HBc IgM - Felsan

lo tanto, la evaluación del anti-HBc es una herramienta útil para el
diagnóstico y el control de la hepatitis B. La prueba ayuda a diferenciar
entre la hepatitis B aguda o la infección crónica reactivada, y entre la
enfermedad crónica asintomática o la remisión persistente.
S
HBc IgM
Principio de la Prueba
®
La
prueba
ImmunoComb II HBc
IgM
es
un
ensayo
inmunoenzimático de fase sólida (EIA), basado en el principio de la
inmunocaptura. La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones
(“dientes”). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas:
punto superior — anti-HBc de conejo (Control Interno)
punto inferior — anticuerpos de cabra anti-IgM humano.
La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos.
Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada
etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine
de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa.
Al comienzo de la prueba, las muestras de suero o plasma se
prediluyen a 1:50 y se agregan al diluyente en los pocillos de la fila A
de la Bandeja de Desarrollo. El Peine luego es insertado en los
pocillos de la fila A. El IgM humano es capturado por los anticuerpos
anti-IgM en los puntos inferiores de los dientes del Peine (Figura 1). En
la fila B, el IgM anti-HBc capturado en los puntos inferiores de los
dientes, y el anti-HBc de conejo fijado en los puntos superiores
(Control Interno), reaccionan con el HBcAg. En la fila C, el HBcAg
unido reacciona con el anticuerpo anti-HBc de conejo marcado con
fosfatasa alcalina (FA). En las próximas dos filas, los componentes no
unidos son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa
alcalina unida reacciona con los componentes cromogénicos. Los
resultados pueden observarse como puntos azul grisáceo en la
superficie del diente del Peine.
Captura de anticuerpos;
60 min
Código: 60452002
α− IgM
humano
Formato: 3 x 12 pruebas
anticuerpos
humanos IgM
Reacción HBcAg –
anticuerpo; 2 min
Para Diagnóstico in vitro únicamente
HBcAg
recomb.
Propósito de uso
®
El kit ImmunoComb II HBc IgM es una prueba rápida para la
detección cualitativa de anticuerpos IgM contra el antígeno core de
la Hepatitis B (HBc) en suero o plasma humano. Treinta y seis
pruebas pueden ser realizadas con un kit.
conjugado
α-HBc
Introducción
El vírus de la hepatitis B (HBV) pertenece a una nueva familia de vírus
de ADN llamados Hepadnaviridae. Se caracteriza por un marcado
hepatotropismo y un singular medio de replicación a través de un
mecanismo de transcripción inversa. El virión completo, o partícula Dane,
consiste de una molécula de ADN circular protegida por un antígeno
nucleocáspide/nuclear (HBcAg) y rodeada por un envoltorio de
lipoproteína conocido como antígeno de superficie (HBsAg). El HBsAg
también se encuentra en la sangre en forma de partículas incompletas
esféricas o filamentosas no infecciosas. Un componente menor del
nucleocáspide HBV, el antígeno HBe (HBeAg), también puede
detectarse en la sangre durante la fase replicativa del virus.
El vírus de la hepatitis B es un vírus ubicuo de distribución global.
Las principales rutas de trasmisión viral son horizontales, a través de la
contaminación sexual y parenteral, y vertical, a través de la trasmisión
prenatal de la madre infectada al feto.
Las consecuencias clínicas de la infección de HBV varían entre las
totalmente inaparentes (70% de los casos) a la hepatitis ictérica aguda.
La mayoría de los pacientes se recuperan completamente seis meses
después del comienzo de la enfermedad. Una pequeña proporción de la
población infectada (<1.5%) puede desarrollar hepatitis fulminante,
a menudo con consecuencias fatales. En una proporción sustancial
(hasta 10%) de los pacientes adultos, el HBV puede persistir,
progresando eventualmente hasta la hepatitis crónica con desarrollo final
de cirrosis y hépatocarcinoma. Los portadores crónicos de hepatitis B
(200 millones en todo el mundo) constituyen la principal reserva del virus
y contribuyen a la diseminación de la enfermedad.
