CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LAS ENZIMAS GLUCOLÍTICAS

Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y
Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C.
13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca.
CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LAS ENZIMAS GLUCOLÍTICAS DE Ustilago maydis
Ramos Casillas L.E1, Guerra-Sánchez G1, Marín-Hernández A2, Moreno-Sánchez R2,
Saavedra E2.
1
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Prolongación de Carpio y Plan de Ayala, col.
Casco de Santo Tomas. Miguel hidalgo, México D.F.; 2 Instituto Nacional de Cardiología,
Juan Badiano No. 1, col. Sección XVI. Tlalpan, CP 14080, México D.F.
[email protected], [email protected], [email protected]
RESUMEN
Ustilago maydis es un modelo importante para el estudio de la patogenicidad en plantas,
puede ser fácilmente propagado bajo condiciones de laboratorio y se pueden aplicar técnicas
moleculares para su estudio, sin embargo; hasta el momento se ignora las características de
las vías metabólicas clásicas, como lo es la glucólisis. En este trabajo se determinó y
comparó los parámetros cinéticos de las enzimas glucolíticas en levaduras de U. maydis
cultivadas en medio rico y en medio de estrés nutricional, para establecer si el crecimiento
del hongo en las diferentes condiciones nutricionales tiene efecto sobre las propiedades
bioquímicas y/o la actividad de las enzimas de la vía. Cuando la levadura fué cultivada en
medio mínimo, la actividad de las enzimas glucolíticas se vió aumentada al doble con
respecto a la actividad de las enzimas del medio rico. Este incremento podría deberse a la
necesidad del organismo de sintetizar, a partir de intermediarios glucolíticos, precursores
para la síntesis de aminoácidos, nucleótidos y lípidos. Considerando los valores de velocidad
máxima de las enzimas determinadas en ambas condiciones, la regulación de la glucólisis
podría recaer en la HK y en la PFK debido a que presentan los valores más bajos. Se
determinaron las constantes cinéticas Km y Vmax de la HK y la PYK, las cuales son
similares a las resportadas para las enzimas de S. cerevisiae. La aldolasa de este
fitopatógeno es del tipo II, dependientes de metal; por otro lado, la fosfoglicerato mutasa es
independiente del cofactor 2,3BPG, aunque la secuencia de aminoácidos de esta enzima
sugiere que este dependiente. Este trabajo reporta por primera vez la caracterización de las
enzimas glucolíticas en este hongo fitopatógeno.
INTRODUCCIÓN
Ustilago maydis es un hongo basidiomiceto y es el agente causante de la enfermedad
del carbón del maíz, comúnmente conocido como huitlacoche (1). Tiene un ciclo de vida
dimórfico, alternando entre una fase haploide no patógena en forma de levaduras las cuales
se dividen por gemación y una etapa de dicarión patógeno, la cual es iniciada con la fusión
de dos levaduras compatibles. La formación de la etapa dicariótica es acompañada por un
cambio morfológico a crecimiento filamentoso. Mientras que la levadura (esporidia) muestra
crecimiento estrictamente saprófito, la propagación del dicarión filamentoso depende del
hospedero (planta) (2).
Desde hace 15 años, U. maydis ha sido un modelo importante para estudiar los
mecanismos moleculares de la diferenciación y de las vías de señalización que determinan la
patogenicidad del hongo. Desde un punto de vista biotecnológico, U. maydis ofrece la
posibilidad de utilizarlo como productor de metabolitos y enzimas debido a su inocuidad para
el humano. Tiene una fase haploide unicelular con un tiempo de generación rápido de 120
min (1) en medio rico, comparable con el de Saccharomyces cerevisiae (90 min) y
Schizosaccharomyces pombe (120 min). Cuenta con un genoma de ≈ 20 Mb (5) ya
secuenciado que permite aplicar estrategias genómicas para su estudio. Sin embargo; a la
fecha no se han explorado los aspectos metabólicos de este fitopatógeno, en especial, la
regulación a la que están sometidas las enzimas del metabolismo central.
