1 evaluación de medios de cultivo altos y bajos en nutrientes para la

EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ALTOS Y BAJOS EN NUTRIENTES
PARA LA RECUPERACIÓN DE HETERÓTROFOS EDÁFICOS EN LA
ECORREGIÓN CAFETERA DE LOS ANDES
NELCY EDITH LATORRE BARRIOS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C.
NOVIEMBRE DE 2007
1
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
2
EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ALTOS Y BAJOS EN NUTRIENTES
PARA LA RECUPERACIÓN DE HETERÓTROFOS EDÁFICOS EN LA
ECORREGIÓN CAFETERA DE LOS ANDES
NELCY EDITH LATORRE BARRIOS
APROBADO
_________________________
Fabio Roldan , Ph D.
Director
________________________
________________________
Gerardo Moreno
David Gómez
Jurado
Jurado
3
EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ALTOS Y BAJOS EN NUTRIENTES
PARA LA RECUPERACIÓN DE HETERÓTROFOS EDÁFICOS EN LA
ECORREGIÓN CAFETERA DE LOS ANDES
NELCY EDITH LATORRE BARRIOS
APROBADO
________________________
Dra Ángela Umaña
Decana Académico
________________________
Janeth Arias Msc
Director de Carreras de Microbiología
4
A Dios y a mis padres por ser la guía de mi vida
5
AGRADECIMIENTOS
Al CIEBREG-COLCIENCIAS y a la Pontificia Universidad Javeriana
por su apoyo
económico y logístico.
Al Doctor Fabio Roldan por su paciencia y su apoyo.
A todos los integrantes de la unidad de saneamiento y biotecnología ambiental (USBA) por
su colaboración.
A mis amigos que me acompañaron a lo largo de ese proceso.
A Andrés por su comprensión, ayuda y por ser siempre incondicional.
A mi familia por ser la motivación de todo y por que sin ellos nada de esto hubiera sido
posible.
6
TABLA DE CONTENIDOS
Pág
RESUMEN ....................................................................................................................... ….1
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 3
2. MARCO TEÓRICO .......................................................................................................... 5
2.1 El Suelo………………………………………………………………………………5
2.1.1 Características físicas del suelo….…………………………………...……….6
2.1.1.1 Textura y estructura del suelo……………………………………….6
2.1.1.2 Porosidad……………………………………………………………7
2.1.2 Características químicas del suelo…………………………………………….8
2.1.2.1 pH……………………………………………...……………………8
2.1.2.2 Materia orgánica…………………………………………...………..8
2.1.3 Distribución microbiana en el suelo ................................................................. 9
2.2 Diversidad microbiana. .............................................................................................. 10
2.3 Microorganismos Heterótrofos .................................................................................. 11
2.4 Determinación del número de microorganismos ....................................................... 12
2.4.1 Requerimientos nutricionales para el crecimiento microbiano……………...12
2.4.1.1 Fuente de carbono……………………………………………………...13
2.4.1.2 Factores de crecimiento…………………………...…………………...13
2.4.2 Medios de cultivo ........................................................................................... 13
2.4.2.1 Clasificación de los medios de cultivo…………………………………14
2.4.2.1.1 Según el estado ...................................................................................... 14
2.4.2.1.2 Según su composición: .......................................................................... 14
2.5 Extracción de microorganismos de la matriz de suelo ............................................. 15
2.5.1 Recuento en placa de heterótrofos totales ....................................................... 16
2.6 Microorganismo oligótrofos y copiótrofos………………………………...………17
2.7 Medios con baja concentración de nutrientes para recuento de heterótrofos ........... 18
2.7.1 Medio R2A ...................................................................................................... 18
2.7.2 Medio NWRI ................................................................................................... 18
2.8 Medios con alta concentración de nutrientes para recuento de heterótrofos ............ 19
2.8.1 Medio tripticasa soya (TSBA) ......................................................................... 19
2.8.2 Agar infusión suelo (AIS) ................................................................................ 19
7
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ............................................................................ 20
4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 21
5. OBJETIVOS .................................................................................................................... 22
5. 1 Objetivo general ........................................................................................................ 22
5.2 Objetivos especificos ................................................................................................ 22
6. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................ 23
6.1 Estandarización del proceso de extracción de microorganismos............................... 23
6.2 Localización del área de estudio ................................................................................ 24
6.3 Diseño experimental .................................................................................................. 26
6.4 Toma de muestras ...................................................................................................... 27
6.5 Análisis fisicoquímicos .............................................................................................. 27
6.6 Comparación de medios de cultivo. ........................................................................... 27
6.7 Análisis estadístico .................................................................................................... 28
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 29
7.1 Estandarización del proceso de extracción de microorganismos.............................. 29
7.2 Comparación de medios de cultivo. .......................................................................... 32
7.2.1 Cuenca del río La Vieja ................................................................................... 33
7.2.2 Cuenca del Río Otún ........................................................................................ 35
7.3 Caracterización microscópica de colonias diferentes recuperadas en medio R2A .... 36
7.4 Evaluación del efecto de las coberturas vegetales sobre la densidad de
microorganismos heterótrofos. ................................................................................. 38
7.4.1 Efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismos heterótrofos
en La Vieja…………..………………………………………………………38
7.4.2 Efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismos heterótrofos
en El Otún …………………………………………….……………………40
7.5 Abundancia de microorganismos heterótrofos en relación con la densidad de
microorganismos totales (DAPI)…………………………………………………41
8. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 45
9 . RECOMENDACIONES ............................................................................................... 45
10. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 46
11. ANEXOS ....................................................................................................................... 53
8
ÍNDICE DE TABLAS
Pág
Tabla 1. Características de los horizontes del suelo…………………………………...…..5
Tabla 2. Clasificación del suelo según tamaño de partícula ………………………...……6
Tabla 3. Tratamientos y soluciones utilizadas durante la extracción de microorganismos
edáficos……..........................................................................................................16
Tabla 4. Tratamientos evaluados durante la extracción de microorganismos
edáficos…..............................................................................................................23
Tabla 5. Coberturas y fincas seleccionadas en la ventana la Vieja…………….....…… ..25
Tabla 6. Coberturas y fincas seleccionadas en la ventana Otún………………….………..26
Tabla 7. Diferencias entre los recuentos de heterótrofos en los medios de cultivo en la
cuenca del río La Vieja………………………………………………………..34
Tabla 8. Diferencias entre los medios de cultivo en la cuenca del río El Otún………….36
Tabla 9. Abundancia relativa de heterótrofos con relación a la densidad total
de
de microorganismos del suelo (DAPI)……………………………………......42
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Dilución inicial de la muestra de suelo en solución de extracción ……………..24
Figura 2. Tratamientos evaluados para la extracción de microorganismos del suelo……..29
Figura 3. Dispersión de los datos en los tratamientos de extracción de microorganismos..30
Figura 5. Interacción entre soluciones y agitaciones evaluadas para extracción de
microorganismos del suelo…………………………………………..…………..31
Figura 6. Morfologías y reacción de Gram observadas en las cuencas ………….………..37
Figura 7. Recuentos de heterótrofos edáficos por cobertura en La Vieja……..………....39
Figura 8. Recuentos de heterótrofos edáficos por coberturas en El Otún…………..…….41
10
RESUMEN
El objetivo del presente estudio fue evaluar medios de cultivo bajos y altos en nutrientes
para la recuperación de heterótrofos del suelo en diferentes coberturas vegetales en la
Ecoregión Cafetera (cuencas de los ríos la Vieja y Otún). Inicialmente, se estandarizó el
proceso de extracción de microorganismos del suelo evaluando diferentes tiempos,
velocidades y soluciones de extracción. Se realizó la comparación de los medios de cultivo
bajos (R2A y NWRI) y altos en nutrientes (TSBA y AIS), para seleccionar el medio que
presentará la mayor recuperación de microorganismos heterótrofos del suelo y poder
evaluar el efecto de las coberturas vegetales sobre las densidades de estos
microorganismos. Finalmente, se determinó la abundancia relativa de los heterótrofos en
relación con los conteos de microorganismos totales obtenidos por 4'-6-Diamidino-2fenilindol diclorhidrato (DAPI).
El uso de solución salina (0.85% p/v) a 160 rpm por 15 min presentó los mayores recuentos
de microorganismos. Se estableció que los medios bajos en nutrientes (R2A y NWRI)
presentaron los recuentos significativamente mayores y específicamente el R2A, que fue
seleccionado y utilizado para estimar la densidad de los heterótrofos edáficos en las
diferentes coberturas.
Las densidades de heterótrofos obtenidas presentaron una alta variabilidad y no se
observaron diferencias significativas entre las diferentes coberturas vegetales evaluadas.
Los mayores recuentos se presentaron guaduales de La Vieja y en el segundo evento de
muestreo en el Otún, esto puede ser posiblemente atribuido al aumento en las
precipitaciones durante este evento. Por otro lado, no se observaron diferencias
significativas en la abundancia relativa de las coberturas evaluadas, lo que puede mostrar
que este grupo microbiano posiblemente no un buen indicador de los cambios en el uso del
suelo.
Palabras claves: abundancia relativa, recuento heterótrofos, densidad microorganismos, uso
del suelo
11
ABSTRACT
The main goal of this study was to evaluate different media with low and high nutrient
concentrations for its ability to recover edaphic heterotrophic microorganisms from
different vegetal covers in the Coffee Eco region (river basins of the rivers Vieja and Otún).
Initially, the process of extraction of microorganisms from soil was standardized evaluating
different times, speeds and extraction solutions. To select the growth media with the
highest microbial recovery, low (R2A and NWRI) and high (TSBA and AIS) media were
compared. The selected media was used to estimate the heterotrophic density in the vegetal
covers. Finally, the abundance of the heterotrophic was determined in relation with the total
microorganisms’ counts that were obtained by using the 4'-6-Diamidino-2-fenilindo
diclorhidratol (DAPI).
The use of saline solution (0,85% p/v) to 160 rpm by 15 min presented the greater counts of
soil microorganisms. It was determined that the growth media with low nutrients presented
significant higher counts and specifically the R2A media, that was selected and use to
estimate the edaphic heterotrophic microorganisms during the study.
The heterotrophic densities observed presented a high variability and there were not
significant differences between the different vegetation covers. The highest counts were
observed in guaduales of La Vieja and in the second sampling event in the Otún. It could be
attributed to the precipitation increase during this sampling event.
On the other hand, significant differences in the relative abundance of the evaluated covers
were not observed, which could possibly indicate that this microbial group is not a good
indicator of the health and use changes of the soil.
Key words: microbial density, relative abundance, heterotrophic counts, soil use
12
1. INTRODUCCIÓN
El suelo es considerado un sistema heterogéneo, dinámico y discontinuo, con presencia de
microorganismos que viven en numerosos microhábitats que difieren temporal y
espacialmente. Factores como la fuente de carbono (FC) y energía (FE), macronutrientes,
micronutrientes, factores de crecimiento, agua disponible, temperatura, presión, aceptores
terminales de electrones (ATEs), pH y potencial de oxido-reducción pueden afectar la
ecología, actividad y densidad de los microorganismos en el suelo.
El conocimiento de la diversidad microbiana del suelo es bastante limitado, principalmente
por la incapacidad de proveer las condiciones de cultivo óptimas para el crecimiento de los
microorganismos. Actualmente, las investigaciones existentes sobre biodiversidad en
diferentes tipos de ecosistemas en Colombia, hacen énfasis en el estudio de la variedad de
flora y fauna, siendo la diversidad microbiana un componente poco conocido.
