Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T

3
Receptores y señalización:
receptores de célula B y
de célula T
L
a coordinación de las funciones fisiológicas en todo
el organismo depende de la capacidad de células
individuales para detectar cambios en su ambiente y
para mostrar respuesta de manera apropiada. Una de
las principales rutas mediante las cuales una célula
interpreta su entorno es por medio de la unión de
moléculas de señales a proteínas receptoras asociadas
a la célula. Una molécula que se une a un receptor es un
ligando. La unión no covalente de un ligando a su receptor
puede inducir alteraciones en el receptor mismo, en su
estado de polimerización, o en el ambiente de ese receptor,
o en varios de estos factores a la vez; estos cambios actúan
para transmitir o transducir la señal de unión a ligando
hacia el interior de la célula, lo que lleva a alteraciones de
las funciones celulares. En el sistema nervioso las moléculas
transmisoras de señales se llamarían neurotransmisores,
y en el sistema endocrino, hormonas. En el sistema
inmunitario, las moléculas extrañas que indican la
presencia de entidades no propias son antígenos y
las moléculas pequeñas que se comunican entre las diversas
poblaciones de células inmunitarias son las citocinas. Las
citocinas especializadas que inducen quimioatracción o
quimiorrepulsión se denominan quimiocinas.
En este capítulo se proporciona una introducción general a
la unión de receptor-ligando, y a los conceptos y estrategias
a los que están por debajo de la transducción de señal. A
continuación la exposición se enfoca de manera específica en
los antígenos y receptores del sistema inmunitario
adaptativo; se introducen los receptores de célula B y de
célula T y los eventos de emisión de señales intracelulares
que se producen en el momento de unión al antígeno.
Dado que las células del sistema inmunitario están
distribuidas en todo el cuerpo —algunas residen en tejidos
fijos y otras circulan por los diversos tejidos linfoides, la
sangre y los linfáticos—, la capacidad de estas células para
comunicarse con otra y para emitir señales hacia otra por
medio de mensajeros moleculares citocinas y quimiocinas
solubles, es esencial para su función. En el capítulo 4 se
describen los eventos de transmisión de señales que se
producen cuando las citocinas y quimiocinas se unen a sus
receptores cognados (que coinciden con ellas). En el
capítulo 5 se incluye una descripción de los receptores de
reconocimiento de patrones (prr) del sistema inmunitario
innato, y de los eventos de emisión de señales iniciados por
su unión a antígeno.
Todos los eventos de señalización empie­zan
con una interacción complementaria entre un
ligando y un receptor. En esta figura se des­cribe
la interacción molecular entre las regiones
variables de una molécula de anticuerpo (las
cadenas ligera y pesada se muestran en azul y
rojo, respectivamente) y el extremo de la molécula
de hemaglutinina del virus de la influenza, que se
muestra en amarillo. [Ilustración basada en datos
de cristalografía de rayos X recabados por P.M.
Colman y W.R. Tulip de GJVH Nossal, 1993, Scientific
American 269(3):22.]
Interacciones receptor-ligando
■
Estrategias comunes usadas en muchas vías de
señalización
■
Vías de señalización que se encuentran con
frecuencia
■
La estructura de los anticuerpos
■
Transducción de señal en células B
■
Receptores de células T y señalización
■
Los conceptos esenciales que son la base de la
señalización celulares en el sistema inmunitario pueden
resumirse como sigue:
• Una señal celular es cualquier evento que da instrucciones
a una célula para que cambie su estado metabólico o proli­
ferativo.
• Las señales suelen ser generadas por la unión de un ligando
a un receptor unido a la célula complementaria.
• Una célula puede hacerse más o menos susceptible a las
acciones de un ligando al incrementar (regular en dirección
ascendente) o disminuir (regular en dirección descendente)
la expresión del receptor para este ligando.
65
66
sección I
|
Introducción
• El ligando puede ser una molécula soluble, o puede ser un
péptido, carbohidrato o lípido presentado sobre la superficie de una célula.
• Desde su punto de entrada, el ligando puede viajar largas
distancias por el cuerpo en el torrente sanguíneo o los linfáticos antes de que llegue a una célula que porta el receptor adecuado.
• La unión de ligando-receptor es no covalente, aunque
puede ser de afinidad bastante alta.
• La unión de ligando al receptor induce un cambio molecu-
lar en el receptor. Este cambio puede ser en la forma de una
alteración conformacional en el receptor, dimerización o
agrupación de receptor, un cambio de la ubicación del
receptor en la membrana, o una modificación covalente.
• Esas alteraciones de receptor ponen en marcha cascadas de
eventos intracelulares que incluyen la activación de enzimas, y cambios de las ubicaciones intracelulares de moléculas importantes.
• El resultado final de la transmisión de señales celulares a
menudo, mas no siempre, es un cambio del programa de
transcripción de la célula blanco.
• A veces una célula debe recibir más de una señal por medio
para formar una conexión receptor-ligando biológicamente
significativa. Además, puesto que cada una de estas in­­teracciones
no covalentes sólo opera en una distancia muy corta —por lo
general alrededor de 1 Angstrom (1 Å = 10–10 m)—, una interacción de alta afinidad entre receptor y ligando depende de un
“ajuste”, o grado de complementariedad, muy cercano, entre el
receptor y el ligando (figura 3-1).
¿Cómo se cuantifica la fuerza de interacciones
receptor-ligando?
Considérese un receptor, R, que se une a un ligando, L. Es posible describir su reacción de unión de acuerdo con la ecuación
que sigue:
k1
R+L
RL (Ec. 3-1)
k –1
en la cual RL representa el complejo de receptor-ligando unido,
k1 es la constante de tasa hacia adelante o de asociación, y k–1 es
la constante de tasa de reversa o de disociación.
La proporción de k1/k–1 es igual a Ka, la constante de asociación de la reacción, y es una medida de la afinidad del par
de receptor-ligando. La constante de asociación se define como
la relación entre la concentración del producto de la reacción,
de más de un receptor para que se llegue a un resultado
particular.
• La integración de las señales recibidas por una célula
ocurre en el ámbito molecular dentro de la célula receptora.
Ligando
Receptor
NH2
Interacciones receptor-ligando
Los receptores de antígeno del sistema inmunitario adaptativo
son proteínas transmembrana situadas en la membrana plasmática. La unión del ligando a su receptor cognado normalmente
se produce por medio de interacciones no covalentes específicas
entre el ligando y la porción extracelular del receptor de membrana. Aunque un linfocito individual sólo expresa un tipo de
receptor de antígeno, también puede expresar muchas moléculas receptoras diferentes para señales como citocinas y quimiocinas y, por ende, una célula sana debe integrar las señales que
provienen de todos los receptores que están ocupados en un
momento dado.
La unión de receptor-ligando ocurre
por medio de múltiples enlaces no covalentes
La superficie de una molécula de receptor se une a la superficie de
su ligando complementario por medio de los mismos tipos
de enlaces químicos no covalentes que usan las enzimas para
unirse a sus sustratos, los cuales comprenden enlaces de hidrógeno y enlaces iónicos, e interacciones hidrofóbicas y Van der
Waals. La clave para que la interacción receptor-ligando sea
significativa es que la suma total de estas interacciones de unión
se mantengan juntas, con suficiente energía de unión y durante
suficiente tiempo, las dos superficies que están interactuando, a fin
de permitir que una señal pase del ligando a la célula que porta el
receptor. Dado que estas interacciones no covalentes son individualmente débiles, se requieren muchas interacciones de ese tipo
CH2 OH ••• O
CH2
C
CH2 NH3+ –O
CH2 CH2
C
O
Enlace de
hidrógeno
CH2 CH2 Enlace
iónico
CH2
CH
CH3
Interacciones
hidrofóbicas
CH3 CH3
CH2
CH3 CH
CH
Interacciones
de Van der Waals
CH3 CH3 CH
CH
CH3
O
CH2
+H
C
O–
3N
CH2
Enlace iónico
FigurA 3-1 La unión de receptor-ligando obedece las
reglas de la química. Los receptores se unen a ligandos usando toda
la gama de interacciones de enlace no covalente, incluso enlaces iónicos
y de hidrógeno, e interacciones de Van der Waals e hidrofóbicas. Para que
se emitan señales, los enlaces deben ser suficientemente fuertes como
para mantener el ligando y el receptor en estrecha proximidad durante
suficiente tiempo como para que se inicien eventos torrente abajo. En
la señalización de células B y T, las interacciones activadoras también
requieren agrupación de receptor. En un ambiente acuoso, las interacciones no covalentes son débiles y dependen de la complementariedad
estrecha de las formas del receptor y el ligando.
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
[RL], y el producto de las concentraciones de reactantes [R],
multiplicado por [L]. Por consiguiente, las unidades de afinidad
son M–1. Mientras más alta es la Ka, más alta es la afinidad de la
interacción.
Ka =
[RL]
[R][L]
(Ec. 3-2)
El recíproco de la constante de asociación, la constante de disociación, Kd, a menudo se usa para describir las interacciones
entre receptores y ligandos. Se define como:
Kd =
[R][L]
[RL]
(Ec. 3-3)
Las unidades de la constante de disociación están en molaridad
(M). La inspección de esta ecuación revela que cuando la mitad
de los sitios receptores están ocupados con ligando —es decir,
[R] = [RL]—, la Kd es igual a la concentración de ligando libre
[L]. Mientras más baja es la Kd, más alta es la afinidad de la
interacción.
Para propósitos de comparación, es útil considerar que los
valores de Kd de muchas interacciones enzima-sustrato se ubican en el rango de 10–3 a 10–5 M. Los valores de Kd de interacciones antígeno-anticuerpo al principio de una respuesta
inmunitaria normalmente son del orden de 10–4 a 10–5 M; sin
embargo, puesto que los anticuerpos generados en el momento
de la estimulación con antígeno son mutados y seleccionados en
el transcurso de una respuesta inmunitaria, las interacciones
antígeno-anticuerpo en etapas tardías de una respuesta inmunitaria pueden alcanzar una Kd tan baja como de 10–12 M. En
estas condiciones, si un antígeno está presente en solución a una
concentración tan baja como de 10–12 M, la mitad de los sitios
de unión a anticuerpo disponibles estará ocupada. Ésta es una
interacción extraordinariamente fuerte entre receptor y ligando.
Las interacciones entre receptores y ligandos
pueden ser multivalentes
Muchos receptores biológicos, incluso receptores de célula B,
son multivalentes —es decir, tienen más de un sitio de unión a
ligando por cada molécula—. Cuando tanto los receptores
como los ligandos son multivalentes —como ocurre, por ejemplo, cuando un receptor de inmunoglobulina bivalente sobre la
superficie de una célula B se une a dos antígenos repetidos idénticos sobre una superficie bacteriana—, la interacción de unión
general entre la célula bacteriana y el receptor de célula B está
notoriamente aumentada en comparación con una interacción
similar, pero univalente. De esta manera, múltiples interacciones receptor-ligando concurrentes aumentan la fuerza de unión
entre dos superficies celulares. Note que la unión por medio
de dos sitios receptores idénticos a dos ligandos idénticos sobre
la misma célula puede ser un poco menos de dos veces tan firme
como la unión por medio de un sitio receptor único. Esto se
debe a que la unión de ambos sitios receptores a dos ligandos
sobre un antígeno único puede tensar un poco las características geométricas de la unión en uno de los sitios o en ambos y,
por ende, interferir un poco con el “ajuste” de las interacciones
individuales.
Gran parte del beneficio de la multivalencia depende del
hecho de que las interacciones de unión no covalente son inhe-
|
Capítulo 3
67
rentemente reversibles; el ligando pasa parte del tiempo unido
al receptor, y parte del tiempo en un estado no unido, o “inactivo” (figura 3-2a). Cuando está involucrado más de un sitio de
unión, es menos probable que todos los sitios receptores estén
simultáneamente en el estado “inactivo” y, por ende, que el
receptor libere el ligando (figuras 3-2b y 3-2c).
El término avidez se usa para describir la fuerza general de
las interacciones de unión colectivas que ocurren durante unión
multivalente. Durante las fases tempranas de la respuesta inmunitaria adaptativa a antígenos multivalentes, las células B secretan anticuerpo IgM, que tiene 10 sitios de unión a antígeno
disponibles por cada molécula. Por ende, la IgM tiene capacidad de unión a antígenos a una magnitud importante desde el
punto de vista biológico, incluso si la afinidad de cada sitio de
unión individual por su antígeno es baja, debido a la avidez de la
interacción antígeno-anticuerpo entera. De igual modo, cuando
un receptor unido a célula se une a un ligando unido a célula,
su interacción puede ser funcionalmente multivalente, incluso
si las moléculas receptoras individuales son monovalentes, porque
múltiples moléculas receptoras pueden agruparse en la membrana celular y participar en la interacción receptor-ligando.
Además, otras interacciones con correceptor también pueden
contribuir a la avidez general de la unión entre una célula y su
antígeno (véase más adelante).
La afinidad de las interacciones receptor-ligando puede
medirse mediante técnicas como diálisis de equilibrio o resonancia de plasmón de superficie (spr). Estos dos métodos se
describen en el capítulo 20.
a)
“Activo”
“Inactivo”
FigurA 3-2 Unión monovalente y bivalente. a) Unión
monovalente. El receptor existe en equilibrio con su ligando, representado aquí como un círculo. Parte del tiempo está unido (la unión se
encuentra en el estado “activo”), y parte del tiempo está no unido (la
unión se encuentra en el estado “inactivo”). La proporción del tiempo que
se pasa en el estado “activo” en contraposición con “inactivo” determina la
afinidad de la interacción de receptor-ligando, y se relaciona con la fuerza
de la suma de las interacciones de unión no covalente entre el receptor
y el ligando. (Continúa)
68
sección I
|
Introducción
b)
FigurA 3-2 (continuación) b) Unión bivalente. Aquí se visualiza un receptor bivalente, que se une a dos sitios en un ligando multivalente único. Esto podría representar, por ejemplo, una molécula de
anticuerpo bivalente que se une a una bacteria que tiene antígenos
repetidos sobre su superficie. En esta representación, ambos sitios están
ocupados. c) En esta representación, el receptor bivalente se ha separado
La expresión de receptor y ligando puede variar en
el transcurso de una respuesta inmunitaria
Una de las características más notorias de la lógica molecular de
las respuestas inmunitarias es que los receptores para algunos
factores de crecimiento y citocinas sólo se expresan según se
re­­quiere. Por ejemplo, casi todos los linfocitos expresan una
forma de baja afinidad, heterodimérica (de dos cadenas), del
receptor para la citocina interleucina-2 (IL-2), que inicia una
señal que promueve la proliferación de linfocitos (esta citocina
y su receptor se cubren con mayor detalle en el capítulo 4). Esa
forma de baja afinidad del receptor es incapaz de unirse a la IL-2
a concentración fisiológica de citocina. Con todo, cuando un
linfocito es activado por unión a antígeno, la señal que proviene
del receptor unido a antígeno causa un incremento de la expresión de una tercera cadena del receptor de IL-2 en la superficie
celular (figura 3-3). La adición de esta tercera cadena convierte
la forma de baja afinidad del receptor de IL-2 en una forma de
alta afinidad, capaz de responder a la concentración de citocina
que se encuentra en los órganos linfoides. El corolario funcional
de esto es que sólo los linfocitos que ya se han unido a antígeno
y han sido estimulados por esa unión, tienen receptores de
citocina de afinidad suficientemente alta para responder a la
concentración fisiológica de citocina. Al esperar hasta que ha
interactuado con su antígeno específico antes de expresar el re­­
ceptor de citocina de alta afinidad, el linfocito conserva energía
y evita el inicio accidental de una respuesta inmunitaria contra
un antígeno irrelevante.
Las concentraciones locales de citocinas y otros
ligandos pueden ser en extremo altas
Al considerar las interacciones entre receptores y sus ligandos,
es importante considerar el ambiente anatómico en el cual están
ocurriendo estas interacciones. Los linfocitos y las células presentadoras de antígeno que participan en una respuesta inmunita-
c)
momentáneamente de uno de sus sitios, pero aún está fijo al ligando
con el otro. Las proteínas grandes, como los anticuerpos, vibran y “respiran” continuamente, lo que da lugar a esa cinética de activo-inactivo.
La unión bivalente o multivalente ayuda a asegurar que cuando un
sitio libera momentáneamente el ligando, la interacción no se pierde
por completo, como se pierde en la parte a).
ria pasan cantidades importantes de tiempo juntos por medio
de múltiples interacciones receptor-ligando. Las señales de citocina liberadas por una célula T, por ejemplo, son recibidas por
una célula presentadora de antígeno unida en la interfaz entre
las células, antes de que la citocina haya tenido tiempo para
difundirse hacia los líquidos tisulares. La secreción de citocinas
hacia exactamente el sitio donde se necesitan es facilitada por la
capacidad de la señalización de receptor de antígeno para inducir redistribución del centro organizador de microtúbulos
(mtoc) dentro de la célula T activada. A su vez, la reorientación del mtoc causa la redistribución de los orgánulos secretores (el cuerpo de Golgi y vesículas secretoras) dentro del
citoplasma de la célula T, de modo que las citocinas sintetizadas
por la célula T son secretadas en la dirección del receptor de
célula T que, a su vez, está unido a la célula presentadora de antígeno. El término técnico para este fenómeno es la redistribución
vectorial (direccional) del aparato secretor. De este modo, las citocinas son secretadas de manera directa hacia el espacio entre la
célula T activada y la célula presentadora de antígeno.
La redistribución vectorial del aparato secretor en células
dendríticas presentadoras de antígeno también ocurre en el
momento de interacción con células T específicas para antígeno. Esto asegura que las citocinas, como la IL-12, que son
secretadas por células dendríticas, sean suministradas con eficiencia a las células T que reconocen antígeno. La figura 3-4
muestra la secreción direccional de la citocina IL-12 por una
célula dendrítica presentadora de antígeno que participa en la
activación de una célula T.
Las células efectoras del sistema inmunitario, como las células B, también son capaces de presentar antígenos sobre su
superficie celular para reconocimiento por células T auxiliares.
Una célula B que ha reconocido de manera específica un antígeno por medio de su propio receptor procesará el antígeno y
expresará una concentración en particular alta de los péptidos
antigénicos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (mhc) sobre su superficie. Por ende, una célula T
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
FigurA 3-3 La expresión de algunos receptores de cito-
cina está regulada en dirección ascendente después de
estimulación celular. Leucocitos teñidos con dapi, un colorante
que detecta dna (azul), no se trataron (izquierda) o se estimularon con
el mitógeno de células T humanas fitohemaglutinina (derecha). En el
auxiliar, unida a un antígeno presentado sobre la superficie de
una célula B, suministrará una concentración alta de citocinas
directamente a una célula B activada, específica para antígeno.
Por consiguiente, la concentración local de citocinas en las interfases celulares puede ser en extremo alta, mucho más alta que en
los líquidos tisulares en general.
Estrategias comunes usadas
en muchas vías de señalización
Una vía de transducción de señal es la ruta molecular mediante
la cual una interacción ligando-receptor se traduce en un cambio bioquímico dentro de la célula afectada. La comunicación
del mensaje del ligando a la célula es iniciada por la complementariedad de estructura entre el ligando y su receptor, que da
|
Capítulo 3
69
momento de la estimulación, la cadena alfa del receptor de IL-2 (IL-2Rα)
(amarillo) está regulada en dirección ascendente, lo que aumenta la
afinidad del receptor de IL-2 por la IL-2. En el momento de estimulación
con antígeno se observa una regulación ascendente similar del IL-2Rα.
[Cortesía de R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA.]
lugar a una interacción de unión de fuerza y duración suficientes para desencadenar un cambio bioquímico en el receptor, o
en sus moléculas asociadas, o en ambos. A su vez, este cambio
bioquímico puede causar una diversa gama de consecuencias bioquímicas en la célula (figura 3-5, Perspectiva general). Los
términos torrente arriba y torrente abajo a menudo se usan para
describir elementos de vías de señalización. Los componentes
torrente arriba de una vía de emisión de señales son los que
están más cerca del receptor; los componentes torrente abajo
son los que están más cerca de las moléculas efectoras que
determinan el resultado de la vía; por ejemplo, los factores de
transcripción o enzimas cuyas actividades son modificadas en
el momento en que se recibe la señal.
Pese a lo discrepantes y complejas que algunas de estas
vías de señalización pueden ser, muchas comparten características. En esta sección, para proporcionar un marco para
analizar las vías individuales empleadas por las células del sis-
FigurA 3-4 Secreción polarizada de IL-12 (rosado) por
células dendríticas (azul) en la dirección de una célula T
unida (verde). La micrografía con aumento más alto muestra la secreción de paquetes de IL-12 a través de la membrana de la célula dendrítica. [J. Pulecio et al., 2010, Journal of Experimental Medicine 207:2,719.]