Este hongo, al igual que otros microorganismos, utiliza la vía glucolítica para la
degradación de la glucosa para obtener energía en forma de ATP para el trabajo celular así
como de intermediarios glucolíticos para la síntesis de precursores de aminoácidos y
nucleótidos. Es probable que la glucólisis se vea afectada por las diferentes condiciones
ambientales y nutricionales a las que está expuesto este fitopatógeno, por ejemplo, la
temperatura ambiental y la humedad, la composición química del tallo, hojas y los granos del
maíz donde se desarrolla el hongo. No existe información acerca de las propiedades
bioquímicas de las enzimas glucolíticas de U. maydis, por lo que este trabajo de
investigación profundizará sobre el funcionamiento de una vía tan importante en el
metabolismo energético de este hongo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Condiciones del cultivo
Se empleó la cepa haploide FB2 (a2b2) de U. maydis. Se inocularon en condiciones
de esterilidad 5x10 6 células/ml en 50 ml de medio rico YPD pH 7.0 (glucosa 1%, nitrato de
amonio 0.15 %, peptona de caseína 0.25%, extracto de levadura 2% y 62.5 ml /l de sol.
sales) y medio mínimo pH 7.0 (glucosa 1%, nitrato de potasio 0.15% y 62.5 ml /l de sol.
sales). Se cultivaron a 28 oC por 48 hrs con agitación constante de 90 rpm. Al cabo de este
tiempo las células se lavaron con agua destilada estéril y la pastilla se resuspendió en 2 ml
de solución de rompimiento (50 mM buffer de fosfatos pH 7.0, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 1mM
PMSF y 20% glicerol). Las células se rompieron agitando fuertemente en vortex con perlas
de vidrio por 20 ciclos de 1 minuto con descansos de 1 minuto en hielo. La mezcla se
centrifuga a 10 000 rpm por 30 min a 4oC y el sobrenadante se somete a ultracentrifugación
a 100 000 rpm por una hora a 4oC. Finalmente, el sobrenadante se conserva a -70 oC para
los ensayos enzimáticos.
Determinación de las actividades de las enzimas glucolíticas
Las actividades enzimáticas se determinaron empleando enzimas acoplantes que
permiten medir la formación de NAD(P)H o desaparición de NADH en un espectrofotómetro a
340 nm tal como se ha descrito anteriormente (5). Los ensayos cinéticos se llevaron a cabo
en condiciones de velocidad máxima a 28oC, que es la temperatura a la cual crece el hongo,
en un buffer de reacción que contiene una mezcla de: 50 mM imidazol, 10 mM acetato, 10
mM MES y 10 mM TRIS a pH 6.4. Para el ensayo de la fosfogliceratocinasa (PGK), se
empleó un buffer de fosfato de potasio 50 mM a pH 6.4.
Se utilizaron entre 0.3 - 60 µg de extracto clarificado y las reacciones se iniciaron con
la adición del sustrato específico para cada una de las enzimas. La actividad basal del
extracto en ausencia de sustrato específico fue siempre restado. En todos los experimentos
enzimáticos se ensayaron diferentes concentraciones de extracto para asegurar que la
actividad detectada fuera proporcional a la concentración de extracto utilizado. También se
aseguró que las enzimas acoplantes no fueran limitantes de la reacción.
Se determinaron las constantes de afinidad (Km) de la hexocinasa (HK) para glucosa y
ATP, y para la piruvato cinasa (PYK) por PEP y ADP. Además se determinó el efecto de
inhibidores y activadores sobre la actividad de algunas enzimas de la glucólisis.
RESULTADOS
Velocidades máximas de enzimas glucolíticas en extractos de U. maydis
Los ensayos enzimáticos se realizaron en la fracción soluble de por lo menos tres
extractos clarificados diferentes para cada una de las condiciones de cultivo. Las actividades
enzimáticas promedio para cada enzima en medio rico YPD pH 7.0, medio mínimo pH 7.0,
se muestran en la Tabla 1.
Tabla I. Actividad específica de las enzimas glucolíticas de U. maydis
cultivado en Medio rico YPD y Medio Mínimo pH 7.0
ENZIMA
HK
Actividad específica
(U/mg de proteína)
YPD pH 7.0
MM pH 7.0
0.42
0.94
HPI
Reacción directa
Reacción reversa
0.69
1.14
2.2
2. 2
ATP-PFK
0.05
0.12
ALDO
2+
sin Co
con 0.5 mM Co2+
2+
con 0.5 mM Zn
0
0.67
0.14
0
0.65
0.12
TPI
Reacción directa
Reacción reversa
18
105
58
232
GAPDH
0.51
0.87
PGK
24
37
PGAM
sin 2,3BPG
+ 0.12 mM 2,3BPG
3. 9
3. 4
2. 6
2. 4
ENO
0.12
0.15
PK
sin F1,6BP
+ 0.1 mM F1,6BP
1. 3
1. 1
0.6
0.5
El número entre paréntesis indica el número de extractos individuales
ensayados.
