Transcripción

Expresión
Génica
GENOMA
Transcripción
•Acceso al genoma
•Ensamblado del complejo de iniciación de la transcripción
•Síntesis de ARN
•Procesamiento del ARN
•Estabilidad del ARN (degradación, localización)
TRANSCRIPTOMA
Traducción
Colección de moléculas de ARN cuya
información genética es requerida por
la célula en un determinado momento
•Ensamblado del complejo de iniciación
•Síntesis de proteínas
•Plegamiento y Procesamiento de proteínas
•Degradación del Proteínas
PROTEOMA
Repertorio de proteínas celulares
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Transcripción
• 1) Reconocimiento del Promotor
• 2) Iniciación: Ensamblado del complejo de iniciación
– Unión de RNA pol sola o con proteínas accesorias a su
promotor
– Conversión de Complejo de iniciación cerradoÆ Complejo de
iniciación abierto (ruptura de la unión H entre algunas bases
en el sitio de iniciación)
– Síntesis de los primeros nt y “clearance” del promotor
• 3) Elongación: Complejo estable de transcripción
• 4) Terminación: Involucra desestabilización de
apareamiento RNA- molde de DNA
Unidad de Transcripción: desde Promotor hasta Terminador
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Eventos en la
iniciación de la
transcripción
Elongación: 40nt/seg
(bacteria)
3
4
RNA polimerasa
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RNA polimerasas
•Bacteriófagos T3 y T7: Un único polipéptido. Reconoce solo unos pocos
promotores del fago
• Bacteria: E.coli
– 5 subunidades α2ββ’ σ
Core
catalítico
• Eucariotas:
– Múltiples subunidades : 8-12
– 3 RNA polimerasas:
• RNA polimerasa I : rRNA (28s, 18s y 5,8s)
• RNA polimerasa II : mRNA y RNA peq (snuRNA)
• RNA polimerasa III : RNA peq (5s rRNA, tRNA, etc)
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Transcripción en Procariotas
Reconocimiento de la secuencia Promotora
Promotor : Sitio de unión de la RNA pol
E.Coli Æ - 2 secuencias de 6pb (ADN doble cadena)
- Distancia entre las 2 secuencias
- Startpoint (purina)
TTGACA
TATAAT
UP
-35
-10
+1
CAT
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Secuencia -35
Separación
entre
secuencias
Secuencia -10
(Pribnow Box)
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Iniciación en E.coli
• Contacto directo RNA pol-Promotor
Core catalíticoÆ Contactos inespecíficos débiles
Subunidad σ Æ Especificidad de secuencias
Sec. -35Æ capacidad de unión de RNA pol
Sec. -10Æ Conversión de complejo cerrado en complejo abierto
(apertura de cadenas)
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Transcripción en
bacterias
Factor σ :
ƒrequerido para unión de
RNA pol al Promotor
ƒLiberación de σ luego de
iniciación de transcripción
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Elongación: Complejo de transcripción (core
catalítico de la RNA pol)
ƒRNA polimerasa cubre 30pb
ƒBurbuja de transcripción 12-14nt
ƒApareamiento RNA- DNA 8 pb
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Terminación en Bacterias
Determinada por la estructura secundaria del ARN transcripto
• Terminadores Intrínsecos
– Palíndrome invertida seguida de corrida de U en el RNA
transcripto
•Formación de estructura de “hairpin” estable en el RNA
desfavorece la unión RNA al molde de DNA
Modos de
acción
•Debilitamiento mayor en la región transcripta con corrida de
U (A-U unión débil)
•Interacción del “hairpin” de RNA con subunidad β
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Terminadores
intrínsecos
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Terminación Rho dependiente
– RNA polimerasa pausa en la señal de terminación
– Señal con “hairpin” menos estable
– No hay corrida de U
– Requiere actividad de proteína Rho
–Rho: actividad helicasa Î rompe activamente la unión entre RNA y
DNA molde
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Transcripción en Eucariotas
Reconocimiento de la secuencia Promotora
• RNA pol eucariotas no reconocen directamente su
secuencia promotora Æ Factores Generales de
Transcripción
• Promotor core
– Sitio de ensamblado del Complejo de iniciación de la
transcripción (Responsable de la Transcripción basal)
• Elementos upstream del promotor
– Unión de proteínas activadoras de la transcripción
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Cada RNA polimerasa
reconoce secuencias
promotoras distintas
•RNA pol I
•core -45 y +20 (rico en GC + corta sec rica AT +1)
•Elementos control upstream (UCE)
RNA pol II
•core -25 TATA Box
•Inr (secuencia iniciadora) YYCARR
•Elementos upstream
•RNA pol III
•Promotor dentro del gen
•3 tipos de promotores
•Usualmente 2 secuencias (50-100pb )
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Promotores de
RNA pol III
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Iniciación –RNA pol II
•
Reconocimiento del Promotor: Factor general de transcripción
(GTF) TFIID
•TBP: Unión a DNA secuencia específica (TATA
Box)
TFIID
•Factores asociados a TBP (TAF): ayudan en la
unión de TBP a TATA Box
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Ensamblado del
complejo de preiniciación
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TBP participa del inicio de
la transcripción de las 3
RNA pol eucariotas
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• Eventos en la iniciación:
– 1) Unión de TBPÆ torción del DNA en la
región de TATA Box
– 2) Torción Æ estructura de reconocimiento
para TFIIB que asegura posicionamiento
correcto de RNA pol II
– 3) Ruptura de uniones H
PIC cerradoÆ PIC abierto (TFII H)
Etapa Final de iniciación:
Fosforilación de CTD de la subunidad
mayor de RNA pol II (TFIIH)Æ liberación del
promotor y establecimiento de complejo de
transcripción estable (Elongación)
CTD: repeticiones de 7 aa (mamíferos 52
repeticiones) ricas en Ser
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Transcripción y Reparación
Procariotas: reclutamiento de Mfd por
frenado de RNA pol.
