ANTECEDENTES La gonadotrofina coriónica humana

Maduración final in Vitro e in Vivo de los ovocitos de
Oncorhynchus mykiss ”Trucha arco iris” Walbaum. 1792. Ramos
Maguiña, Eric Steve
ANTECEDENTES
La gonadotrofina coriónica humana (hCG) desempeña funciones análogas a la
hormona luteinizante; esta última es
el equivalente de la Gonadotrofina II en los
salmónidos, la cual inicia la maduración final de los ovocitos en estos peces. Este
evento se efectúa entre los estadíos de vitelogénesis y de ovulación (Goetz, 1983) y
comienza con la reanudación del ciclo meiótico en la profase I y termina en la metafase
II, donde se detiene el ciclo meiótico que luego se activará durante la fecundación. A la
vez este proceso incluye cambios tanto a nivel nuclear como citoplasmático y entre las
modificaciones nucleares se encuentran: migración de la vesícula germinal, llegada de
la vesícula germinal al polo germinal o periferie del ovocito y desaparición de la
vesícula germinal debido a la desintegración de la membrana nuclear con la
consiguiente dispersión de los cromosomas; las variantes a nivel citoplasmático son la
coalescencia de las gotas lipídicas y de los glóbulos de vitelo, y la adquisición de la
transparencia característica de la desaparición de la vesícula germinal, rasgo distintivo
de la maduración (Redding y Patiño, 1993). La maduración final de los ovocitos de
peces también puede ser agrupada en dos etapas: una temprana que incluye la migración
de la vesícula germinal y coalescencia de las gotas lipídicas, asociada a la presencia de
gonadotrofina II, testosterona y 17ß-estradiol; y una etapa tardía que incluye la
desaparición de la vesícula germinal y coalescencia de los glóbulos de vitelo, vinculada
con el máximo incremento de la gonadotrofina II y de los dos esteroides inductores de
la maduración, el 17a,20ß,dihidroxi-4-pregnen-3-ona y el 17a,20ß,21trihidroxi-4pregnen-3-ona aunque es el primero el que más se expresa en la mayoría de los
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teleósteos (Mylonas et al, 1997) por ejemplo en Oncorhynchus rhodurus (Nagahama y
Adachi, 1985), Pagrus major (Kagawa et al, 1994a), Fundulus heteroclitus (Petrino et
al, 1993), Danio rerio (Pang y Ge, 1999). El 17a,20ß,21trihidroxi-4-pregnen-3-ona se
expresa en Micropogonias undulatus (Trant y Thomas, 1989), Morone saxatilis (King
et al, 1997), Cynoscion nebulosus (Patiño y Thomas, 1990a).
En muchos teleósteos, el efecto de la gonadotrofina II en la maduración final de
los ovocitos involucra dos mecanismos importantes en dos estadíos de desarrollo
temporalmente diferentes, el primero es llamado estadío promotor el cual no necesita de
la presencia del esteroide inductor de la maduración, el segundo y último corresponde al
estadío de maduración que sí requiere de dicho esteroide (Patiño y Thomas, 1990d).
En el primer estadío los folículos son estimulados por la gonadotrofina II de modo que
los ovocitos sintetizan los receptores
para el esteroide inductor de la maduración,
volviéndose capaces de entrar en la etapa de maduración y por tanto pueden responder
positivamente al encontrarse en presencia del esteroide inductor de la maduración. En el
segundo estadío, la gonadotrofina II estimula la producción del esteroide por intermedio
de las células de la teca y de la granulosa, las primeras producen 17a,hidroxi-4-pregnen3-ona la que es convertida a 17a,20ß,dihidroxi-4-pregnen-3-ona en las células de la
granulosa por acción de la enzima 20ß-hidroxiesteroide deshidrogenasa (Pang y Ge,
2002). Un cambio esteroidogénico debido al incremento de la gonadotrofina II durante
la maduración final de los ovocitos provoca que las células de la granulosa cesen de
producir el 17? -estradiol e inicie la producción del esteroide inductor de la maduración
mediante la inhibición de la actividad de la aromatasa P450 que sintetiza al 17? -
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estradiol (Young et al, 1983). La gonadotrofina II es la responsable de la rápida
expresión del ácido ribonucleico mensajero de la enzima 20? -hidroxiesteroide
deshidrogenasa en las células de la granulosa y el esteroide que sintetizan actúa sobre
los receptores ubicados en la membrana plasmática del ovocito en la cual el complejo
esteroide-receptor al unirse con la proteína G produce la activación del factor promotor
de la maduración, ubicado en el citoplasma del ovocito, constituido de la quinasa cdc2 y
de la ciclina B (Nagahama, 1997). Esta unión del esteroide con su receptor disminuye
la producción tanto del adenosín monofosfato cíclico intracelular y del diacil glicerol de
la membrana plasmática del ovocito. La regulación del adenosín monofosfato cíclico
intracelular principalmente ocurre por el control de su degradación que de su síntesis.