Para ampliar el entendimiento de la diversidad microbiana es importante el estudio de los
microorganismos cultivables del suelo, debido a que pueden brindar una aproximación al
conocimiento del efecto de los cambios ambientales sobre la densidad de las comunidades
microbianas. Para esto se debe tener en cuenta el proceso de extracción de los
microorganismos, el aporte de condiciones nutricionales adecuadas, y la aplicación de
temperaturas y tiempos de incubación indicados que favorezcan la mayor recuperación de
los microorganismos de la matriz del suelo.
Este trabajo se enmarcó en el programa del Centro de Investigaciones y Estudios en
Biodiversidad y Recursos Genéticos (CIEBREG) que busca caracterizar, evaluar y
monitorear la biodiversidad de paisajes naturales asociados a sistemas productivos para el
mantenimiento de la funcionalidad ecológica. Esta investigación se llevó a cabo en la
Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) con el fin de servir de soporte
para los trabajos de USBA-CIEBREG en el estudio de microorganismos degradadores de
hidrocarburos, microorganismos del ciclo del nitrógeno y en la evaluación del efecto de las
coberturas vegetales sobre las comunidades microbianas en las cuencas del río La Vieja y
El Otún.
Para cumplir con este objetivo fue necesario evaluar los microorganismos heterótrofos
cultivables del suelo, para lo cual se estandarizó el proceso de extracción de
13
microorganismos, se estimó la densidad de microorganismos heterótrofos, se realizó la
caracterización de morfotipos en las diferentes coberturas vegetales en las cuenca de los
ríos La Vieja y el Otún, y se determinó la relación entre conteo directo con el conteo en
placa por medio del índice de abundancia relativa.
14
2. MARCO TEÓRICO
2.1 El Suelo
El término suelo puede definirse como la capa superior de la Tierra que se distingue de la
roca sólida. Los suelos son formaciones geológicas naturales, agregados de minerales no
consolidados y de partículas orgánicas producidas por la acción combinada del viento, el
agua y los procesos de desintegración orgánica, lo cual justifica su continua evolución y, en
consecuencia, su gran variedad (Lederberg, 2000; Navarro, 2000). La composición química
y la estructura física del suelo están determinadas principalmente por: el tipo de material
geológico del que se origina, la cubierta vegetal, la topografía y los cambios artificiales
resultantes de las actividades humanas (Lederberg, 2000).
El perfil del suelo se considera como la exposición vertical de una porción superficial de la
corteza terrestre, constituido por una serie de capas u horizontes, que se diferencian
estructuralmente en su textura, color y consistencia, además de poseer diferencias
fisicoquímicas y microbiológicas (Tabla 1) (Navarro, 2000).
Tabla 1. Características de los horizontes del suelo.
Horizonte
Características
O
Capas superficiales en las que dominan el detritus orgánico.
Horizonte mineral formado en la superficie del suelo o justo
A
debajo del horizonte O. Contiene una acumulación de materia
orgánica descompuesta (humus).
Horizonte mineral que ha perdido arcillas, hierro y aluminio,
E
dejando fundamentalmente partículas de arena y limo.
Horizonte dominado por la destrucción de la estructura rocosa
B
original que contiene materiales iluviados de los horizontes
superiores.
Horizonte (excluyendo el lecho de roca) escasamente afectado por
C
la génesis del suelo.
Lecho de roca, principalmente basalto, granito, la piedra arenisca o
R
la piedra caliza.
Fuente: Coyne, 2000.
El suelo presenta una gran diversidad de comunidades microbianas que contribuyen en gran
manera en el ciclaje de los nutrientes, su salud y estructura, y por ende su fertilidad,
15
contribuyendo al sostenimiento el crecimiento vegetal (Kennedy, 1999). A su vez, las
plantas ejercen gran influencia en el crecimiento microbiano, principalmente por los
exudados de las raíces y las partes senescentes de las plantas que son una fuente esencial de
nutrientes para los microorganismos (Atlas y Bartha, 2001).
2.1.1 Características físicas del suelo
El suelo esta constituido por materia mineral, materia orgánica, agua y aire, siendo un
medio ideal para ser el soporte del crecimiento de plantas y diferentes comunidades
microbianas (Navarro, 2000).
Según la relación de estos componentes en la matriz del suelo, este puede presentar
diferentes características físicas y químicas que determinan las particulares del suelo como
lo son la textura, la estructura y la porosidad.
2.1.1.1 Textura y estructura del suelo
La textura del suelo constituye una propiedad física muy importante para la ecología de los
microorganismos, ya que determina el área de superficie disponible como hábitat para el
crecimiento de los microorganismos (Atlas y Bartha, 2001). La textura del suelo es
establecida por la distribución de tamaño de las partículas individuales del suelo (Sylvia et
al., 2005). Teniendo en cuenta la influencia del tamaño de estas partículas sobre las
propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo, se han clasificado por medio del
análisis granulométrico (Tabla 2).
Tabla 2. Clasificación del suelo según tamaño de partícula
Denominaciones
Arena gruesa
Arena fina
Limo
Arcilla
Fuente: Navarro, 2000
Diámetro de partícula (μm)
200- 2000
20 -200
20
<2
16
La arena, la arcilla y el limo se adhieren entre si formando agregados (terrones naturales del
suelo) que se mantienen unidos por minerales inorgánicos precipitados o sustancias
húmicas (fracciones muy resistentes de materia orgánica del suelo) (Coyne, 2000). De igual
forma los microorganismos favorecen la formación de estos agregados, principalmente por
la producción de polisacáridos, los cuales contribuyen en la estructura y formación del
suelo (Sylvia et al., 2005). Dependiendo de su forma, los agregados definen la estructura
del suelo, por ejemplo, los agregados de forma esférica poseen mayor espacio entre si,
haciendo que el suelo presente una mayor permeabilidad, a diferencia de los agregados en
forma de bloque o prisma (Sylvia et al., 2005).
2.1.1.2 Porosidad
Entre los agregados y partículas del suelo existen espacios abiertos denominados poros,
cuyo tamaño regula la entrada y colonización de los microorganismos. De igual forma, el
tamaño de los poros influye en la difusión del agua, los gases y los nutrientes a través del
suelo, generando diversas condiciones para el desarrollo microbiano (Coyne, 2000).
La porosidad puede ser de gran tamaño, haciendo referencia al suelo con poros de diámetro
entre 25 y 100 mm, lo que permite un rápido movimiento de gases y el agua del suelo
(Sylvia et al., 2005). Por otro lado, la microporosidad hace referencia a suelos con poros de
diámetros entre 0,2 a 2,5 mm, estos poros se encuentran principalmente en los suelos ricos
en elementos finos y arcilla, presentando una microfauna numerosa y activa (Lederberg,
2000). Por lo general los suelos arcillosos presentan un drenaje lento del agua debido a que
los microporos restringen el flujo de esta, generando zonas de anaerobiosis que favorecen el
crecimiento de microorganismos que sean afines a estas condiciones (Madigan et al., 2001;
Sylvia et al., 2005).
17
2.1.2 Características químicas del suelo
2.1.2.1 pH
El pH del suelo es un factor de gran importancia porque afecta directamente la
disponibilidad de los nutrientes y cambia las características químicas del ambiente. Los
microorganismos tienen rangos de pH óptimos para su crecimiento, que al ser alterados en
el ambiente, modifican significantemente la densidad microbiana (Sylvia et al. 2005). La
mayoría de los microorganismos crecen mejor en suelos minerales con valores de pH
neutros, reduciendo notablemente su actividad cuando el pH es inferior a 5.5 o superior a
9.0 (Navarro, 2000).
2.1.2.2 Materia orgánica
La materia orgánica del suelo está constituida por organismos vivos (microorganismos,
animales y raíces de plantas), materia orgánica en descomposición y la fracción húmica del
suelo (Eweis et al., 1999; Maier et al., 2001). La materia orgánica del suelo sufre procesos
de oxidación que llevarán a la producción de CO2 y H2O. Sin embargo, una parte de la
materia orgánica escapa a este proceso de oxidación y se transforma en grandes
macromoléculas que no son solubles y constituyen la fracción denominada húmica (o
humus (Atlas y Bartha, 2001).
El humus se caracteriza por su color negruzco, debido a la gran cantidad de carbono que
contiene y se encuentra principalmente en los primeros horizontes del suelo. Este se
compone de tres fracciones separables por su solubilidad en ácidos y bases (ácido fúlvico),
en ácidos pero no en álcalis (ácido húmico) o insolubilidad en ambos (húmica) (Bitton,
2002).
En el proceso de degradación de la materia orgánica, el metabolismo de los
microorganismos heterótrofos se encuentra regulado por factores como aireación, humedad,
pH y disponibilidad de nutrientes en el suelo. Algunas condiciones favorecen este proceso
de degradación, entre estos se encuentran: bajo contenido de lignina en los residuos
vegetales, cantidad adecuada de nitrógeno disponible o bajas relaciones C:N, pH cercanos a
18
la neutralidad, adecuada aireación y humedad y temperaturas de suelo entre 30 a 40 °C.
Como resultado de la combinación de diferentes factores en el proceso de descomposición
de los residuos vegetales, una fracción del carbono presente en el suelo es convertido a CO2
y otra es incorporada a la biomasa microbiana interviniendo en gran medida en el reciclaje
del carbono en el ambiente (Navarro, 2000; Sylvia et al., 2005).
La materia orgánica es un indicador clave de la calidad del suelo debido a que la diversidad
y la actividad de la mesofauna y los microorganismos están directamente relacionadas con
la materia orgánica. El aumento de la materia orgánica genera una mayor agregación y
estabilidad de la estructura, incrementando la tasa de infiltración y la retención de agua así
como la resistencia contra la erosión hídrica y eólica (Atlas y Bartha, 2001).
En ciertos suelos a pesar de el bajo contenido proteico se puede detectar una alta actividad
enzimática, esto es frecuente en suelos con alta presencia de arcilla, debido principalmente
a su carga eléctrica neta, actuando como un intercambiador iónico, reteniendo enzimas
procedentes de la descomposición de tejidos y células (Coyne, 2000).
2.1.3 Distribución microbiana en el suelo
Los patrones de distribución espacial de los microorganismos se relacionan con factores
ambientales como temperatura del suelo, pH, salinidad, disponibilidad de agua y nutrientes.
Estos factores influencian la actividad microbiana y desempeñan un papel muy importante
en la determinación de la dinámica espacial y temporal de
los microorganismos en
ambientes naturales.
Las características que influyen en la distribución microbiana en el suelo pueden ser
extrínsecas e intrínsecas. Las características extrínsecas proceden del suelo (estructura,
gases disponibles, agua, potencial de oxidorreducción) y del amiente (radiación solar,
precipitaciones, viento y humedad relativa).
Las características intrínsecas incluyen los mecanismos de persistencia y resistencia de los
microorganismos (esporas), su tamaño, tasa de mortalidad y procesos metabólicos (Coyne,
2000). Estas características se relacionan con la función que desempeñan los
19
microorganismos en el ambiente, ya que estos constituyen un papel fundamental en el
ciclaje continúo de nutrientes como el carbono, nitrógeno, fósforo, hierro y azufre (Kirk et
al., 2004; Liu et al., 2006).
2.2 Diversidad microbiana.
La biodiversidad se define como la variabilidad de organismos vivos de cualquier
ecosistema (terrestre, marino, aéreo o acuático) y comprende la diversidad dentro de cada
especie, así como entre las especies y ecosistemas de los que forman parte (Hawksworth,
1996; Minambiente, 1997)
Al ser la diversidad una expresión de la estructura de un sistema, la forma en que se expresa
esta propiedad corresponde a un número simple y sin unidades generalmente calculado con
una ecuación matemática (Margalef, 1974). La diversidad se fundamenta en la riqueza
(número de especies o tipos de organismos en una comunidad), la uniformidad, la
abundancia relativa y la distribución de individuos entre las especies (Franklin et al., 2001).
