Diapositiva 1 - Sistema educativo virtual UNLP

ESPECTROSCOPÍA DE
FLUORESCENCIA
MOLECULAR
Introducción
Principios teóricos
Instrumentación
Aplicaciones
Introducción: Fenómenos luminiscentes
moleculares
emisión de radiación por
parte de determinadas sustancias que se
encuentran en un
estado electrónico excitado
 Fotoluminiscencia
 Quimioluminiscencia
 Bioluminiscencia
 Termoluminiscencia
 Radioluminiscencia
 Triboluminiscencia
Emisi
ón de
prE
exEmisión
citado Ede
o procedente
•Fluo
s por cedente de
rescende E procedente
radia
nivele
moléculas,
una
Emisión
ción de
cia: Aproducto
UV-V s
b
s
o
r
is
c
reacción
química
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de
•Fosfo
1
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olé cióncitadas
mol m
medfirainctde
alta
partículas e cal
orenergía
Fotoluminiscencia
Se divide en dos categorías:
fluorescencia y fosforescencia dependiendo
de la naturaleza del estado excitado.
Emisión
luminiscente
ESPÍN DEL ELECTRÓN:
SINGLETES Y TRIPLETES
Moléculas en estado
fundamental
OM con 2 e- espines opuestos
e- en nivel
energético
superior con
espines opuestos
SINGLETE
h
SINGLETE
e- en nivel
energético
superior con
espines paralelos
TRIPLETE
Fluorescencia y fosforescencia
Transición PERMITIDA
FLUORESCENCIA
Estado excitado SINGLETE
Rápido retorno al
estado fundamental
Transición PROHIBIDA
Tiempo de vida 10 ns
FOSFORESCENCIA
Estado excitado TRIPLETE
Velocidad de
emisión lenta
Tiempo de vida ms a s
Diagrama de Jablonski
Diagrama típico de los niveles energéticos para una molécula
luminiscente
Excitación
Tiempo requerido
para el proceso de
absorción del
fotón: 10-15 – 10-14 s
Molécula  h  Molécula 
Relajación vibracional y Conversión
interna y externa
Conversión interna:
Relajación vibracional:
Pérdida de E vibracional
excesiva en forma de choques
entre la especie excitada y
otras (ΔT mínimo)
Muy rápido (10-10 – 10-13 s)
Ocurre siempre.
Todos los procesos pueden
considerarse originados desde
el nivel vibracional más bajo
de un estado electrónico
excitado
La emisión fluorescente se
produce a >  excitación
Nivel vibracional inferior de un estado electrónico excitado
Nivel vibracional superior de un estado electrónico de E inferior
(Sin emisión de radiación)
Conversión interna
Espectros de excitación y
emisión de quinina
Fluorescencia
Nivel vibracional
inferior SINGLETE  Estado fundamental  h
excitado
Proceso inverso a la absorción
Relación inversa entre  y
tiempo de vida del estado
excitado
= 103 -105
tiempo de vida de S* = 10-7 -10-9 s
 < 103
tiempo de vida de S* = 10-5 -10-4 s
Cruce entre sistemas
Nivel vibracional inferior de
singlete excitado
Nivel vibracional superior
de un triplete
(Sin emisión de radiación)
(Seguido de relajación
vibracional)
Cruce entre sistemas
Cambio en el spin del eVelocidad < C.I.
Espectros de excitación y emisión
Espectros de excitación y emisión
Espectro de
excitación
Espectro de emisión
Variación de IF al variar la
exc. a una em = cte
Eficacia de las diferentes exc. para
producir fluorescencia
Variación de IF al variar la em a
una exc = cte
Intensidad de la radiación
emitida a diferentes 
Factores que afectan a la fluorescencia
 Del compuesto:
Rendimiento cuántico
Estructura molecular
 Del entorno químico:
Disolvente
Temperatura
pH
Presencia de O2
Rendimiento cuántico (0 < F < 1)
No. fotones emitidos como fluorescencia
F 
No. fotones absorbidos
Función de la velocidad del proceso de desactivación por
emisión/velocidad de otros procesos de desactivación
KF
F 
K F  K CI  K CS  ...
Estructura molecular
Estructura molecular: Transiciones
electrónicas
* anti-enlazante
Energía
n
n
*
 *
* antienlazante
*