Altos títulos (>1:1000) de anticuerpos IgM contra HBcAg aparecen
durante la fase aguda de la infección de HBV, al mismo tiempo que el
IgG y el aumento de transminasa. Ya que el IgM anti-HBc declina
rápidamente, altos títulos de este anticuerpo son evidencia de una
infección aguda de HBV. También pueden observarse niveles
detectables de IgM anti-HBc en enfermedades crónicas en casos
ocasionales de reactivación de HBV como resultado de la
inmunosupresión, o debido a la supresión de esterorides o interferón. Por
60452002/S10/OR
Unión del conjugado
anti-HBc; 20 min
FA
FA
Reacción enzimática de
color; 10 min
FA
sustrato
cromogénico
Figura 1. Principio de la Prueba
El kit incluye un Control Positivo (IgM anti-HBc) y un Control
Negativo, que deben incluirse cada vez que se realiza la prueba.
Al término de ésta, el diente usado con el Control Positivo debe
mostrar 2 puntos de color azul grisáceo. El diente usado con el Control
Negativo debe mostrar el punto superior y un punto inferior muy ténue
o la ausencia del mismo. El punto superior debe también aparecer en
todos los demás dientes, a fin de confirmar que el kit funciona
apropiadamente y que la prueba fue realizada de manera correcta.
Contenido del Kit
Peines
El kit contiene 3 Peines de plástico. Cada Peine tiene 12 dientes, un
diente para cada prueba (Figura 2). Cada diente está sensibilizado en
dos áreas reactivas:
punto superior — anti-HBc de conejo (Control Interno)
punto inferior — anticuerpos de cabra anti-IgM humano
ImmunoComb ® II
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Control Interno
Anti IgM-humano
Figura 2. Peine
1
Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que
contienen una bolsa desecante.
•
Bandejas de Desarrollo
•
El kit contiene 3 bandejas de desarrollo cubiertas con papel de
aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los
reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo
consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una.
Los contenidos de cada fila son los siguientes:
Procedimiento de la Prueba
Fila A diluyente de la muestra
Fila B HBcAg recombinante diluído
Fila C anticuerpo anti-HBc de conejo marcado con fosfatasa
alcalina
Fila D solución de lavado
Fila E solución de lavado
Fila F solución de sustrato cromogénico conteniendo
5-bromo-4-cloro-3 indolil fosfato (BCIP) y nitro azul
tetrazolio (NBT)
Figura 3. Bandeja de Desarrollo
Control Positivo — 1 frasco (tapa roja) de 0,2 ml de plasma humano
diluido, inactivado con calor, positivo para anticuerpos IgM anti-HBc.
Control Negativo — 1 frasco (tapa verde) de 0,2 ml de plasma humano
diluido, inactivado con calor, negativo para anticuerpos anti-HBc.
Diluyente de la muestra — 1 botella de 20 ml de solución buffer fosfato.
Perforador — para perforar el papel aluminio que cubre los pocillos de la
Bandeja de Desarrollo.
Seguridad y Precauciones
•
•
•
•
•
•
•
El Control Positivo contiene HBsAg. Manejar como potencialmente
infeccioso, aunque haya sido inactivado con calor.
Todos los materiales de origen humano usados en la preparación
del kit pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos a
HBsAg, así como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C.
Ya que ningún método puede garantizar por completo la ausencia de
contaminación viral, todas las soluciones de referencia y todas las
muestras humanas deben ser manejadas como si fueran
potencialmente infecciosas.
Use guantes quirúrgicos y ropas de laboratorio. Siga los
procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o
plasma humano.
No use la pipeta aspirando con la boca.
Deseche todas las muestras, Peines usados*, Bandejas de
Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos
biocontaminantes.
No mezcle reactivos de lotes diferentes.
No use el kit después de la fecha de caducidad.
Después de descongelar las muestras de suero,
centrifúguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite
congelar y descongelar repetidamente.
Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no
han mostrado tener efecto sobre los resultados del test.