70
sección I
Introducción
|
3-5
Perspectiva general
Conceptos en la señalización de linfocitos
Correceptor
Ligando
Receptor
Moléculas asociadas
a receptor
PIP2
Tirosina cinasa
asociada a receptor
PIP2
PIP3
DAG
PIP3
DAG
Ras-GRP
PLCγ
PI3
cinasa
IP3
Liberación de Ca2+
desde el retículo
endoplasmático
P
PKC
SOS
P
P
P
P Adaptador
P
Intercambio
de GDP/GTP
P
Adaptador
P
Fosforilación
P
Ras
Activación de calmodulina
y calcineurina
NFAT
Citoplasma
DAG
NF-κB
P
P
NFAT
Núcleo
La unión de ligando a receptores sobre una célula induce diversos
efectos torrente abajo, muchos de los cuales culminan en activación de
factor de transcripción. Aquí se ilustran algunas de las vías que se abordan en este capítulo. La unión del receptor a ligando induce agrupación de receptores y moléculas emisoras de señales hacia regiones de
la membrana denominadas balsas de lípidos (rojo). La unión de receptor a ligando puede acompañarse de unión de correceptores asociados
a sus propios ligandos, y causa la activación de tirosina cinasas asociadas con receptor, que fosforilan proteínas asociadas con receptor. La
unión de moléculas adaptadoras torrente abajo a los grupos fosfato
sobre proteínas adaptadoras crea un andamio en la membrana que
permite entonces la activación de diversas enzimas, entre ellas fosfatasa
Cγ (PLCγ), PI3 cinasa, y otras tirosina cinasas. PLCγ divide el fosfatidil
inositol bifosfato (PIP2) para dar trifosfato de inositol (IP3), que interactúa
con receptores sobre vesículas del retículo endoplasmático para causar
P
IκB
Ubiquitinación
y destrucción
Cascada de la
MAP cinasa
AP-1
NF-κB
Activación de gen
la liberación de iones calcio; éstos a su vez activan la calcineurina, que
desfosforila el factor de transcripción nfat, lo que le permite entrar al
núcleo. El diacilglicerol (dag), que permanece en la membrana después de división de PIP2 por PLCγ, se une a, y activa, la proteína cinasa
C (pkc), que fosforila y activa enzimas que llevan a la destrucción del
inhibidor del factor de transcripción NF-κB. Con la liberación del inhibidor, NF-κB entra al núcleo y activa una serie de genes importantes para
el sistema inmunitario. La unión de la proteína adaptadora Ras-GRP al
complejo de emisión de señales permite la unión y la activación del
factor de intercambio de nucleótido guanina (gef ), Son of Sevenless
(sos) que, a su vez, inicia la cascada de fosforilación de las vías de la
MAP cinasa. Esto da pie a la entrada de un tercer grupo de factores de
transcripción al núcleo, y activación del factor de transcripción AP-1.
(Muchos detalles que se explican en el texto se han omitido de esta
figura en aras de la claridad.)
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
tema inmunitario, se describen algunas de las estrategias compartidas por muchas vías de emisión de señales. En la sección
que sigue se proporcionan tres ejemplos de vías de emisión de
señales usadas por el sistema inmunitario, así como por otros
sistemas.
La unión a ligando puede inducir cambios
conformacionales en el receptor, o agrupación del
receptor, o ambos
El primer paso necesario para la activación de una vía de señalización es que el sitio de unión del ligando a sus receptores de
alguna manera induce un cambio físico o químico en el receptor mismo, o en moléculas asociadas a él. En el caso de muchos
receptores de factor de crecimiento, la unión a ligando induce
un cambio conformacional en el receptor que da lugar a dimerización de receptor (figura 3-6). Puesto que las regiones citoplasmáticas de muchos receptores de factor de crecimiento
tienen actividad de tirosina cinasa, esto da lugar a la fosforilación recíproca de las regiones citoplasmáticas de cada una de las
moléculas receptoras por su pareja de dimerización.
Otros receptores pasan por cambios conformacionales en el
momento de unión a ligando, que dan lugar a órdenes más altos
de polimerización de receptor. Los receptores sobre células B
son formas unidas a membrana de las moléculas de anticuerpo
que la célula B finalmente secretará. En la superficie de células
B vírgenes hay dos tipos de receptores de antígeno, que se denominan inmunoglobulinas M y D (IgM e IgD). Estudios estructurales de la forma IgM del receptor han revelado que la unión
a ligando induce un cambio conformacional en una parte no de
unión a antígeno del receptor, cerca de la membrana, que facilita la agregación de receptores hacia complejos multiméricos, y
su movimiento subsiguiente hacia regiones de la membrana
especializadas. De modo similar, los receptores de célula T se
Factor de
crecimiento
Citosol
P
Dominio
de tirosina
cinasa
Tirosina cinasas
receptoras inactivas
P
P P
P
P
P
P
Actividad de cinasa estimulada
por fosforilación cruzada
FigurA 3-6 Algunos factores de crecimiento inducen
dimerización de sus receptores, seguida por fosforilación de
tirosina recíproca de las moléculas de receptor. Muchos receptores de factor de crecimiento poseen actividad de tirosina cinasa en sus
regiones citoplasmáticas. La dimerización del receptor ocurre en el
momento de unión del ligando relevante y permite fosforilación recíproca en múltiples sitios de las cadenas de receptor dimerizadas, lo que
inicia la cascada de señalización. Como un ejemplo, el factor de células
madre se une a su receptor, c-kit (CD117), sobre la superficie de
células del estroma de la médula ósea.
|
Capítulo 3
71
agrupan en el momento de unión a antígeno. Persisten las controversias respecto a si pasan o no por un cambio conformacional en el momento de unión a antígeno.
Algunos receptores requieren moléculas asociadas
a receptor para emitir una señal de activación
celular
En contraste con los receptores de factor de crecimiento, que
tienen actividades enzimáticas inducibles integradas en la
molécula de receptor misma, los receptores de célula T y B tienen componentes citoplasmáticos muy cortos y, por ende, necesitan ayuda de moléculas asociadas a receptor intracelulares
para desencadenar transducción de señal. El heterodímero Igα/
Igβ (CD79α/β) en células B, y el complejo CD3 hexamérico en
células T, están estrechamente asociados con sus receptores de
antígeno respectivos, y se encargan de transmitir al interior de la
célula las señales iniciadas por unión a ligando (figura 3-7). Estos
dos complejos tienen un par de colas citoplasmáticas largas que
contienen múltiples copias del motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (Immuno-receptor Tyrosine
Activation Motif [itam]). Los itam son motivos de secuencia recurrentes que se encuentran en muchas proteínas emisoras de señales dentro del sistema inmunitario, que contienen
tirosinas que quedan fosforiladas después de transducción de
señal por medio del receptor asociado. La fosforilación de residuos de itam-tirosina a continuación permite el acoplamiento
de moléculas adaptadoras, lo que facilita el inicio de la cascada de
señalización.
Otras moléculas asociadas con los receptores de antígeno de
célula B o T también pueden interactuar con el antígeno o con
otras moléculas sobre la superficie del agente patógeno. Por
ejemplo, en el caso de las células B, el complejo de CD19/CD21
se une a moléculas de complemento fijas de manera covalente al
antígeno (figura 3-7a). De modo similar, moléculas de CD4 y
CD8 sobre células T se unen a regiones no polimórficas de la
molécula de mhc que presenta antígenos, y ayudan en la transducción de señal (figura 3-7b). Por último, el correceptor CD28
sobre células T vírgenes debe interactuar con sus ligandos CD80
(B7-1) y CD86 (B7-2) para que ocurra activación completa de
célula T.
La agrupación de receptor inducida por ligando
puede alterar la ubicación de receptor
La agrupación inducida por ligando de receptores de célula B y
T lentifica las tasas de su difusión dentro de los planos de sus
respectivas membranas celulares, y facilita su movimiento hacia
regiones especializadas de la membrana del linfocito conocidas
como balsas de lípidos. Estas balsas son regiones de la membrana ricas en colesterol y en esfingolípidos, insolubles en detergente, muy ordenadas, pobladas por muchas moléculas cruciales
para la emisión de señales de receptor. El movimiento de receptores y correceptores hacia las balsas de lípidos las hace susceptibles a la acción de enzimas asociadas con esas balsas. En la
figura 3-8 se muestra cómo la tirosina cinasa asociada a balsa
Lyn inicia la cascada de emisión de señales de célula B al fosforilar las moléculas asociadas con receptor Igα e Igβ. La tirosina
cinasa Lck desempeña una función similar en la cascada de
señalización de tcr.
72
sección I
Introducción
|
C3d
Antígeno
CD21
mIgM
CD81
(TAPA-1)
MHC
clase II
CD4
CD80 o
CD86
Péptido
CD19
TCR
δ ε
γ ε
ζ ζ
CD28
ss
lgα/lgβ
(CD79α,β)
ITAM
CD3
FigurA 3-7 Los receptores de células tanto B como T
requieren moléculas asociadas a receptor y correceptores
para la transducción de señal. a) Los receptores de célula B
requieren Igα/Igβ para transmitir su señal. El correceptor CD21, que está
asociado con CD19, se une a la molécula de complemento C3d, que se
une de manera covalente al antígeno. La interacción entre CD21 sobre
la célula B, y C3d asociada con el antígeno, mantiene el antígeno en
contacto con el receptor de célula B, incluso cuando la unión de antígeno-BCR es relativamente débil. Las bandas de color amarillo sobre las
re­giones citoplasmáticas de las moléculas asociadas a receptor indican
motivos de activación de inmunorreceptor basados en tirosina (Immunoreceptor Tyrosine Activation Motifs [itam]). La fosforilación de residuos
tirosina en estos motivos permite la unión de moléculas adaptadoras
torrente abajo, y facilita la transducción de señal desde los receptores.
Tanto CD19 como Igα/Igβ portan itam intracitoplasmáticos y, junto
con CD81 (TAPA-1), participan en eventos de señalización torrente
abajo. b) Los receptores de célula T usan CD3, un complejo de cadenas
δε, γε, y un par de moléculas de cadena ζ o un par de ζν. Los correceptores CD4 y CD8 se unen a la región no polimórfica de las moléculas del
mhc clase II o clase I, respectivamente; esta figura ilustra la unión de
CD4 a mhc clase II. Dicha unión asegura la conexión entre la célula T y
la célula presentadora de antígeno, e inicia también una señal por
medio de CD4/8. El correceptor CD28 proporciona otra señal en el
momento de unión a CD80 o CD86. La unión de CD28 a moléculas
coestimuladoras sobre células presentadoras de antígeno se requiere
para estimulación de células T vírgenes, pero no de memoria.
Antígeno
BCR
Balsa
lgα/lgβ
Lyn
+ Antígeno
Lyn
– Antígeno
Lyn
BLNK
P
P
P
P
Syk
Syk
Traducción
de señal
FigurA 3-8 Regiones balsa de lípidos dentro de membranas. En células B en reposo, el receptor de célula B (bcr) es excluido de
las balsas de lípidos, que son regiones de la membrana altas en colesterol y ricas en glicoesfingolípidos. La balsa está poblada por moléculas
emisoras de señales de tirosina cinasa, como Lyn. En el momento de
unión a antígeno, el bcr se multimeriza (forma agrupaciones), y los
cambios en la conformación del bcr desencadenados por su multime-
BLNK
Internalización
de receptor
rización aumentan la afinidad del bcr por los lípidos de la balsa. El
movimiento del bcr hacia la balsa lo pone en contacto con la tirosina
cinasa Lyn, que fosforila las proteínas asociadas a receptor Igα/Igβ lo
que, así, inicia la cascada de activación. Un movimiento similar de tcr
hacia balsas de lípidos ocurre en el momento de activación de célula T.
[Adaptado de S. K. Pierce, 2002, Nature Reviews Immunology 2:96.]
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
Inactiva
Activa
SH2
SH2
P
pY508
Y397
Cinasa
Y508
P
pY397
Cinasa
FigurA 3-9 Activación de cinasas de la familia Src. Las
cinasas de la familia Src son mantenidas en una configuración cerrada,
inactiva, por la unión de un residuo de tirosina inhibidor fosforilado
(pY508 en este ejemplo) con un dominio SH2 en la misma proteína. La
desfosforilación de esta tirosina abre la molécula, lo que permite que el
sustrato tenga acceso al sitio enzimático. La abertura de la cinasa también
permite la fosforilación de una tirosina interna diferente (pY397), que
estimula más la actividad de la cinasa Src.
La fosforilación de tirosina es un paso temprano en
muchas vías de señalización
Muchas vías de emisión de señales, en particular las que emiten
señales para el crecimiento de células o la proliferación de estas
últimas, se inician con un evento de fosforilación de tirosina.
Muchas de las tirosina cinasas que inician la activación de bcr
y tcr pertenecen a la familia de enzimas conocida como cinasas
de la familia Src. Las cinasas de la familia Src (que en idioma
inglés se pronuncia “sark”) tienen homología con un gen, c-src,
que se identificó por vez primera en aves. Se mostró que un
virus del sarcoma Rous homólogo de estos genes, activo de manera
cuadro 3-1
|
Capítulo 3
73
constitutiva, v-src, induce una forma de cáncer, el fibrosarcoma,
en aves. El hecho de que una mutación sencilla en esta forma viral
de un gen que codifica para tirosina cinasa podría dar lugar a la
aparición de un tumor fue el primer indicio de que los genes que
codifican para tirosina cinasa pueden ser importantes en la regulación de la proliferación celular y, de hecho, en muchos aspectos
de la señalización celular.
Las cinasas de la familia Src son importantes en las etapas
más tempranas de activación de células tanto T como B. Lck y
Fyn son cruciales para la activación de células T, y Lyn, Fyn y Blk
desempeñan los papeles iniciadores correspondientes en células B.
Puesto que la activación inadvertida de estas enzimas puede
llevar a proliferación incontrolada —un precursor para la formación de tumor—, no sorprende que su actividad esté estrechamente regulada de dos maneras distintas pero interconectadas.
Las enzimas tirosina cinasa de la familia Src inactivas existen
en una conformación cerrada, en la cual una tirosina fosforilada
está estrechamente unida a un dominio SH2 (dominio de homología de SH2 [Src homology 2]) interno (figura 3-9, cuadro 3-1).
(Los dominios SH2 en proteínas se unen a residuos de tirosina
fosforilados.) Mientras la tirosina inhibitoria esté fosforilada, la
cinasa de la familia Src permanece plegada sobre sí misma e inactiva. En linfocitos, la enzima tirosina cinasa Csk se encarga de
mantener la fosforilación de la tirosina inhibitoria. Aun así, en el
momento de la activación celular, una tirosina fosfatasa elimina
el fosfato inhibidor, y la cinasa de la familia Src se abre hacia una
conformación parcialmente activa. Así, el evento iniciador en la
transducción de señal a menudo es el movimiento de la tirosina
cinasa hacia una región de la célula o la membrana poblada por
una fosfatasa activadora, apropiada, y distante de la cinasa inhibidora Csk. A continuación se logra actividad completa cuando la
cinasa de la familia Src se fosforila a sí misma en un segundo residuo de tirosina activador.
Dominios seleccionados de proteínas adaptadoras y sus motivos blanco de unión
Dominio de proteína adaptadoraEspecificidad de unión de dominio adaptador
Homología de Src 2 (SH2)Fosfotirosina específica (pY) —que contiene motivos en el contexto de tres a seis aminoácidos ubicados en
posición carboxilo terminal a la pY (se requiere una arginina invariable en el dominio SH2 para unión a pY)
Homología de Src 3 (SH3)Secuencias ricas en prolina en una hélice de poliprolina zurda (los residuos de prolina por lo
general van precedidos por un residuo alifático)
Unión a fosfotirosina (PTB)Motivos peptídicos que contienen pY (DPXpY, donde X es cualquier aminoácido) en el contexto
de secuencias amino terminal
Homología de pleckstrina (PH)Fosfoinositidas específicas, que permiten que proteínas que contienen PH respondan a la
generación de segundos mensajeros lípidos generados por enzimas como la PI3 cinasa
WWSe une a secuencias ricas en prolina (su nombre se deriva de dos residuos de triptófano [W]
conservados, con 20 a 22 aminoácidos de separación)
Secuencias ricas en cisteína (C1)Diacilglicerol (DAG) (en asociación con DAG, el dominio C1 muestra afinidad aumentada por la membrana lipídica, lo que promueve el reclutamiento de proteínas que contienen C1 hacia la membrana)
Unión a tirosina cinasa (TKB)Dominio de unión a fosfotirosina divergente de los dominios SH2 y PTB típicos (consta de tres
motivos estructurales [un fascículo de cuatro hélices, una mano EF, y un dominio SH2 divergente],
que juntos forman un dominio de reconocimiento de fosfoproteína integrado)
Rico en prolinaTramos de secuencia de aminoácidos ricos en residuos de prolina, capaces de unirse a dominios
modulares, entre ellos dominios SH3 y WW
Motivos de unión a 14-3-3Residuos de serina fosforilados en el contexto de uno de los dos motivos RSXpSXP y RXXXpSXp
[Según G.A. Koretsky y P.S. Myung, 2001, Nature Reviews Immunology 1:95]
74
sección I
Introducción
|
particular. En muchas vías de emisión de señales, múltiples pro­
teínas adaptadoras pueden participar en la formación de un
andamio de proteína que proporciona un marco estructural
para la interacción entre miembros de una cascada de emisión
de señales. Los dominios en particular comunes en proteínas
adaptadoras que funcionan en la señalización del sistema inmunitario son el dominio SH2 que se une a residuos de tirosina
fosforilados (pY), el dominio SH3 que se une a agrupaciones de
residuos de prolina, y el dominio de homología de plecstrina
(PH) que se une a fosfatidil inositol trifosfato en la membrana
plasmática.
La unión de proteínas adaptadoras puede simplemente poner
en contacto moléculas entre sí, de modo que, por ejemplo, una
enzima puede actuar sobre su sustrato. De modo alternativo, la
unión de una proteína adaptadora puede inducir un cambio
conformacional, que a su vez puede estabilizar la pareja de
unión, desestabilizarla o activarla.
La transducción de señal puede inducir cambios conformacionales en proteínas que a su vez dan lugar a descubrimiento
de uno o más dominios de proteína con afinidad específica por
otras proteínas. Esas interacciones pueden ser homotípicas (in­­
teracciones entre dominios idénticos) o heterotípicas (interacciones entre dominios diferentes).
La fosforilación de tirosina puede desencadenar cambios en
una vía de emisión de señales de más de una manera. A veces,
la fosforilación de un residuo de tirosina puede inducir un cambio conformacional en la proteína fosforilada misma, que puede
echar a andar esta actividad enzimática o desactivarla. De ma­­
nera alternativa, la fosforilación de tirosina de componentes de
un complejo receptor puede permitir que otras proteínas se unan
a él por medio de sus dominios SH2 o de unión a fosfotirosina
(cuadro 3-1), lo que altera sus ubicaciones dentro de la célula.
Note que una tirosina fosforilada a menudo se denomina un
residuo “pY”.
Las proteínas adaptadoras recolectan miembros
de vías de señalización
Es fácil imaginar el citoplasma como un océano de macromoléculas, con poca estructura u organización, en el cual las proteínas se golpean una a otra a una frecuencia que sólo depende de
sus concentraciones citoplasmáticas generales. De cualquier
modo, nada podría estar más lejos de la verdad. El citoplasma
de hecho es un ambiente intrincadamente organizado, en el cual
disposiciones tridimensionales de proteínas se forman y dispersan de una manera dirigida por eventos de emisión de señales
celulares. Muchas de estas interacciones reversibles entre proteínas están mediadas por proteínas adaptadoras, así como por
interacciones entre miembros de vías de señalización con componentes del citoesqueleto.
Las proteínas adaptadoras carecen de función enzimática o
de receptor intrínseca; tampoco actúan como factores de transcripción. Su función es unirse a motivos o dominios específicos
sobre proteínas o lípidos, enlazar uno al otro; poner sustratos al
alcance de enzimas, y en general mediar la redistribución de
moléculas dentro de la célula. El cuadro 3-1 lista varios dominios adaptadores representativos, junto con sus especificidades
de unión. Las proteínas adaptadoras se caracterizan por tener
múltiples dominios de superficie, cada uno de los cuales posee
una especificidad de unión precisa para una estructura molecular
+ NH3
CH2
CH
COO −
La fosforilación sobre residuos de serina
y treonina también es un paso común en
vías de señalización
En tanto la fosforilación de tirosina suele observarse al inicio de
una cascada de emisión de señales, la fosforilación de proteínas
en residuos de serina y treonina (figura 3-10) tiende a ocurrir en
pasos más avanzados en la activación celular. La fosforilación
de serina o treonina puede servir para activar una enzima fosforilada, para inducir la interacción de una proteína fosforilada
con un grupo diferente de proteínas, para alterar la ubicación
de la proteína dentro de la célula, para proteger la proteína
contra destrucción o, en algunos casos importantes, para con-
COO −
+
H3N
COO −
+
CH
H 3N
CH
CH2OH
CH
H 3C
OH
Tirosina
Treonina
Serina
Tirosina
cinasa
Serina/treonina
cinasas
+ NH3
CH2
CH
OH
COO −
+
H3N
OPO32−
Fosfotirosina
FigurA 3-10 Tirosina, serina y treonina fosforiladas.
COO
−
+
H3N
CH
CH2O PO32−
3-Fosfoserina
COO −
CH
CH
H 3C
OPO32−
Fosfotreonina
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
vertir la proteína fosforilada en un blanco para la destrucción
proteosomal.