 *
 *
*
n no-enlazante
-enlazante
-enlazante
➝ * mayor rendimiento cuántico > fluorescencia
Tiempos de vida media
más cortos (mayor KF)
Menor probabilidad de cruce
entre sistemas (menor KIC)
Estructura molecular: Aromaticidad
No presentan fluorescencia
Presentan fluorescencia
Estructura molecular: Aromaticidad
Estructura molecular: Sustituciones en
el anillo aromático
INFLUYE SOBRE
carácter aceptor de e-
Longitud de onda de excitación (exc)
Longitud de onda de emisión (em)
Rendimiento cuántico de fluorescencia (ΦF)
carácter donor de e-
Estructura molecular
Rigidez
estructural
Reduce el grado de interacción con el
medio
Aumenta F en quelatos
Factores que afectan a la fluorescencia:
Entorno químico
 Efecto del solvente
Viscosidad y polaridad
 Efecto de la temperatura
Variación de la viscosidad y el número de colisiones
 Efecto del pH
Longitud de onda e intensidad diferenciada para la forma ácida y
básica
 Presencia de oxígeno disuelto
Amortiguación de la señal fluorescente
Efecto del solvente
 En general, un aumento de la viscosidad, aumenta F
 Aumento de la polaridad,
Transiciones ➝*
Desplazamiento de
(máx)em hacia el rojo
Transiciones n ➝*
Desplazamiento de
(máx)em hacia el azul
 Efecto del átomo pesado
F disminuye
Solventes con átomos pesados
Favorecen tripletes
Solutos con átomos pesados
Efecto del solvente
Fotografía y espectros de
fluorescencia del 4dimetilamino-4'nitroestilbeno
(DNS) en solventes de
polaridad creciente.
H, hexano; CH, ciclohexano;
T, tolueno; EA, acetato de
etilo; Bu, n-butanol.
Temperatura
Aumento de temperatura
Disminuye F
Colisiones entre moléculas
Procesos de
desactivación no
radiativos
Efecto del pH
 Afecta a F y a (máx)em de compuestos con sustituyentes ácidos o
básicos
 El pH del medio afecta la carga y las formas resonantes del fluoróforo
Oxígeno disuelto
Oxidación del fluoróforo
Disminuye F
Carácter paramagnético del O2
Cruce entre sistemas
Análisis Cuantitativo: Efecto de la
concentración
Relación entre IF y
concentración
Base de las aplicaciones
analíticas
I F  K F  I 0  I 
I0 = intensidad incidente
I = intensidad transmitida
K = cte. de proporcionalidad (depende del instrumento)
F = rendimiento cuántico de fluorescencia
ec. 1
Análisis Cuantitativo: Efecto de la
concentración
De acuerdo a la ley de Beer:
Reemplazando en la ec. 1:
I  I 0 10  bc
I F  K F I 0 ( 1  10  bc )
Desarrollando en serie:
n
 bc ( bc )2
n ( bc ) 
I F  K F I 0 2.3bc 1 

 ...  ( 1 )

2
!
3
!
(
n

1
)!


A bajas concentraciones bc < 1 y es posible despreciar todos los términos
frente a 1:
I F  K F I 0 2.3bc
Análisis Cuantitativo: Efecto de la
concentración
Análisis Cuantitativo: Efecto de la
concentración
Instrumentación
Instrumentación
Fuente de energía: lámpara de Xe
Monocromadores de red de difracción
Detectores: tubos fotomultiplicadores
Cubetas de cuarzo con las 4 caras
transparentes a la radiación
Aplicaciones de la fluorescencia
Análisis cualitativo y estructural
Campo de aplicación
Análisis cuantitativo
Auxiliar en otras técnicas
Métodos analíticos
Fluorescencia directa
Analito fluorescente
Fluorescencia indirecta
Analito no fluorescente
Análisis cualitativo y estructural
 Identificación de sustancias con espectros de emisión muy
característicos
Hidrocarburos aromáticos y compuestos heterocíclicos
 Identificación de iones inorgánicos
Con fluorescencia nativa (sales de uranio y tierras raras)
No fluorescentes por formación de quelatos fluorescentes
Análisis cuantitativo
Muy útil en la determinación de trazas de iones inorgánicos y compuestos
orgánicos
Límite de detección: ppb
Determinación de iones inorgánicos
 Formación de quelatos
luminiscentes con reactivos orgánicos
no luminiscentes
 Formación de complejos
luminiscentes con reactivos
inorgánicos (HCl, HBr)
 Fluorescencia del propio ión
(tierras raras, U(VI))
Determinación de compuestos
orgánicos y biológicos
 Por fluorescencia directa (PAH´s,
hormonas, etc.)
 Por fluorescencia inducida por
reacción química (N-metilcarbamato)
Auxiliar en otras técnicas
 Indicadores fluorescentes en volumetrías
 Detección fluorescente en cromatografía
Bibliografía
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BÁSICA
“Principios de Análisis Instrumental”, D. Skoog, F.
Holler, T. Nieman.
“Fundamentos de Química Analítica”, D. Skoog, D.
West, F. Holler, S. Crouch.
AVANZADA
“Photoluminiscence of solutions”, C. Parker.
“Principles of fluorescence spectroscopy”, J.
Lakowicz