Vectores adenovirales de primera generación, el vector por

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Inmunología
Vol. 22 / Núm 2/ Abril-Junio 2003: 225-242
Vectores adenovirales de primera generación, el vector por
excelencia en inmunoterapia génica del cáncer
I. Narvaiza, G. Mazzolini, C. Qian, J. Prieto, I. Melero
División de Terapia Génica. Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA). Clínica Universitaria y Facultad de Medicina.
Universidad de Navarra, Pamplona (Navarra), España
FIRST GENERATION ADENOVIRAL VECTORS, THE VECTOR PAR
EXCELLENCE FOR IMMUNO-GENE THERAPY OF CANCER
RESUMEN
La terapia génica constituye una novedosa alternativa terapéutica para muchas enfermedades cuando las terapias habituales
no tienen efecto. Básicamente la terapia génica consiste en la introducción de material genético en el interior de una célula diana con
el objeto de producir en ella un cambio funcional que se traduzca
en un efecto terapéutico. El intenso desarrollo de esta área de la biomedicina ha llevado a la puesta en marcha de numerosos protocolos clínicos de terapia génica para el tratamiento experimental
de enfermedades de diverso origen: tumoral, infeccioso, autoinmune, degenerativo, genético. En la mayoría de los casos, es necesario recurrir al empleo de un vehículo, denominado vector, para
introducir el material genético en las células. Éstos pueden provenir de virus modificados genéticamente (vectores virales) o pueden ser formulaciones fisicoquímicas (vectores no virales). Actualmente existe un amplio abanico de vectores para transferencia génica, sin embargo no se dispone del vector ideal que pueda ser tan
versátil como para adaptarse a las numerosas situaciones experimentales o clínicas. Debido a las propiedades de los vectores adenovirales, tales como su alta eficacia de transducción, amplio tropismo, fácil construcción y producción, éstos han sido ampliamente
utilizados y se cuenta con una amplia experiencia en campos como
la terapia génica del cáncer. En este sentido, y a pesar de la corta
duración de expresión del transgén debido a su alta inmunogenicidad, los adenovirus de primera generación han demostrado su
eficacia tanto en estrategias de inmunoterapia en modelos tumorales experimentales como también en ensayos clínicos de fase I.
En este trabajo se revisan críticamente los distintos vectores virales empleados en terapia génica profundizando en las características biológicas de los adenovirus, los distintos tipos de vectores adenovirales, los diferentes sistemas de construcción de adenovirus
de primera generación así como su empleo en distintas aproximaciones de inmunoterapia génica del cáncer.
ABSTRACT
Gene therapy is a new promising therapeutic alternative for a number of diseases in which traditional treatments are unsuccessful. Basically, gene therapy consists in the introduction of genetic material into
target cells with the purpose to produce a therapeutic benefit. Recent
advances in this area of biomedicine have lead to the development of an
ever-increasing list of gene therapy clinical trials for the treatment of
different diseases, such us malignant, infectious, autoimmune, and genetic diseases. In most of the gene therapy approaches the use of a vehicle, called vector, to deliver the genetic material into the cells is required. Vectors can derive from genetically modified virus or can be of nonviral origin. In spite of a variety of vector systems developed, a universal vector adaptable to the diverse experimental or clinical conditions is
not available. Due to their properties such as high transduction efficiency, wide cellular/ tissular tropism, easy handling and production,
Adenoviral vectors have been extensively used in cancer therapy and an
important amount of experience has been accumulated during the last
decade. In spite of their high immunogenicity that limits transgene
expression to a short period of time, first generation adenoviral vectors
have demonstrated their efficacy in several immunotherapy strategies
against experimental tumour models as well as in phase I clinical trials.
This article reviews currently available viral vectors for gene therapy,
biological properties of adenoviruses, the different versions of adenoviral vectors and methods to construct first generation adenoviral vectors
with special emphasis in cancer immunotherapy approaches.
KEY WORDS: Gene therapy / Viral vectors / Adenovirus/ Cytokines.
PALABRAS CLAVE: Terapia génica / Adenovirus/ Citocinas /
Cáncer.
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VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER
TERAPIA GÉNICA
Definición
La terapia génica podría definirse como la transferencia de
material génico exógeno a tejidos u órganos para corregir un
defecto genético o conferir una nueva función biológica con el
propósito último de prevenir o tratar una enfermedad(1-3).
Objetivos de la terapia génica
El objetivo específico que se pretende alcanzar con la
terapia génica puede ser muy diverso. Abarca desde la
restauración o complementación de una función biológica
alterada, a la expresión de proteínas antigénicas como
procedimientos de vacunación génica, pasando por la
introducción de genes que aporten o potencien nuevas
funciones, el silenciamiento o inhibición de genes, o la
introducción de genes o moléculas que permitan la
monitorización de células.
Células diana
Todo tipo de célula somática es susceptible de ser
modificada genéticamente. La modificación génica de la
línea germinal en roedores y otros mamíferos ha sido crucial
para entender la fisiología de múltiples sistemas(4). Sin
embargo, no existe constancia de que se hayan realizado
estudios de transferencia génica en la línea germinal humana
con fines terapéuticos debido a las implicaciones éticas que
conlleva(2, 5).
Material génico transferible
El material génico (transgén) que puede ser transferido
al interior de la célula también puede ser de naturaleza
muy diversa incluyendo: genes completos(6), cassettes de
expresión artificiales(7), moléculas antisentido(8), ribozimas
o siRNAs(9, 10).
Terapia génica ex vivo o in vivo
La terapia génica puede dividirse en dos grandes grupos
desde el punto de vista metodológico: terapia génica ex vivo
y terapia génica in vivo. La terapia génica ex vivo consiste en
la extracción del organismo de las células diana y la consiguiente
reintroducción de dichas células, de manera autóloga o
heteróloga, después de ser transfectadas y seleccionadas;
entendiendo la transfección como el proceso de transferencia
génica y expresión del transgén realizado con éxito. Por el
contrario, la terapia génica in vivo consiste en la transferencia
de material génico directamente en el organismo. Los primeros
ensayos clínicos de terapia génica consistieron en el marcaje
de linfocitos infiltrados en tumores (TIL) ex vivo y su
reinoculación en pacientes con la finalidad de demostrar la
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TABLA I. Propiedades que debería cumplir un vector ideal
• Capacidad para transportar material génico de gran tamaño y
protegerlo de su degradación antes de alcanzar a la célula.
• Alta eficacia de internalización y transferencia del material génico.
• Expresión alta, eficaz, estable y regulada del transgén.
• Especificidad para el tipo celular o tejido diana.
• Expresión específica del transgén en el tipo celular o tejido diana.
• Baja o nula inmunogenicidad (en casos de vacunación génica,
ésta supone una ventaja).
• Baja toxicidad intrínseca.
• Facilidad de manipulación y producción.
• Alto grado de seguridad biológica, tanto para el paciente como
para el entorno.
• Bajo coste de producción.
transferencia de un gen exógeno de forma segura y detectable(2).
Otros ensayos iniciales, también ex vivo, consistieron en la
modificación de linfocitos y hepatocitos mediante retrovirus
con el fin de que fuesen capaces de producir adenosina
deaminasa (ADA) y el receptor de lipoproteínas de baja
densidad (LDL), respectivamente, y subsanar el déficit de
dichas proteínas en los pacientes(1, 2). El primer ensayo clínico
de terapia génica in vivo consistió en la transferencia mediante
liposomas de un plásmido que codificaba HLA-B7 en células
de melanoma(11). Actualmente, la mayoría de los protocolos
de terapia génica buscan la aplicación in vivo debido a su
mayor practicidad, comodidad para el paciente y menor
coste económico. Sin embargo, existen diferentes protocolos
de terapia génica ex vivo muy prometedores como la
modificación génica de células madre CD34(12) o de células
dendríticas para potenciar su efecto antitumoral(13).