U = µmoles/min.
HK, hexocinasa; HPI, hexosa-6-fosfato isomerasa; ATP-PFK, fosfofructocinasa
dependiente de ATP; ALDO, aldolasa; TPI, triosafosfato isomerasa; GAPDH,
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; PGK, fosfoglicerato cinasa; PGAM,
fosfoglicerato mutasa; ENO, enolasa; PYK, piruvato cinasa; 2,3BPG, 2,3bifosfoglicerato; F1,6BP, fructosa-1,6-bifosfato.
En general, la mayoría de las enzimas del hongo crecido en medio mínimo presentaron el
doble de actividad comparadas con la condición de crecimiento en medio rico YPD. Esto
podría deberse a que la condición de estrés nutricional podría estimular las vías para la
síntesis de compuestos esenciales para el hongo tales como nucleótidos y aminoácidos, que
no están presentes en el medio de cultivo mínimo.
Caracterización cinética de la HK y PYK de U. maydis
Con el objetivo de determinar si existían cambios en la expresión de isoenzimas en las
dos condiciones de crecimiento, se determinaron los valores de las constantes de afinidad
para las enzimas presentes en extractos del hongo crecido en ambas condiciones, los cuales
se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Valores de Km de la HK y la PYK por sus sustratos.
Sustrato
HK
PYK
Glucosa
ATP
PEP
ADP
Medio rico YPD
pH 7.0 (mM)
0.108
0.065
0.124
0.334
Medio Mínimo pH
7.0 (mM)
0.085
0.157
0.161
0.309
Efecto de activadores e inhibidores
Existen principalmente dos tipos de fosfofructocinasas 1) la dependiente de ATP,
presente en la mayoría de los organismos y que se menciona que es una de las enzimas que
controlan el flujo de la vía y 2) la dependiente de pirofosfato (PPi) presente en algunos
microorganismos y que utiliza PPi en lugar de ATP como donador del fosfato para fosforilar a
la fructosa. En el caso de U. maydis, se observó actividad de PFK con ATP (Tabla 1),
mientras que no hubo actividad en presencia de PPi, u otros donadores como el ADP y GTP,
lo que indica que la PFK de U. maydis pertenece al grupo de las dependientes de ATP.
La baja actividad de la PFK en este hongo en comparación con el resto de las enzimas
de la vía (Tabla 1) podría sugerir que la concentración de enzima también es baja en la
célula; sin embargo, también es conocido que las ATP-PFKs son enzimas alostéricas que
tienen moduladores negativos potentes tales como altas concentraciones de ATP y citrato.
Por lo tanto, se procedió a ensayar esta actividad en extractos dializados de medio rico YPD
pH 7.0 y medio mínimo, con la finalidad de remover metabolitos que pudieran estar
inhibiendo a la enzima. En el dializado de YPD pH 7.0 se evaluó el efecto de diferentes
activadores de las PFKs tales como K+, NH4+, fructosa-2,6-bifosfato (F2,6BP) y AMP, en
concentraciones que muestran efecto activador en las enzimas de otros microorganismos,
evitando altas concentraciones que pudieran ser inhibitorias. Los resultados se muestran en
la Tabla 3.
Tabla 3. Activadores de la ATP-PFK
Extracto no dializado
Extracto dializado
+10 mM KCl
+ 20 mM NH4Cl
+ 10 mM DTT
+ 10 mM NH4Cl + 20 µM F2,6P2
+10 mM NH4Cl + 1 mM AMP
Actividad específica
(U/ mg de proteína)
0.054
0.135
0.147
0.187
0.120
0.187
0.120
Efecto del 2,3-bifosfoglicerato sobre la actividad de la PGAM.
Existen dos tipos de fosfoglicerato mutasas (PGAMs): las que requieren de 2,3
bifosfoglicerato (2,3BPG) para su actividad y las que son independientes de esta molécula.
Los valores de actividad de PGAM en extractos de U. maydis sin dializar en ausencia del
cofactor son altos y la adición de 0.12 mM no incrementa la actividad (Tabla 1), lo que
sugiere que la PGAM del hongo pertenece a las enzimas independientes del 2,3BPG. Para
descartar que el extracto sin dializar contenga esta molécula, se analizó el efecto de
concentraciones variables de 2,3BPG en la PGAM de extractos dializados de levaduras
cultivadas en medio rico YPD y medio mínimo pH 7.0.