La fosforilación de fosfolípidos de membrana
recluta proteínas que contienen dominio PH hacia
la membrana celular
El fosfolípido fosfatidilinositol bifosfato (Phosphatidyl Inositol bis-Phosphate [PIP2]) es un componente de la cara interna
de membranas plasmáticas de eucariontes. No obstante, el PIP2
es mucho más que un fosfolípido estructural; también participa
de manera activa en la emisión de señales celulares. La enzima
fosfatidil inositol-3-cinasa (Phosphatidyl Inositol-3-kinase
[PI3 cinasa]), activada en el transcurso de la señalización por
medio de muchos receptores inmunitarios, fosforila el PIP2
para formar fosfatidil inositol trifosfato (Phosphatidyl Inositol tris-Phosphate [PIP3]) (figura 3-11). El PIP3 permanece en
la membrana y sirve como un sitio de unión para proteínas que
portan dominios de homología a plecstrina (PH) (cuadro 3-1).
Así, este evento de fosforilación de lípido sirve para mover proteínas desde el citosol hacia la membrana y proporcionarles un
O
O
O
O
O
O−
OH
P
O
O
OH
O
O−
O
P
O−
O
O
O
O
O−
P
O
P
O−
O−
−
FigurA 3-11 El PIP2 puede ser fosforilado (rojo) por la PI3
cinasa para crear PIP3 durante la activación celular. El PIP3 a
continuación crea sitios de unión para proteínas con dominios PH en la
cara interna de la membrana plasmática.
|
Capítulo 3
75
sitio de unión en la superficie de la membrana interna. La ubicación de proteínas en la membrana las pone en contacto con
otros miembros de una cascada de señalización, lo que permite que las enzimas tengan acceso a nuevos sustratos, y permite
la modificación de proteínas adaptadoras, con el montaje subsiguiente de complejos de emisión de señales.
La desintegración de PIP2 por plc, inducida por
señal, causa un incremento de la concentración
citoplasmática de ion calcio
Además de ser fosforilado por la PI3 cinasa, el PIP2 también es
susceptible a un segundo tipo de modificación bioquímica inducida por señal. Una segunda enzima (más correctamente, una
familia de enzimas), la fosfolipasa C (Phospholipase C [plc]),
también es activada en el momento de emisión de señales
de antígeno de linfocitos (figura 3-12). La plc hidroliza el PIP2,
lo cual separa el azúcar trifosfato de inositol (IP3) desde el esqueleto
de diacilglicerol (dag). El dag permanece en la membrana,
donde se une a varias enzimas de señalización importantes, y las
activa. Se libera IP3 hacia el citoplasma, donde interactúa con
receptores de IP3 específicos sobre la superficie de vesículas de
retículo endoplasmático, lo que induce la liberación de iones
calcio (Ca2+) almacenados hacia el citoplasma. Estos iones calcio
a continuación se unen a varias proteínas celulares, y cambian su
conformación y alteran su actividad.
La doble carga positiva de los iones calcio, y el tamaño de
su radio iónico, los hacen en particular idóneos para unión a
muchas proteínas; sin embargo, en el campo de la emisión de
señales celulares, la calmodulina (CaM) es indiscutiblemente la
proteína de unión a calcio de mayor importancia. La CaM es
una proteína en forma de mancuerna, con dos subunidades
globulares separadas por un bastón α-helicoidal (figura 3-13a). Cada
una de las dos subunidades tiene dos sitios de unión a calcio, de
modo que la CaM tiene la capacidad para unirse a cuatro iones
Ca2+. En el momento de la unión a calcio, la CaM pasa por un
cambio conformacional notorio (figura 3-13b), que le permite
unirse a diversas proteínas celulares diferentes, y activarlas.
A medida que se usan iones Ca2+ citoplasmáticos en la unión
a proteínas citoplasmáticas, y la concentración de ion Ca2+ citoplasmática libre disminuye, empiezan a montarse proteínas de
canal de Ca2+ en la membrana. Finalmente, los canales se abren
para permitir la afluencia de más calcio desde el líquido extracelular y completar la activación de las proteínas reguladas por
calcio. El montaje de estas llamadas proteínas de canales de
calcio operados por depósito es imposible en presencia de calcio
intracelular alto.
Muchos tipos diferentes de iones se encuentran en una cé­­
lula, y es razonable preguntar por qué los eucariontes deben
haber adquirido por evolución proteínas con actividades que
muestran tanta capacidad de respuesta a la concentración de
ion Ca2+ intracelular. La respuesta a esta pregunta yace en parte
en el hecho de que es relativamente fácil alterar la concentración
citoplasmática de iones Ca2+. La concentración de Ca2+ en la
sangre y los líquidos tisulares es del orden de 1 mM, mientras
que la concentración citosólica en una célula en reposo está más
cerca de 100 nM —10 000 veces más baja que la concentración
extracelular—. Esta diferencia es mantenida por un sistema de
bombas de membrana eficiente (aunque costoso desde el punto
de vista energético). Además, hay reservas de Ca2+ en concentración más alta dentro de vesículas intracelulares asociadas
76
sección I
|
Introducción
O −O
O
O
O
P HO
O
2−
OH OPO3
OPO32−
OH
H
O
O
Fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2)
Fosfolipasa C
O
OH
O
2−
OH OPO3
H
+
O
2−O
HO
3PO
OPO32−
OH
O
Diacilglicerol (DAG)
(Permanece asociado con la membrana)
Inositol 1,4,5-trifosfato (IP3)
Entra al citoplasma e induce la liberación
de ion Ca2+ a partir de vesículas del ER
FigurA 3-12 El PIP2 puede ser hidrolizado por la PLC para crear DAG e IP3.
con el retículo endoplasmático y las mitocondrias. Así, cualquier evento de señalización que abre canales en la membrana
del retículo endoplasmático, o en la membrana plasmática, y
que permite el flujo libre de iones Ca2+ hacia el citoplasma, facilita un aumento rápido de la concentración citoplasmática de
ion Ca2+.
La ubiquitinación puede inhibir la transducción
de señal o aumentarla
La proteína ubiquitina es una proteína monomérica pequeña,
de 76 residuos, altamente conservada. La unión del carboxilo
terminal de la ubiquitina a residuos de lisina de proteínas blanco
b)
a)
Ca2+
Ca2+
Calmodulina
1
Ca2+
+NH
3
2
COOH
Ca2+
Complejo
de calciocalmodulina
Proteína
blanco
Sitio de unión
a calmodulina
3
La calmodulina se
une a iones Ca2+.
La calmodulina cambia
de conformación,
y se hace activa.
La calmodulina se une
a una proteína blanco.
FigurA 3-13 La proteína reguladora de la unión de calcio calmodulina pasa por un cambio conformacional en el momento
de unión a calcio, que le permite unirse a otras proteínas y activarlas. [Parte a) PDB ID 3CLN.]
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
a menudo va seguida por polimerización de una cadena de
ubiquitinas sobre residuos de lisina seleccionados de la ubiquitina conjugada; esto da lugar a poliubiquitinación de la proteína
blanco. La monoubiquitinación o la poliubiquitinación casi
siempre sirve como un mecanismo mediante el cual las proteínas marcadas son establecidas como objetivo para destrucción
por el proteasoma de la célula. Empero, se sabe que la ubiquitinación en ciertos residuos de proteínas también sirve como una
señal activadora y esta función alternativa de la ubiquitina se
abordará más adelante conforme se describa la activación del
factor de transcripción NF-κB, así como en los capítulos 4 y 5.
Vías de señalización que se
encuentran con frecuencia
El análisis de las rutas bioquímicas mediante las cuales las señales moleculares pasan desde receptores de superficie celular
hacia el interior de la célula ha revelado que algunas vías de
transducción de señal se utilizan repetidas veces en las respuestas celulares a diferentes ligandos. Estas vías se utilizan, de
maneras un poco diferentes, en múltiples sistemas celulares y
de órganos, y en muchas especies. El resultado final de casi todas
estas vías es una alteración del programa de transcripción de la
célula. Aquí se describen brevemente tres de esas vías de particular importancia para el sistema inmunitario adaptativo
(figura 3-5, Perspectiva general). Cada una de estas vías es desencadenada por unión de antígeno al receptor, y conduce a la
activación de una familia de factores de transcripción diferente.
La generación de estos factores de transcripción activos a su vez
inicia la regulación ascendente de una cascada de genes que
tienen importancia para la respuesta inmunitaria, incluso los
que codifican para citocinas, anticuerpos, factores de supervivencia y señales proliferativas.
Si bien el marco conceptual de estas vías de emisión de señales es compartido entre muchos tipos de células, pequeñas
modificaciones en los intermediarios moleculares y factores de
transcripción involucrados permiten que haya variaciones de las
identidades de los genes controlados por señales particulares, y
que haya mecanismos de control de la transcripción específicos
para tipo de célula. Por ejemplo, la enzima plc existe en diferentes formas; la PLCγ1 se usa en células T, y la PLCγ2 en
células B. De modo similar, la familia de factores de transcripción factor nuclear de células T activadas (Nuclear Factor of
Activated T cells [nfat]) incluye cinco miembros, algunos
de los cuales son expresados como variantes empalmadas de
manera diferencial y cada uno de los cuales es afectado por
disposiciones diferentes de señales moleculares.
Además, la activación de la transcripción desde algunos
promotores requiere la unión de múltiples factores de transcripción. Por ejemplo, la expresión completa del gen que codifica
para la interleucina-2 (IL-2) requiere la unión de AP-1, NF-κB
y nfat, además de varios otros factores de transcripción, al
promotor de interleucina. De esta manera, el promotor puede
estar parcialmente activado en presencia de algunos de estos
factores de transcripción, pero no está por completo activo sino
hasta que todos ellos están en su sitio. La sección que sigue se
centra en los principios generales que rigen el control de estas
tres vías, desde la recepción de una señal de antígeno, hasta la
activación de un tipo particular de factor de transcripción.
|
77
Capítulo 3
La vía de la plc induce liberación de calcio
y activación de pkc
Los elementos esenciales de esta vía se presentaron en la exposición sobre las enzimas que modulan el PIP2 en el momento de
la activación celular (figura 3-12), y ahora se sabe que la plc
desintegra la PIP2 hacia IP3 y dag; sin embargo, ¿de qué modo
la plc queda activada en primer lugar? Aquí se usan células T
como ejemplo.
Como se mencionó, las células T usan la forma PLCγ1 de la
enzima. En el momento de la estimulación por antígeno, la fos­
forilación de tirosina de los residuos de itam del complejo
asociado a receptor CD3 da lugar a la localización de la proteína
adaptadora lat a la membrana (figura 3-14). La lat a su vez es
fosforilada, y la PLCγ1 a continuación se une a lat fosforilada;
esta unión asegura que la PLCγ1 se localice a la membrana
CD4
TCR/CD3
PIP3
PIP2 DAG
Itk
PLCγ1
P
Lck
LAT
P
P
IP3
Retículo
endoplasmático
Ca2+
Calcineurina
Calmodulina
(inactiva)
Calmodulina
(activa)
P
NFAT
P
Citoplasma
NFAT
Núcleo
Activación de factor
de transcripción
FigurA 3-14 La activación de la calcineurina por unión
del complejo de calcio-calmodulina induce la desfosforilación de nfat y la entrada del mismo al núcleo.
78
sección I
|
Introducción
celular, el sitio de su sustrato, PIP2. Una vez ubicada en la membrana plasmática, la PLCγ1 es más activada por fosforilación de
tirosina mediada por la cinasa activada por receptor, Lck, así
como por una segunda tirosina cinasa, Itk. La PLCγ1 fosforilada y activada a continuación media la división de PIP2 hacia
IP3 y dag, como se describió.
¿De qué modo estos mediadores secundarios funcionan a
continuación para desencadenar la activación de linfocitos? Los
iones calcio, liberados a partir de reservas intracelulares de IP3, se
unen al intermediario emisor de señales, calmodulina. Cada
mo­lécula de calmodulina se une a cuatro iones calcio, unión que
da lugar a una profunda alteración de su conformación (figura
3-13). El complejo de calcio-calmodulina a continuación se une
a, y activa, la fosfatasa calcineurina, que desfosforila el factor de
transcripción nfat (figura 3-14). Esta desfosforilación induce
un cambio conformacional en nfat, que revela una secuencia de
localización nuclear, que dirige el nfat para que entre al núcleo
y active la transcripción de varios genes blanco importantes de
célula T. Los genes activados por la unión a nfat comprenden los
que codifican para interleucina-2, una citocina que tiene importancia fundamental en el control de la proliferación de células T.
La importancia de la vía de la PLCγ1 para la activación de
células T es ilustrada por los profundos efectos inmunosupresores del fármaco ciclosporina, que se usa para tratar tanto enfermedad autoinmunitaria mediada por células T como rechazo de
trasplante de órgano. En las células T, la ciclosporina se une a la
proteína ciclofilina (inmunofilina), y el complejo de ciclosporina/ciclofilina se une a la calcineurina y la inhibe, lo que suspende con eficacia la proliferación de células T.
La división de PIP2 por plc es una estrategia de emisión de
señales en particular eficiente porque ambos productos de la
desintegración del PIP2 son activos en eventos celulares subsiguientes. El dag, el segundo producto de la desintegración del
PIP2 (figura 3-12), permanece en la membrana, donde se une a
enzimas de la familia de la proteína cinasa C (pkc) y las activa.
Estas cinasas son serina/treonina cinasas activas en diversas
vías de señalización. La proteína cinasa Cθ, importante en la
señalización de células T, sólo requiere unión de dag, mientras
que su pariente, la proteína cinasa C, también debe unirse a
iones Ca2+ para quedar activada por completo. El dag también
está implicado en la vía Ras (que se describe en la sección
siguiente).
La cascada de Ras/Map cinasa activa la
transcripción por medio de AP-1
La vía de emisión de señales Ras se descubrió inicialmente después de que se encontró que una forma viral mutada de la proteína Ras induce cáncer en un modelo de rata. La Ras es una
proteína de unión a gtp, monomérica (que se abrevia proteína G).
Cuando Ras se une a gtp, su conformación cambia hacia
un estado activo, en el cual es capaz de unirse a varias serina/
treonina cinasas, y de activarlas. Empero, la proteína Ras posee
una actividad de GTPasa intrínseca que hidroliza gtp hacia
gdp, y la forma Ras-gdp de la proteína es incapaz de transmitir
una señal positiva a cinasas torrente abajo (figura 3-15); por
ende, la activación de la vía Ras depende de la capacidad para
mantener Ras en su estado unido a gtp. La modulación entre la
forma unida a gtp, activa, y la forma unida a gdp, inactiva, es
desencadenada por dos familias de enzimas. Los factores de
intercambio de guanina-nucleótido (gef) activan Ras al indu-
Factores de intercambio
de nucleótido guanina (GEF)
GTP
GDP
GDP
Inactiva
GTP
Pi
Activa
Proteínas activadoras
de GTPasa (GAP)
FigurA 3-15 Proteínas G monoméricas pequeñas, como
Ras, alteran la conformación dependiendo de si están unidas
a gtp o gdp. La forma unida a gdp de proteínas G pequeñas, como Ras
(verde pálido), es inactiva, y la forma unida a gtp (verde oscuro) es
activa. Las proteínas G pequeñas tienen actividad de GTPasa intrínseca,
que es aumentada por las Proteínas Activadoras de GTPasa (GTPase
activating proteins [gap]). Los factores de intercambio de nucleótido
guanina (guanine nucleotide exchange factors [gef ]) actúan de una
manera opuesta para liberar gdp y promover la unión de gtp.
cirla a liberar gdp y aceptar gtp; las proteínas activadoras de
GTPasa (GTPase Activating Proteins [gap]) inhiben la actividad de proteína al estimular la habilidad intrínseca de Ras
para hidrolizar gtp unido.
Al igual que la vía PLCγ, la vía Ras es iniciada durante activación de linfocitos tanto B como T y, de nuevo, se usarán las
células T como ejemplo. El dag, liberado después de división
de PIP2 mediada por PLCγ1, se une a, y activa, Ras-GRP, una
proteína adaptadora que a continuación recluta el gef, Son of
Sevenless (sos). sos se une a Ras, y la induce para que se una
a gtp, momento en el cual Ras adquiere la capacidad para
unirse a, y activar, el primer miembro de una cascada de enzimas serina/treonina cinasa que se fosforilan y activan una a la
otra. Dado que los miembros de esta cascada se identificaron
por vez primera en experimentos en los que se estudió la activación de células por mitógenos (agentes que inducen proliferación), se denominan la cascada de proteína cinasa activada
por mitógeno (Mitogen Activated Protein Kinase) o de map
cinasa. Los miembros de la cascada son mantenidos en estrecha
proximidad uno a otro mediante la proteína adaptadora ksr.
En la forma de esta cascada de activación de célula T (figura
3-16), RasGTP se une a la map cinasa cinasa cinasa (mapkkk)
Raf. La unión de RasGTP altera la conformación de Raf y estimula su actividad de serina/treonina cinasa. A continuación
Raf fosforila y activa la siguiente enzima en el relevo, una map
cinasa cinasa (mapkk). En este caso mek. mek activada a continuación fosforila su sustrato, la cinasa relacionada con señal
extracelular (Extracellular signal-Related Kinase) o Erk, una map
cinasa, que en consecuencia adquiere la capacidad para pasar a
través de la membrana nuclear.
Una vez dentro del núcleo, Erk fosforila y activa un factor de
transcripción, Elk-1, que coopera con una segunda proteína, el
factor de respuesta sérica (srf), para activar la transcripción
del gen fos. La proteína Fos también es fosforilada por Erk, y
junto con su pareja, Jun, forma el factor de transcripción maestro, AP-1. Jun es fosforilada y activada por medio de una forma
un poco diferente de la vía de la map cinasa. AP-1 es otro de
los factores de transcripción que facilita la transcripción del gen
que codifica para IL-2.
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
|
79
Capítulo 3
Señales mediadas por TCR
TCR/CD3
DAG
Pi
GDP
GTP
Ras-GRP
SOS
(inactiva)
GTP
DAG
PKC
GDP
(activa)
Raf (MAPKKK)
P
Cascada
de MAP
cinasa
MEK (MAPKK)
P
Complejo
de TAK1
Bcl10
MALT1
TRAF6
ERK (MAPK)
NEMO Ub
P
IKK IKK P
Citoplasma
Núcleo
Elk-1 P
NF- B
SRF
Carma-1
Activación de gen
Fos
Fos
P
P
I B Ub
Vía de
NF-κB
Citoplasma
Jun
P
NF- B
P Jun Fos P
AP-1
Activación de gen
FigurA 3-16 La vía Ras involucra una cascada de fosfori-
laciones de serina/treonina, y culmina en la entrada de la
cinasa, Erk, al núcleo, donde fosforila los factores de
transcripción Elk-1 y Fos.
map
La vía Ras es un componente de importancia de muchos programas vinculados con el desarrollo, y de activación celular. Cada
vía usa combinaciones un poco diferentes de proteínas ci­nasas
torrente abajo, pero todas se apegan al mismo modo general de
pasar la señal desde la superficie celular hacia el núcleo por medio
de una cascada de reacciones de fosforilación, con la activación
resultante de un nuevo programa de transcripción.
La pkc activa el factor de transcripción NF-κB
El NF-𝛋B pertenece a una familia de factores de transcripción
heterodiméricos, y cada dímero activa su propio repertorio de
promotores. En las células en reposo, heterodímeros de NF-κB
5´
Activación de gen
Núcleo
3´
FigurA 3-17 La fosforilación y ubiquitinación activa IKK,
que fosforila I𝛋B y lo desactiva, lo que permite la translocación de NF-𝛋B hacia el núcleo.
son mantenidos en el citoplasma mediante unión a la proteína
Inhibidor de NF-𝛋B (I𝛋B). La activación celular induce la fosforilación de estas proteínas inhibidoras mediante un complejo
de IκB cinasa (IKK). La proteína IκB fosforilada a continuación es establecida como objetivo para degradación proteosomal, lo que libera el NF-κB para que entre al núcleo y se una a
los promotores de una amplia gama de genes importantes desde
el punto de vista inmunitario.
NF-κB es importante en el control de la transcripción de proteínas necesarias para el funcionamiento apropiado de muchos
tipos de células de los sistemas inmunitarios innato y adaptativo; en general, la transcripción mediada por NF-κB está asociada con eventos proinflamatorios y de activación, más que
con procesos reguladores. Diferentes tipos de células y receptores usan diversas formas de activación de proteína cinasa, así
como diversas combinaciones de moléculas adaptadoras en
la vía que llevan a la activación de NF-κB. Con todo, todas estas
vías culminan en la fosforilación y la destrucción subsiguiente
del inhibidor de NF-κB, IκB. A continuación se describe la vía de
activación de NF-κB que es desencadenada por el reconocimiento de antígeno por tcr.