Sin embargo, la definición tradicional de la diversidad se ha basado principalmente en el
estudio de plantas y animales y no se aplica fácilmente a los microorganismos.
La diversidad microbiana es, en general, un término que incluye la diversidad genética
(cantidad y distribución de la información genética dentro de las especies), la diversidad de
las comunidades microbianas y la diversidad ecológica. Estas varían según la estructura del
suelo, la complejidad de las interacciones y los niveles tróficos presentes en este ambiente.
(Nannipieri et al., 2003).
La perdida de la biodiversidad en el mundo es causada principalmente por la destrucción de
los hábitats naturales. Las zonas tropicales representan los principales almacenes de
biodiversidad del planeta, estas zonas se pierden rápidamente debido al incremento de
campos de cultivo, expansión de la frontera agrícola, cultivos ilícitos, la transformación del
paisaje, la sobreexplotación y el cambio climático (Pereira et al., 2006).
Debido al desconocimiento de la influencia de las actividades antropogénicas sobre los
ecosistemas subterráneos y sobre las comunidades edáficas, es necesario entender la
diversidad microbiana como una herramienta fundamental para mantener la salud del
ambiente y del suelo (Kirk et al., 2004; Liu, 2006).
20
La gran diversidad de comunidades microbianas no permite que su estudio sea sencillo y
menos aun establecer un eslabón entre la estructura y la distribución de características
fisiológicas de las comunidades microbianas (Calbrix et al., 2005). Sin embargo, en los
últimos años se ha incrementado el interés en esta área, realizándose diversos estudios que
dan una aproximación al conocimiento de la diversidad microbiana, no obstante estas
investigaciones aun son escasas en nuestro país.
2.3 Microorganismos Heterótrofos
Los microorganismos heterótrofos obtienen energía por medio de la oxidación de la materia
orgánica presente en el suelo (Coyne, 2000). Estos microorganismos poseen un papel muy
importante en el ciclo de carbono, reciclando el material orgánico en CO2 y H2O (Atlas y
Bartha, 2001). Debido a su distribución ubicua, gran abundancia y capacidades metabólicas
diversas, los heterótrofos microbianos son los principales responsables de las actividades de
descomposición de la materia orgánica (Lederberg, 2000).
Los microorganismos heterótrofos presentan gran diversidad en cuanto a exigencias en
sustratos carbonados, variando desde los que pueden utilizar hidratos de carbono, alcoholes
y ácidos orgánicos sencillos hasta los que son capaces de descomponer compuestos
polimerizados, como la celulosa y la lignina (Julca-Otiniano et al., 2006).
La mayoría de estos microorganismos heterótrofos son saprofitos comunes en el suelo que
pueden ser eficaces transformadores de sustratos edáficos en biomasa (Julca-Otiniano et
al., 2006).
2.4 Determinación de la densidad de microorganismos
Debido a la necesidad de estudiar las relaciones existentes entre los microorganismos y el
ecosistema, es necesario determinar la biomasa y la actividad microbiana en su hábitat
natural (Atlas y Bartha, 2001). En los métodos de conteo de los microorganismos se
utilizan procedimientos para facilitar su detección, siendo los mas empleados los sistemas
de enumeración directa, como siembra en placa, microscopia por epifluorecencia y
determinación del número más probable (Grant, 1989; Yu et al., 1995).
21
La ventaja de este tipo de metodologías clásicas para el recuento de la biomasa en muestras
ambientales, como la siembra en placa, radica en que se obtiene una alta variedad de
morfotipos que pueden ser posteriormente estudiados. Además, por medio de la
optimización de los medios de cultivo, se puede obtener una recuperación microorganismos
de lento crecimiento o que poseen condiciones específicas para su desarrollo y
multiplicación (Balestra y Misaghi, 1997). Para un mejor entendimiento de los
microorganismos cultivables se deben desarrollar métodos de cultivo simples para obtener
colonias de bacterias del suelo en el laboratorio. Aunque que por medio del uso de técnicas
como las moleculares, se pueden obtener resultados
satisfactorios, estas técnicas son
bastaste costosas y dispendiosas, siendo necesario el uso de metodologías mas simples y
económicas, por lo que aun se utilizan medios de cultivo en el estudio de los
microorganismos (Janssen et al., 2002; Joseph et al., 2003).
2.4.1 Requerimientos nutricionales para el crecimiento microbiano
Los microorganismos requieren una serie nutrientes para su desarrollo, crecimiento y
formación de nueva biomasa. Estos nutrientes pueden ser los macronutrinetes, que son
requeridos en grandes cantidades, como C, N y P; y micronutrientes que se requieren en
pequeñas cantidades como el K, Cu, Ni y Mo (Atlas y Bartha, 2001)
Para el cultivo de los microorganismos es importante proveer una fuente de nitrógeno,
como el amonio, el nitrato o aminoácidos. El nitrógeno es utilizado por las bacterias para
formar aminoácidos y bases nitrogenadas, entre otros moléculas (Sylvia et al., 2005). De
igual forma, elementos como P, S, K y Mg, son requeridos por los microorganismos para la
síntesis de moléculas, como ácidos nucleídos, vitaminas, coenzimas, entre otras. Además
desempeñan funciones importantes como cofactores enzimáticos, como es el caso del Mg
(Coyne, 2000; Madigan et al., 2001).
Elementos como el Cu, Ni, Cr, Mn, Mo, Se y Zn se conocen como micronutrientes o
elementos traza, que son requeridos en bajas concentraciones y desempeñan un rol
estructural en las enzimas; por ejemplo, el Mo6+ se necesita en la nitrogenasa que es el
enzima que cataliza la conversión del nitrógeno atmosférico en amoníaco en la fijación
biológica de nitrógeno (Atlas, 1995).
22
2.4.1.1 Fuente de carbono
El carbono interviene en la composición de los seres vivos y forma parte de la atmósfera,
hidrosfera y litosfera. En la atmósfera se encuentra mayoritariamente en forma de anhídrido
carbónico (CO2), que constituye el 0,03 % de la misma. En la hidrosfera, el carbono se
encuentra en forma de ion bicarbonato (HC −O3 ) y de ion carbonato (C
2−3
O ). En la
litosfera se puede en tres maneras diferentes: formando rocas carbonatadas, silicatos
cálcicos o en forma de combustibles fósiles (Navarro, 2000).
El carbono se transfiere por el CO2 de la atmosfera mediante el proceso de la fotosíntesis y
vuelve a ella a través de la respiración de los animales (Madigan et al., 2001).
El carbono es requerido en la formación de moléculas y como fuente de energía, en el caso
de muchos heterótrofos, difiriendo en la concentración y tipo de compuestos orgánicos que
necesitan como fuente de carbono de acuerdo a su metabolismo (Merck, 2004).
Compuestos como los aminoácidos, ácidos grasos y compuestos aromáticos pueden ser
usados por los microorganismos como fuentes de carbono (Coyne, 2000)
2.4.1.2 Factores de crecimiento.
Son compuestos orgánicos requeridos en muy pequeñas cantidades y solo por algunas
células. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminoácidos y bases nitrogenadas.
Aunque la mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos,
otros requieren tomarlos del medio ambiente (Sylvia et al., 2005).
2.4.2 Medios de cultivo
Los medios de cultivo constituyen un aspecto importante en el estudio de los
microorganismos porque proporcionan los nutrientes necesarios para su crecimiento en el
laboratorio. En la preparación y diseño de un medio de cultivo, se busca proporcionar una
mezcla adecuada de nutrientes requeridos por los microorganismos a una concentración que
optimice su crecimiento. Muchos nutrientes pueden ser inhibitorios o tóxicos cuando su
concentración es demasiado alta, por ello se busca mantener un balance de nutrientes, para
23
evitar los excesos que puedan llegar a subestimar o inhibir el crecimiento de los
microorganismos (Merck, 2004).
2.4.2.1 Clasificación de los medios de cultivo.
Debido a que las necesidades nutricionales de las bacterias son muy amplias, y algunas de
estas son exigentes, existe una variedad de medios de cultivo con composición y
características diferentes. Los medios de cultivo se pueden clasificar según su composición
química y el estado (sólido o liquido) del medio (Escobar de Rico, 2002; Merck, 2004).
2.4.2.1.1 Según el estado
1. Medios líquidos: son medios que no poseen un agente solidificante, se usan
principalmente como caldos de cultivo.
2. Medios sólidos: llevan un agente solidificante (agar) que es un polisacárido acido
producido por ciertas algas que gelifica por debajo de 45° C y se usa a una
concentración de 1,5% p/v.
3. Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7% p/v (Merck, 2004).
2.4.2.1.2 Según su composición:
1. Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de
nitrógeno, sales que proporcionen iones (P, K, Mg, Fe, Ca, entre otros), y nutrientes
estimuladores del crecimiento a concentraciones conocidas.
2. Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios tiene adición de
nutrientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de
carne, etc, con ellos se obtiene un medio rico nutricionalmente, aunque indefinido
químicamente p.e., Mac Conkey, VRBG, Plate Count.
3. Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con nutrientes
que favorecen el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente
heterótrofos exigentes). Ejemplo: adición de sangre, suero o extractos de tejidos de
animales y plantas p.e., Agar Mosel, Agar Sangre.
4. Medios selectivos. Son aquellos que por sus componentes favorecen el crecimiento
específico de un microorganismo o grupo de microorganismos. Son de gran utilidad
24
para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta
p.e., LMX, SPS.
5. Medios diferenciales. Son medios que facilitan la exclusión de microorganismos de
una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.
p.e., Caldo tetrationato.
2.5 Extracción de microorganismos de la matriz de suelo
Los polisacáridos producidos por algunas bacterias intervienen en formación de agregados
del suelo estableciendo fuertes uniones entre las bacterias y las partículas del suelo (Coyne,
2000; Sylvia et al. 2005), estos polisacáridos extracelulares presentan una asociación con
las partículas de arcilla, promoviendo la estabilidad y estructura de los agregados del suelo
(Lindahl, 1996).
Para una mayor recuperación de microorganismos presentes en muestras de suelo es
necesario utilizar una técnica adecuada para la ruptura los agregados del suelo,
garantizando que la mayoría de microorganismos sean liberados (Lindahl, 1996).
La disrupción de estas partículas se puede llevar a cabo por diferentes procesos y uso de
soluciones de extracción (Tabla 3). Muchos procesos de extracción son usados, pero poco
se ha comparado el efecto de estos sobre los resultados obtenidos (Clabrix et al., 2005).
Es de gran importancia evaluar esto debido a que algunos tratamientos pueden causar daño
celular, además de interferir en el pH de la muestra, alterando directamente la población
nativa de microorganismos (Lindahl, 1996).
25
Tabla 3. Tratamientos y soluciones utilizadas durante la extracción de microorganismos
edáficos
Tratamientos
Soluciones
Agitación orbital
Tratamiento ultrasónico
Stomacher
Sonicación
Oxidación química
Disrupción enzimática
Centrifugación
Vortex
Agua destilada o desionizada
Buffer fosfato
NaCl 0.85% (p/v)
Pirofosfato de sódio
Solución Ringer
Fuente: Lindahl, 1996; Calbrix et al., 2005.