Por el contrario, el adenosín monofosfato cíclico de las células foliculares es regulado
por el control de su síntesis más que por su degradación (Thomas et al, 2001). La
capacidad del ovocito para ingresar en la maduración está acompañada del incremento
de las uniones intracelulares (entre las células de la granulosa) e intercelulares (entre las
células de la granulosa y el ovocito), lo cual va acompañado de la síntesis de la
conexina, proteína constitutiva de estas uniones (Patiño y Kagawa, 1999).
En los salmónidos el receptor para la gonadotrofina II se encuentra en las células
de la granulosa (Yan et al, 1992). La presencia de este receptor coincide con el
incremento de la gonadotrofina II en el plasma durante la maduración final del ovocito
(Prat et al, 1996), el cual se encuentra altamente relacionado con los receptores de la
hormona luteinizante de otros vertebrados (Kumar et al, 2001).
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La maduración final de los ovocitos de peces se realiza in Vitro e in Vivo. in
Vitro viene siendo realizada desde la década de los setenta a través de diversas
gonadotrofinas, como la gonadotrofina coriónica humana. Por ejemplo, se ha obtenido
maduración final de los ovocitos en Dicentrarchus labrax con 100UI de hCG por
mililitro de medio de cultivo (Sorbera et al, 2001), Cynoscion nebulosus con 15UI de
hCG por mililitro de medio de cultivo (Thomas et al, 2001), Micropogonias undulatus
con 5UI de hCG por mililitro de medio de cultivo con una previa dosis in Vivo de 100UI
de la hormona por cada kilo de pez (Patiño y Thomas, 1990b), Danio rerio con 10UI
de hCG por mililitro de medio (Wu et al, 2002) y con 1UI de hCG por mililitro de
medio de cultivo Leibovitz L-15 (Pang y Ge, 1999), en Morone americana y Morone
chrysops fue necesario la administración in Vivo de la hormona previa a la maduración
in Vitro sólo en la primera especie mas no en la segunda demostrando que no es
necesaria tal aplicación o que ésta depende de al especie para obtener la maduración
final (King et al, 1995) y en Fundulus heteroclitus utilizando 50UI de hCG por mililitro
de medio de cultivo (Cerdà et al, 1998). Esta maduración in Vitro también se obtiene
utilizando gonadotrofina II sintética, por ejemplo en Pagrus major (Kagawa et al,
1998), hormona luteinizante en Oncorhynchus kisutch (Planas et al, 2000),
17? ,hidroxi-4-pregnen-3-ona
en Brachydanio rerio (Li et al, 1993) y con
17? ,20? ,21trihidroxi-4-pregnen-3-ona luego de un tratamiento con
gonadotrofina
coriónica humana en Micropogonias undulatus (York et al, 1993). La eficiencia de esta
gonadotrofina
disminuye
significativamente
con
el
inhibidor
transcripcional
(actinomicina D), en presencia del inhibidor traduccional (cicloheximida) y del
inhibidor de la síntesis del esteroide inductor de la maduración (King et al, 1994).
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Existen otros componentes que inducen la maduración final in Vitro de los
ovocitos de peces, tales como la insulina y los factores de crecimiento semejantes a
insulina I y II que logran este proceso en Pagrus major (Kagawa et al, 1994b), esto
también involucra la presencia de los receptores ováricos ya sea para la insulina y para
ambos factores de crecimiento semejantes a insulina, los cuales se incrementan durante
la maduración final de los ovocitos (Maestro et al, 1997b). Los inhibidores
transcripcionales, de síntesis del esteroide inductor de la maduración, de las uniones
intra e intercelulares no afectan la maduración in Vitro mediada por el factor de
crecimiento semejante a insulina I, pero sí disminuye significativamente con inhibidores
traduccionales (Weber y Sullivan, 2000). La función de la insulina en la maduración
final in Vitro es estudiada mayoritariamente en mamíferos, valiéndose de los ovocitos
de “Ratón” como modelos experimentales y siendo uno de los protocolos más
satisfactorios el que utiliza 5? g de insulina por mililitro de medio de cultivo (Rose et al,
1999). Los factores de crecimiento semejantes a insulina I y II han sido observados en
todos los vertebrados (Méndez et al, 2001) y ambas estructuras pertenecientes a
Oncorhynchus mykiss son altamente conservadas en un 79.6% y 64.8% de homología
en relación a los factores de crecimiento semejante a insulina I y II humanos, y con un
62.2% y 62.3% de homología respecto a la insulina de Oncorhynchus kisutch,
respectivamente (Shamblott y Chen, 1992). El factor de crecimiento semejante a
insulina I tanto de humanos como de peces ofrece iguales efectos en los bioensayos
realizados con ambos organismos (Duan, 1998).