Equipo Necesario
•
•
•
•
Pipetas de precisión con puntas desechables con capacidad de
10 µl, 25 µl y 490 µl
Tijeras
Cronómetro de laboratorio o reloj
Microtubos
Preparación de la Prueba
Lleve todos los componentes, bandejas de desarrollo, peines, reactivos y
muestras a temperature ambiente y realice la prueba a temperature
ambiente (22°-26°C).
Preparación de la Bandeja de Desarrollo
1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37°C por
20 minutos, o deje a temperatura ambiente (22°-26°C) por
3 horas.
2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, para ser
desechado como desecho biocontaminante al concluir la prueba.
3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo.
Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo;
rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador,
cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen.
Preparación del Peine
Precaución: Para asegurar el funcionamiento apropiado de la
prueba, no toque los dientes del Peine.
1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado.
Retire el Peine.
2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o una
parte. Para utilizar parte del Peine:
a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las
muestras y los controles. Se necesita un diente para cada
prueba. Cada diente tiene impreso el número del código del
kit, "52", para permitir la identificación de los dientes sueltos.
b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o córtelo con tijeras
(ver Figura 4) para separar el número requerido para las
pruebas (Nro. de pruebas más dos controles).
c. Vuelva a meter la porción no utilizada del Peine en el
empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien
el empaque (con un clip, por ejemplo) para mantenerlo seco.
Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas
de 2°a 8°C para su uso posterior.
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Almacenamiento y estabilidad del kit
•
•
•
•
•
•
o
El kit es transportado entre 2-8 C. Durante el transporte el kit
o
debe mantenerse entre ≤ 30 C por cortos períodos de tiempo,
no excediendo un total de 48 horas. Los controles internos
indican que el kit no se ha dañado durante el transporte."
o
Almacene el kit en su caja original de 2-8 C.
No congele el kit.
Después de abrir el kit por primera vez, los componentes deben
o
ser almacenados de 2-8 C.
El desempeño del kit después de abrirlo por primera vez es
estable hasta la fecha de expiración del Kit, cuando se
o
almacena de 2-8 C.
Después del primer uso, el peine y la bandeja no deben ser
usados por más de tres veces.
Manejo de las Muestras
•
•
Es posible usar suero o plasma en la prueba.
Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a
temperaturas de 2° a 8°C antes de la prueba. Para almacenar
las muestras por más de 7 días, congélelas a –20°C o a
temperaturas más bajas.
Figura 4. Fraccionamiento del Peine
Instrucciones de la Prueba
Predilución de Muestras y Controles
1. Para cada muestra y control, vierta 490 µl de diluyente de la
muestra en un microtubo.
2. A cada microtubo agregue 10 µl de una muestra o del Control
Positivo o del Control Negativo suministrados con el kit. Mezcle
vaciando y rellenando repetidamente la solución.
Captura de anticuerpo (FIla A de la Bandeja de Desarrollo)
3. Pipetee 25 µl de una muestra prediluída. Perfore la cubierta de
aluminio de un pocillo de la fila A con la punta de la pipeta o el
perforador y vacíe la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle la
solución vaciando y rellenando el pocillo. Deseche la punta de la
pipeta.
4. Repita el paso 3 para las otras muestras prediluídas y los dos
controles prediluídos. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie
la punta de la pipeta para cada muestra o control.
* A menos que sea archivado para consulta posterior
60452002/S10/OR
2
5. a.
Inserte el Peine (con el lado impreso hacia Ud.) en los
pocillos de la fila A que contienen las muestras y los
controles.
Mezcle: retire e inserte el Peine en los pocillos varias veces.
b. Deje el Peine en la fila A por 60 minutos. Programe el reloj.
Hacia el final de los 60 minutos, perfore el papel aluminio en
la fila B usando el perforador. No abra más pocillos de los
necesarios.
c. Al cumplirse los 60 minutos, saque el Peine de la fila A.
Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes
apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la
superficie frontal del diente.