80
sección I
|
Introducción
En las células T, la activación de NF-κB empieza cuando el
dag, generado por PLCγ1, recluta la serina/treonina cinasa
PKC a la membrana (figura 3-17). Como se mencionó, PKCθ
es la forma de la serina/treonina cinasa que se usa en la vía de
emisión de señales de receptor de célula T. Una vez unida a
dag, la PKCθ es activada y fosforila proteínas adaptadoras,
incluso Carma1, que inician una cascada que finalmente recluta
la ubiquitina ligasa TRAF6. TRAF6 ubiquitina y activa parcialmente el complejo ikk, que está constituido de la proteína
reguladora nemo, y dos subunidades ikk catalíticas. El complejo ikk sólo es activado por completo cuando está fosforilado
y ubiquitinado. (Note que éste es uno de los casos en los cuales
la ubiquitinación no da lugar a degradación subsiguiente de
proteína, sino más bien a su activación.) Otras señales mediadas
por células T activan el complejo TAK1, que fosforila ikk, lo
que completa su activación y permite que fosforile IκB. En este
paso, la fosforilación de IκB emite señales para su degradación,
más que para su activación. NF-κB a continuación está libre
para moverse hacia el núcleo y activar la transcripción de sus
genes blanco, incluso el gen que codifica para IL-2.
Además de esta vía de activación de NF-κB mediada por
receptor de célula T, la señalización por medio de CD28, el
correceptor de célula T, también ejerce control positivo de la
activación de NF-κB en células T.
Estas tres vías juntas ilustran cómo los conceptos amplios
antes introducidos en este capítulo pueden aplicarse a entender
los mecanismos que subyacen la activación de células T; estos
temas recurren en muchas formas en todo el sistema inmunitario.
La estructura de los anticuerpos
Una vez esbozados algunos de los conceptos generales que
constituyen la base de muchas diferentes interacciones receptor-ligando y vías de señalización, ahora se centrará la atención
de manera más específica en los receptores de antígeno del sistema inmunitario adaptativo.
En el momento de la estimulación con antígeno, las células
B secretan anticuerpos que tienen sitios de unión a antígeno
idénticos a los que están en el receptor de antígeno de la membrana de célula B. La identidad entre los sitios de unión del
anticuerpo secretado y el Receptor de Célula B (BCR) unido a
membrana se demostró por vez primera al sintetizar reactivos
que se unieron a anticuerpos secretados por una clona de células B particular, y mostrar que esos reactivos también se unieron a los receptores sobre las células que habían secretado los
anticuerpos. Dado que trabajar con proteínas solubles es significativamente más fácil que manipular proteínas receptoras de
membrana, la presencia de una forma soluble del receptor facilitó mucho la caracterización de la estructura del receptor de
célula B. En consecuencia, los aspectos de bioquímica básica del
receptor de célula B se establecieron mucho tiempo antes que
los del Receptor de Célula T (TCR) que, a diferencia del bcr,
no se libera en una forma secretada. El recuadro 3-1, Experimento clásico, detalla los experimentos ganadores del Premio
Nobel que establecieron la estructura de cuatro cadenas de la
molécula de anticuerpo.
Esta sección empieza con una exposición de la estructura
de anticuerpos, y después se describe el receptor de membrana de célula B y sus vías de señalización asociadas. Los
anticuerpos secretados y sus formas de receptor unidas a
membrana pertenecen a la familia de proteínas inmunoglobulina. Esta familia grande de proteínas, que incluye receptores
tanto de célula B como de célula T, moléculas de adhesión,
algunas tirosina cinasas y otros receptores inmunitarios, se ca­racteriza por la presencia de uno o más dominios de inmuno­­
globulina.
Los anticuerpos están constituidos de múltiples
dominios de inmunoglobulina
El dominio de inmunoglobulina (figura 3-18) se genera cuando
una cadena polipeptídica se pliega hacia una serie organizada
de cadenas con plegamiento β paralelas. Dentro de cada dominio, las cadenas β están dispuestas hacia un par de láminas β
que forman un dominio terciario, compacto. El número de
cadenas por cada lámina varía entre proteínas individuales. En
moléculas de anticuerpo, casi todos los dominios de inmunoglobulina contienen aproximadamente 110 aminoácidos, y cada
lámina β contiene de tres a cinco cadenas. El par de láminas β
dentro de cada dominio son estabilizadas una respecto a la otra
por medio de un enlace disulfuro intracadena. Los dominios
vecinos están conectados uno a otro por medio de un tramo de
cadena polipeptídica relativamente no estructurada. Dentro
de las cadenas β, aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos alternan,
y sus cadenas laterales están orientadas en posición perpendicular al plano de la lámina. Los aminoácidos hidrofóbicos
sobre una lámina están orientados hacia la lámina opuesta y,
por ende, las dos láminas dentro de cada dominio son estabilizadas por interacciones hidrofóbicas entre las dos láminas, así
como por el enlace disulfuro covalente.
El plegamiento de inmunoglobulina proporciona un ejemplo perfecto de cómo la estructura determina la función, o la
facilita, o ambas cosas. En los extremos de cada una de las láminas β, regiones polipeptídicas que muestran plegamiento más
laxo enlazan una cadena β a la siguiente, y estas regiones laxamente plegadas pueden dar cabida a diversas longitudes y
estructuras de cadena lateral de aminoácidos sin causar alteración alguna de la estructura general de la molécula. Por ende, en
la molécula de anticuerpo, el plegamiento de inmunoglobulina
está muy bien adaptado para proporcionar un andamio único en
el cual pueden construirse múltiples sitios de unión diferentes,
puesto que los sitios de unión a antígeno pueden simplemente
integrarse hacia estas regiones laxamente plegadas de los dominios de unión a antígeno. Estas propiedades explican por qué el
dominio de inmunoglobulina se ha usado en tantas proteínas
con funciones de reconocimiento o de adhesión. La estructura
del dominio esencial proporciona un esqueleto molecular,
mientras que las regiones laxamente plegadas se pueden adaptar
para que se unan de manera específica a muchas estructuras
adhesivas o antigénicas.
De hecho, la estructura del dominio de inmunoglobulina es
usada por muchas proteínas además de las cadenas de bcr. El
receptor de célula T también está constituido de unidades repetitivas del dominio de inmunoglobulina (véase más adelante).
Otras proteínas en las que se utilizan dominios de inmunoglobulina comprenden receptores Fc; las proteínas accesorias del
receptor de célula T CD2, CD4, CD8 y CD28; las proteínas
asociadas a receptor tanto del tcr como del bcr; moléculas de
adhesión, y otras. En la figura 3-19 se ilustran algunas de estas
proteínas que contienen dominio de inmunoglobulina. Cada
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
a)
Dominio CL
|
Capítulo 3
81
Dominio VL
Asas
Cadenas β
COOH
NH2
Enlace disulfuro
CDR
Ordenamiento de cadena β
b)
COOH
NH2
COOH
NH2
CDR
FigurA 3-18 Diagrama de la estructura plegada de inmunoglobulina de los dominios de región variable (VL) y cons­
tante (CL) de la cadena ligera de anticuerpo. a) Las dos láminas
con plegamiento β en cada dominio son mantenidas juntas por interacciones hidrofóbicas y el enlace disulfuro conservado. Las cadenas β que
componen cada lámina se muestran en colores diferentes. Las tres asas
de cada dominio variable muestran considerable variación de longitud y
secuencia de aminoácidos; estas regiones hipervariables (azul) constituyen el sitio de unión a antígeno. Las regiones hipervariables por lo gene-
una de estas proteínas es clasificada como un miembro de la
superfamilia de inmunoglobulina, un término que se usa para
denotar proteínas derivadas de un gen primordial común que
codifica para la estructura del dominio básica.
Los anticuerpos comparten una estructura de dos
cadenas ligeras y dos cadenas pesadas
Todos los anticuerpos comparten una estructura de cuatro
cadenas polipeptídicas (figura 3-20), que consta de dos cadenas
ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (heavy [H]) también idénticas. Cada cadena ligera está unida a su cadena
pesada pareja mediante un enlace disulfuro entre residuos de
cisteína correspondientes, así como por interacciones no covalentes entre los dominios VH y VL y los dominios CH1 y CL.
ral se llaman regiones determinantes de la complementariedad (cdr).
Los dominios de cadena pesada tienen la misma estructura característica.
b) Las láminas con plegamiento β están abiertas para revelar la relación
de las cadenas β individuales y las asas de unión. Note que el dominio
variable contiene dos cadenas β más que el dominio constante. [Parte a)
adaptada de M. Schiffer et al., 1973, Biochemistry 12:4620; reimpreso con autorización; parte b) adaptada de A.F. Williams y A.N. Barclay, 1988, Annual Review of
Immunology 6:381.]
Estos enlaces permiten la formación de un heterodímero estrechamente asociado (H-L). Múltiples puentes disulfuro enlazan
juntas las dos cadenas pesadas a alrededor de la mitad de su
longitud, y las partes C terminal de las dos cadenas pesadas
también participan en interacciones de enlace no covalente
entre dominios correspondientes.
La molécula de anticuerpo forma una Y, con dos regiones de
unión a antígeno en los extremos de la Y (figura 3-21). Cada
región de unión a antígeno está constituida de aminoácidos
derivados de los dominios amino terminal de las cadenas tanto
pesada como ligera. Las cadenas tanto pesada como ligera contribuyen con dos dominios a cada extremo de la Y; el dominio
no de unión a antígeno de cada cadena sirve para extender el
extremo de unión a antígeno. La base de la Y consta de los
dominios C terminal de la cadena pesada de anticuerpo.
experimento clásico
La elucidación de la estructura de anticuerpo
Primer grupo de experimentos
Arne Tiselius, Pers Pederson, Michael
Heidelberger y Elvin Kabat
Desde finales del siglo xix se ha sabido que
los anticuerpos residen en el suero sanguíneo, es decir, en el componente de la sangre
que queda una vez que se han eliminado
células y proteínas de la coagulación. Em­­
pero, la naturaleza química de esos anticuerpos permaneció como un misterio hasta
que Tiselius y Pederson de Suecia, y Heidelberger y Kabat, en Estados Unidos, hicieron
sus experimentos, publicados en 1939. Hi­­
cieron uso del hecho de que, cuando los
anticuerpos reaccionan con un antígeno
proteínico multivalente, forman un comple­jo
multimolecular con enlaces covalentes que
salen de la solución. Este proceso se conoce
como inmunoprecipitación (véanse en el
capítulo 20 los usos modernos de esta técnica). Inmunizaron conejos con la proteína
ovoalbúmina (el principal componente
de las yemas de huevo), extrajeron sangre de
los conejos para obtener un antisuero antiovoalbúmina, y después dividieron su antisuero en dos alícuotas. Sujetaron la primera
alícuota a electroforesis y midieron la cantidad de proteína que avanzó distancias di­­
ferentes desde el origen en un campo
eléctrico. El gráfico azul en la figura 1 describe las cuatro subpoblaciones de proteínas
principales resueltas mediante su técnica. La
primera —y la de mayor tamaño— es el
pico de albúmina, la proteína más abundante en el suero, que se encarga de transportar lípidos en la sangre. Nombraron a los
otros picos globulinas. Dos picos de menor
tamaño están denotados como los picos de
globulina α y β, y después un tercer pico
de globulina, la globulina gamma, claramente representa un grupo de proteínas en
concentración alta en el suero.
Con todo, la parte más notable del experimento ocurrió cuando los investigadores
mezclaron su segunda alícuota del suero
con ovoalbúmina, el antígeno. Los anticuerpos en el suero se unieron a la ovoalbúmina
82
en un complejo multivalente, que salió de la
solución y se precipitó. A continuación el
precipitado se extrajo mediante centrifugación. Ahora que habían logrado eliminar los
anticuerpos de un antisuero, la pregunta fue
¿qué pico de proteína quedaría afectado?
El gráfico de color negro en la figura 1
ilustra sus resultados. Se perdió muy poca
proteína de los picos de albúmina o de
globulina α o β. Aun así, la inmunoprecipitación dio lugar a un decremento notorio del
tamaño del pico de globulina γ, lo que de­­
mostró que casi todos sus anticuerpos antiovoalbúmina podían clasificarse como glo­­bulinas γ.
Ahora se sabe que casi todos los anticuerpos de la clase IgG de hecho se encuentran en la clase de globulina γ. No obstante,
se encuentran anticuerpos de otras clases
en los picos de globulina α y β, lo cual puede
explicar el decremento leve de la concentración de proteína que se encontró después de
inmunoprecipitación en estos otros picos
de proteína.
Conocer la clase de proteína sérica en la cual
caen los anticuerpos fue un inicio, pero los
inmunoquímicos a continuación necesita-
ron averiguar qué aspecto tenían los anticuerpos. El hecho de que podían formar
complejos multivalentes precipitables sugirió que cada anticuerpo tenía la capacidad
de unión a más de un sitio en un antígeno
multivalente. Sin embargo, los científicos
aún desconocían cómo muchas cadenas
polipeptídicas constituyen una molécula de
anticuerpo, y cómo muchos sitios de unión
a antígeno estuvieron presentes en cada
mo­lécula.
Dos líneas de experimentación llevadas a
cabo en un marco de tiempo similar en
ambos lados del Atlántico se combinaron
para proporcionar las respuestas a estas dos
preguntas. Experimentos de ultracentrifugación habían colocado el peso molecular de
las moléculas de anticuerpos IgG en aproximadamente 150 000 daltones. La digestión
de IgG con la enzima papaína produjo tres
fragmentos, dos de los cuales fueron idénticos, y un tercero que fue claramente distinto
(figura 2). El tercer fragmento, de aproximadamente 50 000 daltones, formó de manera
espontánea cristales y, por ende, se nombró
el fragmento cristalizable, o Fc. Al demostrar
que podían inhibir de manera competitiva la
unión de anticuerpos a su antígeno, se mostró que los otros dos fragmentos retienen la
capacidad de unión a antígeno del anticuerpo original. Por ende, estos fragmentos
se nombraron Fab, o fragmento de unión a
+
−
Segundo grupo de experimentos
Sir Rodney Porter, Gerald Edelman
y Alfred Nisonoff
Albúmina
Globulinas
γ
Absorbancia
Los experimentos en los que se identificó
por vez primera a los anticuerpos como
inmunoglobulinas séricas y después se ca­­
racterizó su estructura de cuatro cadenas
familiar, representan algunas de las mejores
adaptaciones de la química de proteína al­­
guna vez usadas para resolver un problema
biológico.
α
β
Distancia de migración
FigurA 1
Demostración experimental de que casi todos los anticuerpos están en la fracción de globulina γ de las proteínas séricas. Después de que se inmunizó a conejos con
ovoalbúmina (ova), sus antisueros se combinaron y se procesaron con electroforesis, que separó las
proteínas séricas de acuerdo con su carga eléctrica y masa. La línea azul muestra el patrón electroforético de antisuero no tratado. La línea negra muestra el patrón de antisuero que se incubó primero con
ova para eliminar anticuerpos anti-ova, y después quedó sujeto a electroforesis. [Adaptado de A. Tiselius and
E. A. Kabat, 1939, Journal of Experimental Medicine 69:119, con permiso de copyright de Rockefeller University Press.]
RECUADRO 3-1
antígeno (Fragment antigen binding). Este
experimento indicó que una molécula de
an­ticuerpo única contenía dos sitios de unión
a antígeno y una tercera parte de la molécula que no participaba en la reacción de
unión.
El uso de otra enzima proteolítica, la
pepsina, dio lugar a la formación de un fragmento único de 100 000 daltones, que contuvo dos sitios de unión a antígeno que aún
fueron mantenidos juntos en una molécula
bivalente. Puesto que la molécula actuó
como si contuviera dos fragmentos Fab,
pero claramente tuvo un componente adicional que facilitó la combinación de los dos
fragmentos hacia una molécula, se nombró
F(ab’)2. La digestión con pepsina no da lugar
a un fragmento Fc recuperable, puesto que
al parecer lo digiere hacia fragmentos más
pequeños. Empero, F(ab’)2 derivados de anticuerpos se usan a menudo en experimentos
en los cuales los científicos desean evitar
artefactos originados por la unión de anticuerpos a receptores Fc sobre superficies
celulares.
En el segundo grupo de experimentos,
los investigadores redujeron la molécula de
IgG entera usando β-mercaptoetanol, a fin
de romper enlaces disulfuro, y produjeron
alquilación del producto reducido de modo
que los enlaces disulfuro no podían volver a
formarse de manera espontánea. A continuación usaron una técnica llamada filtración en gel para separar y medir el tamaño
de los fragmentos de proteína generados
mediante esta reducción y alquilación. (En la
actualidad se usarían geles sds page para
hacer este experimento.) De esta manera, se
demostró que cada molécula de IgG contenía dos cadenas pesadas, con peso molecular (mw) de 50 000 y dos cadenas ligeras, con
mw de 22 000.
Ahora el desafío fue combinar los resultados de estos experimentos para crear un
modelo consistente de la molécula de anticuerpo. Para hacer esto, los científicos tuvieron que determinar cuál de las cadenas
estaba implicada en la unión a antígeno, y
cuál cadena contribuía a los fragmentos
cristalizables. Los inmunólogos a menudo
usan medios inmunológicos para responder
sus preguntas y ésta no fue la excepción.
Eligieron usar fragmentos Fab y Fc purificados a partir de anticuerpos IgG de conejo
para inmunizar dos cabras. A partir de estas
cabras, generaron anticuerpos anti-Fab y
anti-Fc, que hicieron reaccionar, en experimentos separados, con las cadenas pesada y
Gerald Edelman por su trabajo en el descubrimiento de la estructura de las inmunoglobulinas.
ligera provenientes de los experimentos de
reducción y alquilación. La respuesta fue
inmediatamente clara.
Los anticuerpos anti-Fab se unieron a
cadenas tanto pesadas como ligeras y, por
ende, el sitio de unión a antígeno de la IgG
original de conejo estuvo formado de componentes de cadenas tanto pesada como
ligera. Con todo, los anticuerpos anti-Fc sólo
se unieron a las cadenas pesadas, pero no a
las cadenas ligeras de la molécula de IgG, lo
que demostró que la parte Fc de la molécula
sólo estaba constituida de cadenas pesadas.
Por último, experimentos de química de
proteína cuidadosos demostraron que los
aminos terminales de las dos cadenas residían en la porción Fab de la molécula. De
esta manera, la estructura de cuatro cadenas
familiar, con los sitios de unión en los aminos
terminales de los pares de cadenas pesadas
y ligeras, se dedujo a partir de algunos experimentos clásicos muy bien realizados.
En 1972 se otorgó el Premio Nobel en
Fisiología y Medicina a sir Rodney Porter y
Enlaces
disulfuro
SS
SS
SS
Edelman, G.M., B.A. Cunningham, W.E. Gall,
P.D. Gottlieb, U. Rutishauser, y M.J. Waxdal.
1969. The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the
United States of America 63:78-85.
Fleishman, J., B., R.H. Pain, y R.R. Porter. 1962
Sep. Reduction of gamma-globulins. Archives
of Biochemistry and Biophysics Suppl 1:174-80.
Heidelberger, M., y K. O. Pedersen. 1937. The
molecular weight of antibodies. The Journal of
Experimental Medicine 65:393-414.
Nisonoff, A., F.C. Wissler, y L.N. Lipman. 1960.
Properties of the major component of a peptic
digest of rabbit antibody. Science 132:17701771.
Porter, R.R. (1972). Lecture for the Nobel Prize for
physiology or medicine 1972: Structural studies
of immunoglobulins. Scandinavian Journal of
Immunology 34(4):381-389.
Tiselius, A., y E.A. Kabat. 1939. An electrophoretic study of immune sera and purified antibody preparations. The Journal of Experimental
Medicine 69:119-131.
Cadena L
SS
F(ab')2
Digestión
con pepsina
Cadena H
SS
SS
SS
SS
+
Fragmentos Fc
Reducción con
mercaptoetanol
Digestión con papaína
Fab
Fab
+
SS
SS
SS
SS
HS
HS
SH
SH
+
+
+
SH
SH
SH Cadenas L
SH
Fc
Cadenas H
FigurA 2
Estructura prototipo de IgG, que muestra la estructura de cadena y los enlaces
disulfuro intercadena. Se indican los fragmentos producidos por digestión enzimática con pepsina o papaína, o mediante división de los enlaces disulfuro con mercaptoetanol. Las cadenas ligeras (L)
están en azul claro y las cadenas pesadas (H) están en azul oscuro.
83
84
sección I
Introducción
|
Inmunoglobulina (IgM)
V
S
S
V
S
S
S
S
S
S
S
S S
S S
S
C
S
S
S
S
S
S
Heterodímero
Ig-α/ Ig-β
C
S
S
S
S
C
C
S
S
S
S
C
C
C
V
S
C
S
S
V
C
S
C
S
S
S
S
C
Moléculas del MHC
Receptor de célula T
CHO
C
V
S
S
S
S
C
S
S
S
S
Clase I
V
S
S
C
S
S
S
S
C
S S
SS
Clase II
α
β
S
S
C
β2
microglobulina
C
S
S
S
S
C
Moléculas de adhesión
VCAM-1
S
S
C
Receptor
poli-Ig
Proteínas accesorias de célula T
V
ICAM-1
S
S
C
S
S
C
S
S
C
γ
δ
ε
S
S
S
S
S
S
C
V
S
S
CD3
CD2
V
S
S
CD8
V
C
C
S
S
V
S
S
S
S
V
S S
S
S
C
CD4
V
S
S
C
S
S
S
S
V
S
S
C
S
S
C
S
S
C
S
S
C
CD64
Fcγ RI
S
S
C
S
S
ICAM-2
C
S
S
C
S
S
C
S
S
C
C
S
S
C
S
S
C
S
S
C
C
S
S
LFA–3
S
S
C
S
S
C
S
S
C
S
S
γ γ
FigurA 3-19 Algunos ejemplos de proteínas que portan dominios de inmunoglobulina. Cada dominio de inmunoglobulina se
representa mediante un asa azul y, cuando es importante, está marcado como variable (V) o constante (C).
