mecanismos de ruptura celular

¿Para qué romper células?
Para obtener productos que se encuentran en
el interior de las células.
La técnica de RC seleccionada
determina el tamaño de los
desechos y la influencia que
tendrán en las operaciones que
se utilicen para su separación.
Ejemplos de productos intracelulares • 
Ácidos nucleicos • 
Enzimas • 
• 
Tanasa • 
• 
Invertasa Proteasas • 
DNA polimerasa Pigmentos • 
B-­‐ficoeritrina (BPE), colorante rosa • 
Polímeros intracelulares • 
AnBbióBcos Rompimiento celular
Separación,
tratamiento de
cuerpos de inclusión
Purificación alta
resolución
refinamiento
Refinamiento
sobrenadante
Separación de células
Concentración
•  Sin células
Con
células
•  Células inmovilizadas o
•  Células retenidas
proteínas
intracelulares
Caldo de
fermentación
La recuperación óptima de productos intracelulares
requiere del conocimiento de la estructura de las
capas externas que protegen a las células.
Paredes microbianas:
MECANISMOS DE RUPTURA CELULAR La selección de una técnica depende de las caracterísBcas del producto: u 
Resistencia a: • 
Medios alcalinos • 
Solventes • 
Detergentes • 
Enzimas • 
Temperatura • 
Esfuerzo de corte La técnica uBlizada determinará el tamaño de los desechos que se producirán Los métodos de ruptura celular en la industria pueden ser divididos en: •  Métodos químicos •  Métodos Qsicos •  Métodos biológicos ROMPIMIENTO CELULAR RUPTURA DE CÉLULAS DE MICROORGANISMOS Métodos Físicos Ultrasonido Método Líquido Prensas Gaulin/
Manton Prensa de French Molinos Molino Dyno Molino coloidal Método Sólido Congelación, descongelación Molino de bolas Prensas Prensa X Prensa Hughes Métodos Químicos Métodos Biológicos Liofilización Enzimas que digieren la pared celular Tratamiento con ácidos Detergentes Extracción con acetona/tolueno Cambio en la presión osmóRca Fagos Agentes que inhiben la pared celular Métodos químicos: Choque osmóBco Permeabilización Disolución lipídica (tolueno 10% de la biomasa) DigesBón enzimáBca (enzimas que atacan la pared celular) •  Tratamiento alcalino •  Detergentes •  Liofilización • 
• 
• 
• 
Los métodos no-­‐mecánicos son fáciles de escalar, si uno necesita tratar 10 veces más materia orgánica basta con adicionar 10 veces más reacBvo químico o enzimáBco Rompimiento celular por métodos químicos. TÉCNICAS
PRINCIPIO
ESTRÉS EN EL
PRODUCTO
COSTO
Solubilización
Detergentes solubilizan la
membrana
Suave
Moderado/
Caro
Choque osmótico
Ruptura osmótica de la
membrana
Suave
Barato
Ruptura
de glóbulos rojos
Disolución lipídica
Solventes orgánicos actúan
sobre
la pared celular
desestabilizándola
Barato
Rompimiento de
levaduras con
tolueno
Digestión
enzimática
Rompimiento por la digestión
de
la pared celular
Suave
Caro
Micrococcus
lysodeikticus
tratado con
lisozima
Fuerte
Barato
Tratamiento
alcalino
Permeabilización
enzimatica
La saponificación de los
lípidos solubiliza la
membrana
Permeabilizan la membrana
ocasionando
la ruptura de la célula
Moderado
Suave
Caro
EJEMPLO
Tratamiento de M.
lysodeikticus
con lisozima
Métodos mecánicos: Métodos a pequeña escala: • Ultrasonificación • Molido con abrasivos • Homogeneizadores Métodos a gran escala: • Homogeneizadores a alta presión • Molinos de perlas Rompimiento celular por métodos mecánicos TÉCNICAS
PRINCIPIO
ESTRÉS
SOBRE EL
PRODUCTO
Homogeneizador
de cuchillos
Las células son
rotas en un mezclador
Moderado
Las células son forzadas
Homogeneizador a pasar a través de un
pequeño orificio,
alta
produciendo su ruptura
presión
por el esfuerzo de
corte
Molienda
Las células son rotas
por medio de una
molienda con abrasivos
Molino de perlas
Las células son
trituradas con perlas de
acero o vidrio
Ultrasonificación
Las células son
quebradas en una
cavidad ultrasónica
COSTO
EJEMPLO
Moderado
Rompimiento de tejidos y
células animales.