2.5.1 Recuento en placa de heterótrofos totales
El método de recuento en placa es muy utilizado para la enumeración de microorganismos
viables, especialmente para bacterias y hongos. Las técnicas de recuento en placa emplean
con mayor frecuencia el agar como agente solidificante ya que la mayoría de las bacterias
carecen de las enzimas necesarias para despolimerizarlo (Atlas y Bartha, 2001). Para la
enumeración de heterótrofos aerobios en muestras ambientales los métodos de recuento en
superficie son la mejor alternativa. Los recuentos en profundidad, no se consideran
adecuados porque pueden causar la muerte de las células debido a la baja concentración de
oxigeno y la exposición a la temperatura de los medios fundidos (45 a 50 ºC). (Kaper et al.,
1977; Reasoner, 2004).
Las colonias que crecen sobre los medios de cultivo dan un estimado de la cantidad de
microorganismos presentes en una muestra (Escobar de Rico, 2002), esto se realiza por
medio del recuento de las unidades formadoras de colonia (UFC). Una UFC es el término
que debe utilizarse para reportar el número de colonias en placa; cada microorganismo en
un medio de cultivo adecuado da origen a una colonia, estas colonias pueden surgir en
pares, cadenas o grupos (American Public Health Association, 2005). Para el recuento de
microorganismos heterótrofos se han empleado temperaturas de incubación de 22-28ºC,
con tiempos de 3 a 7 días (Reasoner, 2004)
26
La principal ventaja de la siembra en placa es que a partir de esta se logran obtener cultivos
puros, es decir microorganismos viables, que pueden usarse para análisis posteriores, como
análisis taxonómicos o genéticos (Elliott y Des Jardin, 1999). Sin embargó, una de las
limitaciones en esta técnica, es el desconocimiento de todos los requisitos y condiciones de
cultivo de los microorganismos y la incapacidad para recuperar células de crecimiento lento
y células viables no cultivables (McCaing et al., 2001). Esto se puede contrarrestar por
medio de la selección de diferentes medios de cultivo para suplir las necesidades
nutricionales de los microorganismos en cultivo (Balestra y Misaghi, 1997).
2.6 Microorganismo oligótrofos y copiótrofos
Los microorganismos heterótrofos además de utilizar una variedad de fuentes de carbono,
dependen para su desarrollo de la concentración en que se encuentran los nutrientes en el
ambiente, según esto se pueden clasificar en oligotrófos por su habilidad de crecer en
ambientes bajos en nutrientes y presentar bajas tasas metabólicas, y en copiótrofos por su
afinidad hacia ambientes altos en nutrientes y por presentar altas tasas de crecimiento
(Staley, 2000; Sylvia et al., 2005)
Algunos estudios sugieren que los microorganismos oligótrofos crecen mejor a
concentraciones de sustratos menores a 10 mg (Riis et al., 1998; Phung et al., 2004). De
igual manera se ha demostrado que los microorganismos oligotrófos se aíslan de ambientes
bajos en nutrientes como agua y estuarios (Van der Kooji and Hijen ,1983). Sin embargo,
Saito y col. (1998) afirman que estos microorganismos se encuentran ampliamente en el
suelo. Los microorganismos oligótrofos desempeñan un rol importante en la
descomposición de la materia orgánica y la dinámica de nutrientes, siendo aislados en
diferentes tipos de suelos (Hattori, 1976; Hashimoto et al., 2006).
Por otro lado, los microorganismos copiótrofos tienen la capacidad de dividirse en menos
de 15 minutos, además de presentar una baja afinidad por el trasporte de nutrientes dentro
de la célula. Los microorganismos copiótrofos pueden sobrecrecer en ambientes altos en
nutrientes debido a que sus sistemas de trasporte de nutrientes generan un aumento rápido
de biomasa (Staley, 2000).
27
2.7 Medios con baja concentración de nutrientes para recuento de heterótrofos
2.7.1 Medio R2A
Reasoner y Geldreich (1985) modificaron el medio Henrici (McTernan et al., 1974)
disminuyendo a la mitad la concentración de nutrientes, creando así el medio R2A (Anexo
A). Este medio debido a su baja concentración de fuente de carbono y energía, se
implemento en la enumeración de microorganismos heterótrofos en lagos oligotróficos
(Reasoner y Geldreich, 1985). Aunque inicialmente se uso en muestras de agua, varios
estudios mostraron la misma efectividad en muestras de suelo, principalmente por la buena
recuperación de microorganismos (Mikell, et al.,
1995; Margesin y Schinner, 2001;
Franklin et al., 2001; Ellis et al., 2003 y Calbrix et al., 2005)
La ventaja que posee el uso de este medio radica en que su baja concentración de nutrientes
permite el crecimiento, multiplicación y mantenimiento de una serie de microorganismos
del suelo que pueden ser inhibidos por concentraciones altas de algunos nutrientes. Por esto
se establece que son de mayor utilidad los medios “bajos en nutrientes” básicamente para
una mayor recuperación de microorganismos oligotróficos debido a su inhabilidad de
crecer en medios con altas concentraciones de nutrientes (Olsen y Bakken, 1987).
2.7.2 Medio NWRI
El medio NWRI es un medio bajo en nutrientes alternativo al agar R2A para la detección de
las bacterias heterótrofas (American Public Health Association, 2005) (Anexo A). Varios
estudios han empleado este medio para la recuperación de microorganismos heterótrofos en
muestras de agua (Reasoner, 2004). Sin embargo, su uso en suelos no se ha sido reportado.
En un estudio realizado por Parrington & Sharpe (1998) el medio NWRI se comparó con
medios altos en nutrientes (tripicasa soya y plate count) demostrando que se obtenían
mayores recuentos de heterótrofos con el NWRI, además se obtenían colonias mas
definidas y una buena recuperación de microorganismos filamentosos (Lillis y Bissonnette,
2001).
28
2.8 Medios con alta concentración de nutrientes para recuento de heterótrofos
2.8.1 Medio tripticasa soya (TSBA)
El TSBA es un medio con alta concentración de nutrientes utilizado ampliamente en el
procesamiento de muestras de suelo (Ellis et al., 2003) (Anexo A). McCaig y col. (2001) y
Balestra y col. (1997) usaron este medio para la caracterización de las especies bacterianas
del suelo y en la estimación de la diversidad microbiana, por ser un buen soporte para el
crecimiento bacteriano. Martin (1975) y Elliot y col. (1999) usaron el medio TSBA para el
recuento de bacterias presentes en el suelo, estableciendo que este medio proporciona
condiciones nutricionales a los microorganismos edáficos para el aumentó de biomasa.
2.8.2 Agar infusión suelo (AIS)
El agar infusión suelo es usado ampliamente en los recuentos para muestras de suelo,
debido principalmente a que este medio suministra condiciones presentes en el ambiente
natural los microorganismos (Anexo A). Su principal ventaja para recuperar
microorganismos edáficos es
que posee factores promotores de crecimiento que se
encuentran en el suelo como vitaminas y aminoácidos, que son requeridos por estos
(García, 1973). Olsen y Bakken (1987) realizaron el recuento de UFC de microorganismos
heterótrofos presentes en muestras de suelo, determinando que para obtener una mayor
recuperación de microorganismos a partir de muestras de suelo, los medios más indicados
son aquellos que tienen en su formulación la infusión de suelo. El AIS ha sido ampliamente
reportado (ASM, 1999) y se ha utilizado en la Unidad de saneamiento y biotecnología
ambiental (USBA) de la Pontificia Univerisidad Javeriana para la recuperación de
microorganismos heterótrofos en suelos contaminados con hidrocarburos y en estudios de
biorremediación (Cleves y Sandoval, 2003; Maldonado, 2004; Vallejo, 2004)
29
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
La perdida de la diversidad microbiana se ha incrementado en el país, principalmente por
las perturbaciones que ejerce el hombre sobre el ambiente, modificando y fragmentando el
paisaje y estableciendo sistemas productivos p.e, ganadería de leche, ganadería de carne,
cultivos mixtos. Estos sistemas productivos incentivan el uso de agroquímicos (fertilizantes
y plaguicidas), la implementación de sistemas de riego, el cultivo intensivo y el
aprovechamiento extensivo de la tierra, causando un desequilibrio en la funcionalidad y el
mantenimiento de las actividades en que intervienen los microorganismos. Entre estas
actividades se encuentran la fijación de nitrógeno, ciclaje de nutrientes, degradación de
compuestos contaminantes, control de plagas, entre otros.
Para evaluar el efecto antopogénico sobre la densidad de las comunidades microbianas del
suelo, se deben establecer metodologías que permitan el estudio de la ecología microbiana.
En la evaluación de la parte cultivable de los microorganismos del suelo, se han usado
medios de cultivo que no proporcionan las condiciones necesarias para el desarrollo de
diferentes microorganismos. Por tal motivo, en el presente estudio se estandarizó el proceso
de extracción de microorganismos del suelo y se realizó una comparación entre medios de
cultivo altos y bajos en nutrientes, determinando que medio proporciona los requerimientos
nutricionales necesarios para obtener una mayor recuperación de microorganismos
heterótrofos como herramienta para las investigaciones realizadas por USBA-CIEBREG en
el estudio de las comunidades microbianas.
30
4. JUSTIFICACIÓN
Los microorganismos del suelo comprenden la mayor diversidad del planeta cumpliendo un
papel fundamental en la descomposición de la materia orgánica y en el ciclaje de nutrientes,
interviniendo en la disponibilidad de los nutrientes, las características físicas y químicas de
suelo.
Actualmente en Colombia, son pocos los estudios sobre diversidad de microorganismos
edáficos cultivables debido a que se desconocen las condiciones adecuadas de cultivo. Los
métodos convencionales de recuperación de microorganismos heterótrofos edáficos,
basados en el uso de un solo tipo de medio de cultivo ayudan a la recuperación de unos
pocos microorganismos, principalmente porque en la mayoría de los casos las condiciones
de cultivo no imitan el ambiente natural de los microorganismos, y consecuentemente no se
aportan los componentes apropiados para el óptimo crecimiento y desarrollo de
los
microorganismos.
Para realizar una valoración de la diversidad en la ecorregión cafetera, el CIEBREG en uno
de sus objetivos buscó caracterizar, evaluar y monitorear la biodiversidad de sistemas
productivos asociados a paisajes naturales, para el mantenimiento de la funcionalidad
ecológica. A nivel edáfico, fue necesario evaluar diferentes medios de cultivo para obtener
una mayor recuperación de microorganismos heterótrofos por medio de la técnica de
recuento en placa, como soporte en el estudio de microorganismos degradadores de
hidrocarburos y microorganismos del ciclo del nitrógeno en trabajos realizados en USBA.
31
5. OBJETIVOS
5. 1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar medios de cultivo altos y bajos nutrientes para la recuperación de heterótrofos en
diferentes coberturas vegetales en la Ecoregión Cafetera (Cuencas de los ríos La Vieja y
Otún).
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Estandarizar el proceso de extracción de microorganismos en muestras de suelo
para la recuperación de microorganismos heterótrofos.
•
Comparar medios de cultivo altos y bajos en nutrientes para la recuperación de
microorganismos heterótrofos en muestras de suelo.
•
Estimar la densidad de los microorganismos heterótrofos totales por recuento en
placa en las coberturas vegetales seleccionadas.
•
Estimar la densidad de microorganismos heterótrofos en términos de abundancia
relativa y realizar la caracterización de morfotipos en las diferentes coberturas.
32
6. MATERIALES Y MÉTODOS
Durante el presente estudio se estandarizó el proceso de extracción de microorganismos de
suelo
evaluando
diferentes
tiempos,
velocidades
y
soluciones
de
extracción.