La figura 3-21 muestra que la estructura general de la
molécula de anticuerpo consta de tres regiones relativamente
compactas unidas por una región bisagra más flexible. La re­­
gión bisagra es en particular susceptible a división proteolítica
por la enzima papaína. La división con papaína resuelve la
molécu­­la de anticuerpo hacia dos fragmentos idénticos que
retienen la especificidad de unión a antígeno (antigen-binding) del anticuerpo original (que se muestra como las regiones Fab en la figura 3-21), y la región restante de la molécula,
que consta de la porción no de unión a antígeno. Esta última
región, que es idéntica para todos los anticuerpos de una clase
dada, se cristaliza fácilmente y, así, se llama la región Fc (fragmento cristalizable).
Cada región Fab y región Fc de los anticuerpos media sus propias funciones particulares durante una respuesta de anticuerpos a
un antígeno. Las regiones Fab se unen al antígeno, y la región Fc del
anticuerpo unido a antígeno se une a los receptores Fc sobre células fagocíticas o citolíticas, o a moléculas efectoras inmunitarias. De
esta manera, los anticuerpos sirven como puentes fisiológicos entre
un antígeno presente en un agente patógeno, y las células o moléculas que finalmente lo destruirán. Hay una familia de receptores
Fc; cada receptor Fc se expresa sobre una gama distinta de células,
y se une a una clase diferente de anticuerpos.
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
S
S
3+
H
V
S
L
V
H1
CH2
S
L
S
S
O–
CHO
S S
S S
CH3
S S
C
CO
CH2
S
S S
S
Unión a
antígeno
Actividad
efectora
CH3
CL
S
S
S S
S S
CHO
Cadena pesada
μ, γ, α, δ o ϵ
S
S
1
CH
S
–
O
CO
C
VL
S
Cadena
ligera
κoλ
4
21
S
S
S
S
S
VH
3+
Bisagra
S
Fab
Cadenas
ligeras
NH
+
3
NH
85
Capítulo 3
Fab
NH
+
3
NH
|
446
COO–
COO–
FigurA 3-20 Diagrama de la estructura de inmunoglobulinas derivado del análisis de la secuencia de aminoácidos.
Cada cadena pesada (azul oscuro) y ligera (azul claro) en una molécula
de inmunoglobulina contiene una región variable (V) amino terminal
que consta de 100 a 110 aminoácidos y difiere de un anticuerpo al
siguiente. El resto de cada cadena en la molécula —las regiones constantes (C)— muestra variación limitada que define los dos subtipos de
cadena ligera y las cinco subclases de cadena pesada. Algunas cadenas
pesadas (γ, δ y α) también contienen una región bisagra rica en prolina.
Las porciones amino terminal, que corresponden a las regiones V, se
unen a antígeno; las funciones efectoras están mediadas por los dominios carboxilo terminal. Las cadenas pesadas μ y ϵ, que carecen de una
región bisagra, contienen un dominio adicional en la parte media de la
molécula. CHO denota un grupo carbohidrato enlazado a la cadena
pesada.
Hay dos clases principales de cadenas ligeras
de anticuerpo
La secuenciación de aminoácidos de cadenas ligeras de anticuerpos reveló que la mitad amino terminal (alrededor de 110
aminoácidos) de la cadena ligera era en extremo variable, mientras que la secuencia de la mitad carboxilo terminal podía
clasificarse en una de dos tipos de secuencias principales. Así, la
mitad N terminal de cadenas ligeras se denomina región variable, o VL, de la cadena ligera, y la parte menos variable de la
secuencia se llama región constante, o CL. Las dos secuencias
principales de región constante de cadena ligera se denominan
cadenas κ (kappa) o λ (lambda). Conforme se generaron más
secuencias de cadena ligera, quedó de manifiesto que las
secuencias de la región constante de la cadena λ podían subdividirse en cuatro subtipos —λ1, λ2, λ3 y λ4— con base en
sustituciones de aminoácido en algunas posiciones. En seres
humanos, las cadenas ligeras están divididas de manera bastante uniforme entre las dos clases de cadena ligera; 60% de las
cadenas ligeras de ser humano es κ, mientras que sólo 40% es λ.
En ratones, la situación es bastante distinta: sólo 5% de las
cadenas ligeras de ratón es del tipo de cadena ligera λ. Todas
las cadenas ligeras tienen un peso molecular de aproximadamente 22 kDa.
El análisis adicional de secuencias de cadena ligera demostró
que, incluso dentro de las regiones variables de la cadena ligera,
Sitio de unión
a antígeno
Sitio de unión
a antígeno
Fc
Región bisagra
= región abierta;
sitio de flexibilidad
segmentaria
Cadenas pesadas
FigurA 3-21 La estructura tridimensional de la IgG. En
esta representación son claramente visibles los dominios de inmunoglobulina de 110 aminoácidos de los cuales está construida la molécula,
junto con la estructura bisagra abierta en el centro de la molécula, que
proporciona flexibilidad en la unión a antígenos multivalentes. En la IgG,
la cadena ligera contiene dos dominios de inmunoglobulina, y la cadena
pesada, cuatro. Fab, porción del anticuerpo de unión a antígeno; contiene dominios VL/VH y CL/CH1 pareados. Fc, región del anticuerpo no de
unión a antígeno, con dominios CH2/CH2 y CH3/CH3 pareados. [Fuente D.
Sadava, H.C. Heller, G.H. Orians, W.K. Purves, y D.M. Hillis. Life: The Science of
Biology, 7ed. (© 2004 Sinauer Associates, Inc., y W.H. Freeman & Co.), figura
18-10 con modificaciones.]
hubo regiones de hipervariabilidad. Dado que pudo mostrarse
que estas regiones hipervariables interactúan con el antígeno
unido, se renombraron las regiones determinantes de la complementariedad o CDR.
Los lectores con conocimiento en genética identificarán de
inmediato un problema: ¿cómo es posible codificar una cadena
proteínica única con algunas regiones que son en extremo di­­
versas y otras regiones que son relativamente constantes, mientras se mantiene esa distinción a través de millones de años de
deriva evolutiva? La solución a este enigma comprende la codificación de una región variable de anticuerpo única en múltiples
segmentos genéticos que después se unen entre sí en diferentes
combinaciones en cada célula productora de anticuerpos individual. Este mecanismo singular se describirá a fondo en el ca­­
pítulo 7.
Hay cinco clases principales de cadenas pesadas
de anticuerpo
Al usar anticuerpos dirigidos hacia la región constante de
inmunoglobulinas, y la secuenciación de aminoácidos de inmunoglobulinas derivadas de células tumorales de plasmacitoma,
ciertos investigadores descubrieron que las secuencias de las
regiones constantes de cadena pesada caen dentro de cinco
patrones básicos. Estas cinco secuencias básicas se han llamado
con las letras griegas: μ (mu), δ (delta), γ (gamma), ϵ (épsilon)
y α (alfa). Cada región constante de cadena pesada diferente se
denomina isotipo, y el isotipo de las cadenas pesadas de una
86
cuadro 3-2
sección I
|
Introducción
Composición de cadena de las cinco clases de inmunoglobulina
CadenaNúmero de Clase*
pesada
dominios de Ig CH SubclasesCadena ligeraCadena J
Fórmula
molecular
IgG
γ
3
γ2κ2
γ2λ2
IgM
µ
4
γ1, γ2, γ3, γ4 (humana)
κ o λ
Ninguna
γ1, γ2a, γ2b, γ3 (ratón)
Ninguna
κ o λ
Sí
IgA
α
3
α1, α2
κ o λ
Sí
IgE
ϵ
4
Ninguna
κ o λ
Ninguna
IgD
δ
3
Ninguna
κ o λ
Ninguna
(µ2κ2)n
(µ2λ2)n
n=1o5
(α2κ2)n
(α2λ2)n
n = 1, 2, 3, o 4
ϵ2κ2
ϵ2κ2
δ2κ2
δ2λ2
*
Véanse en la figura 3-22 las estructuras generales de las cinco clases de anticuerpos.
molécula de anticuerpo dada determina su clase. Así, los anticuerpos con una cadena pesada del isotipo μ son de la clase
IgM; aquellos con una cadena pesada δ son IgD; aquellos con γ,
IgG; aquellos con є, IgE, y aquellos con α, IgA. La longitud de la
región constante de las cadenas pesadas es de 330 residuos de
aminoácidos (para las cadenas γ, δ y α) o de 440 aminoácidos
(para las cadenas μ y ε). De modo correspondiente, los pesos
moleculares de las cadenas pesadas varían de acuerdo a su clase.
Las cadenas pesadas de IgA, IgD e IgG pesan alrededor de 55
kDa, mientras que los anticuerpos IgM e IgE son aproximadamente 20% más pesados.
Diferencias menores en las secuencias de aminoácidos de
grupos de cadenas pesadas α y γ llevaron a subclasificación
adicional de esas cadenas pesadas en subisotipos y, por ende,
sus anticuerpos correspondientes, hacia subclases (cuadro 3-2).
Hay dos subisotipos de la cadena pesada α, α1 y α2, y, así, dos
clases de IgA, IgA1 e IgA2. De modo similar, hay cuatro subisotipos de las cadenas pesadas γ, γ1, γ2, γ3 y γ4, con la formación
correspondiente de las cuatro subclases de IgG: IgG1, IgG2,
IgG3 e IgG4. En ratones, los cuatro subisotipos de cadena γ son
γ1, γ2α, γ2β y γ3, y las subclases correspondientes de anticuerpos IgG de ratón son IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, respectivamente.
El análisis adicional reveló que el número exacto de enlaces
disulfuro entre las cadenas pesadas de anticuerpos, y las posiciones precisas de dichos enlaces, varían entre anticuerpos de
distintas clases y subclases (figura 3-22).
Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos
pueden servir como antígenos
Los principios esenciales de la estructura de anticuerpos se
establecieron antes del desarrollo de la tecnología requerida
para generar artificialmente anticuerpos monoclonales y, de
hecho, gran parte de la investigación básica de determinación
de la estructura se completó antes de que hubiera técnicas
disponibles para secuenciación rápida de dna. Por ende,
como una fuente de anticuerpos homogéneos, los inmunólogos recurrieron a los productos proteínicos de tumores secretores de anticuerpos. Los plasmacitomas son tumores de
células plasmáticas, la célula de etapa final de diferenciación
de células B, y las células de ese tumor normalmente están
situadas en la médula ósea. Cuando una clona única de células plasmáticas se hace cancerosa, se llama plasmacitoma en
tanto permanece en un solo hueso. Sin embargo, una vez que
metastatiza hacia múltiples sitios de la médula ósea, el tumor
se llama mieloma múltiple. Los tumores plasmacitoma o mieloma secretan grandes cantidades de anticuerpos monoclonales
hacia el suero y los líquidos tisulares de los pacientes, y estos
anticuerpos pueden purificarse en grandes cantidades. En lugar
de secretar el anticuerpo entero, algunos de estos tumores sólo
secretarán las cadenas ligeras, o a veces tanto las cadenas ligeras
como los anticuerpos enteros, hacia el suero. Las cadenas ligeras homogéneas secretadas por estos tumores mieloma se
llaman proteínas de Bence-Jones.
Entre mediados y finales del siglo xx se usaron anticuerpos
derivados de tumor para generar mucha información respecto
a la estructura de anticuerpos y la secuencia de los mismos.
Cuando se creó un medio por el cual generar estos tumores
artificialmente en ratones, los datos provenientes de tumores de
seres humanos se complementaron con información derivada de líneas de células murinas generadas en el laboratorio,
muchas de las cuales aún se usan.
Los anticuerpos séricos tanto derivados de tumor como
purificados también se usaron como antígenos, y los anticuerpos anti-inmunoglobulina así derivados resultaron ser extra­
ordinariamente útiles en la elucidación de la estructura de
anticuerpos. Los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo
derivados de una especie de animal (por ejemplo, un conejo),
pueden inyectarse en una segunda especie (p. ej., una cabra), o
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
a) IgG
b) IgD
VH
VL
Cγ1
CL
CL
Capítulo 3
c) IgE
VH
VL
|
VH
VL
C δ1
CL
Cε1
Cε2
Región
bisagra
Cγ 2
Cγ 3
Cε4
C δ3
d) IgA (dímero)
e) IgM (pentámero)
VL
Cα1
VH
VL
C μ1
CL
CL
Cα2
Cadena J
Cε3
Cδ2
VH
87
Enlace
disulfuro
Región
bisagra
Cα3
FigurA 3-22 Estructuras generales de las cinco clases
principales de anticuerpos. Las cadenas ligeras se muestran en
sombras más claras y los enlaces disulfuro están indicados mediante
líneas negras gruesas. Note que las cadenas pesadas de IgG, IgA e IgD
contienen cuatro dominios y una región bisagra, mientras que las cadenas pesadas de IgM e IgE contienen cinco dominios pero no región
bisagra. Las formas poliméricas de IgM e IgA contienen un polipéptido,
incluso en otro animal de la misma especie, en el cual el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo servirá como un antígeno.
En el recuadro 3-1 se describe la serie de experimentos en los
cuales anticuerpos sintetizados contra fragmentos proteolíticos
aislados de moléculas de inmunoglobulina se usaron para ayudar a determinar la estructura de la inmunoglobulina. Para
entender estos experimentos, y muchos otros en los que también se usan anticuerpos dirigidos contra inmunoglobulinas
enteras o contra fragmentos de inmunoglobulina, es importante
comprender bien la naturaleza de los determinantes antigénicos
sobre moléculas de inmunoglobulina. Un determinante antigénico se define como una región de un antígeno que hace contacto
con la región de combinación a antígeno sobre un anticuerpo.
Cμ2
Cμ3
Cμ4
Cadena J
llamado cadena J, que está unido por dos enlaces disulfuro a la región
Fc en dos monómeros diferentes. La IgM sérica siempre es un pentámero;
casi toda la IgA sérica existe como un monómero, aunque a veces hay
dímeros, trímeros e incluso tetrámeros. En estas figuras no se muestran
los enlaces disulfuro intracadena ni los enlaces disulfuro que unen cadenas ligeras y pesadas (figura 3-23).
En el cuadro 3-3 se describen los diferentes tipos de anticuerpos
que reconocen determinantes de inmunoglobulina.
Los anticuerpos anti-isotipo se dirigen contra determinantes antigénicos presentes en la región constante de una clase de
anticuerpo de cadena pesada o de cadena ligera particular, pero
no sobre cualquiera de las otras. Por ejemplo, un anticuerpo
anti-isotipo sólo puede unirse a cadenas pesadas μ humanas,
pero no a regiones constantes δ, γ, α o є humanas. De manera
alternativa, puede unirse a cadenas ligeras κ, pero no a cadenas
ligeras λ. Así, un anticuerpo anti-isotipo sólo se une a una clase
o subclase de región constante de anticuerpo única. Los anticuerpos anti-isotipo por lo general son específicos para determinantes presentes sobre la región constante de anticuerpos
88
cuadro 3-3
sección I
|
Introducción
Anticuerpos que reconocen otros anticuerpos
Tipo de anticuerpo
Qué reconoce
Anti-Fab (fragmento, unión a antígeno)Fragmento de anticuerpo generado con papaína, que consta de los dominios
VHCH1–VLCL.
Anti-Fc (fragmento, cristalizable)Fragmento de anticuerpo generado con papaína que consta de los dominios CH2CH3
(y, para IgM e IgD, CH4) pareados.
Anti-isotipo
Determinantes antigénicos específicos para cada clase de cadena pesada.
Anti-alotipoDeterminantes antigénicos que son específicos para alelo —diferencias pequeñas en la
región constante de las cadenas ligera y pesada que varían entre individuos.
Anti-idiotipoDeterminantes antigénicos característicos de un sitio de combinación de un antígeno
particular. Cada anticuerpo tendrá sus propios determinantes idiotípicos característicos
hechos de residuos provenientes de las cadenas pesada y ligera que contribuyen a las
regiones de unión a antígeno.
provenientes de una especie de animal particular, aunque puede
ocurrir algo de reactividad cruzada entre especies relacionadas
—por ejemplo, ratones y ratas—.
Algunos genes que codifican para cadena pesada o ligera
existen en múltiples formas alélicas, y las formas alélicas al­­ter­
nativas del mismo isotipo se denominan alotipos. En general,
dos anticuerpos con diferencias alotípicas variarán en sólo algunos residuos de una de las cadenas de inmunoglobulina, y estos
residuos constituyen los determinantes alotípicos. Los anticuerpos antialotipo son generados al inmunizar a un in­­dividuo
de una especie con anticuerpos derivados de un se­­gundo animal de la misma especie que porta una forma al­­­ternativa (alelo)
del gen que codifica para inmunoglobulina par­­­ticular. Después de que ha ocurrido una respuesta inmunitaria, el investigador
purifica o selecciona los anticuerpos que reconocen los determinantes alotípicos provenientes del individuo inmunizado.
Los anticuerpos antialotipo se usan, por ejemplo, para rastrear
poblaciones de células particulares en experimentos en los cuales células B que provienen de una cepa de animales que portan
un alotipo particular son transfe­ridas hacia una segunda cepa
que difiere en el alotipo de in­­munoglobulina.
Por último, anticuerpos dirigidos contra el sitio de unión a
antígeno de un anticuerpo particular se denominan anticuerpos anti-idiotípicos. Pueden generarse al inmunizar un animal
con grandes cantidades de un anticuerpo monoclonal purificado que, por definición, porta un sitio único de unión a antígeno. Los anticuerpos provenientes del animal inmunizado que
reconocen el sitio de unión a antígeno del anticuerpo original a
continuación se pueden purificar. Los anticuerpos anti-idiotípicos se usaron en los experimentos iniciales que probaron que el
receptor de célula B tenía el mismo sitio de unión a antígeno
que el anticuerpo secretado por esa célula B, y ahora se usan
para dar seguimiento al destino de células B que portan una
especificidad de receptor única en experimentos de inmunolocalización.
Como se describió, el tratamiento de moléculas de anticuerpos enteras con la enzima papaína divide la molécula de anticuerpo en la región bisagra, y libera dos fragmentos Fab de unión
a antígeno y un fragmento Fc por cada molécula de anticuerpo.
Los anticuerpos anti-Fab y anti-Fc se producen al inmunizar
una especie distinta de animal de la que proporcionó los fragmentos de anticuerpo, con fragmentos Fab o Fc, respectivamente.
Cada uno de los dominios de las cadenas
pesada y ligera de anticuerpo media funciones
específicas
Los anticuerpos protegen al huésped contra infecciones, al unirse
a agentes patógenos y facilitar su eliminación. Los anticuerpos
de diferentes clases de cadena pesada están especializados para
mediar funciones protectoras particulares, como activación de
complemento (capítulo 6), aglutinación de agente patógeno,
o fagocitosis (capítulo 13), y cada dominio diferente de la molécula de anticuerpo desempeña su propio papel en estos mecanismos de defensa del huésped. Aquí se examina brevemente la
estructura de cada uno de los dominios de cadena pesada de
anticuerpo a la vez, empezando con los dominios CH1 y CL, que
son los proximales a los dominios VH y VL, respectivamente
(figura 3-20).
Dominios CH1 y CL
Como se comentó, la multivalencia del receptor aumenta mucho
la fuerza (avidez) de la unión de receptor a antígeno. Los anticuerpos han evolucionado para aprovechar esta propiedad al
emplear dos sitios de unión a antígeno, cada uno de los cuales
puede unirse a determinantes individuales sobre antígenos multivalentes, como los que se encuentran sobre superficies bacterianas. Los dominios CH1 y CL sirven para extender los extremos
de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo, lo que facilita
interacciones con antígenos multivalentes y maximiza la capacidad del anticuerpo para unirse a más de un sitio sobre un antígeno multivalente. Un enlace disulfuro intercadena entre estos
dos dominios los mantiene juntos y puede facilitar la capacidad
de algunos pares VH-VL para unirse entre sí y formar un sitio de
combinación estable.
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
IgG1
IgG2
|
Capítulo 3
IgG3
89
IgG4
Enlace
disulfuro
FigurA 3-23 Estructura general de las cuatro subclases de IgG humana, que difieren en el número y el reordenamiento de los
enlaces disulfuro intercadena (líneas negras gruesas) que unen las cadenas pesadas. Una característica notable de la IgG3 humana son
sus 11 enlaces disulfuro intercadena.
Las regiones bisagra
Las cadenas pesadas γ, δ y α contienen una secuencia peptídica
extendida entre los dominios CH1 y CH2, que no tiene homología con los otros dominios (figuras 3-20 y 3-22). Esta llamada
región bisagra es rica en residuos de prolina, que la hacen en
particular flexible y, como consecuencia, los dos extremos de
unión a antígeno de anticuerpos IgG, IgD e IgA pueden adoptar
una amplia variedad de ángulos uno respecto a otro, lo cual
facilita la unión eficiente a antígeno. La naturaleza extendida de
la cadena de aminoácidos en la región bisagra contribuye a la
vulnerabilidad de esta parte de la molécula a la división por
proteasa, una vulnerabilidad que se explotó ingeniosamente en
los experimentos tempranos que caracterizaron la estructura de
anticuerpos (recuadro 3-1).