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El suero es otro componente que mejora la maduración final de los ovocitos in
Vitro (Ocaña et al, 1999) debido a que contiene una diversidad de sustancias nutritivas,
hormonas, factores de crecimiento y otros metabolitos que favorecen el cultivo (Tiffan
y Rondorf, 2000). Este suero puede ser sintético como el Ultroser U, que al ser usado al
2% (v/v) garantiza la reagregación de los blastómeros de Oncorhynchus mykiss luego de
su disgregación y criopreservación (Calvi y Maisse, 1998), pero también se puede
emplear el suero que proviene directamente de la sangre de los peces, donde las
proteínas del sistema del complemento que se encuentran en el suero tienen que
inactivarse mediante calor para evitar la lisis celular mediada por esas proteínas
(Sunyer et al, 1997). La inactivación de las proteínas del complemento en los peces de
aguas frías se realiza mediante el tratamiento térmico del suero de 40 a 45°C durante
20min (Holland y Lambris, 2002). Para la obtención de la sangre y el mejor manejo de
los peces es necesario anestesiar a los animales, siendo el clorobutanol uno de los
anestésicos usados en salmónidos (Stosskopf, 1993).
Por otra parte, la maduración final in Vivo de los ovocitos de peces se realiza
mediante la inducción hormonal para conseguir la ovulación y el desove respectivo, lo
cual se viene aplicando desde la década de los treinta facilitada porque los mecanismos
internos que regulan el proceso reproductivo en su mayor parte por hormonas son
similares entre las especies, en cambio los factores ambientales externos que controlan
este proceso varían considerablemente entre las especies; tales sustancias hormonales
que inducen la maduración final in Vivo son: la gonadotrofina coriónica humana,
análogos a la hormona liberadora de gonadotrofinas, análogos a la hormona liberadora
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de la hormona luteinizante sólos o en combinación con inhibidores de dopamina
(sustancia que inhibe la liberación de las gonadotrofinas), mediante los esteroides
inductores de la maduración, y finalmente el extracto de pituitaria en cuyo uso es
necesario tener en cuenta la cercanía filogenética del pez donante en relación al pez
receptor consiguéndose resultados satisfactorios en Carassius auratus
y en la “Carpa
china” al utilizar la pituitaria de “Carpa”, en cambio los salmónidos como las “Truchas”
son más afines al extracto de pituitaria de “Salmón” (Rottman et al, 1991). La
gonadotrofina coriónica humana es la hormona gonadotrófica purificada más usada para
inducir el desove por su acción directa en la gónada, aunque puede causar
inmunoreacciones en el pez receptor lo cual reduce su efecto a través de las
generaciones (Patiño, 1997). Esta hormona inyectada intramuscularmente permite la
ovulación de Lutjanus campechanus con una dosis de 1000UI de hCG por Kg de pez
(Laidley y Ostrows ki, 2000). Este proceso de maduración también se consigue
mediante la combinación de esta hormona con el extracto de pituitaria de “Carpa”, tal
como sucede en Barbodes schwanenfeldi (Bailey y Cole, 1999). En Oncorhynchus
mykiss, la ovulación se consigue mediante el uso de los análogos a la hormona
liberadora de gonadotrofinas (Breton et al, 1990), análogos a la hormona liberadora de
la hormona luteinizante en combinación con el antagonista del receptor de dopamina
(Glubokov et al, 1992). En nuestro país se realizan estos estudios en los peces
amazónicos: Colossoma macropomum “Gamitana” y en Piaractus brachypomus “Paco”
mediante los análogos a la hormona liberadora de la hormona luteinizante (Alcántara y
Guerra, 1992). La ovulación es el mecanismo por el cual el ovocito es expulsado de sus
células foliculares, siendo mediada por las prostaglandinas que provocan la ruptura de
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las uniones intercelulares entre las células foliculares y el ovocito (Cetta y Goetz,
1982). Durante y luego de la ovulación de “Truchas” se observan en el fluido celómico
de las mismas a las llamadas proteínas ovulatorias de truchas sintetizadas por las células
de la granulosa, las cuales poseen actividad inhibitoria de las serinoproteasas
bloqueando la degradación inespecífica del ovario y de otros tejidos que incrementan el
número de esas enzimas como producto de la ovulación, además inhiben el crecimiento
bacteriano en los óvulos (Coffman et al, 2000).
En base a todo lo mencionado, el objetivo de la tesis fue evaluar la eficiencia de
la gonadotrofina coriónica humana para inducir la maduración final in Vitro e in Vivo de
los ovocitos de Oncorhynchus mykiss basada en la producción de ovocitos maduros y el
tiempo en el cual se produce la inducción de la maduración, bajo determinadas
condiciones de cultivo.
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