VECTORES PARA TERAPIA GÉNICA
La transferencia de material génico exógeno puede
realizarse empleando métodos diferentes, pero en la mayoría
de los casos es necesario la utilización de un vehículo o
vector que facilite la introducción de dicho material génico(1,
14). Las propiedades del vector ideal (Tabla I) pueden variar
en función de las necesidades concretas pero, en cualquier
caso, sus propiedades condicionarán enormemente el éxito
del proceso de transferencia génica en cualquiera de sus
etapas: 1) alcanzar la célula diana, 2) introducción y liberación
del material génico en el interior celular y 3) expresión
del transgén. Los vectores empleados en terapia génica se
pueden clasificar en dos grandes grupos en función de su
naturaleza: a) vectores virales (basados en virus modificados
genéticamente) y b) vectores físicos o no virales (resto de
los sistemas no basados en virus) (Tabla II).
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TABLA II. Propiedades de los vectores más empleados para transferencia génica
Propiedades Vector
No virales
Retrovirus
Lentivirus
AAV
Adenovirus
Ad Gutless
Amplio
Células en
división
Amplio
(Pseudotipaje)
Amplio
Amplio
Amplio
Construcción/producción
Fácil
Moderada
Difícil
Difícil
Moderada
Difícil
Eficiencia de transducción
Insuficiente
Baja
Muy alta
Alta
Capacidad de transgén
Ilimitada
< 4-5 Kb
8-9 Kb
< 4-5 Kb
5-8 Kb
< 37 Kb
Títulos de producción
Muy altos
Bajos
(105-107)
Bajos
(102-1010 )
Medios
(109-1013)
Altos
(1011-1014)
Medios
(106-1010)
Días
Muy larga
(integración)
Muy larga
(integración)
Muy larga
(integración)
7- 14 días
Meses-años
Baja
Baja
Muy alta
Baja
Alta
Alta
Tropismo celular
Duración de la expresión
Inmunogenicidad
Seguridad
Nula - Muy baja
Baja
Muy alta
Baja
(Mutagénesis
insercional)
Baja-moderada Moderada-alta
Baja
Media
(Mutagénesis
(Mutagénesis
insercional-HIV) insercional)
Las propiedades de los vectores no virales mostradas son propiedades generales y alguno de ellos en concreto pueden presentar variaciones. Los títulos de
los vectores virales hacen referencia a iu/ml. Modificado de Wang Y et al. 2000 DDT (5) 1; 10-16.
Vectores no virales
Existen numerosos métodos de transferencia génica
basados en vectores no virales. Todos ellos comparten una
serie de propiedades como su simplicidad y facilidad de
preparación, permiten transferir moléculas de gran tamaño,
son poco inmunogénicos, su toxicidad suele ser baja y son
muy seguros. Sin embargo, la eficacia de transferencia génica
alcanzada con los vectores no virales suele ser baja y son
poco específicos. Los vectores no virales más empleados
son el DNA desnudo(15, 16), los liposomas(11, 17), la pistola
génica(18, 19), los polímeros catiónicos (poliplejos)(20), los
complejos DNA-proteína(21) y la electroporación(22, 23). A
pesar de la baja eficacia de transferencia génica que ofrecen
los vectores no virales, éstos han dado buenos resultados
en ensayos de vacunación(24) y se están desarrollando nuevos
vectores y nuevas técnicas que auguran un futuro prometedor
para estos vectores(25, 26).
Vectores virales
Los virus constituyen, probablemente, la forma de vida
más simple y representan el ente natural más evolucionado
para transferir material génico exógeno al interior celular.
Hasta el día de hoy, el ser humano no ha sido capaz de crear
artificialmente un sistema que supere la eficiencia de
transferencia génica que han alcanzado los virus tras millones
de años de evolución. Este hecho ha llevado al empleo y
manipulación de los virus como vectores para transferir
material génico con fines experimentales y terapéuticos.
Distintos tipos de virus han sido modificados para construir
vectores para transferencia génica y terapia génica, cada
uno de ellos con unas propiedades determinadas (Tabla II).
Los métodos utilizados para construir los distintos
vectores virales siguen un patrón similar. Las funciones
codificadas por los virus pueden dividirse en elementos
que actúan en cis o en trans. Las secuencias que actúan en
cis, como los orígenes de replicación o la secuencia de
encapsidación, deben encontrarse en el propio genoma del
vector viral; mientras que los elementos que actúan en trans,
como las proteínas estructurales y/o de la envuelta o la
maquinaria necesaria para la replicación viral, no es necesario
que sean codificados por el propio genoma viral y pueden
ser suministradas por células transfectadas de forma estable
con los genes que las codifican (células empaquetadoras),
mediante plásmidos o virus «helper» (Fig. 1). El método
general para la construcción de vectores virales consiste en
la sustitución de elementos que actúan en trans, imprescindibles
para la replicación, por el material génico que se desea
transferir. De este modo se consiguen partículas virales no
replicativas pero infectivas, y con capacidad para transferir
el material génico terapéutico introducido en su genoma.
El número de vectores virales disponibles es amplio y
la elección del mismo dependerá de nuestro objetivo. Los
retrovirus son los vectores más adecuados para la transferencia
génica ex vivo y si se desea la expresión prolongada del
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VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER
Trans acting Viral genes
Cis
Proteína µ
Cis
Proteasa
(B)
Virus «helper»
Transgén
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Proteína IIIa
Proteína VIII
(A)
DNA viral
Hexon
(C)
Proteína IX
Proteína VII
Proteína terminal
(D)
Célula empaquetadora
Figura 1. Método general de construcción de vectores adenovirales. Los
métodos de construcción/producción de vectores virales siguen un patrón
general: las células son transfectadas con un plásmido, DNA o RNA que
contienen las secuencias virales que actúan en cis y el material génico que
se desea transferir (transgén) (A); los genes virales que actúan en trans
pueden aportarse en forma de plásmidos (B), DNA viral, virus «helper» (C)
o/y por la propia célula transfectada (D).
transgén (27, 28). Si se pretende modificar células madre
hematopoyéticas o leucocitos, la elección más acertada serán
los lentivirus(29, 30). En caso de una aproximación in vivo
buscando la expresión prolongada del transgén nos
decantaremos por los AAV(30, 31) o los adenovirus «gutless»(32),
dependiendo del tamaño del mismo. Los adenovirus de
primera generación son el vector viral más apropiado en
aproximaciones de terapia génica del cáncer que requieren
altos niveles de expresión del transgén deseado y no se
necesita la expresión prolongada del mismo, como es el
caso de la terapia génica con genes suicidas o la inmunoterapia
génica.
ADENOVIRUS
Los adenovirus (Ad) pertenecen a la familia Adenoviridae.
Se conocen casi 50 serotipos distintos de adenovirus humanos
divididos en 6 subgrupos (A a F) en función de sus
características inmunológicas, biológicas y secuencias
genómicas(33). Los adenovirus humanos mejor caracterizados
y más utilizados en terapia génica son los Ad tipo2 y Ad
tipo5, ambos pertenecientes al subgrupo C(34).
Estructura y organización genómica de la partícula adenoviral
Los adenovirus son virus DNA cuyo genoma esta
encerrado en una cubierta proteica de geometría icosahédrica,
denominada cápside, de 70-100 nm de diámetro, sin envuelta(33).
