calor y
agua entre las células y el medio
externo que culmina con un cambio
de fase liquida a sólida. Los
embriones alcanzan su equilibrio
osmótico antes de comenzar el
Vitrificación
Principio: Es un proceso termodinamico mediante un fluido incrementa su
viscosidad durante el enfriamiento
adquiriendo propiedades de un sólido.
El fluido pasa a un estado solido no
estructurado similar al vidrio de donde la
técnica toma su nombre.
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descenso de la temperatura y lo
mantienen durante el enfriamiento.
Medios De Congelación:
Se utiliza el etilinglicol como
crioprotector a una concentración de
1,5 M .Tiempo de estabilización
debido a su alta permeabilidad no
deben superar los 5 minutos.
Método de Congelación
Estabilización del embrión con el
crioprotector a Tº ambiente hasta
alcanzar
el
equilibrio
osmótico
.Prender la congeladora y estabilizarla
entre -5 a -7 ºC luego colocar las
pajuelas cargadas con el embrión y
proceder a realizar el seeding (inducir
la formación de hielo en el medio
extracelular y se realiza tocando el
envase de los embriones con una
pinza enfriada previamente a -196
ºC). Luego se inicia el descenso
controlado de Temperatura a una
velocidad de 0,5 ºC /min hasta
alcanzar la temperatura de entre -30 a
-40 ºC , momento en que los
embriones son sumergidos en el
nitrógeno líquido.
Medios de Congelación
Para obtener el estado amorfo necesario
para la vitrificación de embriones la
concentración de crioprotectores que se
utiliza es entre 4-8 M a una velocidad de
congelación de 2500 ºC /min
Los Crioprotectores son altamente toxicos
a esas concentraciones por ese motivo
existen
diferentes
métodos
para
minimizar
la toxicidad de los
crioprotectores como :
 Agregar crioprotectores a baja Tº
 Agregar en 2 o 3 pasos
 Exponer el embrión a los
crioprotectores
por
periodos
breves.
 Utilizar microvolumenes
 Incrementar la Velocidad de
descenso de T a 15.000
ºC/min,(eliminar
vapores
de
nitrógeno
y
envases
de
microvolumen) permitirá utilizar
etilinglicol a 1,5 M en la
vitrificación.
Método de Vitrificación
Inmersión directa en nitrógeno líquido,
esto representa una velocidad para
macrovolumenes + de 50 ul de º2500
ºC/min y para microvolumenes –de 20 ul
una velocidad de enfriamiento de 22000
ºC/ min.
La técnica más usada es el OPS ,
consiste en una pajuela de 0,25 ml se
calienta se estira y se corta en el lugar
más fino. El paso siguiente es equilibrar el
embrión en el crioprotector de 1 a 3 min,
luego a una segunda solución con un
volumen no mayor a 5ul y finalmente
pasarlo a una microgota de 1ul y hay que
tener en cuenta que no debe sobrepasar
un periodo de 25 seg entre las dos gotas
y luego por capilaridad el embrión ingresa
a la pajuela que se introduce en el
nitrógeno líquido.
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Descongelado
La
descongelación
se
efectúa
colocando las pajuelas en un baño de
agua a 30 ºC hasta que se
descongele la pajuela, secar la
pajuela y transferir el embrión dentro
de los 15 minutos de descongelado.
Calentamiento
El calentamiento de embriones vitrificado
debe ser rápido, generalmente a 37 ºC a
baño Maria. La remoción del crioprotector
debería iniciarse lo antes posible para
minimizar la exposición intracelular a
niveles tóxicos de crioprotector. Los
embriones se colocan en soluciones con
mucha
menor
concentración
de
crioprotector más 0,5 a 1 M
de sucrosa
para evitar que el agua ingrese a la celula
al diluir los crioprotectores.
Costos
Es necesario adquirir un equipo de
congelamiento automático que realice
el descenso programado de la Tº
Técnica
Simple similar manejo de los
embriones en fresco, hasta la
estabilización y el cargado de la
congeladora de embriones.
Embriones In Vitro :
Técnica de cripreservacion con
resultados variables para embriones
producidos in vitro(PIV)
Costos
Es
una
técnica
más económica
considerando que no es necesario
adquirir ningún equipamiento especial
Técnica
Los procedimientos de vitrificación
requieren cuidado extremos al planear el
tiempo de los pasos y la ubicación de los
embriones en los envases utilizados.
Embriones In Vitro
Técnica
de
criopreservacion
con
resultados
estables
y
óptimos
comercialmente
para
embriones
producidos in vitro