Adicionalmente, se realizó una comparación de diferentes medios de cultivo altos y bajos
en nutrientes para obtener una mayor recuperación de microorganismos heterótrofos y así
poder evaluar el efecto de las coberturas sobre las densidades de estos microorganismos.
Finalmente, se determinó la abundancia de los heterótrofos en relación con el conteo de
microorganismos totales obtenido por Vela (2007) utilizando 4'-6-Diamidino-2-fenilindol
diclorhidrato (DAPI).
6.1 Estandarización del proceso de extracción de microorganismos en muestras de
suelo para la recuperación de microorganismos heterótrofos.
Para estandarizar el proceso de extracción de los microorganismos del suelo se evaluaron
cuatro tratamientos comparando diferentes tiempos, velocidades y soluciones de extracción
(Tabla 4). Estos tratamientos se seleccionaron por ser reportados en la literatura (Yu et al.,
1995; Lindahl, 1996; Riis et al., 1998; Calbrix et al., 2005) y por ser utilizados en el
laboratorio de la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA). Para la
estandarización, se tomaron 5.0 g de suelo de la reserva forestal Bremen (municipios
Filandia y Circasia, Quindío), y se adicionaron a 45 ml de cada una de las soluciones de
extracción evaluadas y se agitaron de acuerdo a cada tratamiento (Figura 1).
Tabla 4. Tratamientos evaluados durante la extracción de microorganismos de suelo
Tratamiento
1
2
3
4
Solución de extracción
Buffer fosfato (Anexo B)
Buffer fosfato
Solución salina 0.85% (p/v)
Solución salina 0.85% (p/v)
Agitación orbital
(rpm)
160
200
160
200
Tiempo
(min)
15
20
15
20
Después del proceso de extracción, se realizaron diluciones de la suspensión de suelo con
base 10 (10-1 a 10-6). Se sembró 0.1mL en superficie a partir de la dilución 10-3 en el medio
33
agar infusión suelo (AIS) (Anexo A). Este medio se venia usando para el recuento de
heterótrofos en el laboratorio USBA. Las placas sembradas se incubaron a temperatura
ambiente (22-25ºC) y se realizó el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) al
quinto día de incubación.
Figura 1. Preparación de dilución inicial de la muestra de suelo en solución de extracción
6.2 Localización del área de estudio
El presente estudio se llevó a cabo en la ecorregión cafetera, específicamente en los
departamentos de Risaralda y Quindío. Se seleccionaron dos ventanas como unidades
macro del esquema de muestreo, correspondientes a las cuencas hidrográficas de los ríos La
Vieja y El Otún. Estas ventanas fueron elegidas con base en criterios de heterogeneidad
espacial, gradiente altitudinal, estructuras de paisaje y por presentar diferentes coberturas y
múltiples categorías de manejo (Camargo, 2006).
Ventana La Vieja
El río La Vieja es uno de los principales tributarios del río Cauca, y es considerado un gran
eje fluvial. Su cuenca hidrográfica está ubicada en el centro-occidente de Colombia en los
departamentos del Quindío, Risaralda y Valle, con un área aproximada 2,925 km2 y se
encuentra ubicada al sur occidente de la ecorregión cafetera.
Geográficamente esta cuenca, está enmarcada dentro de las siguientes coordenadas: 4°04´ y
4°49´ de latitud norte y 75°24´ y 75°57´ de longitud oeste y presenta una gran
34
heterogeneidad ambiental evidenciada en sus diferencias climáticas y topográficas (Díaz et
al., 1996).
Esta cuenca, debido a la formación geológica de los Andes centrales colombianos, de
origen terciario y cuaternario, presenta suelos de formación reciente, de origen volcánico y
sedimentario por areniscas, arcillositas y conglomerados, que se caracterizan por ser de
disposición superficial, texturas finas y pH moderadamente ácidos (Díaz et al., 1996).
En esta ventana se seleccionaron cuatro coberturas predominantes que correspondían a los
tipos de paisajes mas sobresalientes (Roldan, 2006) (Tablas 5).
Tabla 5. Coberturas y fincas seleccionadas en la ventana la Vieja.
Ventana Cobertura
Finca
La Ramada
Guadual
La Comarca
La Granja
Bosque
Bremen
La Vieja
La Ramada
Pastizal
Villa Ximena
El Bolsillo
Cafetal sin sombrío
La Alegría
Ventana Otún
En la cuenca del Río Otún, ubicada en el departamento de Risaralda, se encuentran bosques
premontanos de alta humedad con vegetación arbórea, pastizales naturales y mejorados, y
cultivos mixtos (cebolla y aromáticas), terrenos de alta fertilidad que son utilizados para la
explotación maderera y algunos cultivos de subsistencia. Estas tierras son óptimas para el
cultivo de cebolla, aromáticas, plátano,
maíz, yuca, fríjol, los cuales pueden ser
tecnificados o de nivel artesanal. Los suelos del Otún se caracterizan por ser drenados,
profundos, con alto contenido de arcillas y materia orgánica y presentar un pH acido
(Beltran et al., 1988). En Otún se seleccionaron cuatro coberturas representativas de esta
35
cuenca para determinar su efecto sobre la densidad de microorganismos heterótrofos (Tabla
6).
Tabla 6. Coberturas y fincas selecionadas en la ventana Otún.
Ventana
Cobertura
Finca
Santa Helena
Bosque
La Pastora
La Playa
Guadual
Mandalay
El Otún
Bella Vista
Cebolla
Macarena
Playa Rica
Forestales
Lisbrán
6.3 Diseño experimental
El estudio se llevó a cabo en dos eventos de muestreo en épocas diferentes del año, el
primer evento se realizó del 23 al 30 de Junio y el segundo del 22 al 30 de Septiembre de
2006.
Para cada una de las ventanas (La Vieja y Otún) se seleccionaron las cuatro coberturas más
representativas (Tablas 5 y 6) y dentro de cada una de las coberturas se eligieron dos fincas
donde se seleccionaron aleatoriamente tres puntos a muestrear. Finalmente se obtuvieron 48
muestras en cada evento de muestreo (EM) para la comparación de medios bajos (R2A y
NWRI) y altos en nutrientes (AIS y TSBA) con el fin de realizar el recuento de
microorganismos heterótrofos en la ecorregión cafetera.
36
6.4 Toma de muestras
Para la toma de las muestras de suelo en cada una de las coberturas, se delimitaron tres
cuadrantes de 2.5 x 2.5 m, ubicados al menos a 30 m de los bordes. Dentro de cada
cuadrante se tomaron muestras de cada uno de los vértices y del centro usando un barreno
de 20 cm de largo por 5 cm de diámetro. Se obtuvo una muestra compuesta por cuadrante
después de mezclar vigorosamente las muestras obtenidas de todos los puntos del
cuadrante. De esta mezcla, se tomaron aproximadamente 500 g. Este procedimiento se
repitió en cada cuadrante. La muestra compuesta se colocó en bolsas de cierre hermético
Whirlpack®, y se conservaron en refrigeración (4-6 °C) hasta su procesamiento en USBA.
6.5 Análisis fisicoquímicos
Se midió la temperatura in situ con un termómetro de suelo a 20 cm de profundidad y la
altura de la hojarasca. En el laboratorio de USBA se evaluaron el pH y el porcentaje de
humedad. El pH se determinó de acuerdo al protocolo de la Agencia Ambiental de Estados
Unidos (EPA, 9045c) y el porcentaje de humedad se midió de acuerdo al protocolo del
Instituto Geográfico Agustín Codazzi (Olarte, 1979).
6.6 Comparación de medios de cultivo altos (TSBA y AIS) y bajos en nutrientes (R2A
y NWRI) para la recuperación de microorganismos heterótrofos en muestras de suelo.
Para la comparación de medios de cultivo se utilizaron las muestras de suelo recolectadas
en la ecorregión cafetera y se procesaron teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la
estandarización del proceso de extracción de microorganismos edáficos (ver numeral 6.1)
(n=96). De esta manera, se agregaron 5.0 g de la muestra de suelo (AJ150:Mettler) en 45
ml de solución salina 0.85% p/v (J.T Baker: grado reactivo) filtrada en membranas de
celulosa (0.22μm) y estérilizada (121°C x 15 psi) y se agitó durante 15 min a 160 rpm en
un agitador orbital (New science: 12100). Bajo condiciones de esterilidad se realizaron
diluciones seriadas con base 10 hasta 106 en solución salina, agitando con vortex antes de
tomar una alícuota de cada dilución. Se colocaron 100 μl de las diluciones de la muestra
sobre placas con los diferentes medios a evaluar (ver numeral 2.6): bajos en nutrientes
37
(R2A (Difco) y NWRI) y altos en nutrientes (TSBA (Oxoid) y AIS) (Anexo A). El
procedimiento se realizó por duplicado en cada dilución. Finalmente las cajas se incubaron
aproximadamente de 22 a 25 °C por 5 d, se realizó el recuento de las unidades formadoras
de colonias de heterótrofos totales y los datos se convirtieron a gramos peso seco
(UFC/gps)(n=384). Se realizó tinción de Gram a las colonias que presentaron características
macroscópicas diferentes en las placas donde se hizo el recuento, para determinar las
características microscópicas: reacción Gram positiva o Gram negativas y morfología
(bacilos, cocos, cocobacilos).
6.7 Análisis estadístico
Para la comparación de medios de cultivo se usó la prueba de ANOVA y el test TukeyKramer (p<0.05) debido a que los datos presentaban una distribución normal.
Posteriormente se compararon lo resultados obtenidos en el medio R2A, los cuales no
presentaron una distribución normal, por lo que se usó la prueba de Kruskal Wallis
(p<0.05) para evaluar el efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismo
heterótrofos.
Se compararon los recuentos entre eventos de muestreo para cada una de las ventanas
usando la prueba de Wilcoxon (p<0.05).
Finalmente para establecer si las variables
fisicoquímicas presentaban correlación con el recuento de heterótrofos se realizó el análisis
no paramétrico de Spearman.
38
7. RESUL
LTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Estandariz
de microorrganismos en muestraas de
E
zación del proceso
p
de extracción
e
sueloo para la reecuperación
n de microorganismos heterótroofos.
Se observó
o
un efecto sign
nificativo de
d los trataamientos evvaluados soobre el recu
uento de
heterrótrofos dell suelo (AN
NOVA y Tu
ukey-Krameer; p< 0.05; n = 40) (A
Anexo C y D). Los
mayoores recuenntos se presentaron cuaando se utillizó la soluución salinaa 0.85% (p//v) a 160
rpm por 15 min y bufferr fosfato a 200 rpm por 20 min,
m
sin obsservarse diferencias
miento con buffer
b
fosfaato a 160 rpm
m por 15
signiificativas enntre los dos tratamientoos. El tratam
min presentó reecuentos siggnificativam
mente menoores a los demás trataamientos (F
Figura 2)
Log UFC/gps
(Aneexo C).