ƒLiberación de RNA pol
ƒReclutamiento de sistema UvrABC
Eucariotas: reclutamiento de TFIIH por
frenado de RNA pol.
ƒDegradación de RNA pol
ƒTFIIH + Complejo de reparación
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Síntesis y procesamiento del RNA en
eucariotas
• Diferencia con Bacterias:
– Traducción diferida de transcripción
– Procesamiento del RNA durante la transcripción
•CAP
•Corte y empalme de exones: Splicing
•Poly A
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Enzimas unidas al CTDÆ
componentes de RNA pol II
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Capping
Escape exitoso (30 nt sintetizados)Æ Capping
ƒAdición de G al extremo 5’ del RNAÆ Unión 5’-5’
(Guanidil Transferasa)
ƒUnión de un grupo metiloÆ 7 metil Guanosina
(Metil Transferasa)
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Elongación
• Transcriptos eucariotas más largos que bacterias (distrofina
2400kb) Î Importancia en estabilidad del complejo de
transcripción
• RNA pol sola:
– velocidad de síntesis baja
– pausa frecuente
• Factores de elongación
Proteínas asociadas con la
RNA pol II después del
escape del promotor
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TERMINACIÓN
RNA polimerasa I
•Involucra el reconocimiento de una secuencia de 18pb
por un factor auxiliar
•Extremo 3’ ARN maduro difiere del 3’ generado por
terminación Î procesamiento del ARNr
RNA polimerasa III
•Señal: Corrida de U dentro de una región rica en GC
•Terminación dentro de una corrida de U
•Clivaje y poliadenilación del ARN. Señal en el ARN
transcripto
RNA polimerasa II
•Terminación de la transcripción downstream del sitio de
clivaje (sitio no definido). El clivaje dispara la
terminación.
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Terminación y poliadenilación
•
CPSF y CstF : Componente de especificidad y factor estimulatorio.
– Reconocimiento de secuencias.
•
Endonucleasa : CFI y CFII
– Clivaje para generar nuevo 3’
•
Poly A polimerasa (PAP) : RNA polimerasa independiente de molde
– Cola de polyA (~250 A)
– Actúa en un sitio interno del transcripto
Señal de poliadenilación
ƒ5’ AAUAAA 3’ 10-30 nt upstream del sitio de
poliadenilación (CPSF)
ƒ Sitio de poliadenilación posterior a CA
ƒ Región rica en GU 10-20nt downstream (CstF)
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¾ Contacto de CPSF y CstF con
secuencias de poliadenilación cambia las
propiedades del complejo de elongación
Æ Terminación de transcripción
CPSF y CstF reclutadas por
RNA pol II (CTD)
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“Splicing”
• Distintos tipos de Intrones:
– 7 tipos en eucariotas
– Otros distintos en archaea
En mRNA 2 tipos de intrones:
ƒGU-AG Æ mayoritarios
ƒAU-AC
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•sitio 5’ : AG GUAAGU (dador)
GU-AG
•sitio 3’ : PyPyPyPyPyPyPNCAG (aceptor)
•A: punto de ramificación
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•Splicing: reacciones de trans-esterificación
1) Clivaje en el sitio 5’ promovido
por -OH 2’ de nt A localizado dentro
de la secuencia del intrón (punto de
ramificación)
– Ataque del sitio 5’ Æ clivaje de la
unión fosfodiester
– Formación de nueva unión 5’-2’
(lariat)
2) Clivaje del sitio 3’ y unión de
exones promovido por –OH 3’ del
extremo del exón
– Clivaje en el sitio 3’
– Liberación del intrón (lariat)
– Unión de exones
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• Aparato de splicing: Spliceosoma
•SnRNP
Spliceosoma
•Sn RNA : U1, U2, U4, U5 y U6
•Proteínas
•Proteínas asociadas
Importante por:
- Distancia entre sitios de splicing
- Selección de sitios de splicing
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Selección de sitios de splicing correctos
Factores reguladores de splicing
Proteínas SR : Dominio RS + RRM
¾ Interacción entre U1-sn RNP y
U2-snRNP
¾ Interacción con ESE (enhancer en
exon)
¾ Interacción con ESS
(silenciadores en exon)
¾ SCAF (SR like factores asociados
a CTD): conexión física entre
spliceosoma y CTD de RNA pol II
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“Splicing” Alternativo: Mecanismo para generar múltiples isoformas
de proteínas
Procesamiento diferencial del ARN de algunos genes: de modo tejido específico,
en distintas etapas del desarrollo o como respuesta a alguna señal.
Mecanismo adicional de regulación de la expresión.
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ƒVariación de concentración relativa de factores generales de splicing y ribonucleoproteínas de unión al ARN (hnRNP)
Ej: - ASF/SF2 en bajas cantidades: selección de sitio de splicing 5’ más fuerte. En
altas cantidades: sitio 5’ más cercano al 3’.
- hnRNPA1: selección del sitio 5’ más distante. Unión a ESS: bloquea
utilización de sitio 3’ adyacente
ƒRepresión o activación de sitios de splicing por factores de splicing específicos de
tejidos o etapas del desarrollo
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