Clase_regulacion_expresion_genica_2009

Genomas, contenido de genes.
REGULACION DE LA EXPRESION GENICA
-Donde, cual, cuanto, cuando, se expresa la información génica?
-Elementos cis- y transregulatorios
-Operon lac Jacob Monod,
- regulación positiva y negativa, represión por catabolito
-Regulación en eucariotas
- elementos cis, función de un enhancer
- elementos trans, factores de transcripción, cofactores
-Características de hetero- y eucromatina,
-regulación por modificaciones epigeneticas
-Métodos de análisis funcional de secuencias regulatorias
- in silico, in vitro, in vivo , gen reportero
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promotor
codificante
3
tra ’-nodu
cid
a
5
tra ’-nodu
cid
a
ESTRUCTURA de un GEN
intergenico
DNA
la
de
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n
RNA
proteina
Análisis in silico para la predicción de
secuencias cis-regulatorias
Secuencias de consenso en la región promotora predice
sitios de unión de factores de transcripción
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En procariotas:
En procariotas el factor sigma determina
cual, donde y cuando se transcribe un gen
Lodish, 10.1
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REGULACION
-Estudiado en procariotas en el operon lactosa
-modelo: OPERON, Francoise Jacob y Jaques Monod 1961
-Mutantes constitutivos y mutantes no-inducibles
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EXPRESION en PROCARIOTAS
- transcripción y traducción espacial y temporalmente acoplada
- mensajeros policistronicos
- la síntesis de varios proteínas está bajo control de un promotor
PROMOTOR
+1
gen 1
gen 2
gen 3
5’
3’
un mRNA
policistrónico
Varias proteínas
Proteína 1
Proteína 2
Proteína 3
REGULACION NEGATIVA
El gen está en
OFF por un
represor unido
al operador y
se activa por
sacar el
represor
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REGULACION POSITIVA
El gen está en
OFF y se activa
por que se une
un activador
E. coli sintetiza tres proteínas para utilizar
lactosa como fuente de energía
entra lactosa a la célula bacteriana
lactosa permeasa
 galactosidasa:
Una pequeña parte de lactosa se
transforma en alolactosa
(el inductor que saca el inhibidor
del operador)
-galactosidasa
galactosa
glucosa
alolactosa
La -galactosidasa cataliza la
digestión a galactosa y glucosa
acetilasa no se sabe bien su rol
Regulación por elementos cis (secuencias) y
elementos trans (proteínas regulatorias)
OPERON lactosa
gen
represor/inductor
I
genes estructurales
PROMOTOR
P
operador
O
lacZ
lacY
lacA
-galactosidasa permeasa acetilasa
3072bp
1251bp
609pb
represor
1040bp
CAP
CAP: catabolite activating protein
Repressor
RNA Pol
La secuencia cis-regulatoria del lac-operon
Alberts, 7-38
+1
tss
Jacob y Monod (1962) estudiaron mutantes que constitutivamente utilizan
lactosa y revelaron la regulación del operon de la lactosa en E. coli.
La lactosa saca el represor del operador y solamente
cuando no hay glucosa se transcribe el operon-lac
Z
I
P
Y
A
O
represor/inhibidor
alolactosa
1.) cuando no hay lactosa, la célula no transcribe los genes del operon-lac, el represor está
unido al operador, que inhibe la unión de la RNA polimerasa al promotor
2.) cuando hay lactosa, la lactosa (alolactosa) se une al represor y el represor ya no está en
el operador
3.) cuando hay glucosa y lactosa, la célula prefiere usar glucosa  la presencia de glucosa
reprime la degradación de la lactosa = represión por catabolito
4.) cuando no hay glucosa aumenta la concentración del cAMP, el cAMP se une a una
proteína (CAP) y estimula la unión de la RNA Pol al promotor  transcripción del operon-lac
Estructura de un gen Eucariotico
GEN EUCARIOTICO
tss: transcription start site
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mRNA maduro
POSIBLES PUNTOS DE CONTROL DE LA
EXPRESIÓN GÉNICA
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Inicio de Transcripción
TRANSCRIPCION POL II en EUCARIOTAS
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secuencias cis-regulatorios en promotor eucariota
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FUNCION DE UN ENHANCER
Secuencia enhancer puede ubicarse río arriba (5’) o rio abajo (3) o detro del gen para modular la expresión
FACTORES DE TRANSCRIPCION
Elementos trans-regulatorios
Proteínas regulatorias: diseño modular
región transactivadora
+
región unión al DNA
Ej:
- homeobox
- leucin zipper
- dedos de zinc
TIPOS DE MOTIVOS DE UNION AL DNA
Ej.: el motivo helice-vuelta-helice se
encuentra en el dominio homeobox,
el dominio de unión al DNA
Secuencias especificas pueden ser reconocidas
sin que se abren las hebras complementarias, de