La cápside está formada por tres proteínas principales: el
hexón, la base pentona y la fibra con una protuberancia
terminal, además de otras proteínas menores VI, VIII, IX,
IIIa y IVa2(34-36) (Fig. 2). El genoma viral es una molécula
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Proteína V
Proteína VI
Base pentona
Base pentona
Knob
Figura 2. Estructura de la partícula adenoviral. Sección esquemática de
un adenovirión. La organización de las proteínas estructurales se basa en
estudios publicados, excepto la localización de la proteína VIII y la organización
espacial del genoma viral. Modificado a partir de Flint SJ, Adenoviruses
(2001), Encyclopedia of Life Science. 2001 Nature Publishing Group.
www.els.net.
lineal de DNA de doble hebra de unas 36 Kb con una proteína
terminal (TP) unida covalentemente a cada uno de sus
extremos 5’. En ambos extremos del genoma viral se definen
unas secuencias cortas denominadas ITRs que constituyen
el origen de replicación del DNA. A continuación del ITR
izquierdo (con relación al mapa del genoma adenoviral
establecido por convención, Fig. 2) se localiza la secuencia
de empaquetamiento (Ψ), requerida para la encapsidación
del genoma y que actúa en cis. El DNA viral esta íntimamente
asociado con una proteína muy básica (VII) y con un pequeño
péptido denominado µ. Otra proteína, denominada V, está
empaquetada con este complejo DNA-proteína y parece
que constituye una unión estructural con la cápside, a través
de la proteína VI. El virus contiene, además, una proteasa
codificada por el genoma viral (Pr) que es necesaria para
el procesamiento de algunas proteínas estructurales y para
producir virus infecciosos maduros(34).
Ciclo infectivo del adenovirus
El ciclo infectivo de los adenovirus puede diferenciarse
en dos fases(37). La primera fase o fase temprana incluye la
entrada del virus en la célula huésped, el transporte del
genoma viral al núcleo y la transcripción y traducción
selectiva de los genes tempranos(34). Los sucesos tempranos
modulan las funciones de la célula facilitando la replicación
del genoma viral y la transcripción y traducción de los genes
virales tardíos. Los procesos posteriores a la replicación
constituyen la segunda fase o fase tardía y terminan con
el ensamblaje de las proteínas estructurales y la maduración
del virus infectivo en el núcleo. La infección adenoviral
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MLP
55Kd,
19Kd
L1
243R
E1B
289R
E1A
0
10
20
30
IX
IV
100Kd, 33Kd, L5
pVI, II, Pr L4 pVIII
L3
III.pVII, V
12,5Kd, 6,7Kd,
L2
gp19Kd, ADP
IIIa
RIDαβ, 17,7Kd
E3
VA RNAs I-II
40
IVa2
60
70
DBP
80
90
100 mu
E2A
orf 1-6/7 E4
pTP
Pol
50
E2B
Figura 3. Organización transcripcional del genoma del adenovirus tipo 2.
Los transcritos tempranos aparecen en negro (flechas negras) y los tardíos
en gris (flechas blancas). Las flechas indican la dirección de la transcripción.
En cursiva aparecen las proteínas codificadas por cada región transcripcional;
(mu: unidades de mapa).
finaliza con la lisis celular y liberación de nuevas partículas
adenovirales. La primera fase suele requerir, en células
permisivas, entre 6-8 h, mientras que la fase tardía suele ser
más rápida liberando partículas virales en 4-6 horas. El
genoma adenoviral se puede dividir en dos regiones,
dependiendo de que su transcripción sea anterior o posterior
a la replicación del mismo. Las regiones de transcripción
temprana se denominan regiones tempranas E1, E2, E3 y
E4 y las regiones transcritas durante la fase tardía L1 a L5
(Fig. 3).
La adsorción del virus a la célula diana está mediada
por la unión entre la protuberancia de la fibra adenoviral
y receptores situados en la superficie de la membrana celular.
El principal receptor para el subgrupo C de adenovirus es
el receptor del Virus Coxsakie B/Adenovirus (CAR)(38).
CAR es una proteína de membrana que pertenece a la super
familia de las inmunoglobulinas y que consta de un dominio
extracelular, un dominio transmembrana y otro citoplasmático,
siendo el dominio extracelular suficiente para la unión
del virus(39). La presencia del CAR condiciona la susceptibilidad
a la infección por adenovirus y su ausencia en la membrana
de determinados tipos celulares explica la resistencia de los
mismos a la infección por adenovirus(40). Además de CAR,
el dominio α2 de la cadena pesada de las moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHCI) también se ha descrito como un correceptor para la
adsorción del adenovirus(41).
Después de la interacción de la fibra adenoviral con sus
receptores, tiene lugar la internalización de la partícula viral
por un proceso de endocitosis mediada por receptor. El
proceso de internalización está promovido por la interacción
directa entre un motivo RGD (arginina-glicina-ácido aspártico),
que queda expuesto en la base pentona del adenovirus, y
las integrinas celulares que contienen la cadena αV,
principalmente αVβ3 y a Vβ5(42, 43), que actúan como receptores
de internalización. La interacción del virus con la membrana
plasmática induce numerosas vías de señalización como la
vía de la kinasa de fosfoinositido-3-ol (PI-3K) que dispara
la familia de GTPasas Rho y la polimerización y reorganización
de la actina para facilitar la endocitosis mediada por vesículas
recubiertas de clatrina(44-47).
Una vez en el interior del endosoma, en un proceso
mediado por la base pentona y el bajo pH, la membrana
endosomal se degrada y el endosoma se lisa liberando su
contenido al citosol(48). El virión es desarmado por etapas
durante el proceso de internalización y transporte al núcleo(49,
50). Parece que la proteasa codificada por el virus permite
la desorganización de la cápside adenoviral por proteolisis
de la proteína estructural VI. El virión, parcialmente
desorganizado, es transportado hasta la membrana nuclear
y el genoma viral es introducido en el núcleo a través del
poro nuclear; este proceso estaría mediado por la asociación
del «core» viral (genoma más TP, VII, V y µ) con la proteína
celular p32 y requiere la participación de dineína y
microtúbulos(51, 52).
La transcripción, replicación y encapsidación del genoma
del adenovirus tienen lugar en el núcleo de la célula infectada
y comienza con la transcripción de los genes tempranos
(Fig. 3)(53). Los productos del gen E1 se pueden dividir en
E1A y E1B. La unidad de transcripción E1A es la primera
en ser transcrita y da lugar a dos proteínas que comparten
su secuencia, 289R y 243R, involucradas en la regulación
de la transcripción viral e imprescindibles para la replicación
viral. Estas proteínas tienen como función principal modular
el metabolismo celular para hacer a la célula susceptible a
la replicación viral(37). E1B genera por procesos de splicing
alternativo dos proteínas, 19k y 55k, que son necesarias
para bloquear el transporte de RNA mensajero celular,
estimular el transporte de RNA mensajeros adenovirales,
favorecer la replicación viral y bloquear la inducción de
apoptosis (dependiente principalmente de p53) por efecto
de las funciones de E1A(37).
La región E2 codifica proteínas necesarias para la
replicación viral y se puede dividir en 2 subregiones, E2a
y E2b, que comparten el mismo promotor. E2a codifica la
proteína de unión al DNA de 72kD (DBP) y E2b codifica la
polimerasa de DNA viral (Pol) y el precursor de la proteína
terminal (pTP)(54).
La región E3 da lugar a numerosas proteínas involucradas,
principalmente, en la evasión de la respuesta inmunitaria
generada contra el adenovirus(55). La proteína gp19k se une
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VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER
a la cadena pesada del MHC-I, la retiene en el retículo
endoplasmático (RE) e impide la expresión del MHC-I en
la superficie celular(56). La proteína 14,7k y el complejo RID
(10.4/14,5k) inhiben la apoptosis y la inflamación inducida
por el TNF(34). Aunque E3 no es imprescindible para la
replicación y la producción de virus in vitro, codifica para
una proteína de 11,6 kDa denominada adenovirus death
protein (ADP) necesaria para la liberación eficiente de los
viriones del núcleo y la lisis de la célula(57, 58).
La región E4(59) codifica al menos 6 proteínas (ORF 16/7) que facilitan el metabolismo del RNA mensajero viral,
promueven la replicación del DNA viral, la expresión de
genes tardíos y el shut off de la síntesis de proteínas celulares.