Tabla 4. Efecto del 2,3BPG sobre la PGAM de U. maydis
Extracto no dializado
Extracto dializado
sin 2,3BPG
+ 0.12 mM 2,3BPG
+ 0.24 mM 2,3BPG
Actividad específica
U/ mg proteína
YPD pH 7
MM pH 7
3.9
2.6
7.2
6.0
7.2
6.5
5.8
5.7
La actividad de la PGAM aumentó casi al doble al dializar el extracto, sin embargo, la
adición de 0.12 mM prácticamente no tuvo ningún efecto en la actividad, mientras que al
incrementar a 0.24 mM se observó un efecto parcialmente inhibidor.
DISCUSIÒN.
En las dos condiciones ensayadas, las enzimas que presentaron la actividad más baja
son la HK y la PFK. Si el valor del flujo total de la vía es cercano a los valores de velocidad
determinado para estas dos enzimas, entonces éstas podrían considerarse como etapas
limitantes de la vía y por lo tanto controlar el flujo de la misma. Aunque la actividad de la
enolasa es también baja, podría deberse a un efecto del ensayo acoplado y no de la
actividad real de la enzima ya que el sustrato 2PG se utilizó como sal de Bario el cual tiene
efecto precipitante en el ensayo enzimático.
La cinética de la HK para glucosa y ATP fue de tipo hiperbólica. En el caso de la PYK de
este hongo, también presentó curvas hiperbólicas con respecto a ambos sustratos. De
especial interés es el comportamiento con el sustrato PEP, para el cual, las PYKs de otros
tipos celulares muestran un comportamiento típicamente sigmoidal.
Los valores de Km de la HK por glucosa y ATP son muy similares en la condición de
medio YPD pH 7.0 y medio mínimo pH 7.0 (ver tabla 2), lo que indicó que la HK tiene
prácticamente la misma afinidad por sus sustratos, no importando las condiciones
nutricionales en las que se cultive la levadura. A pesar de que en medio mínimo la HK
presentó mayor actividad (ver Tabla 1), no se pudo detectar cambios drásticos en la afinidad
de la enzima por su sustrato, lo que sugiere que probablemente en medio mínimo hubo un
incremento en la concentración, una activación o alternativamente una desinhibición de la
misma isoenzima de la HK. Los valores de Km de la HK de Ustilago son comparables con los
valores reportados para los de S. cerevisiae, de 0.1 mM y 0.2 mM para glucosa y ATP,
respectivamente.
La afinidad de la piruvato cinasa por ADP y PEP no varió en las dos condiciones de
cultivo evaluadas como lo demuestran los valores de Km (Tabla 2). Valores similares se han
reportado para Phycomyces blakesleeanus (hongo filamentoso) (3), ADP 0.52 mM y PEP 0.90
mM. Los valores que obtuvimos también concuerdan con los reportados para la PYK de S.
cerevisiae (4) para el caso del PEP y ADP, respectivamente: en presencia de fructosa 1, 6bifosfato 0.099 mM y 0.16 mM; mientras que en ausencia de fructosa 1,6-bifosfato 10 mM
para el PEP.
La actividad que se midió para la PFK en el extracto dializado aumentó al doble con
respecto al extracto no dializado (Tabla 3). Sin embargo, de los activadores ensayados sólo
el NH4+ activó en un 38%. Así mismo se determinó que la concentración óptima de ATP es 1
mM, ya que a mayores concentraciones existe inhibición como se observa en muchas PFKs.
Se ensayaron diferentes concentraciones de F6P y se requiere al menos 20 mM de F6P para
que observar esta actividad. Además se ensayaron diferentes concentraciones de extracto y
diferentes pHs, con el fin de incrementar la actividad de la PFK con resultados poco exitosos.
Estos resultados sugieren que la actividad y/o concentración de PFK es baja en U. maydis y
que por lo tanto esta enzima sí podría representar un punto de control importante en el flujo
de la vía.
La nula actividad de la aldolasa de U. maydis en ausencia de un metal divalente (Tabla 1)
indica que esta enzima pertenece a la clase II de aldolasas, que requieren de un metal
divalente para su actividad y que comúnmente se encuentra en hongos, algas y algunas
bacterias. Las aldolasas tipo I, independientes de metal, son características de plantas y
animales y su mecanismo de reacción es diferente. Se ensayó el efecto de diferentes
concentraciones de metales divalentes que se sabe que también pueden ser utilizados por
estas metalo-aldolasas (6) tales como el Co2+ y Zn2+ (Tabla 1), éste último es de relevancia
fisiológica ya que es el metal divalente que se encuentra en mayor concentración en la
mayoría de las células. Se obtuvo que el mejor catión para la aldolasa de U. maydis es el
Co2+ a una concentración de 0.5 mM, mientras que con Zn2+ solamente se obtuvo un 20 %
de la actividad obtenida con cobalto en ambas condiciones de cultivo.