afuera en el surco mayor y menor
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El dominio homeo de 60 aá está codificado en el
homeo-box de 180 bp
el homeodominio, que contienen el motivo helice-vuelta-helice, se compone de 60aa
codificado por 180bp “homeo-box”, altamente conservada, presente en multiples proteinas
regulatorios como los factores de transcripcion con homeo-box, ej. genes hox en eucariotas,
que determinan eje anterior-posterior
Wolberger et al., Cell 67:517 528, 1991
Otro tipo de motivo de unión al DNA:
DEDOS DE ZINC zinc-finger
Ej.: fragmento del receptor de glucocorticoide
Células detectan y responden a nivel transcripcional a hormonas glucocorticoides
que están producidos por la glándula adrenal en respuesta al estrés
Luisi et al., Nature 352:497 505, 1991
INTERACCION PROTEINA-PROTEINA
proteínas regulatorias que no
se unen directamente DNA se
llaman co-activador o co-represor
esta proteína participa en complejos
activadoras y represoras
Transcripción y procesamiento
Edición del RNA: Editing
EPIGENETICA
PATRON HEREDABLE DE LA ACTIVIDAD DE GENES QUE NO IMPLICA
CAMBIOS A NIVEL DE NUCLEOTIDOS, SI NO MEDIANTE EL ESTADO
DE ORGANIZACION DEL DNA (ESTRUCTURA DE LA CROMATINA)
-Modificación química del DNA (metilación)
-Modificación química de las proteínas histonas
(acetilación, metilación, fosforilación, poliadenilación)
- Unión de otras proteínas al DNA
 Regulación del aceso a ser transcrito
! Efecto ambiental !
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IMPORTANCIA DE LA METILACION DEL DNA
-en mamíferos en dinucleotidos CpG
-involucrado en funciones importantes como
- impronta
- inactivación de la cromosoma X
- silenciamiento de retrotransposones
- inactivación de genes de tumores
- regulación de la expresión génica en embriones
Heterocromatina  DNA no acesible, no activa
Eucromatina  DNA acesible, activa
Dnmt1 = mantención-MT; Dnmt3a y b = de novo MT
Informacion adicional
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Estudios de todos los transcritos en un momento en un lugar
Transcriptomics
Distintos genes en un tejido en diferentes
momentos
No transcritos
Verde: ++++
Rojo: -
Un gen en distintos
tejido
Estudios de todas las proteínas en un momento en un lugar
Proteomics
En cerebro humano
En hígado humano
Cada punto es una proteína
Separación de proteínas por electroforesis bi-dimensional (1. pI; 2. tamaño)
La actividad de la β-galactosidasa se
visualiza con X-gal
-Región regulatoria 5’ y gen lacZ  -galactosidasa,
inductor in vivo: (allo)lactosa, in vitro: IPTG
-actividad del gen lacZ con sustrato X-Gal produce producto color azul
- -galactosidasa activa  en presencia de
X-Gal, IPTG  AZUL
- -galactosidasa inactiva  en presencia
de X-Gal, IPTG  sin color
unión irreversible al represor
X-gal
Gen reportero GFP en rana transgénica bajo control de un promotor
tejido-expecífico, que dicta la expresión del gen en el ojo
 Expresión in vivo del gen reportero GFP en ojo
GFP
Aequorea victoria
Gen green fluoreszent protein GFP
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GEN REPORTERO
Región regulatoria modula expresión de secuencia codificante gen reportero
-In vitro:
estudio promotor: inducción de la expresión gen reportero (fold-induction)
transfección de constructos en líneas celulares, evaluar expresión gen reportero
ej: - gen lacZ  -galactosidasa  reacción colorimetrico
- gen luciferasa  con sustrato luciferin  reacción colorimetrico
-in vivo: ej: - gen green fluorezcence protein  detección in vivo, cualitativo
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PRINCIPIO DE LA APLICACIÓN DE RNA ANTISENTIDO
oligonucleotidos antisentido específicos se
incorporan a la célula, hibridan con el
mRNA específico y bloquean la síntesis de
la proteína  estudio del efecto al fenotipo
indica la función
INTERACCION PROTEINA/DNA
footprinting
Ej:
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INTERACCION PROTEINA/DNA in vivo
Chromatin immune precipitation ChIP
Cross-link de las células
con formaldehido
lisis de las células
romper cromatina
inmunoprecipitación
revertir el cross-link
eliminar proteínas y
limpiar DNA
amplificar secuencia especifica
La inmunoprecipitacion puede ser ej. con anticuerpo contra histona, histona modificada o factor de transcripción especifico
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INTERACCION PROTEINA/DNA in vitro
EMSA electromobility shift assay
DNA marcado radiactivmente
Extracto nuclear
Fraccionamiento en
geles de poliacrilamida y
retardo del complejo
DNA/proteína
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