Los productos del ORF 3 y ORF 6 facilitan el crecimiento
viral incrementando la estabilidad de los transcritos virales
tardíos en el núcleo. Además, la proteína generada por el
ORF 6 forma complejos con la proteína E1B de 55 kDa para
promover el transporte de RNAs virales fuera del núcleo.
El producto del ORF 6/7 se une al factor de transcripción
celular E2F activando la región E2 para incrementar la
expresión de proteínas involucradas en la replicación viral.
La replicación del DNA viral comienza 8 horas después
de la infección. Se inicia en ambos extremos del genoma
viral empleando los ITRs y la TP como molde para la síntesis
de DNA catalizada por la polimerasa adenoviral (Pol). La
síntesis continúa a lo largo de todo el genoma mediante un
mecanismo de desplazamiento que requiere de DNABP,
Pol y distintos factores celulares(34, 54).
Después de la replicación comienza la fase de transcripción
tardía. En ese momento prácticamente todas las proteínas
expresadas en la célula infectada son de origen viral debido
a la actividad de los productos de E1 y E4. La transcripción
tardía esta controlada por el MLP (de Mayor Late Promoter)
y da lugar a 5 transcritos (L1-L5) por procesos de splicing
complejos. L1-L5 codifican las proteínas estructurales y las
proteínas necesarias para la encapsidación del genoma viral
y para la maduración de los viriones. En la fase tardía se
transcriben una serie de RNAs que no son traducidos,
denominados VA RNAs, requeridos para la traducción
de los transcritos virales tardíos y la inhibición de proteínas
antivirales inducidas por interferón(37); también se expresa
la proteína IX que contribuye a la estabilidad térmica del
adenovirus y a la eficiencia de encapsidación del genoma
viral completo. El proceso de encapsidación esta dirigido
por la presencia en el genoma adenoviral de la señal de
empaquetamiento situada en el extremo izquierdo (Ψ) y
que consiste en una serie secuencias ricas en A-T(60). La
producción de viriones continúa durante 40 horas tras la
internalización, está acompañada de importantes cambios
en la infraestructura y la permeabilidad nuclear, facilitando
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la salida del virus al citoplasma y finaliza con la lisis celular
liberando más de 104 partículas virales por célula(57, 61).
VECTORES ADENOVIRALES
Los adenovirus son los vectores virales más empleados
actualmente en terapia génica in vivo, y debido a sus propiedades
es uno de los mejores vectores para la terapia génica del
cáncer y más concretamente para la inmunoterapia génica.
Las propiedades de los vectores adenovirales son: 1) un
tropismo muy amplio, infectando numerosos tipos celulares;
2) infectan tanto células quiescentes como células en divisió;
3) muy alta eficacia de transducción; expresan cantidades
altas del transgén; 4) no requieren de integración en su ciclo
infectivo y el material génico se expresa de forma episomal;
5) son muy inmunogénicos; 6) su construcción, manipulación
y producción son relativamente sencillas, son virus estables
y se obtienen títulos altos (1011-1015 pfu/ml); 7) no se han
descrito patologías graves asociadas al adenovirus salvaje;
8) su toxicidad como vector es baja y su bioseguridad es alta.
Los adenovirus pueden encapsidar moléculas de hasta
105% el tamaño del genoma natural, es decir, aceptarían
insertos de 1 Kb. Como se comentó anteriormente, para
poder introducir material génico exógeno en el adenovirus
se recurre a la deleción de regiones del virus para dejar
espacio y sustituirlas por el material exógeno. Se han descrito
decenas de métodos para construir adenovirus recombinantes
defectivos y para mejorar sus propiedades como vectores
para terapia génica (62). Básicamente los adenovirus
recombinantes defectivos empleados como vectores pueden
dividirse en tres clases (Fig. 4): I) Adenovirus de primera
generación, II) Adenovirus de segunda-tercera generación
y III) Adenovirus gutless(30, 63).
Los adenovirus de primera generación son, hasta el día
de hoy, los más empleados en terapia génica y están basados
en la substitución de las regiones E1 y/o E3 por el material
génico que se desea transferir. Dado que las proteínas
expresadas por la región E1 son imprescindibles para la
expresión de otros genes virales y la replicación del adenovirus,
la producción de los virus recombinantes se realiza en células
transformadas con la región E1 del adenovirus, la línea
celular empaquetadora más utilizada es la línea celular
293 (64). La deleción de E1 implica que el adenovirus
recombinante sea defectivo para su replicación impidiendo
que pueda replicarse y amplificarse tras su administración
y añade un elemento de seguridad. La región E3 codifica
proteínas que no son imprescindibles para la replicación
viral por lo que no es necesario que la línea celular
empaquetadora las aporte. Sin embargo, es interesante que
el vector recombinante exprese la proteína ADP, que facilita
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I. NARVAIZA ET AL.
INMUNOLOGÍA
Adenovirus de 1ª Generación
Ψ
∆ E1
(3.2 Kb)
± ∆ E3
(3.1 Kb)
Adenovirus de 2ª y 3ª Generación
Ψ
∆ E1
± ∆ E2B
(1.8 Kb)
± ∆ E2 ± ∆ E3 ± ∆ E4
(1.6 Kb)
(2.4 Kb)
Adenovirus Gutless
Ψ
Figura 4. Distintos tipos de vectores adenovirales. Representación del genoma
de las distintas generaciones de vectores adenovirales con cada una de las
regiones delecionadas (entre paréntesis se indica el tamaño máximo de cada
deleción). Las flechas representan los ITRs y Ψ la secuencia de encapsidación.
Los adenovirus de 1ª generación aceptan insertos de hasta 8 Kb, los de 2 y
3ª insertos de hasta 14 Kb y los adenovirus «gutless» tienen una capacidad
superior a las 36 Kb (la línea punteada representa secuencias no adenovirales).
Modificado a partir de X Daanthine and MJ Imperiale, Gene Ther 2000; 7:
1707.
la liberación de partículas al exterior de la célula infectada,
o la gp19k. Los adenovirus delecionados en E1 admiten
transgenes de hasta 5,1 Kb y los delecionados en E1 y E3
insertos de hasta 8,2 Kb.
Los adenovirus de primera generación son muy
inmunogénicos y su introducción en el organismo dispara
una respuesta inmunitaria potente, tanto contra la propia
cápside viral como frente a las proteínas virales que se
expresan durante la infección(65-67). La respuesta inmunitaria
que se genera es, en un primer termino, innata y está mediada
principalmente por macrófagos. En el caso de la administración
sistémica en ratones las células de Kupffer son responsables
de la eliminación del 90% del adenovirus. Posteriormente
se genera una respuesta inmunitaria adaptativa celular y
humoral(67). La respuesta celular se debe al procesamiento
de las proteínas virales y su expresión en el contexto del
MHC-I y II que activa las respuestas mediadas por linfocitos
T helper y citotóxicos y que conlleva a la eliminación de las
células transducidas(68, 69). La respuesta humoral induce la
producción de anticuerpos neutralizantes frente a la cápside
viral(70). La inmunogenicidad de los adenovirus constituye
un gran inconveniente para su uso como vectores en terapia
génica de larga expresión ya que limita la expresión del
transgén a 7–14 días(71), debido a la destrucción inmunitaria
de las células transducidas, e impide la administración
repetida del adenovirus debido al efecto neutralizante de
los anticuerpos contra la cápside viral generados con la
primera administración.
Para solucionar el inconveniente de la inmunogenicidad
generada por la expresión de proteínas virales y aumentar
la capacidad de clonaje de los adenovirus de primera
generación, se han desarrollado vectores delecionados de
otras regiones virales, además de E1, como E2a, E2b o/y
E4(72). Sin embargo, estos vectores no han dado los resultados
esperados y su aplicación ha sido muy limitada(73-76).