En el caso de la PGAM, los resultados cinéticos sugieren que es independiente de
2,3BPG; sin embargo, identificamos en el banco de secuencias del genoma de U. maydis
una secuencia que presenta mayor similitud con las PGAM dependientes de esta molécula.
Este resultado es de especial interés ya que la secuencia de aminoácidos de PGAMs de
levaduras como S. pombe, Debaryomyces hansenii y Candida albicans presentan alta
similitud con las secuencias de las enzimas del grupo de las dependientes de 2,3BPG (7).
Una posibilidad es que U. maydis posea los dos tipos de enzimas y que en las condiciones
del medio de cultivo sólo se esté expresando la enzima independiente del 2,3 BPG o que
éste se encuentre unido con alta afinidad a la enzima y que el dializado no sea suficiente
para despegarlo.
Uno de los activadores alostéricos más importante de algunos tipos de piruvato
cinasas (PYK) es la fructosa-1,6BP sintetizada por la PFK, la cual es una manera de
señalarle a la última enzima de la vía, la PYK, para acelerar el flujo total de la glucólisis. La
PYK de U. maydis no fue activada por este metabolito a concentraciones en el intervalo de
0.1-0.2 mM. Esto contrasta con lo reportado para la enzima de otros hongos tales como
Phycomyces blakesleeanus (3) y Saccharomyces cerevisiae (4) que indican un efecto
activador de este metabolito en las enzimas respectivas.
CONCLUSIONES
Las enzimas glucolíticas de U. maydis en condiciones de estrés presentan mayor
actividad, probablemente porque se requieren precursores para la síntesis de aminoácidos
como el PEP, 3-fosfoglicerato, 2 fosfoglicerato; para la síntesis de nucleótidos como la
glucosa-6P, y para la síntesis de triglicéridos como la dihidroxiacetona fosfato.
Los valores de afinidad de la HK y PYK por sus sustratos son similares en ambas
condiciones de cultivo, por lo que el incremento en la velocidad en la condición de agobio
nutricional puede deberse a un incremento en la concentración de enzima.
La actividad de la PFK es muy baja con respecto a las demás enzimas evaluadas. Esto
indica que esta enzima puede representar un punto de control importante para el flujo de la
vía en este hongo.
La ALDO pertenece a las aldolasas tipo II que requieren de un metal divalente para su
actividad y la PGAM puede estar unida fuertemente al 2,3BPG.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Biol. Rusely Encalada por su ayuda en la medición de algunas
actividades. Este trabajo fue apoyado por los donativos 43811-Q a RMS y donativos del
proyecto CGPI 20050887 del IPN. Ramos-casillas L. es becaria CONACYT (2004-2005)
REFERENCIAS
1. Banuett F. (2002). Pathogenic development in Ustilago maydis a progression of
morphological transitions that results in tumor formation and teliospore production.
Molecular biology of fungal development. Marcel Dekker, Inc. 14: 349-398.
2. Kämper J. (2004). A PCR-based system for highly efficient generation of gene
replacement mutants in Ustilago maydis. Mol Gen Genomics. 271: 103-110.
3. Arriaga D., Busto F., Del valle P and Soler J. (1989). A kinetic study of the pH effect on
the allosteric properties of pyruvate kinase from Phycomyces blaskesleeanus.
Biochimica et Biophysica Acta. 998: 221-230.
4. Kinderlerer J., Ainsworth S., Morris C. and Rhodes N. (1986). The regulatory
properties of yeast pyruvate kinase. Biochem J. 234: 699-703.
5. Saavedra E., Encalada R., Pineda E., Jasso-Chávez R and Moreno R. (2005).
Glycolisis in Entamoeba histolytica: biochemical characterization of recombinant
glycolytic enzymes and flux control analysis.
6. Horecker B. L., Tsolas O and Lai C. Y (1972). Aldolases. In The Enzymes (boyer P.D)
vol. VII, pp. 213-258. Academic Press, New York.
7. www.broad.mit.edu/annotation/fungi/ustilago_maydis/