Fuerte
Moderado
Tratamiento a gran
escala
de suspensión
de células.
Moderado
Barato
Fuerte
Fuerte
Barato
Rompimiento a gran escala
para suspensiones de células y
células de plantas
Caro
Rompimiento de suspensiones
de células a lo menos en
pequeña escala
Métodos biológicos: •  Enzimas •  Fagos •  Agentes inhibidores de pared celular Estos métodos no son muy empleados debido a que son muy costosos. Animales Micelio Bacterias Gram + Bacterias Gram – Levaduras Esporas Dificultad para rompimiento de diferentes Bpos de células. 7 = Fácil de romper 1 = Difícil de romper
Que hay que tomar en cuenta para la selección de un método de ruptura celular • 
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Naturaleza del producto intracelular Escala de la operación Velocidad Estabilidad del producto Pureza del producto Costo del método CHOQUE OSMÓTICO Las células se colocan en un volumen de agua frecuentemente 2 veces mayor que el volumen de células. Las células se expanden, por un simple flujo osmóBco que se produce debido a que las células conBenen solutos, ocasionando que el agua entre al interior. Debido a esta expansión puede conducir a su lisis o rompimiento. El uso de este método depende de la resistencia de las células. Ley de van`t Hoff
Toluenización: Ruptura a altas concentraciones, , se trabaja a bajas temperaturas, células inacBvas metabólicamente. Permeabilización a bajas concentraciones, células metabólicamente acBvas comienzan a destruirse. DigesRón enzimáRca Consiste en el empleo de enzimas que atacan a la pared celular hidrolizándola. Permeabilizando la membrana para liberar compuestos intracelulares al medio o rompiendo completamente la célula. DigesRón enzimáRca A pH< 5 las células no se rompen aún cuando la pared haya sido destruida por digesBón. •  Los costos son muy altos •  No hay recuperación de las enzimas empleadas •  Mayor suscepBbilidad a Gram + Ejemplos Gram(+): lisozima Gram(-­‐): lisozima + AEDT Levaduras: β1,3-­‐glucanasa, β1,6-­‐glucanasa manasa, quiBnasa Permeabilización con detergentes Los detergentes Benen una zona hidroQlica y otra hidrofóbica, por esta razón pueden interactuar tanto con el agua como con los lípidos. Su habilidad se basa en la solubilización de los lípidos de la pared celular Los detergentes más uBlizados son de tres Bpos: •Detergente aniónico •Detergente caBónico •Detergente no-­‐iónico Ejemplos Detergentes aniónicos : • 
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Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Sulfonato de Sodio Tauroclorato de Sodio Colato de sodio Ejemplos Detergentes caBónicos: •  Bromuro de CaBltrimeBl Amonio (CTAB) Ejemplos Detergente no-­‐iónicos •  Triton X-­‐100 •  Tween •  Spam Permeabilización con detergentes A bajas concentraciones no se produce degradación de lípidos. A alta concentración se produce una degradación que resulta lineal a la concentración de detergente, junto a esta variable también se altera la tensión superficial de la solución. Permeabilización con detergentes Procedimiento: 1.  Se coloca un determinado volumen de detergente concentrado por un volumen de células. Generalmente la mitad de volumen de detergente que de volumen de células. 2. El detergente rompe la membrana celular. 3. La suspensión resultante se centrifuga para remover los fragmentos de células y se pasa por etapas de extracción para aislar el producto. Permeabilización con detergentes Tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, pH 11.5-­‐12.5; 20-­‐30 min) Ventajas: •  Simple y barato •  Aplicación a gran escala Desventajas: •  Tratamiento fuerte, los lípidos son converBdos en detergentes •  No selecBvo •  Aplica únicamente si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino Ultrasonificación Frecuencias >20 KHz produciendo vibraciones que provocan el fenómeno de cavitación. •  Se producen zonas de baja presión en el líquido •  El líquido se transforma en gas formándose pequeñas burbujas •  Las burbujas