Los adenovirus denominados gutless, helper dependent
o fully deleted constituyen el último tipo de vectores adenovirales
desarrollados hasta hoy. El genoma de estos vectores carece
de todos los genes virales y sólo conservan las secuencias
que actúan en cis, es decir, los ITRs y la secuencia de
encapsidación. Estos virus podrían transportar material
génico exógeno de hasta 37 Kb, por ejemplo varios transgenes
distintos o genes completos (incluyendo las secuencias
reguladoras, intrones y exones). Se ha demostrado que con
el empleo de estos adenovirus se detecta la expresión del
transgén dos años después de su administración en animales,
no inducen una respuesta inmune significativa y permiten
la administración repetida del mismo vector a lo largo del
tiempo(6, 32, 77, 78). Sin embargo, la construcción y producción
de estos adenovirus requiere el uso de un adenovirus helper
que aporte todos los elementos que actúan en trans, y todavía
no es posible conseguir una producción final de adenovirus
gutless libre de contaminación por partículas helper. Además,
su producción es costosa y muy laboriosa, es difícil producir
títulos altos de virus y su genoma es, a menudo, inestable.
En un capítulo aparte cabe destacar los adenovirus
selectivos en replicación capaces de replicarse específicamente
en células tumorales p53–, que si bien no son vectores para
tansferencia génica, son también utilizados en terapia génica
del cáncer (79). Un ejemplo de estos adenovirus son los
adenovirus que contienen una deleción en el gen E1B por
lo que son incapaces de inhibir la apoptosis mediada por
p53 e inducida por la acción de E1A. Sin embargo, estos
adenovirus son capaces de replicarse activamente en células
que carecen de p53 funcional, amplificándose, infectando
las células vecinas y causando lisis celular. Parte del efecto
antitumoral observado con estos adenovirus in vivo se debe,
posiblemente, a sus propiedades para inducir una respuesta
inmunitaria en el tejido maligno(80). Estos agentes se han
probado en ensayos clínicos demostrando un perfil de
seguridad aceptable y efectos sinérgicos con quimioterapia
convencional(81).
Otros factores a considerar en un vector adenoviral de
primera generación
Un factor clave a la hora de diseñar un adenovirus
recombinante reside en la elección del promotor que va a
dirigir la expresión del transgén. En función del promotor
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P gina 232
VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER
elegido, la expresión del transgén será más o menos intensa
y más o menos prolongada en el tiempo. En este sentido
se puede diferenciar entre promotores universales y promotores
específicos de tejido o tipo celular. I) Los promotores
universales son generalmente de origen viral, y permiten
la expresión del transgén en prácticamente todos los tipos
celulares y tejidos. De entre todos los promotores universales
empleados hasta la fecha en transferencia génica, el promotor
temprano del citomegalovirus humano (CMV) ha demostrado
ser el más eficaz(63, 82, 83). Sin embargo, el empleo del promotor
CMV empieza a cuestionarse porque trabajos recientes
sugieren el silenciamiento de la expresión del transgén
debido a modificaciones del promotor por la célula(71, 84) y/o
la inducción de expresión de NF-kB(85, 86). II) Los promotores
específicos permiten la expresión restringida del transgén
a determinados tejidos o tipos celulares, como el promotor
de la α-fetoproteína en células de hepatocarcinoma. Si bien
actualmente se están haciendo grandes esfuerzos en la
búsqueda de nuevos promotores específicos, todavía queda
un largo trabajo por desarrollar(37, 87, 88).
Otra aproximación interesante es el empleo de promotores
regulables, como los promotores Tet-on y Tet-off que activan
la expresión del transgén en respuesta a la administración
o supresión de tetraciclina respectivamente(89). Este tipo
de promotores permite regular la expresión del transgén a
voluntad, pero todavía se requiere su optimización para ser
utilizados en aproximaciones in vivo.
En contraposición o como complemento al uso de
promotores regulables o específicos de tejido, se están
realizando numerosos esfuerzos para modificar el tropismo
natural de los adenovirus de manera que infecten de forma
específica un determinado tipo celular o tisular(90). El tropismo
específico del adenovirus evitaría, además, la transducción
no deseada de otros tejidos cuando el vector es administrado
de forma sistémica. Las aproximaciones desarrolladas en
este sentido van desde la modificación genética de la fibra
del adenovirus hasta el empleo de anticuerpos biespecíficos
fibra–molécula diana(91, 92). La producción de estos vectores
adenovirales con tropismo modificado es poco eficaz y muy
costosa lo que ha limitado su utilización.
Construcción de vectores adenovirales de primera generación
Como se comentó anteriormente, existen numerosos
métodos para la construcción de adenovirus de primera
generación(62). El método clásico y más empleado hasta hace
pocos años fue ideado por el grupo de F.L. Graham(93, 94).
Este método se basa en la recombinación homóloga, en
células 293, entre un plásmido que contiene el genoma del
Ad 5 con una inserción en la región E1 (pJM17 ) y un plásmido
(p∆E1Sp1) que contiene el cassette de expresión con el
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transgén deseado en lugar de la región E1 (Fig. 5A)(95). Si
bien este sistema ha sido muy empleado hasta la fecha y
la mayoría de los adenovirus recombinantes generados en
muchos laboratorios han sido construidos con este método,
la eficiencia de la recombinación homóloga es muy baja y
se requieren entre 14 y 21 días para observar la formación
de virus recombinante.
A finales de los años 90, se desarrolló un nuevo método
para construir adenovirus recombinantes de primera
generación y gutless mediante un sistema basado en la
recombinasa Cre del fago P1(96, 97) (Fig. 5B). Este sistema
consiste en la co-transfección de células CRE (células 293
que expresan la recombinasa Cre del fago P1 de forma
estable) con el DNA de un adenovirus recombinante defectivo
en E1 y E3 (Ψ5) cuya secuencia de encapsidación está
flanqueada por dos secuencias LoxP, y un plásmido shuttle
(pAdLox) que contiene el extremo izquierdo del genoma
de Ad5 seguida de un cassette de expresión donde se puede
clonar el gen deseado y un sitio LoxP (Fig. 5B). La principal
ventaja del sistema Cre-Lox reside en la eficiencia de
recombinación dirigida por Cre que generará en el nuevo
genoma adenoviral, ya que una semana después de la cotransfección se sabrá si el proceso ha tenido éxito(62).
A la hora de elegir un método para construir adenovirus
recombinantes hay otra serie de puntos que se deben
considerar: 1) la laboriosidad del método, 2) el tiempo que
se requiere para obtener el nuevo adenovirus recombinante,
3) la posibilidad de que se produzcan modificaciones difíciles
de detectar en el genoma adenoviral y 4) la formación de
adenovirus con capacidad replicativa. En los últimos años
han aparecido nuevos métodos, más o menos eficaces y
laboriosos, para la construcción de adenovirus de primera
generación basados en la recombinación in vitro en E. coli
rec+ o el empleo de cósmidos(62, 98). Así, frente a los sistemas
basados en la recombinación en células de mamífero, existen
otros métodos basados en la recombinación en E. coli rec+
antes de la transfección en las células empaquetadoras
con el genoma del nuevo virus recombinante(99). La principal
ventaja que ofrece este tipo de método es el ahorro de tiempo
y la ausencia de virus helper o parental contaminante en la
preparación adenoviral. Esto supondría que, en principio,
no fuera necesario la selección de una sola partícula viral.
El mayor inconveniente de estos sistemas, y de todos los
que emplean el genoma viral en forma de plásmido, es la
inestabilidad de los plásmidos que contienen el genoma
adenoviral. Esta inestabilidad es consecuencia de su gran
tamaño, que a menudo hacen complicada su manipulación
y producción, y de recombinaciones favorecidas por la
presencia de secuencias palindrómicas (ITRs).
A diferencia de otros vectores virales como los AAV o
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I. NARVAIZA ET AL.