Además de estos residuos de prolina, la región bisagra también contiene varias cisteínas, que participan en la dimerización de cadena pesada. El número real de enlaces disulfuro
intercadena en la región bisagra varía considerablemente
entre diferentes clases y subclases de cadena pesada de anticuerpos (figura 3-23) así como entre especies. Al carecer de
una región bisagra, las cadenas pesadas de IgE hacen sus
enlaces disulfuro entre ca­­dena pesada entre los dominios CH1
y CH3. En la IgM, los enlaces disulfuro forman puentes entre
los pares de cadenas pesadas al nivel de CH3 y CH4. Aunque
las cadenas μ y ε carecen de regiones bisagra, tienen un dominio de inmunoglobulina adicional que retiene algunas cualidades tipo bisagra.
Cadenas de carbohidratos
Los dos dominios CH2 de las cadenas α, δ y γ, y los dos dominios CH3 de las cadenas μ y ε están separados de sus dominios
pareja de cadena pesada mediante cadenas laterales de oligosacárido que evitan que las dos cadenas pesadas se enclaven una
cerca de la otra (figura 3-24). Como resultado, los dominios
pares están significativamente más accesibles al ambiente
acuoso que los otros dominios de región constante. Se cree que
esta accesibilidad contribuye a la capacidad de los anticuerpos
IgM e IgG para unirse a componentes del complemento. En
general, las inmunoglobulinas están extensamente glucosiladas,
y algunos anticuerpos incluso tienen carbohidratos fijos a sus
cadenas ligeras.
Los dominios carboxilo terminal
FigurA 3-24 Los residuos de carbohidrato, que se
muestran en color rosa, evitan el contacto estrecho entre los
dominios CH2 de IgG1 humana. [PDB ID 1IGT.]
Las cinco clases de anticuerpos pueden expresarse como
inmunoglobulina de membrana o secretada. Los anticuerpos
secretados tienen una secuencia de aminoácidos hidrofílica de
90
sección I
|
Introducción
Transcrito primario
AAA
Empalme
alternativo
Transcritos procesados
AAA
Forma secretada
Segmento
hidrofílico
AAA
Forma unida a membrana
lgα/lgβ
Segmentos unidos a membrana
FigurA 3-25 Las formas de inmunoglobulina de membrana en contraposición con secretada se crean mediante
empalme de mRNA alternativo. Los cuadros de color azul oscuro
corresponden a las secciones de transcrito de mRNA de las secuencias
de región variable reordenadas, en tanto que los cuadros de color azul
claro ilustran las partes del transcrito de mRNA que corresponden a los
dominios de región constante individual de los genes que codifican
para cadena pesada. El gen que codifica para IgM, que se muestra aquí,
contiene una región variable y cuatro exones de región constante. El
diversas longitudes en el carboxilo terminal del dominio CH
final. En receptores de inmunoglobulina unidos a membrana,
esta región hidrofílica es reemplazada por tres regiones (figura
3-25):
• Una secuencia “espaciadora” hidrofílica, extracelular, de
aproximadamente 26 aminoácidos
• Un segmento transmembrana hidrofílico de alrededor de
25 aminoácidos
• Una cola citoplasmática muy corta, de aproximadamente
tres aminoácidos
Las células B expresan diferentes clases de inmunoglobulina
de membrana en etapas del desarrollo particulares, y bajo condiciones estimulatorias diferentes. Las células pre-B, inmaduras,
sólo expresan IgM de membrana. La coexpresión de IgD de
membrana, junto con IgM, es uno de los marcadores de diferenciación hacia una célula B por completo madura que todavía no
ha encontrado antígeno. Después de la estimulación con antígeno, la IgD se pierde de la superficie celular, y la región constante de la membrana y la inmunoglobulina secretada pueden
cambiar hacia cualquiera de los otros isotipos. La clase de anticuerpo secretado por células B estimuladas por antígeno está
determinada por citocinas liberadas por células T y células presentadoras de antígeno en la vecindad de la célula B activada.
Anticuerpos de diferentes clases de cadena pesada tienen afinidades selectivas por receptores Fc de superficie celular particulares, así como por componentes del sistema de complemento.
Las funciones efectoras de clases de anticuerpos particulares se
comentan más en los capítulos 6 y 13.
segmento de color rosado representa el transcrito que codifica para la
porción C terminal de la inmunoglobulina secretada. Los segmentos de
color verde representan el transcrito que codifica para las porciones C
terminal del receptor de inmunoglobulina unido a membrana, incluso
las regiones transmembrana y citoplasmática. El empalme alternativo
crea los dos tipos diferentes de moléculas de inmunoglobulina. Las
inmunoglobulinas unidas a membrana y secretadas sobre cualquier
célula B comparten las regiones de unión a antígeno idénticas y la
mayor parte de las secuencias de cadena pesada.
La cristalografía de rayos X se ha usado
para definir la base estructural de la unión
antígeno-anticuerpo
La cristalografía se ha usado para explorar la naturaleza de la
unión antígeno-anticuerpo para un gran número de anticuerpos, y ha demostrado que una u otra cadena, o ambas cadenas,
podrían proporcionar casi todos los residuos de contacto con
cualquier antígeno. Así, algunos anticuerpos se unen al antígeno principalmente por medio de contactos con residuos de la
región variable de cadena pesada; la cadena ligera meramente
proporciona apoyo estructural para el sitio de unión; sucede lo
contrario para otras interacciones antígeno-anticuerpo. Aun
otros anticuerpos usan residuos provenientes de ambas cadenas
para ponerse en contacto de manera directa con el antígeno.
Aun así, casi siempre los contactos entre antígeno y anticuerpo
ocurren en una amplia cara, y las protuberancias y depresiones
en la superficie del anticuerpo probablemente coinciden con
depresiones o abultamientos complementarios en el antígeno.
En la figura 3-26 se ilustra la unión de un anticuerpo al extremo
de la molécula de hemaglutinina del virus de la gripe. En otro
caso bien estudiado de una unión de anticuerpo a la proteína
lisozima, se mostró que el área de superficie de interacción es
bastante grande; en diferentes pares de anticuerpo-lisozima
varía de 650 a 900 Angstroms cuadrados. Dada la unión estrecha entre un anticuerpo y su antígeno complementario, no debe
sorprender que, al menos en algunos casos, la unión de antígeno a anticuerpo induce un cambio conformacional en el
anticuerpo, que puede visualizarse mediante cristalografía de
rayos X (figura 3-27).
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
a)
|
Capítulo 3
91
b)
Antígeno
Anticuerpo
FigurA 3-26 Simulación por computadora de una interacción entre anticuerpo y antígenos del virus de la gripe. a) El antígeno (amarillo) se muestra interactuando con la molécula de anticuerpo; la región variable de la cadena pesada está en rojo, y la región variable de la
cadena ligera está en azul. b) La complementariedad de las dos moléculas es revelada al separar el antígeno del anticuerpo 8 Å. [Basado en datos de
cristalografía de rayos X recabados por P.M. Colman y W.R. Tulip. Tomado de G.J.V.H. Nossal, 1993. Scientific American 269(3):22.]
H3
L1
H2
H1
L2
L3
FigurA 3-27 Puede ocurrir cambio conformacional en el
momento de la unión de antígeno a anticuerpo. Esta figura
muestra un complejo entre un péptido derivado de la proteasa del HIV y
un fragmento Fab proveniente de un anticuerpo antiproteasa. El péptido
se muestra en color negro. La línea roja muestra la estructura del fragmento Fab antes de que se una al péptido, y la línea azul muestra su
estructura después de unión. Hay cambios conformacionales importantes en los CDR del Fab en el momento de la unión al antígeno; éstos son
en especial pronunciados en el CDR1 de la cadena ligera (L1) y CDR3 de
la cadena pesada (H3). [Tomado de J. Lescar et al., 1997, Journal of Molecular
Biology 267:/207; cortesía de G. Bentley, Institute Pasteur.]
Transducción de señal en células B
Una vez descrita la estructura de las moléculas de anticuerpo y
su forma unida a membrana, el receptor de célula B (bcr),
ahora se dirigirá la atención a la función del bcr. Recuérdese
que la estructura del bcr es idéntica a la de los anticuerpos que
la célula secretará en el momento de la estimulación por antígeno, excepto por la porción C– terminal de la cadena pesada;
esta porción es modificada de modo que fije el receptor a la
membrana plasmática de la célula B. Antes del reconocimiento
de antígeno, las células B maduras que residen en los tejidos
linfoides secundarios, como el bazo o los ganglios linfáticos,
expresan formas unidas a membrana tanto de IgM como de IgD.
Como se describió, la cola citoplasmática de la cadena pe­­sada
del bcr es en extremo corta —sólo tiene tres aminoácidos— y,
así, uno de los enigmas que tuvieron que resolver quienes exploraron la activación de antígeno mediado por bcr fue cómo una
cola citoplasmática tan corta podía transmitir con eficiencia
una señal hacia el citoplasma. Este problema se resolvió cuando
experimentos de coinmunoprecipitación revelaron que cada
molécula de bcr estaba asociada de manera no covalente con un
heterodímero, la Igα/Igβ (figura 3-7a) que se encarga de transducir la señal de antígeno hacia el interior de la célula. Recuerde que
las cadenas de Igα/Igβ contienen itam que incluyen residuos de
tirosina que quedan fosforilados en el momento de activación
por medio del receptor, y sirven como residuos de acoplamiento
para componentes de emisión de se­­ñales torrente abajo. Por
ende, el bcr se divide desde los puntos de vista estructural y
funcional en dos componentes: un componente de reconocimiento (el receptor de inmunoglobulina) y un componente de
transducción de señal (Igα/Igβ).
En secciones previas de este capítulo se describieron algunos
principios generales de la transducción de señal, y se esbozaron
tres vías de transducción de señal empleadas comúnmente (figura
3-5, Perspectiva general). En esta sección se muestra cómo esos
principios se aplican a los eventos intracelulares que suceden en el
momento de interacciones antígeno-receptor en células B.
La unión a antígeno da lugar a acoplamiento
de moléculas adaptadoras y enzimas hacia el
complejo de membrana de BCR-Igα/Igβ
La unión a antígeno induce alteraciones conformacionales en el
bcr, que exponen regiones en los dominios Cμ4 de las cadenas
92
sección I
|
Introducción
CD21
CD19
PIP3
PIP3
Lyn
P
P
P
P
P
P
P
P
P Syk
P
Akt PDK1
BCAP
PI3K
lgα/lgβ
P
PIP3
P
Lyn
PLCγ2
Btk
P
P
BLNK
VAV
P
P
Grb-2
SOS
Ca2+
P PI3K
Fosforilación
y desactivación
Rac/Rho/
cdc42
Reorganización
del citoesqueleto
Ras
PKC
Calmodulina
Cascada de la
MAP cinasa
Calcineurina
Bax Bad Antiapoptótica
Supervivencia celular
Citoplasma
NFAT
NF-κB
AP-1
Núcleo
Activación de gen
FigurA 3-28 Vías de transducción de señal que emanan
del bcr. La agrupación de receptor mediada por antígeno hacia las
regiones balsas de lípidos de la membrana lleva a fosforilación por
cinasa de la familia src de los correceptores Igα/Igβ y CD19, las proteínas adaptadoras BLNK y BCAP, y la tirosina cinasa, Syk. BCAP y
CD19 reclutan PI3 cinasa hacia la membrana, con generación de PIP3
y localización subsiguiente de PDK1 y Akt a la membrana. La fosforilación por Akt aumenta la supervivencia celular y lleva a activación
de los factores de transcripción NF-κB y CREB, como se describió. La
pesadas de receptor. Las interacciones entre moléculas receptoras
vecinas por medio de estos dominios generan oligomerización de
receptor (formación de agrupaciones pequeñas de complejos
de antígeno-receptor) y movimiento subsiguiente de estas agrupaciones de receptor hacia regiones de balsas de lípidos especializadas de la membrana de la célula B. Por ende, los residuos
itam de Igα/Igβ son acercados mucho a las cinasas de la familia Src, Lyn (figura 3-28), Fyn y Blk. La fosforilación de tirosina
de los residuos de itam Igα/Igβ por estas cinasas de la familia
Src, en particular Lyn, a continuación proporciona sitios de
fijación para la proteína adaptadora blnk y una tirosina cinasa
adicional, Syk, que es fosforilada y activada por las cinasas de la
familia Src. A continuación, Syk fosforila blnk, lo que propor-
activación de la isoforma de PLC de célula B, PLCγ2, ocurre en el
momento de unión al adaptador localizado a la membrana, BLNK y
fosforilación por Syk, lo que da lugar a la generación de DAG e IP3,
con activación de las vías de NFAT y NF-κB (véase el texto). Las vías
de MAP cinasa son activadas por medio de la unión de Grb2 a BLNK,
con activación subsiguiente de Ras y mediante la activación de la
proteína GEF, VAV, que activa Rac. [Adaptado de M. E. Conley et al. 2009.
Annual Reviews of Immunology 27:199-227.]
ciona sitios de acoplamiento para múltiples componentes to­­rrente
abajo de la vía de señalización. La proteína adaptadora bcap y
CD19, el co-receptor de célula B, también son fosforiladas por
estas tirosina cinasas, y sirven para reclutar la enzima PI3 cinasa
hacia la membrana plasmática.
Las células B usan muchas de las vías
de señalización torrente abajo antes descritas
Las vías de emisión de señales torrente abajo usadas por el bcr
ahora serán familiares. Las tirosina cinasas Syk y Btk juntas
fosforilan y activan PLCγ2, que hidroliza PIP2, como se describió.
El aumento resultante de las concentraciones intracitoplasmáticas
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
de Ca2+ induce la activación de calcineurina y el mo­­vimiento de
nfat hacia el núcleo (figura 3-24). El otro producto de la hi­­
drólisis del PIP2, el dag (figura 3-12), permanece en la membrana y se une a la isoforma de célula B de proteína cinasa C, lo
que da pie a la fosforilación y liberación del inhibidor de NF-κB,
como se describió para células T (figura 3-17). Esto da lugar a la
localización nuclear y activación de NF-κB.
Vías efectoras torrente abajo adicionales desencadenan los
muchos otros cambios que tienen lugar en el momento de activación de célula B; por ejemplo, la PI3 cinasa, ahora localizada
a la membrana, fosforila PIP2 hacia PIP3 (figura 3-11), lo que
permite el reclutamiento de las proteínas que contienen dominio ph, PDK1 y Akt. En el momento de la fosforilación por la
serina-treonina cinasa PDK1, Akt promueve la supervivencia
celular al fosforilar moléculas proapoptóticas, como Bax y
Bad, y desactivarlas. También fosforila y activa los factores
de transcripción NF-κB y creb, que apoyan las funciones de
proliferación, diferenciación y supervivencia de las células B
acti­vadas.
La vía de la map cinasa (figura 3-16) también es activada
durante la activación de células B. La fijación de Grb2 a blnk
desencadena la unión del gef sos, seguida por la unión y
|
Capítulo 3
93
activación de Ras, como se describió. De modo similar, Rac,
otra proteína G monomérica pequeña de la familia Ras, es activada por la unión de la proteína gef, Vav. Tanto Ras como Rac
son proteínas G pequeñas que actúan para iniciar vías de emisión de señales de map cinasa. Como se describió, la activación
de la vía de la map cinasa culmina en la expresión del factor de
transcripción fosforilado Elk. En células B, Elk promueve la
síntesis del factor de transcripción Egr-1, que actúa para inducir
alteraciones de la expresión de superficie celular de moléculas
de adhesión importantes, y finalmente sirve para ayudar a la
migración de linfocitos B hacia tejidos linfoides secundarios y
dentro de los mismos. Efectores torrente abajo desde Rac promueven la polimerización de actina, lo que facilita más la motilidad de células B.
En conclusión, la unión de antígeno en el bcr lleva a múltiples cambios de la actividad transcripcional, así como de la
localización de células B y la motilidad de las mismas, que
juntas dan lugar a su supervivencia, proliferación, diferenciación y secreción final de anticuerpos, aumentadas. Como se
ejemplifica en el recuadro 3-2, los defectos en proteínas involucradas en la señalización de célula B pueden llevar a inmunodeficiencias.
Recuadro 3-2
Enfoque clínico
Los defectos en la proteína emisora de señales de célula B,
Btk, llevan a agammaglobulinemia ligada a X
La caracterización
de las proteínas
necesarias para la señalización de células B
y T abrió nuevas avenidas de exploración
para médicos que estuvieron trabajando con
pacientes que sufrían trastornos de inmunodeficiencia. Los médicos y los es­­pecialistas en
inmunogenética ahora trabajan en estrecha
colaboración para diag­nosticar pacientes con
inmunodeficiencias y tratarlos, para el beneficio tanto de la clínica como de las ciencias
básicas.
La caracterización de los genes de los
cuales dependen trastornos del sistema inmunitario es complicada por el hecho de que las
deficiencias de anticuerpos pueden producirse por genes defectuosos que codifican
para proteínas de células T o B (porque las
células T proporcionan factores auxiliares
necesarios para la producción de anticuerpos
por células B), o incluso por mutaciones en
genes que codifican para proteínas en las
células del estroma importantes para el desarrollo de células B saludables en la mé­­dula
ósea. Aun así, sin importar cuál es la causa,
todas las deficiencias de anticuerpos se manifiestan en clínica por susceptibilidad aumentada a infecciones bacterianas, en particular
de los pulmones, los intestinos y (en niños de
más corta edad) el oído.
En 1952, un pediatra, Ogden Bruton, re­­
portó en la revista Pediatrics el caso de un
niño de ocho años de edad que sufrió múltiples episodios de neumonía. La electroforesis del suero del niño mostró que carecía
por completo de globulinas séricas; por
ende, esta enfermedad se denominó agammaglobulinemia. Ésa fue la primera enfermedad de inmunodeficiencia para la cual un
dato de laboratorio explicó los síntomas clínicos, y el tratamiento que Bruton aplicó —la
administración de inyecciones de gamma­
globulina por vía subcutánea— aún se usa.
Conforme se reportaron casos similares, se
notó que la mayor parte de los casos pediátricos de agammaglobulinemia ocurría en
varones, mientras que en adultos la enfermedad parecía afectar a ambos sexos de
manera similar. El mapeo cuidadoso de la
susceptibilidad de la enfermedad al cromosoma X dio lugar a que la forma pediátrica
de la enfermedad se denominara xla, que
significa agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (X-Iinked agammaglobulinemia).
Con la caracterización de los componentes de la vía de transducción de señal de BCR
durante los decenios de 1980-1989 y 19901999, se tuvo la oportunidad de definir cuáles
proteínas están dañadas o cuáles proteínas
faltan en síndromes de inmunodeficiencia
par­­ticulares. En 1993, 41 años después de la
descripción inicial de la enfermedad, dos
grupos reportaron de manera independiente
que muchos casos de xla se producían por
mutaciones en una tirosina cinasa citoplasmática llamada tirosina cinasa de Bruton, o
Btk; ahora se sabe que un total de 85% de los
pacientes afectados por xla tiene mutaciones en el gen Btk.
La Btk es un miembro de la familia de
tirosina cinasas citoplasmáticas Tec, que se
expresan de modo predominante en células
hematopoyéticas. Las cinasas de la familia Tec
comparten un dominio cinasa C terminal,
precedido por dominios SH2 y SH3, un dominio rico en prolina, y un dominio PH amino
terminal, capaz de unirse a fosfolípidos PIP3
generados por la actividad de la PI3 cinasa. La
Btk se expresa tanto en células B como en
plaquetas, y es activada después de emisión
de señales por medio del bcr, el pre-BCR
(que se expresa en células B en desarrollo),
los receptores de IL-5 e IL-6, y el receptor de
quimiocina CXCR4. Su participación en la
señalización pre-BCR explica por qué los
niños con xla sufren desarrollo defectuoso
de células B.
(continúa)
94
sección I
Enfoque clínico
|
Introducción
Recuadro 3-2
(continuación)
Después de la activación, la Btk se mueve
hacia el lado interno de la membrana plasmática, donde es fosforilada y parcialmente
activada (figura 3-28). La activación se completa cuando se autofosforila en un segundo
sitio de fosforilación. La Btk se une a la proteína adaptadora blnk, junto con PLCγ2. La
Btk a continuación fosforila y activa PLCγ2 lo
que lleva, como se describió, a flujos de calcio y activación de las vías de NF-κB y nfat;
por ende, la Btk ocupa una posición fundamental en la activación de células B y no
sorprende que las mutaciones en el gen que
la codifica den lugar a consecuencias tan
devastadoras.
Se han identificado más de 600 mutaciones diferentes en el gen btk; casi todas
se producen por sustituciones de par de
bases único o por la inserción o deleción
de menos de cinco pares de bases. Al
igual que para otras mutaciones ligadas a
X que son mortales sin intervención médica, la enfermedad xla se mantiene en
la población por la ge­­neración de nuevas
mutaciones.