8,00
7,80
7,60
7,40
7,20
7,00
6,80
6,60
6,40
6,20
6,00
16
60 rpm X 15 min
n
200 rp
pm X 20 min
160 rpm X 15 min
200 rpm X 20 min
Buffer fosfato
Bufffer fosfato
Solución salina 0.85%
S
Solución salina 0.85%
0
1
2
3
4
Tratamiento
Fig
gura 2. Trattamientos evvaluados paara la extraccción de miccroorganism
mos del suello. Las
barras de error muesstran una desviación esttándar (n=10)
r
o
obtenidos,
see pudo obseervar una mayor
m
disperrsión de los datos en
A paartir de los resultados
los tratamientos
t
s con buffeer fosfato (Tratamient
(
tos 1 y 2) (Figura 3). Por otro lado los
tratam
mientos conn solución salina (3 y 4) presenntaron una menor
m
disppersión en los
l datos
indiccando una mayor
m
preciisión (Figurra 3). La dispersión enn los tratam
mientos 1 y 2,
2 podía
indiccar dos cosaas, un errorr experimenntal o que eel tamaño de
d la muesttra no fue suficiente
s
para representarr la variabiliidad de los datos.
d
39
Para verificar si el tamaño de la muestra era el parámetro relacionado con la dispersión se
tuvo en cuenta que los promedios (Log UFC/gps) solo se diferenciaban en un máximo de
1.5 unidades, que trasladado a la potencia de 10 son aproximadamente 31.6 UFC, valor que
no era significativo en el contexto que se evaluó este estudio.
1
2
3
4
Tratamiento
Figura 3. Dispersión de los datos en los tratamientos de extracción de microorganismos.
Las flechas indican los valores con mayor dispersión
El logaritmo de los datos presentó homogeneidad de varianzas y una distribución normal,
por esta razón se compararon los tratamientos utilizando una ANOVA y el test de TukeyKramer (Anexo D). Durante el análisis de varianzas se observó que 0.3% de la variación
total podría ser atribuida a los tratamientos lo que indico que todos lo tratamientos eran
buenos.
Sin embargo, se busco establecer con cual de estos tratamientos se podía obtener mayores
recuentos y para ello se observó la interacción entre las soluciones y agitaciones evaluadas.
Se observó un efecto conjunto de las dos variables, indicando que la solución salina
presentaba mayores recuentos independiente a la agitación (Figura 5).
40
Al no presentarse diferencias significativas en el uso de solución salina con agitación a 160
rpm por 15 min y el buffer fosfato con agitación a 200 rpm por 20 min, se seleccionó el
primer tratamiento por presentar recuentos mayores, menor dispersión en los datos y por ser
la solución salina mas económica y de fácil preparación.
Resultados similares fueron obtenidos por Calbrix y col. (2005) quienes analizaron la
eficiencia de diferentes tratamientos para la extracción de microorganismos del suelo, los
autores no encontraron diferencias significativas entre los tratamientos y seleccionaron la
solución salina al 0.85% por su fácil preparación y manejo. Por otro lado, Yu y col. (1995)
así como Riis y col. (1998) determinaron que el uso de la solución salina al 0.85%
combinada con agitaciones menores a 200 rpm era el método optimo para la separación de
los microorganismos de las partículas de suelo.
Agitación (rpm)
Figura 5. Interacción entre soluciones y agitaciones evaluadas para extracción de
microorganismos del suelo (BF: buffer fosfato. SS: Solucion salina).
Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, el proceso de extracción se
estableció de la siguiente manera: adición de 5.0 g de suelo (Mettler: AJ150) a 45 ml de
solución salina (0.85% p/v) (J.T Baker; grado reactivo) estéril (121°C x 15 psi) y filtrada en
membranas de celulosa de 0.22μm (GSWP09050: Millipore) con agitación orbital a 160
41
rpm por 15 min (12100: New science). Esta selección se realizó porque se obtuvieron
mayores recuentos con este tratamiento y una mayor precisión.
Una vez terminado el proceso de agitación, se dejo decantar el sedimento durante 5 min con
el fin de tomar la solución de suelo donde deberían estar en suspensión los
microorganismos.
7.2 Comparación de medios de cultivo altos (TSBA y AIS) y bajos en nutrientes (R2A
y NWRI) para la recuperación de microorganismos heterótrofos en muestras de suelo.
Para la comparación de los medios de cultivo con altos y bajos nutrientes, se utilizó el
recuento en placa (ASM, 1999; American Public Health Association, 2005) y se
implemento la técnica estandarizada para la extracción de microorganismos edáficos.
Posteriormente, se evaluó cual de los medios mencionados en la literatura como altos y
bajos en nutrientes presentaban mayores recuentos de microorganismos heterótrofos en las
diferentes coberturas vegetales evaluadas, con el fin de determinar que medio se debería
usar el segundo año del estudio.
En términos generales, de las 96 muestras evaluadas en los dos eventos de muestreo, se
presentaron recuentos significativamente mayores en R2A en el 31% de los resultados,
22% en NWRI, 6.25% en TSBA y 3.75% en AIS (Tukey-Kramer; p < 0.05; n=384) (Anexo
E y F); indicando, que los medios con bajos nutrientes permitían una mayor recuperación
de los microorganismos heterótrofos presentes en las diferentes coberturas vegetales,
debido a que permiten el crecimiento y mantenimiento de una serie de microorganismos del
suelo que pueden ser inhibidos por altas concentraciones de algunos nutrientes (Chand et
al., 1992).
Aunque se considera al suelo como un ambiente rico en nutrientes, es difícil generalizar y
por el contrario es altamente heterogéneo, presentando microambientes con bajas
concentraciones de nutrientes. Según Ferrari y col. (2005), el suelo es un sustrato complejo
que contiene una variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos que suministran
condiciones óptimas para el desarrollo de diferentes grupos de microorganismos. Uno de
los grupos predominantes en este ambiente son los microorganismos oligótrofos (Hattori,
42
1976), quienes desempeñan un papel importante en la descomposición de la materia
orgánica y en la dinámica de nutrientes (Hashimoto et al., 2006).
Olsen y Bakken (1987) evaluaron diferentes medios de cultivo para la optimización del
recuento en placa de microorganismos edáficos, obteniendo mayores recuentos en medios
bajos en nutrientes debido a que se obtiene una mayor recuperación de microorganismos
oligotróficos por su inhabilidad para crecer en medios con altas concentraciones de
nutrientes (Riis et al., 1998; Phung et al., 2004).
De igual manera Chand y col. (1992) concluyeron que los medios con altas concentraciones
de nutrientes son inapropiados para el recuento de microorganismos del suelo,
principalmente por que en estos se presenta sobrecrecimieto de microorganismos con altas
tasas metabólicas, inhibiendo el desarrollo de microorganismos de lento crecimiento. Así
mismo, Elliott y Des Jardin (1999) comentan el efecto negativo de las altas concentraciones
de nutrientes en la recuperación de microorganismos por la inhibición causada por algunos
componentes de los medios.
En el presente estudio se observó una mejor recuperación de microorganismos heterótrofos
en los medios considerados bajos en nutrientes (R2A y NWRI) (Parrington y Sharpe, 1998;
Reasoner, 2004), indicando que estos medios permiten el crecimiento de colonias
microbianas diferenciadas debido a que no crecen superpuestas, ni se presenta crecimiento
acelerado de algunos microorganismos, lo que puede favorece el posterior aislamiento y
estudio de los heterótrofos presentes en el suelo. Resultados similares fueron obtenidos por
Whang y Hattori (1988) al comparar dos medios de cultivo: agar nutritivo (AN) y agar
nutritivo diluido (AND), para la recuperación de microorganismos del suelo. Los autores
observaron que en el medio bajo en nutrientes se presentaron mayores recuentos, indicando
que estos proporcionaban mejores condiciones para el desarrollo de microorganismos
oligotrófos. Teniendo en cuenta que este tipo de microorganismos es sensible a los
nutrientes orgánicos y presenta bajas tasas de crecimiento (Saito et al., 1998).
7.2.1 Cuenca del río La Vieja
Los resultados observados en La Vieja mostraron que en todas las coberturas los medios
con bajas concentraciones de nutrientes (R2A y NWRI) permitieron una mayor
recuperación de microorganismos heterótrofos (Anexo E). En bosque, guadual y cafetal sin
sombrío se presentaron recuentos significativamente mayores en los medios con bajas
43
concentraciones de nutrientes (Tabla 7). Teniendo en cuenta el alto contenido de materia
orgánica reportado en la literatura para los suelos de guaduales (11.21%), bosques
(22.0%) y cafetales (9.5%) (Giraldo y Sabogal, 1999; Sadeghian et al., 1999), se esperaba
obtener una mayor recuperación de microorganismos heterótrofos en medios altos en
nutrientes. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la materia orgánica disponible en el
suelo es utilizada rápidamente y de igual forma se encuentra asociada con materiales del
suelo, como las arcillas, haciéndola recalcitrante e inaccesible para los microorganismos
(Morita, 2000). Estas condiciones pueden permitir el desarrollo de microorganismos con
la capacidad de crecer a bajas concentraciones de nutrientes, lo que pudo verse en una
mayor recuperación en medios R2A y NWRI. Por otro lado en la cobertura pastizal, no se
presentaron diferencias significativas en los recuentos obtenidos los diferentes medios de
cultivo, indicando que este tipo de cobertura posiblemente puede presentar
microorganismos con requerimientos nutricionales mayores (Tabla 7).
Tabla 7. Diferencias entre los recuentos de heterótrofos en los medios de cultivo en
la cuenca del río La Vieja
Cobertura
Medio de cultivo
R2A
Bosque
Pastizal
Guadual
CSS
NWRI
TSBA
AIS
R2A
b
TSBA
b
NWRI
b
AIS
a
a
a
a
NWRI
R2A
TSBA
AIS
a
a
R2A
NWRI
a
b
TSBA
b
AIS
a
a
a
b
Las letras diferentes indican diferencias significativas p< 0.05
Los medios con mayores recuentos se presentan a la izquierda.
CSS: Cafetal sin sombrío
b
44
7.2.2 Cuenca del Río Otún
En Otún en las coberturas de cebolla y guadual se presentaron recuentos significativamente
mayores en medios bajos en nutrientes (Tabla 8). Según Mantilla y col. (2000) los altos
contenidos de materia orgánica del suelo se relacionan con la baja tasa de mineralización,
esto se puede atribuir a la capacidad los aluminosilicatos amorfos (arcillas, feldespato,
cloritas, granito) para adsorber los productos húmicos, convirtiendo la materia orgánica en
un sustrato poco disponible para los microorganismos, generando ambientes bajos en
nutrientes. Estas condicionen pueden favorece el desarrollo de microorganismos oligotrófos
y microorganismos con bajas tasas metabólicas, lo que pudo generar a una recuperación
mayor en medios bajos en nutrientes (R2A y NWRI).
Por otro lado, en bosques y forestales no se observaron diferencias significativas en la
recuperación de microorganismos heterótrofos en los diferentes medios de cultivo. Sin
embargo, se presentaron recuentos mayores en los medios bajos en nutrientes,
principalmente en el medio R2A. Teniendo en cuenta que el contenido, la clase y la
composición la materia orgánica del suelo depende también de factores ambientales (clima,
posición geográfica, temperatura, uso del suelos, entre otros, factores edáficos (humedad,
temperatura, pH y aireación) (Mantilla et al., 2000), se puede asumir que la variabilidad del
suelo puede proveer diversas condiciones para el desarrollo de diferentes tipos de
microorganismos, lo que se vio reflejado en una buena recuperación con medios bajos y
altos en nutrientes.
Según Massa y col. (1998) después de comparar varios medios para la recuperación de
heterótrofos en muestras de agua, obtuvieron mayores recuentos en el medio R2A y por su
alta eficiencia recomiendan este medio para el recuento en placa de microorganismos
heterótrofos. Aunque el medio R2A se uso inicialmente en la enumeración de
microorganismos heterótrofos en lagos oligotróficos, debido a sus bajas concentraciones de
diferentes fuentes carbono y fuentes de energía (Reasoner y Geldreich, 1985), varios
estudios indican la misma efectividad en muestras de suelo principalmente por la buena
recuperación de microorganismos heterótrofos (Mikell et al., 1995; Franklin et al., 2001;
Margesin y Schinner, 2001; Ellis et al., 2003 y Calbrix et al., 2005).