INMUNOLOGÍA
Ori
Amp
A
(0 mu)
∆E1 (1.0-9.8 mu)
Promotor
TrasngénpA
(100/0 mu)
(3.7 mu)
B
(16.1 mu)
p∆E1sp1
Ψ5
LoxP
Tet
Amp
LoxP
Ψ
ITR
ITR
Recombinasa CRE
LoxP
Ori
Ψ
(3.7 mu)
+
LoxP
ITR
∆Ψ/Ψ5
ITR
(16.1 mu)
ITR
pJM17
Ψ
Promotor
Transgén An
ITR
LoxP
pAdlox
Recombinasa CRE
ITR
Ψ
Promotor
LoxP
Transgén An
Nuevo Adenovirus
ITR
+
LoxP
ITR
ITR
Nuevo Adenovirus
ITR
Promotor
Transgén An
ITR
Figura 5. Recombinación homóloga frente al sistema Cre-LoxP. Esquema representativo de 2 métodos empleados para la construcción de adenovirus recombinantes.
A) El método clásico consiste en la cotransfección de células 293 con dos plásmidos, uno que contiene el genoma del adenovirus tipo 5 con una inserción en la
región E1 que hace que el tamaño de dicho DNA exceda la capacidad empaquetadora de la cápside adenoviral, impidiendo su empaquetamiento y que se puedan
generar partículas virales (pJM17); y otro plásmido que contiene el extremo izquierdo del genoma adenoviral (0-16,1 mu) con una deleción del gen E1 (1.09.8 mu) en el que se puede introducir un cassette de expresión con el gen deseado (p∆E1Sp1A). La recombinación homóloga entre las regiones adenovirales de
ambos plásmidos da lugar a un genoma de adenovirus defectivo en E1 que contiene el cassette de expresión con el gen de interés en su lugar. Dado que la línea
293 tiene integrada la región E1 del genoma de adenovirus en su propio genoma y expresa los genes contenidos en dicha región, ésta complementará las funciones
que requieren los adenovirus defectivos en E1. El nuevo genoma formado tras la recombinación de los plásmidos se replicará y encapsidará en las células 293
dando lugar a nuevas partículas adenovirales recombinantes defectivas en E1 y con capacidad para expresar el transgén elegido.
B) Método basado en la recombinasa Cre. La recombinasa Cre cataliza la escisión de la secuencia de empaquetación (ψ) del Ψ5 a nivel de los sitios LoxP; a
continuación, la recombinasa Cre dirige la recombinación entre el sitio LoxP que queda en el genoma de Ψ5∆ψ y el sitio LoxP del plásmido pAdLox, previamente
linearizado, que contiene el extremo izquierdo del genoma de Ad5 con el ITR, la secuencia de encapsidación del Ad5 con el gen de interés situado a continuación
del promotor CMV y un sitio LoxP. Una vez introducido el DNA viral en la célula, la recombinasa Cre es capaz de escindir la secuencia de encapsidación del
DNA viral (Ψ5) flanqueada por dos secuencias LoxP y dirigir la recombinación entre el sitio LoxP remanente y la región LoxP del plásmido «shuttle». Como
resultado de este proceso el DNA adenoviral (Ψ5/∆Ψ) no podrá encapsidarse a no ser que se haya recombinado con el plásmido pAdLox generando un adenovirus
recombinante defectivo que contendría el transgén de interés con capacidad para replicarse y encapsidarse. Este proceso requiere entre 7 y 10 días (109). La
eficiencia de la recombinasa Cre no es del 100% por lo que será necesario realizar una serie de pasos sucesivos de amplificación (infección) en células CRE+ para
eliminar la contaminación por virus Ψ5 residual; además es muy recomendable la purificación de una sola partícula adenoviral recombinante infectiva a partir
de la cual producir a gran escala el nuevo adenovirus.
los adenovirus gutless, los adenovirus de primera generación
se pueden autorreplicar en células empaquetadoras. Por
esta razón, la producción de altas cantidades del vector no
supone un problema y su escalabilidad es relativamente
sencilla. El mayor inconveniente que nos encontramos
cuando queremos escalar la producción de adenovirus, para
su utilización en ensayos in vivo o en protocolos clínicos, es
la generación de adenovirus con capacidad replicativa
(RCAs)(79). Los RCAs se forman por recombinación entre el
genoma adenoviral recombinante y las secuencias adenovirales
homólogas presentes en el genoma de la célula empaquetadora.
La recombinación entre dichas regiones puede dar lugar a
adenovirus recombinantes con capacidad replicativa por
adquisición de la región E1 presente en la célula
empaquetadora. La probabilidad de que se produzca este
fenómeno es pequeña pero se incrementa con el número de
pases. Para solucionar este inconveniente se han generado
nuevas líneas de células empaquetadoras (como las células
PER.C6(100)) y nuevos genomas adenovirales que no comparten
secuencias homólogas solapantes. Es muy conveniente
controlar la presencia de RCAs para evitar la toxicidad de
los mismos y la interpretación errónea de los resultados
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VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER
obtenidos. Actualmente, el límite de RCAs en lotes adenovirales
para ensayos clínicos se sitúa en 1 RCA por 108 partículas
físicas (pp) según el Recombinant DNA Advisory Comittee
(RAC).
Toxicidad de los vectores adenovirales
Desde un punto de vista teórico, los vectores adenovirales
pueden resultar tóxicos por cuatro razones: 1) Porque
contengan cantidades apreciables de adenovirus con capacidad
replicativa, generados durante la producción por recombinación
entre secuencias del vector y secuencias homólogas de las
células permisivas(100); 2) Porque contengan cantidades
apreciables de proteínas virales no eliminadas durante el
proceso de purificación; 3) Por la respuesta inmunológica
innata(67) y específica(101) generada contra antígenos virales
o contra el transgén(102), que puede generar un síndrome de
hipercitoquinemia comparable al shock endotóxico; 4) Por
la acción del producto de la expresión del transgén o de
proteínas virales(103).
En roedores, la administración sistémica de un adenovirus
portador del gen de la α-1-antitripsina humana(104) produjo
dos efectos apreciables: trombocitopenia transitoria,
dependiente de dosis, de aparición precoz; y una lesión
hepática, dependiente de dosis, de aparición inmediata (24
horas) y progresión persistente, caracterizada por
hipertransaminasemia severa y consistente en degeneración
hepatocitaria, necrosis focal e inflamación portal y lobulillar.
La dosis letal mínima fue de 9·1013 partículas/kg. Otros
estudios (Wivel N et al, datos no publicados) han confirmado
que la administración sistémica de un vector no terapéutico
(AdLacZ) produce en roedores y primates toxicidad
dependiente de dosis. En este caso, y también en ratones,
la dosis máxima tolerada fue superior a 5·1011 pfu/kg y la
dosis sin efecto observable fue de 5·10 9 pfu/kg,
circunscribiéndose la toxicidad a hepatitis transitoria. En
primates Macaca mulata, la dosis mínima letal fue de 5·1011
pfu/kg y la dosis sin efecto observable fue de 2.5·109 pfu/kg,
circunscribiéndose la toxicidad a hepatitis transitoria.
La posibilidad de transferir involuntariamente el transgén
a células germinales de forma estable ha sido estudiada
recientemente, habiéndose demostrado la presencia universal
y transitoria del vector en las gónadas y la ausencia de
transmisión a la progenie(105).
Ensayos en fase I del tratamiento de tumores de cabeza
y cuello y carcinoma de pulmón no microcítico mediante
la administración intratumoral de un vector adenoviral con
el gen del p53 han mostrado datos farmacocinéticos y
toxicológicos importantes(106), como son: 1) que el vector no
es detectable en la sangre más allá de las 24 horas y en el
esputo más allá de los 7 días de la administración (y esto
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teniendo en cuenta que la administración intratumoral
permite, en este caso, el paso directo del vector al tracto
respiratorio); 2) que no se detectaron adenovirus con capacidad
replicativa en ningún tejido; 3) que no se observó toxicidad
limitante de dosis, aunque la fiebre y los fenómenos locales
de inflamación en el lugar de la punción fueron frecuentes;
y 4) que la expresión del gen persiste en sucesivas
administraciones a pesar del desarrollo de anticuerpos desde
la primera hora del tratamiento.