Los pacientes con xla por lo general
están sanos durante el periodo neonatal
(inmediatamente después del nacimiento),
cuando aún se benefician de los anticuerpos
maternos. No obstante, entre tres y 18 meses
de edad empiezan infecciones bacterianas
recurrentes, y en la actualidad la edad media
en el momento del diagnóstico en la parte
no latina de América es de tres años. La xla
es un defecto denominado “con fugas”; la
mayoría de los niños con mutaciones en btk
tiene algo de inmunoglobulina sérica, y
algunas células B en la circulación periférica.
El pronóstico para pacientes que reciben
tratamiento con dosis regulares de gammaglobulina ha mejorado de manera notoria
durante los últimos 25 años con el uso de
inyecciones profilácticas de gammaglo­
bulina.
Las células B en pacientes con xla tienen un fenotipo característico que puede
usarse para propósitos diagnósticos. La
expresión de CD19 es baja y variable en
pacientes con xla, mientras que la expresión de IgM de membrana, normalmente
variable en células B maduras, es relativamente alta y consistente en pacientes con
xla. Este fenotipo puede observarse en la
figura 1, que muestra los perfiles en la citometría de flujo de un individuo testigo normal (los dos gráficos de la izquierda) y un
paciente con gen btk defectuoso (los dos
gráficos de la derecha). En los dos gráficos
superiores, se nota que el paciente con xla
tiene muy pocas células CD19+ en comparación con el testigo, y que las cifras de CD19
sobre la superficie de las células B que existen son más bajas que las que se observan
en las células testigo. En los dos gráficos
inferiores se nota que, si bien hay menos
células B CD19+ en general en el paciente
con btk alterado, todas las células B CD19+
tienen cifras relativamente altas de IgM de
superficie, mientras que las cifras de IgM
de membrana son mucho más variables en
los testigos saludables.
Bruton, O.C. 1952. Agammaglobulinemia. Pediatrics 9:722-728.
Conley, M.E., et al. 2009. Primary B cell immunodeficiencies: Comparisons and contrasts.
Annual Review of Immunology 27:199-227.
Tsukuda, S., et al. 1993. Deficient expression of
a B cell cytoplasmic tyrosine kinase in
human X-linked agammaglobulinemia. Cell
72:279-290.
Vetrie, D., et al. 1993. The gene involved in
X-linked agammaglobulinemia is a member
of the src family of protein tyrosine kinases.
Nature 361:226-233.
Testigo
CD19
Btk
CD19
Anticuerpo del testigo
CD19
Anticuerpo del testigo
CD19
sIgM
sIgM
FigurA 1
Perfiles de FACS de un individuo normal y un paciente con XLA. [Adaptado de Conley et
al. 2009. Annual Review of Immunology 27:199.]
Las células B también reciben señales por medio
de co-receptores
El receptor de inmunoglobulina sobre la membrana de célula B
está asociado de manera no covalente con tres moléculas transmembrana: CD19, CD21 y CD81 (TAPA-1) (figura 3-7a). Los
antígenos a veces son presentados al bcr ya unidos de manera
covalente a proteínas del complemento, en particular al componente del complemento C3d. (La cascada de complemento
se comenta en el capítulo 6.) El co-receptor de célula B CD21 se
une de manera específica a C3d, sobre antígenos cubiertos por
C3d. Esta co-unión (co-engagement) del bcr y CD21 lleva el
co-receptor y el bcr hacia estrecha aposición uno con otro.
Cuando esto sucede, residuos de tirosina sobre la cara citoplasmática del co-receptor quedan fosforilados por las mismas
enzimas que fosforilan los itam sobre Igα/Igβ, lo que proporciona sitios de fijación para PI3 cinasa. La localización de
la PI3 cinasa al co-receptor aumenta tanto la supervivencia
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
celular como las alteraciones del programa de transcripción
que acompañan a la activación celular (figura 3-28). CD19
también sirve como un sitio adicional de reclutamiento de
PLCγ.
Receptores de célula T y señalización
Las células T se unen a antígenos complejos constituidos de
péptidos ubicados en el surco de proteínas del mhc unidas a
membrana. Cuando el receptor de célula T hace contacto con
su mhc-antígeno peptídico sobre la superficie de una célula
presentadora de antígeno, las dos membranas celulares son
llevadas hacia aposición estrecha una con otra. Esto añade
otro estrato de complejidad al proceso de activación de célula
T que no encuentra paralelo en la señalización de célula B. Al
margen de esta complejidad adicional, los eventos de activación de célula T aún se despliegan de acuerdo con una mezcla
de las estrategias antes descritas, y tienen muchas similitudes
con la emisión de señales de receptor de célula B. Aquí, se
describe brevemente la estructura del receptor de célula T y a
continuación se caracterizan las rutas de emisión de señales
por medio de este receptor. El recuadro 3-3 describe los experimentos que dieron lugar al aislamiento y la caracterización
del αβTCR.
El receptor de célula T es un heterodímero
con regiones variable y constante
Hay dos tipos de receptores de célula T, ambos son heterodímeros (dímeros constituidos de dos polipéptidos diferentes).
Casi todas las células T recirculantes portan he­­terodímeros
αβ, que se unen a ligandos constituidos de un péptido antigénico presentado en un surco molecular sobre la superficie de
una molécula del mhc tipo I o tipo II. Un se­­gundo sub­grupo
de células T expresa, en lugar de esto, un receptor de célula T
heterodimérico compuesto de un par diferente de cadenas de
proteína, llamadas γ y δ. Las células T que portan receptores
γδ tienen patrones de localización particulares (a menudo en
tejidos mucosos) y algunas células T γδ reconocen tipos de
antígenos diferentes de los que son unidos por células T αβ.
Aunque algunas células T γδ reconocen antígenos peptídicos
presentados por mhc convencionales, otras células T γδ se
unen a porciones de lípido y glicolípido presentadas por
moléculas del mhc no canónicas. Aún otras clonas de células
T γδ parecen reconocer proteínas de choque por calor autogeneradas o fosfoantígenos derivados de microbios. No ha
logrado establecerse todavía una teoría unificada de la naturaleza precisa de antígenos reconocidos por células T γδ.
Empero, esta capacidad de dichas cé­­lulas para romper las
reglas de restricción del mhc tal vez explique la evolución de
una diferencia leve en el ángulo entre la región de unión a
antígeno y la región constante del receptor de cé­­lula T, que
queda de manifiesto en un análisis cristalográfico de rayos X
de los dos tipos de receptor (figura 3-29). A pesar de estas
diferencias funcionales en los receptores αβ en contraposición con γδ, sus características bioquímicas esenciales son
bastante similares.
|
Capítulo 3
95
El resto de este capítulo se enfoca en la estructura y la señalización del tipo de tcr αβ dominante, reconociendo que puede
haber diferencias menores entre los dos tipos de re­­ceptores y
sus componentes torrente abajo.
Aunque el tcr no es una inmunoglobulina en sí, las proteínas del tcr son miembros de la superfamilia de proteínas
inmunoglobulina y, por ende, las estructuras dominio de heterodímeros de tcr αβ y γδ son notoriamente similares a las de
las inmunoglobulinas (figura 3-19). La cadena α tiene un peso
molecular de 40 a 50 kDa, y la cadena β es de 40 a 45 kDa. Al
igual que las cadenas ligeras de anticuerpo, las cadenas de tcr
tienen dos dominios tipo inmunoglobulina, cada uno de los
cuales contiene un enlace disulfuro intracadena que abarca 60 a
75 aminoácidos. El dominio Cα del tcr difiere de casi todos los
dominios de inmunoglobulina en que posee sólo una lámina β
única, en lugar de un par, y el resto de la secuencia muestra
plegamiento más variable. El dominio amino terminal (variable) en ambas cadenas muestra notoria variación de secuencia,
pero las secuencias del resto de cada cadena están conservadas
(son constantes). Cada uno de los dominios variables de tcr
tiene tres regiones hipervariables, que parecen ser equivalentes
a las regiones determinantes de la complementariedad (cdr) en
las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Una cuarta
región hipervariable sobre la cadena β de tcr no parece tener
contacto con el antígeno, y, por ende, su importancia funcional
es incierta.
En el extremo C terminal del dominio constante, cada ca­­
dena de tcr contiene una secuencia conectora corta, en la cual
un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro con la otra
cadena del heterodímero. En posición C– terminal a este disulfuro hay una región transmembrana de 21 o 22 aminoácidos,
que ancla cada cadena en la membrana plasmática. Los dominios transmembrana de las cadenas alfa y beta de tcr son poco
comunes por cuanto cada uno de ellos contiene residuos de
aminoácido con carga positiva que promueven la interacción
con residuos con carga negativa correspondientes sobre las
cadenas del complejo CD3 transductor de señal. Por último, al
igual que los bcr, cada cadena de tcr sólo contiene una cola
citoplasmática muy corta en el extremo carboxilo terminal.
Dominios V
Dominios C
γδ TCR
111°
αβ TCR
147°
FigurA 3-29 Comparación de las estructuras cristalinas
de TCR 𝛄𝛅 y 𝛂𝛃. La diferencia (puesta de relieve con líneas negras) en
el ángulo codo entre formas γδ y αβ forma el TCR.
EXPERIMENTO CLÁSICO
El descubrimiento del receptor de células T αβ
Una vez
que los científicos habían establecido que el bcr era simplemente una
forma unida a membrana del anticuerpo
secretado, la elucidación de la estructura del
bcr se convirtió en un problema significati-
1
vamente más tratable. Sin embargo, los
investigadores dedicados a caracterizar el
receptor de célula T (tcr) no disfrutaron de
la misma ventaja, porque el tcr no es secretado en forma soluble. Por ende, las caracte-
4
Generación de un hibridoma de células T
con especificidad de antígeno conocida
Se inmuniza ratones con
ovoalbúmina (OVA)
Se espera varios días
Se extirpan ganglios linfáticos
Se cultivan células T del ganglio linfático con
3
Producción de anticuerpos que se unen
a TCR sobre el hibridoma de células T
Se inmuniza a un nuevo ratón con
células provenientes de un hibridoma
de células T específico para OVA
Se espera varios días
Se aísla el bazo
OVA
5
2
rísticas bioquímicas del tcr se entendieron
después que las del bcr, hasta el decenio de
1980-1989, cuando un importante avance
científico —la capacidad para sintetizar anticuerpos monoclonales a partir de tumores
Se fusionan células B provenientes del
bazo con línea de células B a largo plazo
Se añade polietilénglicol para inducir fusión
de células T específicas para antígeno con
línea de células T de vida prolongada
Se diluyen las células fusionadas de modo que
cada célula contenga un hibridoma de células T
único. Se permite que las células se dividan para
formar clonas y se prueba cada clona respecto
a su capacidad para secretar IL-2 cuando es
estimulada con péptidos de ovoalbúmina. Se
hacen crecer clonas individuales de hibridomas
de células T que reconocen OVA.
6
Selección y expansión de las clonas de células B a
largo plazo que secretan anticuerpos monoclonales
que se unen al hibridoma de células T
Se recolectan anticuerpos monoclonales
que se unen a líneas de células T
FigurA 1
La generación de anticuerpos específicos para el tcr
96
RECUADRO 3-3
de células B construidos de manera artificial,
o hibridomas— hizo técnicamente más factible el análisis del tcr.
Un hibridoma es un producto de fusión
de dos células. Los hibridomas de células B
se generan al fusionar de manera artificial
linfocitos de vida breve, productores de anticuerpos, con células tumorales de vida prolongada a fin de generar células hijas de vida
prolongada que secretan grandes cantidades de anticuerpos monoclonales. (El término monoclonal se refiere al hecho de
que todas las células en un cultivo de hibridoma dado se derivan de la clona única de
células y, por ende, portan el mismo dna; los
detalles de la tecnología se describen en el
capítulo 20.) Aunque esta técnica se desarrolló por vez primera para la generación de
células B de vida prolongada, los científicos
que trabajaban en el laboratorio de John
Kappler y Philippa Marrack también la aplicaron a linfocitos T.
Los investigadores empezaron por inmunizar un ratón con la proteína ovoalbúmina
(ova), y permitieron que células T específicas para ova se dividieran y diferenciaran
durante algunos días, y después recolectaron los ganglios linfáticos del animal inmunizado. Para enriquecer su población inicial
con tantas células T específicas para ova
como fue posible, durante varias horas cultivaron con ova in vitro las células de ganglio
7
linfático recolectadas (figura 1, paso 1). Después de cierto tiempo en cultivo, fusionaron
estas células T específicas para ova, activadas, con células derivadas de un tumor de
células T (figura 1, paso 2); de este modo generaron varios cultivos de hibridoma de
células T de vida prolongada que reconocieron péptidos de ova en el contexto del
mhc del ratón original, un alelo del mhc
llamado H-2d. A continuación diluyeron las
células fusionadas en cada cultivo, lo que
generó varias líneas de hibridoma de células T
en las cuales todas las células en una línea
de hibridoma individual se derivaron del
pro­ducto de un evento de fusión único (fi­­
gura 1, paso 3); esto se denomina clonación
por dilución limitante. De esta manera, aislaron un hibridoma de células T que expresó
un tcr capaz de reconocer un péptido proveniente de la ova, en el contexto de proteínas del mhc clase 2 provenientes de ratones
de la cepa H-2d.
Entonces esas células T podían utilizarse
como antígenos e inyectarlas en un ratón
(figura 1, paso 4). Algunos días más tarde se
extirpó el bazo de este animal, y las células B
del ratón se fusionaron con células tumorales de la línea B (figura 1, paso 5). Después de
cultivar para estabilizar los híbridos, los
investigadores clonaron los hibridomas de
células B y seleccionaron una línea de hibridoma de células B que produjo anticuerpos
monoclonales que se unieron de manera
específica al hibridoma de células T (figura 1,
paso 6). Lo que es más importante, estos
anticuerpos interfirieron con la capacidad
de las células T para reconocer su antígeno
cognado (figura 1, paso 7). El hecho de que
este anticuerpo monoclonal inhibió la unión
de antígeno a tcr sugirió que el anticuerpo
se estaba uniendo de manera directa al
receptor, y estaba compitiendo con el antígeno por unión al tcr. A continuación usaron estos anticuerpos para inmunoprecipitar
el tcr desde preparaciones de membrana
solubilizadas con detergente, y purificaron la
proteína tcr (figura 1, paso 8).
De modo concurrente con estos experimentos, en los laboratorios de Stephen
Hedrick y de Mark Davis en los nih y de Tak
Mak en Toronto, se habían estado buscando
los genes que codifican para receptor de
célula T, y se habían logrado avances. Estos
experimentos, así como investigación subsiguiente realizada por Susumu Tonegawa, que
completó la identificación de los genes
que codifican para el tcr, se describen con
detalle en el capítulo 7.
Haskins et al. 1983. The major histocompatibility
complex-restricted antigen receptor on T cells. I.
Isolation with a monoclonal antibody. The Journal of Experimental Medicine 157:1149-1169.
Haskins et al. 1984. The major histocompatibility
complex-restricted antigen receptor on T
cells. Annual Review of Immunology 2:51-66.
Identificación de anticuerpo monoclonal que interfiere con el
reconocimiento de antígeno por células de hibridoma de células T
La mezcla de hibridoma
de células T con células
presentadoras de OVA en
ausencia de anticuerpo da
lugar a la proliferación de
hibridoma de células T
OVA
La mezcla de hibridoma
de células T con células
presentadoras de OVA en
presencia de anticuerpo da
lugar a proliferación nula
de hibridoma de células T
OVA
8
Las dos cadenas del receptor αβ
pueden observarse en la línea 1
del gel, corriendo una arriba de
la otra a aproximadamente 40
a 45 kDa. Se mostró que las dos
bandas de peso molecular más
alto que se observan en esta línea
representan bandas inespecíficas.
Bandas de
TCR
αβ de 45 kDa
97
98
sección I
Introducción
|
El complejo de transducción de señal de célula T
incluye CD3
Del mismo modo que la señalización de célula B requiere la
participación del complejo de transducción de señal Igα/Igβ,
la emisión de señales por medio del tcr depende de un complejo de proteínas denominadas en conjunto CD3 (figura 3-30).
El complejo CD3 está constituido de tres dímeros, un par δє
(delta épsilon), un par γє (gamma épsilon), y un tercer par que
consta de dos moléculas de CD3ζ (zeta) o un heterodímero
a)
ζη (zeta, eta). (Note que las cadenas γ y δ de CD3 son distintas
de las cadenas que constituyen el tcr γδ.) Al igual que Igα e
Igβ, las colas citoplasmáticas de las moléculas de CD3 están
salpicadas de secuencias itam que sirven como sitios de acoplamiento para proteínas adaptadoras después de fosforilación
de tirosina inducida por activación. Cada uno de los dímeros
CD3 contiene aminoácidos con carga negativa en su dominio
transmembrana que forman enlaces iónicos con los residuos
que tienen carga positiva sobre las regiones intramembrana del
receptor de célula T.
TCR
S S
201
222 S S 255
9
+
+
−
−
140
30
NH2
NH2
90
+
COOH COOH
(248) (282)
εδ
NH2
105
105
NH2
S S
184
ζ ζ
γε
91
S S
S S
134
23
S S
90
β
S S
S S
22
NH2
S S
NH2
S S
α
80
−
−
−
−
116
130
130
106
160
COOH
ITAM
185
COOH
185
COOH
150
COOH
143
COOH
COOH
TCR–CD3
b)
TCR
γε
δε
−
+
+
+
−
ζζ
−
ITAM
FigurA 3-30 Diagrama del complejo de TCR-CD3, que
constituye el receptor de unión a antígeno de célula T.
a) Los componentes del complejo CD3 incluyen los homodímeros ζζ
(de manera alternativa, un heterodímero ζη) más heterodímeros γϵ y δϵ.
Los dominios externos de las cadenas γ, δ y ϵ de CD3 constan de pliegues de inmunoglobulina, que facilita su interacción con el receptor de
célula T y uno con otro. Las colas citoplasmáticas largas de las cadenas
CD3 contienen una secuencia común, el motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (Immunoreceptor Tyrosine Activation
Motif [itam]), que funciona en la transducción de señal; estas secuencias
se muestran como cuadros de color azul. b) También pueden ocurrir
interacciones iónicas entre las regiones transmembrana que tienen carga
opuesta en el tcr y las cadenas CD3. Se muestran las interacciones propuestas entre los componentes de CD3 y el TCR αβ. [Adaptado de M.E. Call
y K.W. Wucherpfenning, 2004. Molecular mechanisms for the assembly of the T cell
receptor-CD3 complex. Molecular Immunology 40:1295.]
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
cuadro 3-4
|
99
Capítulo 3
Moléculas
accesorias de células T seleccionadas que participan en la transducción de señal
de células T
FUNCIÓN
Nombre
LigandoAdhesión
TransducciónMiembro de
de señal
la superfamilia Ig
CD4
MHC clase II
+
+
+
CD8
MHC clase I
+
+
+
CD2 (LFA-2)
CD58 (LFA-3)
+
+
+
CD28
CD80, CD86
?
+
+
CTLA-4
CD80, CD86
?
+
−
CD45R
CD22
+
+
+
CD5
CD72
?
+
−
CD8
β
S S
D2
α
S S
D1
S S
CD4
S S
El receptor de célula T está asociado de manera no covalente
con varias moléculas accesorias sobre la superficie celular
(cuadro 3-4). Con todo, las únicas dos de esas moléculas que
también reconocen el mhc-antígeno peptídico son CD4 y
CD8. Recuérdese que las células T maduras pueden subdividirse en dos poblaciones de acuerdo con su expresión de CD4
o CD8 sobre la membrana plasmática. Las células T CD4+
reconocen péptidos que están combinados con moléculas del
mhc clase II, y funcionan principalmente como células T
auxiliares o re­guladoras, mientras que las células T CD8+ reconocen antígeno que es expresado sobre la superficie de mo­­
léculas del mhc clase I, y funcionan principalmente como
células T citotóxicas.
CD4 es una glucoproteína de membrana monomérica de 55
kDa que contiene cuatro dominios tipo inmunoglobulina extracelulares (D1 a D4), una región transmembrana hidrofóbica, y
una cola citoplasmática larga que contiene tres residuos de
serina que pueden ser fosforilados (figura 3-31). CD8 adopta la
forma de un heterodímero αβ u homodímero αα enlazado con
enlace disulfuro (no son lo mismo que las cadenas α y β que
constituyen el heterodímero de tcr). Las cadenas tanto α
como β del CD8 son glucoproteínas pequeñas de aproximadamente 30 a 38 kDa. Cada cadena consta de un dominio tipo
inmunoglobulina, extracelular, único, una región tallo, una re­­
gión transmembrana hidrofóbica, y una cola citoplasmática que
contiene 25 a 27 residuos, varios de los cuales pueden ser fosforilados.
Los dominios extracelulares de CD4 y CD8 se unen a re­­
giones conservadas de moléculas del mhc clase II y clase I,
respectivamente (figura 3-7b). La co-unión de una molécula
del mhc única tanto por el tcr como por su co-receptor
CD4 o CD8 aumenta la avidez de la unión de célula T a su
blanco. Esta co-unión también acerca mucho los dominios
citoplasmáticos del TCR/CD3 y el co-receptor respectivo, y
ayuda a iniciar la cascada de eventos intracelulares que activan
una célula T.