45
Tabla 8. Diferencias entre los medios de cultivo en la cuenca del río El Otún
Cobertura
Medios de cultivo
NWRI
R2A
AIS
TSBA
a
R2A
a
b
NWRI
a
b
TSBA
b
AIS
a
a
a
a
NWRI
R2A
AIS
TSBA
R2A
b
NWRI
b
TSBA
b
AIS
a
a
a
a
Cebolla
Bosque
Guadual
a
Forestales
Las letras diferentes indican diferencias significativas p< 0.05
Los medios con mayores recuentos se presentan a la izquierda.
Los recuentos obtenido con el medio R2A (bajo en nutrientes) se seleccionaron para
evaluar el efecto de las coberturas vegetales sobre la densidad de microorganismos
heterótrofos (Anexo I y K), debido a que este medio permitió el desarrollo los
microorganismos heterótrofos sin que se presentaran antagonismos por diferencias en las
tasas de crecimiento lo que permitió obtener mayores recuentos de heterótrofos en las
coberturas evaluadas.
7.3 Caracterización microscópica de colonias diferentes recuperadas en medio R2A
Se realizó tinción de Gram a las colonias de la dilución donde se hizo el recuento de
heterótrofos, observándose una mayor prevalencia de bacilos, en las dos cuencas. De igual
forma se observó una mayor proporción de Gram positivos (Figuras 6) (Anexo J). Según
Aguilera
y
Vélez
(2001)
los
principales
géneros
aislados
e
identificados
independientemente de la procedencia del suelo, son Bacillus y Clostridium, estos además
de ser bacilos Gram positivos tienen la capacidad de formar endosporas. Muchas bacterias
en respuesta a la disminución de nutrientes y cambios en el ambiente generan estas
estructuras que no son células reproductoras sino formas de resistencia, estas estructuras
hacen a los microorganismos mas resistentes a condiciones ambientales y por ende
predominantes en el suelo (Sylvia et al., 2005).
46
La Vieja
80
Coco bacilo
Coco
morfologas (%)
100
Bacilo
60
40
20
La Vieja 80
Gram negativo
60
40
20
0
0
Bosque
CF SS
Guadual
Pastizal
Bosque
Cobertura
Bacilo
80
Coco bacilo
Coco
60
Gram negativo
40
20
0
0
Cebolla Forestales Guadual
Cobertura
Gram positivo
80
20
Bosque
Pastizal
100
colonias (%)
100
40
Guadual
Otún Otún
60
CF SS
Coberuta
B
colonias (%)
Gram positivo
100
morfologías (%)
A
Bosque
Cebolla Forestales Guadual
Cobertura
Figura 6. Morfologías y tinción de Gram observadas en las cuencas de los ríos A) La Vieja y B) El Otún
47
7.4 Evaluación del efecto de las coberturas vegetales sobre la densidad de
microorganismos heterótrofos.
Para la evaluación del efecto de las coberturas sobre la densidad de heterótrofos se tuvieron
en cuenta las variables fisicoquímicas de las muestras, se realizó la prueba de Spearman
con el fin de determinar la correlación de las variables fisicoquímicas (temperatura, pH,
humedad y altura de hojarasca) con la densidad de microorganismos heterótrofos, el
análisis indicó que no existía ninguna influencia de estas variables sobre los recuentos en
cada una de las coberturas vegetales (Anexo G y H).
Teniendo en cuenta que la cantidad, tipo y disponibilidad de materia orgánica determina la
densidad de la comunidad heterotrófica del suelo, se debe asumir que las comunidades
microbianas variaran según las condiciones ambientales y la disponibilidad de sustratos
asociados a la materia vegetal haciendo ciertos grupos más predominantes que otros
(Aguilera y Vélez, 2001). Sin embargo, en el presente estudio después de comparar los
recuentos obtenidos en cada una de las coberturas vegetales usando la prueba de Kruskal
Wallis (p < 0.05; n=96) no se encontraron diferencias significativas en el recuento de
heterótrofos entre las diferentes coberturas en ninguno de los dos eventos de muestreo
(Figuras 7 y 8) (Anexo K).
7.4.1
Efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismos
heterótrofos en La Vieja
En términos generales no se observaron diferencias significativas en los recuentos de
heterótrofos obtenidos en las diferentes coberturas vegetales en esta cuenca (Kruskal
Wallis; p < 0.05; n=96) (Anexo K).
Sin embargo, en los guaduales se presentaron
mayores recuentos y menor dispersión en los dos eventos de muestreo (Figura 7).
48
Figurra 7. Reccuentos heteerótrofos edáficos porr coberturaa en La Viieja. Se preesenta el
prom
medio y una desviación estándar (nn=12)
c
(1999) quienes reeportaron
Resuultados simiilares fueroon obtenidoos por Saddeghian y col.
mayoor actividadd microbianna - CO2 en
e la coberrtura de guaadual (evalluación de CO2 por
respiirometria), al caracteerizar sueloos en sisteemas agroppecuarios y forestalees en el
depaartamento deel Quindío (Colombia)). Teniendo en cuenta que
q el rápiddo crecimieento de la
guaddua le apoorta al sueelo un aum
mento conssiderable de
d hojas en
e descomp
posición,
enriqqueciendo y mejorandoo la texturaa y estructurra del sueloo (Giraldo y Sabogal, 1999), y
que los
l microorrganismos están
e
en mayyor abundanncia en las primeras ettapas del prroceso de
descoomposiciónn de las hojaas (hojarasca) (Feria, 19998); se poddría asumir que las con
ndiciones
preseentes en la ccobertura dee guadual inncrementan los niveles de materia orgánica diisponible
para los microorrganismos heterótrofos
h
s. Según Paaz y col. (20006) la relaación directaa entre la
mateeria orgánica del suelo y la dinám
mica de la biomasa
b
miccrobiana se presenta po
or que el
mateerial orgániico que ing
gresa al suuelo es utiilizado com
mo fuente de energía por las
poblaaciones miccrobianas, lo
l que pudoo influir enn mayores recuentos
r
de heterótroffos en la
cobertura de guaadual.
Por otro
o lado, sabiendo que existe unaa relación directament
d
e proporcioonal entre laa materia
orgánnica y la bbiomasa microbiana
m
(Giraldo y Sabogal, 1999; Man
ntilla, 20000; JulcaOtin
niano et all., 2006; Paz et al., 2006) y qu
ue la desccomposición de la hojarasca
contribuye al cciclaje de nu
utrientes haciéndolos
h
s mas dispoonibles paraa microorgganismos
49
y plantas (Varela et al., 2002; Cleveland et al., 2004), se esperaba que existiera un efecto
mayor de aquellas coberturas con presencia de hojarasca (bosques y cafetales) sobre los
recuentos de microorganismos heterótrofos, sin embargo en este estudio no se evidenció
ningún efecto de esta variable sobre la densidad de heterótrofos (Spearman; p < 0.05; n=96)
(Anexo H).
De acuerdo a Varela y colaboradores (2004), algunos componentes de la hojarasca activan
la vida microbiana, ejerciendo una acción positiva sobre la descomposición de la materia
orgánica, por el contrario otros tienen efecto negativo. Según Mantilla y col. (2000) se
debe tener en cuenta la relación del contenido de alta materia orgánica del suelo con la
presencia de algunos aluminosilicatos amorfos, debido a que absorben diferentes productos
húmicos, convirtiendo la materia orgánica en un sustrato poco disponible para los
microorganismos. Esto podría justificar por que la presencia de hojarasca no presento
correlación con la densidad de heterótrofos.
7.4.2
Efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismos
heterótrofos en El Otún
En la cuenca del río El Otún no se observaron diferencias significativas en los recuentos
entre las coberturas en los dos eventos de muestreo (Kruskal Wallis; p < 0.05; n=96)
(Anexo K). Sin embargo los recuentos en el segundo evento de muestreo fueron
significativamente mayores (Wilcoxon; p<0.05; n=96) (Figura 8) (Anexo M).
Según el Centro Nacional de Investigación de Café (CENICAFE) la distribución promedio
mensual de lluvias para la cuenca del río El Otún fue 190 mm en junio y 277 mm en
Octubre. Teniendo en cuenta el aumento en las precipitaciones en el segundo evento de
muestreo y la influencia de esta variable en el aumento de los niveles de materia orgánica
por el mal drenaje de los suelos (Mantilla et al., 2000), se podría asumir que el nivel de
precipitaciones presentó una influencia sobre la densidad heterótrofos en el segundo evento
de muestreo, debido a que se obtiene un mayor número de microorganismos cuando se
aumenta la cantidad de sustratos en el suelo (Aguilera y Vélez, 2001).
50
Figura 8. Recuentos de heterótrofos edáficos por coberturas en El Otún. Se presenta el
promedio y la desviación estándar (n=12)
Por otro lado, se observaron mayores recuentos y menor dispersión de los datos en la
cobertura de forestales en el segundo evento muestreo, contrario a lo reportado por
Sadeghian y col. (1999), quienes obtuvieron baja actividad microbiana - CO2 en las
plantaciones forestales (pinos) (evaluación de CO2 por respirometria), relacionándolo
principalmente con el menor contenido de la materia orgánica que caracterizó a esta
cobertura en su investigación.
Teniendo en cuenta que las variables fisicoquímicas (humedad, temperatura, pH) no
presentaron influencia sobre la densidad de heterótrofos (Anexo H), no se puede establecer
a que corresponden los mayores recuentos de heterótrofos en los forestales con respecto a
las demás coberturas vegetales. Según Aguilera y Vélez (2001) factores como el porcentaje
de materia orgánica, concentración de nitrógeno y fosforo, que no fueron medidos en este
estudio, pueden determinar la densidad de microorganismos en el suelo, debido a su
importancia en el metabolismo de los heterótrofos.
7.5 Abundancia de microorganismos heterótrofos en relación con la densidad de
microorganismos totales (DAPI)
Al comparar los recuentos en placa de heterótrofos cultivables con los conteos de totales
por DAPI (Vela, 2007), se observó que las condiciones de cultivo dadas recuperaron
51
microorganismos heterótrofos cultivables, aerobios y mesófilos, mientras que la técnica de
conteo de microorganismos totales por DAPI determinó la densidad de aerobios,
anaerobios, cultivables y no cultivables, viables y no viables. Por tal razón la mejor manera
de relacionar estos resultados es calculando la abundancia relativa, donde se mide la
densidad de una población (densidad de heterótrofos edáficos) con respecto a un grupo
mayor (densidad de microorganismos totales por DAPI).
Para determinar la abundancia relativa (Ar) de microorganismos heterótrofos se utilizó la
100 (Magurran, 1989) (Tabla 9). Los valores observados no
formula
presentaron diferencias significativas (Tukey-Kramer; p<0.05; n=192) (Anexo L),lo que
puede indicar que posiblemente los microorganismos heterótrofos no se ven afectados por
los cambios en el manejo del suelo, dados por los múltiples usos productivos en las
diferentes coberturas vegetales.
Tabla 9. Abundancia relativa de heterótrofos con relación a la densidad total de
microorganismos del suelo (DAPI) en las coberturas vegetales seleccionadas.