colapsan debido a los cambios de presión. •  Se producen fuertes esfuerzos de corte en el líquido que rompen las células. Ultrasonificación Desventajas: •  Producción de radicales libres •  Destrucción del producto por las ondas •  Destrucción del producto por la temperatura •  Elevados requerimientos de energía •  Altos costos Homogeneización Homogeneizadores: el material biológico se somete a una fuerte presión hidrostáBca (500 atm) y la presión se libera bruscamente que el líquido salga por una válvula. La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la rupturas. Estos se pueden obtener por: 1.  Émbolos 2.  Cuchillas 3.  Pistones Congelación-­‐descongelación Formar y deshacer los cristales de hielo Ventajas: •  Muy simple de realizar •  Se realiza a bajas temperaturas Desventajas: •  Tiempos largos •  Algunos microorganismos son resistentes •  Sensibilidad de las enzimas a congelación/
descongelación Molino de perlas Operación intermitente: El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinéBca de primer orden. El balance de masa liberada puede ser expresado mediante la ecuación: Ejemplo 1: Obtención y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa, a parBr de extractos celulares de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM5. Las bacterias con lisozima se colocaron en un baño maría durante 12 horas a 40°C. Posteriormente, se completó el rompimiento celular por sonificación en un equipo Branson Sonifer (VWR Company), con la siguientes indicaciones: Output control: 7, Duty cycle: 60, Time: 10 minutos Posteriormente se solubilizó con el detergente Tritón X-­‐100 debido a que la enzima que se desea obtener estaba ligada a la membrana. La metodología uBlizada consisBó en agregar a cada 600mL de extracto celular después de la sonificacion, 200mL de Tritón X-­‐100; se dejó homogenizar la solución. Se dejó actuar por una hora y se centrifugó a 10000 rpm durante 45 min en una centrifuga refrigerada. Se tomó el sobrenadante y el detergente remanente fue reBrado mediante diálisis. Ejemplo 2: Ruptura celular de Saccharomyces cerevisiae por medio de métodos químicos. Se basan en el uso de solventes orgánicos y detergentes para acelerar los procesos de autólisis de S. cerevisiae. El sistema se basa en la autólisis celular por medio de una plasmólisis originada por tratamiento de las células con solventes orgánicos. Para seguir la liberación del contenido intracelular miden la canBdad de la proteasa vacuolar carboxipepBdasa. Y liberada por la célula, requiriendo el proceso un fino control del pH alrededor de 8. Entre los solventes orgánicos destacan los alcoholes de cadena entre 6 y 9 carbonos de longitud. Los detergentes con mejores resultados son el Tritón X-­‐100 y N-­‐laurilsarcosina. Ventajas a nivel industrial: •  No requiere aparatos especiales •  Restos celulares fáciles de separar por centrifuga •  Costo de los productos inductores bajo. Desventajas: •  Dificultad para eliminar compuestos químicos •  Riesgo de desnaturalización •  Largos Bempos para lograr la autólisis 20-­‐30h. •  Aumentan el riesgo de las proteínas de interés por la proteasas presentes. Ejemplo 3: Ruptura celular de S. cerevisiae por medio de enzimas líBcos combinado con el uso de estabilizadores osmóBcos. Con estos tratamientos se ha logrado la liberación selecBva de enzimas y proteínas localizados en diferentes comparBmientos celulares. El complejo empleado procede de Oerskowia xanthinoly;ca. Se trata de una mezcla de enzimas líBcos con acBvidades en beta-­‐1,3-­‐gluconasa, proteasa, beta-­‐1,6-­‐glucanasa, mananasa y quiBnasa. Todas actúan en forma sinérgica en la degradación de la pared celular, la acBvidad mananasa que degrada la capa externa de manano de la pared y la beta-­‐1,3-­‐glucanasa para la degradación de la capa interna de glucano. La produccion de estas enzimas obtenida en un fermentados de 2000 litros es suficiente para lisar un fermentador de 100,000 litros de S. cerevisiae.