La señalización por medio del receptor de antígeno, incluso
cuando se combina con la que ocurre por medio de CD4 o CD8,
es insuficiente para activar una célula T que no ha tenido contacto previo con antígeno (una célula T virgen). Una célula T
virgen necesita recibir simultáneamente señales por medio del
tcr y su co-receptor, CD28, para ser activada. Las moléculas
de tcr y CD28 sobre una célula T virgen deben co-unirse al
mhc-péptido presentado y el ligando CD28, CD80 (o CD86),
respectivamente, sobre la célula presentadora de antígeno para
que ocurra activación completa. Ya se hizo alusión a los eventos
de señalización mediados por CD28, que incluyen la estimulación
de la síntesis de interleucina-2 por la célula T, y se comentan a
fondo en el capítulo 11.
D3
D4
S S
Los co-receptores de célula T CD4 y CD8
también se unen al mhc
S S
FigurA 3-31 Estructura general de los correceptores CD4
y CD8; los dominios tipo Ig se muestran como círculos. CD8
adopta la forma de un heterodímero αβ o un homodímero αα. La molécula de CD4 monomérica contiene cuatro dominios con plegamiento Ig;
cada cadena en la molécula de CD8 contiene uno.
100
sección I
|
Introducción
CD45
TCR/CD3
CD4
CD28
ss
PIP3
PIP3
Itk
GADS
P
Grb-2 PI3K
LAT SLP76
P P
P
VAV
P
P
PLCγ1
P
P
P
ZAP-70 P
P
P
P
Lck
P
Grb-2
SOS
Bax Bad
Rac/Rho/
cdc42
Ras
DAG
Ca2+
Akt PDK1
Reorganización
del citoesqueleto
Supervivencia
Cascada de
MAP cinasa
PKCθ
FigurA 3-32 Vías de transducción de señal que
Calmodulina
Calcineurina
Citoplasma
Núcleo
NFAT
NF-κB
AP-1
Activación de gen
La Lck es la primera tirosina cinasa activada
en la señalización de célula T
Cuando el receptor de célula T interactúa con su antígeno unido
a célula, receptores, co-receptores y moléculas emisoras de se­­
ñales se agrupan hacia las balsas de lípidos ricas en colesterol de
la membrana plasmática (figura 3-32). La tirosina cinasa de la
familia Src, Lck, en circunstancias normales se encuentra asociada con CD4 y CD8, y la asociación entre Lck y CD4 es en
particular estrecha. La agrupación (inducida por antígeno) del
complejo de receptor-co-receptor lleva Lck hacia la vecindad de
la tirosina fosfatasa asociada a membrana, CD45, que elimina el
grupo fosfato inhibitorio sobre Lck. La fosforilación recíproca
por moléculas de Lck cercanas en sus sitios de tirosina activadores (figura 3-9) a continuación induce a Lck para que fosforile
residuos de itam de CD3. (Note que estos eventos tem­pranos
corren parejos con los inducidos en células B por la cinasa de la
familia SRC, Lyn, que también está regulada por la actividad de
fosfatasa de CD45.)
Una vez que los itam de CD3 son fosforilados, una segunda
tirosina cinasa, ZAP-70, se acopla en los residuos de tirosina
emanan del tcr. La unión de antígeno a célula T activa
la cinasa de la familia src, Lck, que fosforila la cinasa ZAP-70. La
ZAP-70 a su vez fosforila las moléculas adaptadoras LAT,
SLP76 y GADS que forman un andamio que permite la fosforilación y activación de PLCγ1 y PKCθ, con los efectos consiguientes sobre la activación de factor de transcripción
descrita en el texto. Las proteínas GEF Vav y SOS también son
activadas en el momento de la unión a LAT, lo que conduce
a activación de la vía del factor de transcripción Ras/MAP
cinasa y la vía Rac/Rho/cdc42; ello da pie a cambios de la
forma de la célula y la motilidad de la misma. La PI3 cinasa,
translocada hacia el lado citoplasmático de CD28, forma
PIP3, lo que induce la localización de las enzimas PDK1 y Akt
a la membrana. Esto lleva a más activación de NF-κB y supervivencia celular aumentada, como se describió.
fosforilados de las cadenas CD3ζ. ZAP-70 es activada por fosforilación mediada por Lck, y fosforila muchas moléculas adaptadoras, incluso SLP-76 y LAT, así como enzimas importantes en
la activación de células T, como PLCγ1.
Las células T usan estrategias de señalización
torrente abajo similares a las de las células B
Del mismo modo que en las células B, las señales iniciadoras en
el receptor de antígeno de células T con eventos de fosforilación
de tirosina a continuación son diseminadas a enzimas y factores de transcripción intracelulares usando una red de moléculas adaptadoras y enzimas.
En células T, una de las moléculas adaptadoras más tempranas que se incorpora en el complejo de emisión de señales es
LAT (proteína enlazadora de células T activadas [Linker protein
of activated T cells]), una proteína transmembrana asociada
con balsas de lípidos en la membrana plasmática. Después de
ligadura a tcr, lat es fosforilada en múltiples residuos por
ZAP-70, y estos residuos fosforilados ahora proporcionan sitios
de acoplamiento para varias enzimas importantes que portan
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
dominios SH2, incluso PLCγ1 (figura 3-32). La lat fosforilada
también se une a la proteína adaptadora gads, que está
asociada de manera constitutiva con el adaptador SLP-76.
Esta combinación de proteínas adaptadoras es crucial para la
señalización de receptor de célula T; proporciona el marco
estructural para casi todos los eventos de emisión de señales
torrente abajo.
Muchos de estos eventos torrente abajo ahora serán familiares. PLCγ1, localizado a la membrana plasmática por unión a
lat, es más activado por fosforilación de tirosina, mediada por
la cinasa Itk (que pertenece a una familia de cinasa denominada
cinasas Tec). Como se describió, PLCγ1 desintegra PIP2, lo que
libera IP3, que induce la liberación de calcio y la activación de
nfat por medio de la activación de calcineurina. El dag creado
por hidrólisis de PIP2 se une, en células T, a una forma especializada de pkc llamada la PKCθ (theta). Como se describió, esta
parte de la cascada de emisión de señales culmina de modo
similar en la degradación de los inhibidores de NF-κB y la
translocación del factor de transcripción activo hacia el núcleo
(figura 3-17).
La lat fosforilada también se asocia con el dominio SH2 de
Grb2, la ahora familiar molécula adaptadora que introduce
componentes de la vía Ras al complejo de señalización. Recuerde
que Grb2 se une de manera constitutiva a sos, el gef que facilita
|
Capítulo 3
101
la activación de la vía Ras. En células T, la vía Ras es importante
tanto para la activación del factor de transcripción AP-1, que
funciona para emitir señales para la secreción de citocina, como
para el paso de señales que reorganizan el citoesqueleto de
actina para liberación de citocina dirigida.
Así, al igual que para células B, la unión de tcr-antígeno
conduce a una multitud de consecuencias, entre ellas regulación
ascendente de factor de transcripción, reorganización del cito­
esqueleto, y secreción de citocina. De nuevo, al igual que para
células B, la emisión de señales de células T también afecta la
expresión de moléculas de adhesión como integrinas sobre
la su­­perficie celular y quimiocinas, que tiene efectos subsiguientes sobre la localización celular.
Está claro que la descripción de la señalización de la inmunidad adaptativa ofrecida en este capítulo representa sólo
la punta del iceberg, y estas cascadas de emisión de señales contienen más componentes y resultados que aquellos a los que
puede hacerse alusión en este breve esbozo. No obstante, del
mismo modo que las proteínas adaptadoras proporcionan un
andamio para que el sistema inmunitario organice sus proteínas emisoras de señales, los autores esperan que este capítulo
haya proporcionado un andamio similar para la organización
de los pensamientos del lector respecto a estos procesos fascinantes y complejos.
r e s u m e n
■■
■■
■■
■■
■■
■■
■■
Los antígenos se unen a receptores por medio de interacciones
de enlace no covalentes.
Las interacciones entre antígenos y receptores del sistema inmunitario son aumentadas por interacciones simultáneas entre coreceptores expresados por linfocitos y moléculas sobre células
presentadoras de antígeno o sobre antígenos complejos.
de NF-κB. El acoplamiento de la molécula adaptadora Grb2 a
proteínas adaptadoras facilita su unión a la proteína gef, sos, y
la activación de la vía de la map cinasa, lo que da por resultado
activación del factor de transcripción AP-1.
■■
Casi todas las interacciones receptor-antígeno son multivalentes,
y esta multivalencia aumenta significativamente la avidez de la
interacción de unión de receptor-antígeno.
La unión de antígeno a receptor induce una cascada de señalización
en la célula que porta el receptor, que da pie a alteraciones de la
motilidad, las propiedades adhesivas y el programa de transcripción de la célula activada.
La señalización de antígeno es iniciada por células tanto T como
B por agrupación de receptor mediada por antígeno. Los receptores agrupados están situados en regiones especializadas de las
membranas, llamadas balsas de lípidos.
Las proteínas CD3 e Igα/Igβ, que son elementos de transducción
de señal asociados con receptor de células B y T, son fosforiladas
sobre motivos de activación de inmunorreceptor basados en
tirosina (Immuno-receptor Tyrosine Activation Motifs [itam]),
y éstos sirven como puntos de acoplamiento para moléculas
adaptadoras.
Enzimas emisoras de señales torrente abajo y gef se acoplan
sobre las moléculas adaptadoras y hacen contacto con sus sustratos. Estas enzimas incluyen fosfolipasa Cγ, que desintegra PIP2
hacia dag e IP3. La interacción de IP3 con receptores localizados
al er lleva a la liberación de calcio intracelular y la activación de
proteínas reguladas por calcio, como la fosfatasa calcineurina. La
calcineurina desfosforila el factor de transcripción nfat, lo que
permite que éste tenga acceso al núcleo. El dag se une a la proteína cinasa C y la activa, lo que finalmente conduce a activación
■■
■■
■■
■■
■■
■■
El receptor de antígeno sobre células B es una forma unida a
membrana de la molécula de inmunoglobulina de cuatro cadenas que la célula B secreta en el momento de estimulación. Una
molécula de inmunoglobulina comúnmente se conoce como un
anticuerpo. Los anticuerpos tienen dos cadenas pesadas y dos
cadenas ligeras.
Los anticuerpos secretados por células B en el momento de
estimulación se clasifican de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, y anticuerpos de diferentes clases
desempeñan diversas funciones durante una respuesta inmunitaria.
La señalización de antígeno en células B procede de acuerdo
con las estrategias de emisión de señales compartidas entre
muchos tipos de células.
El receptor de antígeno sobre células T no es una molécula de
inmunoglobulina, aunque sus dominios de proteína están clasificados como pertenecientes a la superfamilia de proteínas inmunoglobulina.
Casi todas las células T portan receptores constituidos por un
heterodímero αβ que reconoce un antígeno complejo, que consiste en un péptido corto insertado en un surco en la superficie
de una proteína codificada por el complejo principal de histocompatibilidad (mhc) de genes.
Algunas células T portan receptores formados de cadenas receptoras γδ que reconocen una gama diferente de antígenos.
La señalización de antígeno en células T comparte muchas estrategias características con la señalización de célula B.
102
sección I
|
Introducción
R e f e r e n c i a s
Andreotti, A.H., P.L. Schwartzberg, R.E. Joseph, y L.J. Berg.
2010. T-cell signaling regulated by the Tec family kinase, Itk. Cold
Spring Harbor Perspectives in Biology 2:a002287.
Porter, R. R. (1972). Lecture for the Nobel Prize for physiology or
medicine 1972: Structural studies of immunoglobulins. Scandinavian Journal of Immunology 34(4):381-389.
Chaturvedi, A., Z. Siddiqui, F. Bayiroglu, y K.V. Rao. 2002. A
GPI-linked isoform of the IgD receptor regulates resting B cell
activation. Nature Immunology 3:951.
Tiselius, A. 1937. Electrophoresis of serum globulin. I. The Biochemical Journal 31:313.
Choudhuri, K., y M.L. Dustin. 2010. Signaling microdomains in
T cells. FEBS Letters 584:4823.
Edelman G.M., B.A. Cunningham, W.E. Gall, P.D. Gottlieb, U.
Rutishauser, y M. J. Waxdal. 1969. The covalent structure of an
entire gammaG immunoglobulin molecule. Proceedings of the
National Academy of Sciences U.S.A. 63:78.
Finlay, D., y D. Cantrell. The coordination of T-cell function by
serine/threonine kinases. 2011. Cold Spring Harbor Perspectives in
Biology 3:a002261.
Fitzgerald, K.A., y Z.J. Chen. 2006. Sorting out Toll signals. Cell
125:834.
Tiselius, A., y E. A. Kabat. 1938. Electrophoresis of immune serum.
Science 87:416.
Tiselius, A., y E. A. Kabat. 1939. An electrophoretic study of
immune sera and purified antibody preparations. Journal of
Experimental Medicine 69:119.
Wang, H., T. A. Kadlecek, B. B. Au-Yeung, H. E. Goodfellow, L. Y.
Hsu, T. S. Freedman, y A. Weiss. 2010. ZAP-70: An essential
kinase in T-cell signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2:a002279.
Yamamoto, M., y K. Takeda. 2010. Current views of toll-like receptor signaling pathways. Gastroenterology Research and Practice
2010:240365.
Heidelberger, M., y F.E. Kendall. 1936. Quantitative studies on
antibody purification : I. The dissociation of precipitates formed by
Pneumococcus specific polysaccharides and homologous antibodies. Journal of Experimental Medicine 64:161.
Sitios web útiles
Heidelberger, M., y K.O. Pedersen. 1937. The Molecular Weight of
Antibodies. Journal of Experimental Medicine 65:393.
metabólicas y reguladoras en la cual pueden efectuarse búsquedas.
Kanneganti, T.D., M. Lamkanfi, y G. Nunez. 2007. Intracellular
NOD-like receptors in host defense and disease. Immunity
27:549.
Koretzky, G.A., y P. S. Myung. 2001. Positive and negative regulation of T-cell activation by adaptor proteins. Nature Reviews
Immunology 1:95.
Kurosaki, T. 2011. Regulation of BCR signaling. Molecular Immunology 48:1287.
Love, P.E., y S.M. Hayes. 2010. ITAM-mediated signaling by the
T-cell antigen receptor. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology
2:a002485.
Macian, F. 2005. NFAT proteins: Key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology 5:472.
Nisonoff, A., F.C. Wissler, y L.N. Lipman. 1960. Properties of the
major component of a peptic digest of rabbit antibody. Science
132:1770.
Palacios, E.H., y A. Weiss. 2004. Function of the Src-family
kinases, Lck and Fyn, in T-cell development and activation.
Oncogene 23:7990.
Park, S.G., J. Schulze-Luehrman, M.S. Hayden, N. Hashimoto, W.
Ogawa, M. Kasuga, y S. Ghos. 2009. The kinase PDK1 integrates T cell antigen receptor and CD28 coreceptor signaling to
induce NF-kappaB and activate T cells. Nature Immunology
10:158.
www.genego.com Este sitio ofrece una base de datos de vías
www.nature.com/subject/cellsignaling Es una colección
de artículos de investigación originales, revisiones y comentarios
respecto a la emisión de señales celulares.
http://stke.sciencemag.org El sitio web de Signal Transduction Knowledge Environment, mantenido por la revista Science. Es
un excelente sitio, pero partes del mismo están cerradas a quienes
carecen de una suscripción.
www.signaling-gateway.org Este portal es presentado por la
University of California en San Diego, y es apoyado por Genentech
y Nature. Un excelente recurso, completo, con artículos especiales.
www.qiagen.com/geneglobe/pathwayview.aspx Qia-
gen. Un útil sitio web comercial.
www.biosignaling.com Parte de Springer Science+Business
Media.
www.youtube.com Muchos videos y animaciones excelentes
de sitios web de emisión de señales están disponibles en Youtube,
demasiado numerosos como para mencionarlos aquí. Simplemente
hay que escribir las vías en un navegador de web e ingresar. Sin em­­
bargo, es necesario conocer de dónde proviene el video. No todos
los videos son exactos, de modo que es necesario verificar los he­­
chos con la literatura médica publicada.
www.hhmi.org/biointeractive/immunology/tcell.
html Película del Howard Hughes Medical Institute (HHMI):
Cloning an Army of T Cells for Immune Defense.
Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T
P r e g u n t a s
d e
|
Capítulo 3
103
e s t u d i o
1. La familia nfat es una familia omnipresente de factores de
transcripción.
a. En condiciones de reposo, ¿dónde está ubicado el nfat en
una célula?
b. En condiciones activadas, ¿dónde está ubicado el nfat en
una célula?
c. ¿Cómo se libera desde su estado en reposo y se le permite
que se reubique?
d. Los fármacos inmunosupresores, como la ciclosporina, ac­­
túan por medio de inhibición de la fosfatasa calcineurina. Si nfat es omnipresente, ¿cómo cree que estos
fármacos pueden actuar con tan pocos efectos secunda­
rios sobre otros procesos de señalización dentro del
cuerpo?
2. Durante los primeros días de los experimentos diseñados para
detectar el receptor de célula T, varios grupos de investigación
diferentes encontraron que los anticuerpos dirigidos contra
proteínas de inmunoglobulina parecieron unirse al receptor
de célula T. Dado lo que ahora se sabe acerca de la estructura de las inmunoglobulinas y el receptor de célula T, ¿por
qué esto no es por completo sorprendente?
3. ¿Cierto o falso? Explique sus respuestas.
Las interacciones entre receptores y ligandos en la superficie
celular:
a. están mediadas por interacciones covalentes.
b. pueden dar lugar a la creación de nuevas interacciones co­­
valentes dentro de la célula.
4. Describa cómo las manipulaciones experimentales que siguen
se usaron para determinar la estructura de anticuerpos.
a. Reducción y alquilación de la molécula de anticuerpo
b. Digestión enzimática de la molécula de anticuerpo
c. Detección de fragmentos de inmunoglobulina por anti-
cuerpo
5. ¿Qué es un itam, y qué proteínas modifican el itam en Igα e
Igβ?
6. Defina una proteína adaptadora. Describa cómo una interac-
ción entre proteínas que portan SH2 y grupos de tirosina fosforilados (pY) ayuda a transducir una señal desde el receptor
de célula T hacia la proteína cinasa ZAP-70.
7. La IgM tiene 10 sitios de unión a antígeno por cada molécula,
mientras que la IgM sólo tiene dos. ¿Esperaría que la IgM
fuera capaz de unirse a cinco veces más sitios antigénicos en
un antígeno multivalente que la IgG? ¿Por qué sí/por qué no?
8. Usted y otra compañera están estudiando un receptor de cito-
cina sobre una célula B que tiene un Kd de 10–6 M. Usted sabe
que los sitios receptores de citocina sobre la superficie celular
deben estar ocupados al menos 50% para que la célula B reciba
una señal de citocina desde una célula T auxiliar. Su compañera de laboratorio mide la concentración de citocina en la
sangre del animal de experimentación y detecta una concentración de 10–7 M. Ella le dice a usted que el efecto que ustedes
han estado midiendo posiblemente no podría depender de las
citocina que están estudiando. Usted está en desacuerdo. ¿Por
qué?
9. La activación de cinasas de la familia Src es el primer paso en
varios tipos diferentes de vías de señalización. Por ende tiene
sentido biológico que la actividad de esta familia de tirosina
cinasas esté regulada de manera en extremo estrecha. Describa
cómo la fosforilación de cinasas de la familia Src puede
suministrar señales tanto activadoras como inhibidoras a
cinasas Src.
10. Usted ha generado una clona de células T en la cual la tirosina
cinasa de la familia Src, Lck, es inactiva. Estimula esa clona
con su péptido antigénico cognado, presentado sobre la plataforma de mhc apropiada, y hace pruebas para secreción de
interleucina-2, como una medida de activación de células T.
¿Espera ver secreción de IL-2 o no? Explique.
11. Nombre una proteína que se ha mostrado que es defectuosa en
muchos casos de agammaglobulinemia ligada a X, y describa
cómo una reducción de la actividad de esta proteína podría
llevar a inmunodeficiencia.
12. Las proteínas receptoras de células B y T tienen regiones in­­
tracitoplasmáticas notoriamente cortas, de sólo algunos
aminoácidos. ¿Cómo puede usted conciliar esta característica
estructural con la necesidad de emitir una señal al interior de
la célula de la presencia de antígeno unido?
13. Describa una manera en la cual la estructura de los anticuer-
pos está muy bien adaptada a su función.
14. Como un estudiante graduado, su asesor ha dado a usted una
clona de células T que parece estar constitutivamente (siempre) activada, aunque a un bajo nivel, incluso en ausencia de
estimulación antigénica, y le ha pedido que averigüe por qué.
Su compañero de pupitre le sugiere empezar por verificar la
secuencia de su gen lck, o el estado de la actividad de Csk en
la célula. Usted está de acuerdo en que son buenas ideas. ¿Cuál
es su razonamiento?