Reacción Antígeno–Anticuerpo (Fila B)
6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila B. Mezcle como en el
paso 5a. Programe el reloj para 2 minutos. Perfore el papel
aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el Peine y
absorba el líquido adherido como en el paso 5c.
Unión del Conjugado (Fila C)
7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle. Programe el
reloj para 20 minutos. Perfore el papel aluminio de la fila D.
Después de 20 minutos, retire el Peine y absorba el líquido
adherido.
Primer Lavado (FIla D)
8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Agite: retire e inserte
vigorosamente el Peine en los pocillos por al menos
10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias
veces agitando en el trascurso de 2 minutos: mientras tanto,
perfore el papel aluminio de la fila E. Después de 2 minutos,
retire el Peine y absorba el líquido adherido.
Segundo Lavado (Fila E)
9. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente
durante dos minutos, como en el paso 8. Mientras tanto, perfore
el papel aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el
Peine y absorba el líquido adherido.
Reacción de Color (Fila F)
10. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Programe el
reloj para 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el Peine.
Detención de la Reacción (Fila E)
11. Inserte el Peine de nuevo en la fila E. Después de 1 minuto,
retire el Peine y deje secar al aire.
Almacenamiento de las Partes No Usadas
del Kit
Bandeja de Desarrollo
Si no usó todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo, puede
almacenarla para ser utilizada posteriormente:
• Selle los pocillos usados con una cinta adhesiva ancha a fin de
que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que
la Bandeja de Desarrollo sea volcada.
Otros Materiales del Kit
• Vuelva a colocar la(s) Bandeja(s) de Desarrollo, Peine(s),
perforador, diluyente de la muestra, controles, diluyente de la
muestra e instrucciones en la caja original del kit y almacene a
temperatura de 2°a 8°C.
Resultados de la Prueba
Validación
A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar
que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes tres
condiciones (ver Figura 5):
1. El Control Positivo debe producir dos puntos en el diente del
Peine.
2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control
Interno). El punto inferior debe no aparecer o aparecer
ténuemente, sin afectar la interpretación de los resultados.
3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior
(Control Interno).
Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados no
son válidos y las muestras y controles deben ser reexaminados.
Interpretación Cualitativa de los
Resultados
Interpretación Visual
Compare la intensidad del punto inferior de cada diente de la muestra
con la del punto inferior del diente del Control Positivo. (Figura 6).
• Un punto con una intensidad mayor que o igual a la del Control
Positivo indica un resultado positivo.
• Un punto con una intensidad levemente menor que la del Control
Positivo debe ser considerado como un resultado indeterminado, y
una segunda muestra debe ser examinada una semana después.
• La ausencia del punto o su presencia con menor intensidad indica
un resultado negativo.
≤
Resultado Negativo
Control
Positivo
Muestra
Resultados Positivos
Figura 6. Resultados de la Prueba
Documentación de los Resultados
Debido a que el color que aparece en el Peine es estable, los Peines
pueden ser archivados para consulta posterior.
Limitaciones
Al igual que otras pruebas ideadas para ser usadas como diagnósticos
in vitro, los resultados de esta prueba deben ser evaluados en relación
a todos los síntomas, historia clínica y otras pruebas de laboratorio del
paciente.
Características del Ensayo*
®
El desempeño de el kit ImmunoComb II HBc IgM ha sido
evaluado sobre un total de 776 muestras. Los resultados son
resumidos en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados de la Prueba
®
Prueba de Referencia
ImmunoComb II HBc IgM
Positivo
Negativo
Positivo
75
0
Negativo
3
698
Se calcularon las características del ensayo, encontrándose los
siguientes reultados:
Sensibilidad – 100 %
Especificidad – 99.5 %
Repetibilidad
Diez peines escogidos al azar de diferentes partes de un lote de
producción. Un suero positivo fue probado 12 veces en estos
10 peines. Todas las veces el suero positivo fue detectado.
Reproducibilidad
Tres muestras positivas para HBc IgM fueron analizadas en peines
tomados de tres diferentes lotes de producción. En todos los casos,
todas las muestras positivas fueron detectadas.