En otro ensayo en fase I del tratamiento de carcinoma
de pulmón no microcítico mediante la administración
intratumoral de un vector adenoviral con el gen del p53(107),
los efectos secundarios observados fueron fiebre levemoderada (9/15), síndrome gripal (1/15), artralgias (1/15),
disnea (1/15), hipertensión (1/15) y taquicardia (1/15). La
excreción del vector por esputo, orina, heces e hisopado
rectal fue estudiada a diario y sólo en un paciente se demostró
la presencia del virus defectivo en el esputo el 2º día después
del tratamiento. Todos los pacientes tenían anticuerpos antiadenovirus antes del tratamiento, cuyos títulos aumentaron
significativamente tras él, y que no impidieron la transferencia
eficaz del vector por vía intratumoral.
En un ensayo de fase I, desarrollado en la Universidad
de Pennsylvania, para el tratamiento de pacientes con déficit
de ornitin-transcarbamilasa (OTC) mediante la inyección
intra-arterial de un adenovirus de segunda generación capaz
de expresar OTC se registró el fallecimiento de un paciente
asintomático y para quien no se esperaba un efecto terapéutico
neto (108). Dicho acontecimiento letal se produjo como
consecuencia de un síndrome de fracaso multiorgánico
debido a la hiperproducción a la circulación sistémica de
múltiples citoquinas (fundamentalmente IL-6)(109). Este
lamentable caso, en el que se habían contravenido las reglas
impuestas por las autoridades regulatorias (FDA y RAC),
ha permitido intensificar la regulación y estudiar mejor
preclínicamente el uso de vectores adenovirales, que por
otras vías y dosis han demostrado un perfil de seguridad
envidiable en humanos(110).
VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA
GENERACIÓN EN INMUNOTERAPIA DEL CÁNCER
La aplicación de adenovirus para el tratamiento del
cáncer se remonta al año 1956, cuando un adenovirus salvaje
fue utilizado como terapia contra el cáncer de cervix(111). En
los últimos años, el uso de los adenovirus ha centrado la
atención en la terapia génica del cáncer debido a su gran
capacidad para clonar genes en su interior, por su facilidad
en el manejo y producción, y por su poder infectivo e
inmunogenicidad. Sin embargo conviene recordar que estos
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I. NARVAIZA ET AL.
INMUNOLOGÍA
Terapia génica ex vivo
{
Terapia génica in vivo
Antígenos tumorales
Antígenos tumorales
Citocinas
Citocinas
Moléculas de coestímulo
Quimiocinas
Moléculas de coestímulo
{
Figura 6. Empleo de los vectores adenovirales en inmunoterapia génica del
cáncer. Aproximaciones de inmunoterapia génica del cáncer ex vivo e in vivo
empleando vectores adenovirales de primera generación.
vectores no son eficientes cuando se necesita reintroducirlos
en el organismo, debido al desarrollo de respuesta inmunitaria
humoral (anticuerpos neutralizantes) y celular que dificultan,
al menos parcialmente, su administración repetida(65, 112, 113).
La inmunoterapia tiene como objetivo disparar y potenciar
los mecanismos inmunológicos que desencadenen una
respuesta efectora eficaz contra las células tumorales. La
inmunoterapia se basa en los mecanismos y condiciones de
presentación de antígenos tumorales para que estos sean
realmente inmunogénicos, y en la optimización de las
condiciones para que se de una activación eficaz de la
respuesta antitumoral.
Existen tres aproximaciones metodológicas distintas
para abordar la inmunoterapia del cáncer mediante
transferencia génica y que recurren al uso de los adenovirus
de primera generación (Fig 6). I) Introducción de proteínas
potencialmente inmunogénicas de origen tumoral por
procedimientos de vacunación génica. En este sentido se ha
demostrado que la administración de adenovirus capaces
de expresar antígenos asociados a tumores (AAT)(114, 115)
de melanoma como gp100, MART-1 ó gp75 induce la
generación de CTLs específicos frente a dichos antígenos(116,
117). II) Una segunda aproximación consiste en la manipulación
ex vivo de las células presentadoras de antígeno profesionales
(APCs) de forma que expresen péptidos antigénicos, moléculas
de coestímulo o citocinas para que sus propiedades
presentadora e inmunoestimuladora sean más efectivas(118).
La infección de células dendríticas con adenovirus no alterara
sus propiedades inmunoactivadoras(119, 120), y la modificación
de DCs con adenovirus que expresan AAT como MART-1
ha demostrado ser efectiva para generar CTLs específicos
frente a dicho antígeno(121). También se ha demostrado
que la modificación de DCs con un adenovirus que expresa
la interleucina-12 (IL-12) aumenta la eficacia antitumoral
de la administración de DCs en el tratamiento de distintos
modelos de adenocarcinoma de colon en ratones Balb/c y
C57BL/6(13, 122, 123). III) La tercera estrategia que se sirve de
los adenovirus es la modificación de las células tumorales
mediante transferencia de genes de citocinas, quimiocinas
o moléculas de coestímulo con la finalidad de crear las
condiciones óptimas para una respuesta inmunitaria efectiva(124,
125). Esta aproximación puede realizarse tanto de forma ex
vivo como in vivo(126).
Las citocinas han demostrado su eficacia antitumoral
tanto mediante su administración en forma de proteína
recombinante, como empleando distintos métodos de
transferencia génica en diversos modelos de tumores
experimentales: IL-2(127), IL-4 (128), IL-6(129), IL-7(130), IL-12(131,
132) , IFN-γ (133) , TNF-α (134) o GM-CSF (135) . Sin embargo, la
administración sistémica de citocinas recombinantes como
la IL-2 o la IL-12 ha sido descartada por los efectos tóxicos
observados en distintos ensayos clínicos(136-138). En estos
casos, la terapia génica in vivo, y más concretamente con
adenovirus, se presenta como una forma eficaz y segura de
localizar en el microambiente tumoral la producción de altas
cantidades de la citocina deseada potenciando la respuesta
inmune y reduciendo los riesgos de toxicidad. La
administración del vector puede realizarse de forma sistémica
o de forma local, pero dado que los vectores disponibles
actualmente no permiten la transducción selectiva y específica
de las células tumorales, la administración sistémica supone
la transducción de tejidos y tipos celulares no deseados que
conllevan a la toxicidad(139). Por lo tanto, la forma más segura
y eficaz de transferencia de genes de citocinas es la
administración intratumoral directa en la masa tumoral.
La interleucina 2 (IL-2) es una potente citocina con
importantes propiedades inmunoestimuladoras, como lo
refleja su capacidad para incrementar la actividad de los
CTLs(127), células NK/LAK y TILs(140, 141). Aunque la aplicación
sistémica de IL-2 ha inducido inmunidad antitumoral en
muchos modelos animales, los efectos tóxicos que produce
su aplicación en altas concentraciones limitan claramente
su aplicación en la clínica(136). Para evitar los efectos tóxicos,
se han diseñado estrategias de tratamiento que permiten
generar elevadas concentraciones de la citocina localmente
en el tumor(133, 142, 143). En este sentido, Addison y col., describen
el empleo de un adenovirus que expresa el gen de la IL-2
para el tratamiento de animales transgénicos portadores de
adenocarcinoma mamario. En este trabajo concluyen que
el tratamiento aplicado era capaz de inducir remisiones
tumorales y de desarrollar memoria inmunológica(144).