Reacción cruzada
No se encontró reacción cruzada con muestras positivas para
hepatitis tales como Antígeno de Superficie del virus de la hepatitis
B, virus de la hepatitis C , HIV-1, HIV-2, HBc IgG, HAV, Rubéola,
Toxo, HTLV, CMV y para enfermedades autoinmunes tales como
Factor Reumatoideo.
Interferencia
No se observó interferencia con muestras hemolisadas
(hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipémicas (Colesterol hasta
281.6 mg/dL; Triglicéridos hasta 381.0 mg/dL) y bilirrubina alta
(hasta 20 mg/dl).
Control
Positivo
Control
Negativo
Figura 5. Validación de la Prueba
60452002/S10/OR
Resultados
Inválidos
* Datos detallados disponibles
3
Bibliografía
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hepatitis B virus. J Med Vir 3:141-149.
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New York. pp 73-138.
Kiyasu PK, Caldwell SH. 1993. Diagnosis and treatment of the major
hepatotropic viruses. Am J Med Sci 306:248-261.
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Hepatitis. (Hollinger FB, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL,
Ticehurst J, eds. Raven Press, New York. pp 39-71.
Swenson PD. 1991. Hepatitis viruses. In: Balows A, Hausler WJ,
Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical
Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology,
Washington, DC. pp 959-983.
Version: 60452002/S10/OR
(04/2008)
Leyenda de los símbolos
®
ImmunoComb tarjeta
CARD
Bandejas de Desarrollo
PLATE
CONTROL
CONTROL
+
Control positivo
-
Control negativo
PERFORATOR
Perforador
Consulte las instrucciones de uso
Atención,ver instrucciones de uso
IVD
Producto sanitario para
diagnóstico in vitro
Limite de temperatura
Σ
n
Contenido suficiente para n
ensayos
Fabricante
Representante autorizado en la
Comunidad Europea
REF
Número de catálogo
DIL
Diluyente de la muestra
LOT
Código de lote
Fecha de caducidad
Número de serie
60452002/S10/OR
4
Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba
1
2
Preincubación de la Bandeja de
Desarrollo: 3 hrs. a temperatura
ambiente, o 20 minutos a 37ºC
Tomar y prediluir
muestras y controles
Agregar muestras y
controles prediluídos
a la fila A. Mezclar
6
7
5
Insertar el Peine y mezclar en
la fila A. Incubar
Luego de mezclar/agitar y
incubar en las filas C,D y E
Perforación de la fila B
3
4
8
Absorber líquido
adherido a los dientes
.....
9
Reacción de color en la
fila F
Sacar el Peine del empaque
Insertar el Peine y agitar
en la fila B. Incubar
10
Resultados
Resumen del Procedimiento de la Prueba
Las instrucciones abreviadas abajo son para los usuarios experimentados en el uso del
kit ImmunoComb® II HBc IgM.
(para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo)
1. Dejar que todos los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente y
realizar la prueba a temperatura ambiente.
2. Prediluir 10 µl de cada muestra y control con 490 µl de diluyente de la muestra.
3. Verter 25 µl de cada muestra y control prediluídos en los pocillos de la fila A de la
Bandeja de Desarrollo y mezclar.
4. Insertar el Peine en la fila A y continuar como se describe en la Tabla 1:
Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba
Paso
Fila
Proceda como sigue
Captura de anticuerpos
A
Mezcle; incube 60 minutos; absorba.
Reacción antígeno-anticuerpo
B
Mezcle; incube 2 minutos; absorba.
Unión del conjugado
C
Mezcle; incube 20 minutos; absorba.
Lavado
D
Agite; incube 2 minutos; absorba.
Lavado
E
Agite; incube 2 minutos; absorba.
Reacción de color
F
Mezcle; incube 10 minutos.
Detención de la reacción
E
Incube 1 minuto; seque al aire.
60452002/S10/OR
1
2
Manera de romper el Peine
5