Posteriormente, el mismo grupo de investigadores,
empleando un modelo tumoral idéntico, aplicaron un vector
adenoviral que expresaba el gen del TNF-α mutado,
observando en algunos casos remisiones tumorales parciales,
y en otros, respuestas completas, eliminando con el uso
de este vector los efectos tóxicos que induce el adenovirus
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VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER
que expresa la forma wild type del TNF-α(145). También se ha
comunicado el empleo de combinaciones de citocinas con
genes suicidas para el tratamiento de las metástasis hepáticas
del CC, es el caso del grupo de Woo y col., que mediante
inyección simultánea de adenovirus que expresan el gen de
la HSV-tk con el gen de la IL-2(146), o la combinación de los
dos anteriores con el gen del Factor Estimulante del Crecimiento
de Granulocitos y Macrófagos (GM-CSF) (147). Estos
investigadores obtienen en estos experimentos remisiones
tumorales parciales, escaso incremento en la supervivencia
en algunos de los animales tratados y un elevado índice de
recurrencias posteriores. No observaron efecto terapéutico
destacable con el uso por separado de los vectores mencionados.
Otra de las estrategias consiste en el empleo de moléculas
coestimuladoras con el fin de alcanzar una activación efectiva
de los linfocitos T. En un sistema murino de melanoma, la
introducción de la molécula de B7-1 (CD80)(148) en tumores,
fue capaz de incrementar la inmunidad antitumoral y
erradicar tumores(149). Dessureault y col., diseñaron un vector
adenoviral para infectar células humanas de una línea
tumoral con B7-1, observando que posteriormente las células
expresaban la molécula en su superficie (150). Graham y
col., desarrollaron un adenovirus que expresa de manera
simultánea los genes de la IL-12 y de B7-1 para tratar mediante
inyección i.t. directa el adenocarcinoma de mama. Observaron
la regresión tumoral completa en el 70% de los tumores
tratados, efecto que fue claramente superior al alcanzado
tras la aplicación de cada uno de los genes por separado(151).
Más tarde, el grupo de Gauldie y cols., comunicaron el
empleo de un vector adenoviral que expresaba los genes
B7-1/B7-2 murino y de la IL-2 humana para el tratamiento
del cáncer mamario(152). En estos experimentos se obtuvo
un 100% de remisiones tumorales completas, aunque esta
respuesta se asoció al desarrollo de fenómenos tóxicos. El
adenovirus que expresa el gen B-7.1 también ha sido aplicado
experimentalmente por otro grupo de investigadores para
incrementar la inmunogenicidad de células de adenocarcinoma
de ovario y cervix humanos(153). El ligando del CD40 (CD40L), expresado principalmente en APCs, es esencial para la
iniciación de la respuesta específica de las células T. Distintos
grupos han recurrido a un vector adenoviral que expresa
CD40-L para tratar tumores experimentales de diversa estirpe
en roedores, entre ellos B16, CT26 y MCH-7777, observando
la regresión de un 60% de los mismos(154, 155).
Otras de las citocinas con potentes efectos
inmunoestimuladores que ha sido utilizada para el tratamiento
del cáncer usando vectores adenovirales es la IL-12(122, 156).
De manera similar a la rIL-2, la rIL-12 también es capaz de
producir efectos tóxicos relacionados con la dosis y con la
vía de administración (137). La IL-12 (157, 158) es producida
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principalmente por células fagocitarias y APCs (159, 160)
en respuesta a distintos estímulos por diversos mecanismos:
a) independientes de células T(159), y b) dependientes de
células T(161, 162). La IL-12 favorece la generación de respuestas
Th1(163), aumenta la generación y actividad de linfocitos T
citotóxicos, la actividad citolítica de las células NK y activa
las células NKT(159, 163).
La transferencia del gen de la IL-12 mediante adenovirus
ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de distintos
modelos tumorales(144, 164-171). Mazzolini et al. demostraron
que la transferencia génica de IL-12 mediante adenovirus
(AdIL-12) en un modelo de tumores subcutáneos e
intrahepáticos de células de adenocarcinoma de colon CT26
en ratones Balb/c tiene un potente efecto antitumoral(7). La
administración intratumoral (i.t.) de AdIL-12 indujo el
rechazo completo de los tumores en el 70% de los ratones
así tratados. El mecanismo de acción incluye una respuesta
antitumoral totalmente dependiente de células CD8+. La
inyección i.t. de AdIL-12 no sólo permitió la erradicación
de los nódulos tumorales tratados, sino también la eliminación
de tumores distantes no tratados y la protección a largo
plazo frente a nuevas reinoculaciones de células CT 26. El
tratamiento i.t. con AdIL-12 induce una potente activación
y generación de CTLs específicos de células CT26, lo cual
ha permitido obtener cultivos de linfocitos antitumorales
(LAT) con actividad citolítica específica frente a células CT26
para su empleo en terapia celular adoptiva. La transferencia
adoptiva de dichos LAT ha demostrado una escasa eficacia
antitumoral frente a tumores establecidos ya desarrollados.
Sin embargo, la administración i.t. de AdIL-12 en un nódulo
subcutáneo junto con la transferencia adoptiva de LAT
vía sistémica demostró una potente sinergia en la actividad
antitumoral frente a tumores intrahepáticos no tratados(172).
Posteriormente, se demostró que la transferencia génica de
IL-12 induce cambios en el endotelio tumoral, especialmente
el aumento de la expresión de VCAM-1 que favorece la
eficacia de la terapia adoptiva con LAT. Barajas y cols.
demostraron que la respuesta antitumoral generada por
el tratamiento con AdIL-12 en un modelo de hepatocarcinoma
en ratas Búfalo es dependiente de células NK(170). Pese a que
la terapia génica con adenovirus que expresan IL-12 reduce
la toxicidad del tratamiento antitumoral con IL-12 recombinante,
se siguen observando efectos tóxicos asociados a la
hiperproducción de IFN-γ por altas dosis de AdIL-12(173).
Otro de los mecanismos fundamentales responsables de
la actividad antitumoral de la IL-12 es la inhibición de la
neovascularización tumoral(170, 174). Este efecto angiostático
no es efecto directo de la IL-12 sino que es debido,
fundamentalmente, a la quimiocina IP-10. La IP-10 es una
quimiocina α que se secreta en respuesta a IFN-γ con efectos
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INMUNOLOGÍA
angiostáticos, y su neutralización reduce significativamente
el efecto antitumoral de la IL-12(170, 175-179). Estos resultados
han llevado al inicio de un ensayo clínico de fase I para
evaluar la toxicidad de la transferencia génica de la IL-12
humana mediante adenovirus de primera generación
para el tratamiento de tumores hepáticos y gastrointestinales
(Mazzolini et al., manuscrito en preparación).
También se ha analizado la eficacia antitumoral de la
transferencia génica de distintos genes de quimiocinas pero,
a pesar de inducir un infiltrado leucocitario en el tejido
maligno, su eficacia ha resultado escasa en la mayoría de
los casos(180-183). Sin embargo, la transferencia de genes de
quimiocinas combinada con la transferencia génica de genes
de citocinas o genes de moléculas de coestímulo que favorecen
la activación linfocitaria, de acuerdo con la teoría de la
activación–atracción(183, 184), ha dado buenos resultados en
el tratamiento de distintos modelos experimentales de
cáncer(180, 182, 183, 185).
CONCLUSIONES
Pese a que no son perfectos y todavía se requiere su
optimización, los adenovirus de primera generación son, y
probablemente seguirán siendo, una herramienta muy útil
para la transferencia de genes. En particular, son el vector
viral por excelencia en aproximaciones de terapia génica del
cáncer que requieren altos niveles de expresión del transgén
deseado, no necesitan la expresión prolongada del mismo
y la respuesta inmune que inducen no es un inconveniente
o incluso puede suponer una ventaja. Éste es el caso de la
vacunación génica o la inmunoterapia del cáncer.
CORRESPONDENCIA:
Ignacio Melero Bermejo
División de Hepatología y Terapia génica,
CIMA-Universidad de Navarra
C/Irunlarrea s/n.
31008 Pamplona (Navarra) España
Tel: +34 948425668 Fax: +34 948425700
E-mail: [email protected]
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