Cobertura Heterótrofos DAPI
Ar
Bosque
7,05
11,23 62,75
Pastizal
7,11
11,18 63,53
Guadual
7,30
CFSS
Cobertura Heterótrofos DAPI
Ar
Cebolla
6,87
11,15 61,62
Bosque
7,02
11,12 63,11
11,26 64,85
Guadual
6,78
11,07 61,20
7,12
11,37 62,56
Forestales
6,66
11,46 58,06
Bosque
7,26
11,51 63,03
Cebolla
7,12
11,39 62,45
Pastizal
7,05
11,30 62,37
Bosque
6,98
11,57 60,31
EM 1
EM2
EM
1
EM2
Guadual
7,16
11,39 62,84
Guadual
7,11
11,57 61,39
CFSS
7,13
11,22 63,51
Forestales
7,24
11,58 62,51
CFSS: Cafetal sin sombrío
EM: Evento de muestreo
52
Según Paz y col. (2006) la actividad biológica puede estimarse a través de indicadores que
generan información sobre la dinámica de la materia orgánica en el suelo, como lo es la
determinación de biomasa microbiana. Esta propiedad permite estimar la calidad biológica
del suelo, por ser de rápida respuesta a los cambios en el manejo agronómico y sufrir
cambios frente al estrés ambiental. Sin embargo, según los resultados obtenidos en este
estudio, la densidad de microorganismos heterótrofos no se vio afectada por los diferentes
manejos de cultivo, mostrando que este grupo funcional no se debe considerar como un
indicador biológico de la calidad y salud del suelo.
Debido a la falta de estudios que relacionen los microorganismos heterótrofos con
coberturas vegetales, no se puede analizar si la proporción de este grupo microbiano es
mayor o menor a lo esperado en la ecorregión cafetera. Sin embargo, al comparar los
resultados obtenidos entre las coberturas vegetales se pudo observar que en general se
presentó una alta variabilidad en los recuentos de heterótrofos impidiendo observar
cambios en la población de estos microorganismos, de igual forma se observó que el grupo
funcional de heterótrofos es muy heterogéneo, presentando afinidad por diferentes sustratos
del suelo. Teniendo en cuenta que un buen indicador de la calidad del suelo debe ser
sensible a los cambios ambientales (Acuña et al., 2006) y que la densidad de
microorganismos heterótrofos no se vio afectada por los diferentes manejos de cultivo, se
puede asumir que posiblemente este grupo funcional no se debe considerar como un
indicador biológico de la calidad y salud del suelo.
53
8. CONCLUSIONES
1. El uso de solución salina (0.85% p/v) con agitación de 160 rpm por 15 min
presento menor dispersión de los datos y la mayor recuperación de
microorganismos heterótrofos de la matriz del suelo
2. En las diferentes coberturas vegetales de las cuencas del río La Vieja y Otún los
medios de cultivo bajos en nutrientes presentaron la mayor recuperación de
heterótrofos, específicamente el medio R2A que fue seleccionado y utilizado para
estimar la densidad de los heterótrofos edáficos.
3. No se observaron diferencias en las densidades de los microorganismos
heterótrofos en las coberturas vegetales evaluadas indicando que posiblemente no
se puede evaluar la calidad y salud del suelo por medio de este grupo microbiano.
54
9. RECOMENDACIONES
1. Es necesario la medición la materia orgánica en estudios posteriores de los
microorganismos heterótrofos.
2. Para estudios posteriores es necesario enfocar el estudio de los heterótrofos a un
grupo especifico sean hongos, bacterias o bacterias filamentosos debido a que al
analizar estos en un solo estudio se pueden presentar inhibiciones.
3. Para el recuento de bacterias heterótrofas con el medio de cultivo R2A es necesario
adicionar un inhibidor para evitar el crecimiento de las bacterias filamentosas con
el fin de evitar inhibición por metabólicos de crecimiento.
55
9. BIBLIOGRAFÍA
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62
10. ANEXOS
ANEXO A. COMPOSICIÓN MEDIOS DE CULTIVO
1. MEDIO R2A
Glucosa
Peptona de proteasa
Extracto de levadura
Almidón soluble
Piruvato de sodio
KHPO4
MgSO4
Casaminoacidos
(g/L)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.3
0.3
0.05
0.5
2. MEDIO NWRI
Peptona
Caseina soluble
K2HPO4
MgSO4
FeCl3
(g/L)
3.0
0.5
0.2
0.05
0.001
3. MEDIO TSBA
Tripticasa
Dextrosa
Peptona
NaCl
K2HPO4
(g/L)
17.0
2.5
3.0
5.0
2.5
4. MEDIO AIS
Glucosa
Extracto de levadura
K2HPO4
KH2PO4
MgSO4 .7H2O
Infusión suelo*
Agua destilada
(g/L)
7.5
3.0
0.5
0.5
0.5
400ml
600ml
*Infusión suelo
Suelo del sitio de muestro
Agua destilada
250 g
750ml
63
ANEXO B. PREPARACIÓN BUFFER FOSFATO
(American Public Health Association, 2005)
Solución 1: 34 g de H2PO4 en 1 L de agua destilada. El pH se ajustó a 7.2.
Solución 2: 50 g de MgSO4.7H2O en 1 L de agua destilada
Solución de trabajo: se tomaron 1.25 ml de la solución 1 y 5.0 ml de la solución 2, y se
completó a 1 L con agua destilada
64
ANEXO C. RECUENTO DE HETERÓTROFOS PARA LOS TRATAMIENTOS EVALUADOS
% Humedad
Media(%H)
35,20
37,77
ds
P.S
Solución diluyente
Tratamiento
Heterotrofos (AIS) 1'
Replica (AIS) 1''
1'/PS
1´´/PS
Media
Log Media
0,60
Buffer fosfato
160rpm*15min
1,71E+06
1,98E+06
2,83E+06 3,28E+06
3,05E+06
6,5
0,58
Buffer fosfato
160rpm*15min
1,83E+06
1,29E+06
3,16E+06 2,23E+06
2,70E+06
6,4
3,08 0,60
Buffer fosfato
160rpm*15min
1,23E+06
1,38E+06
2,05E+06 2,30E+06
2,18E+06
6,3
35,19
0,62
Buffer fosfato
160rpm*15min
1,62E+06
1,86E+06
2,62E+06 3,01E+06
2,81E+06
6,4
31,82
0,59
Buffer fosfato
160rpm*15min
3,80E+06
5,70E+06
6,49E+06 9,74E+06
8,12E+06
6,9
35,20
0,60
Buffer fosfato
200rpm*15min
1,67E+07
1,30E+07
2,76E+07 2,15E+07
2,46E+07
7,4
40,00
36,00
37,77
0,58
Buffer fosfato
200rpm*15min
9,50E+06
1,44E+07
1,64E+07 2,49E+07
2,06E+07
7,3
3,08 0,60
Buffer fosfato
200rpm*15min
1,25E+07
1,22E+07
2,09E+07 2,04E+07
2,06E+07
7,3
35,19
0,62
Buffer fosfato
200rpm*15min
1,03E+07
1,38E+07
1,66E+07 2,23E+07
1,95E+07
7,3
31,82
0,59
Buffer fosfato
200rpm*15min
5,20E+06
6,80E+06
8,89E+06 1,16E+07
1,03E+07
7,0
35,20
0,60
NaCl
160rpm*15min
1,93E+07
1,07E+07
3,20E+07 1,77E+07
2,48E+07
7,4
40,00
36,00
37,77
0,58
NaCl
160rpm*15min
1,20E+07
1,72E+07
2,07E+07 2,97E+07
2,52E+07
7,4
3,08 0,60
NaCl
160rpm*15min
9,70E+06
8,10E+06
1,62E+07 1,35E+07
1,49E+07
7,2
35,19
0,62
NaCl
160rpm*15min
1,38E+07
1,83E+07
2,23E+07 2,96E+07
2,59E+07
7,4
31,82
0,59
NaCl
160rpm*15min
8,30E+06
9,30E+06
1,42E+07 1,59E+07
1,50E+07
7,2
35,20
0,60
NaCl
200rpm*15min
8,00E+06
9,30E+06
1,32E+07 1,54E+07
1,43E+07
7,2
40,00
36,00
37,77
0,58
NaCl
200rpm*15min
6,80E+06
8,00E+05
1,17E+07 1,38E+06
6,57E+06
6,8
3,08 0,60
NaCl
200rpm*15min
5,80E+06
6,70E+06
9,69E+06 1,12E+07
1,04E+07
7,0
35,19
0,62
NaCl
200rpm*15min
6,70E+06
5,50E+06
1,08E+07 8,89E+06
9,86E+06
7,0
31,82
0,59
NaCl
200rpm*15min
1,14E+07
9,60E+06
1,95E+07 1,64E+07
1,79E+07
7,3
40,00
36,00
ds
6,5
0,22
7,3
0,15
7,3
0,13
7,0
0,17
PS: peso seco
65
ANEXO D. Distribución de los tratamientos, ANOVA y comparación de medias
utilizando Tukey-Kramer para la estandarización del proceso de extracción
7,5
7
Log UFC/gps
6,5
6
1
2
3
All Pairs
Tukey-Kramer
0,05
4
Tratamiento
Análisis de una vía Anova
Análisis de Varianza
Source
DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F
Tratamiento 3
3,9054275
1,30181
0,04801
Error
36
1,7284700
C. Total
39
5,6338975
27,1136
<.0001
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2,69323
Abs(Dif)-LSD
3
2
4
1
3
-0,26392 -0,21992 0,03708 0,52208
2
-0,21992 -0,26392 -0,00692 0,47808
4
0,03708 -0,00692 -0,26392 0,22108
1
0,52208 0,47808 0,22108 -0,26392
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
66
ANEXO E. RECUENTO DE HETERÓTROFOS EN LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO EVALUADOS
Muestreo Ventana
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Fincas
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
Coberturas Medio Replica
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
AIS
Bosque
b
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
NWRI
Bosque
b
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
R2A
Bosque
b
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
TSBA
Bosque
b
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
Bosque
b
AIS
Bosque
a
Bosque
b
Bosque
a
Recuento
6,43E+06
3,03E+06
7,87E+06
5,42E+06
3,56E+06
2,80E+06
2,61E+07
1,83E+07
1,33E+07
1,61E+07
6,62E+05
5,85E+05
2,03E+07
2,54E+07
1,74E+07
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1,17E+06
1,17E+07
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Log Recuento
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6,48
6,90
6,73
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7,12
7,21
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5,77
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7,40
7,24
7,10
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6,11
6,91
6,80
7,09
6,95
6,20
6,07
7,07
6,99
6,90
7,03
7,02
Media
DS
6,65
0,19
6,77
0,76
6,89
0,59
6,67
0,43
6,83
0,44
67
Muestreo Ventana
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
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1
2
1
2
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1
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1
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1
1
1
1
1
1
1
1
Fincas
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Granja
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
Coberturas
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Pastizal
Pastizal
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NWRI
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a
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Log Recuento
5,94
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7,22
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7,27
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7,20
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7,00
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6,74
6,98
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6,76
7,01
Media
DS
7,20
0,08
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0,07
7,05
0,07
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68
Muestreo Ventana
1
1
1
1
1
1
1
1
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1
2
1
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2
1
2
1
2
1
Fincas
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
Coberturas
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
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Pastizal
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Medio Replica
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b
Recuento
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1,26E+07
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1,19E+07
1,24E+07
1,04E+07
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Log Recuento
7,11
7,27
7,21
7,86
7,92
7,01
7,00
6,77
6,79
7,29
7,21
6,87
6,78
6,80
6,84
6,90
6,93
7,00
7,08
7,07
7,12
7,00
7,10
7,55
7,51
6,30
7,36
7,07
7,10
7,02
7,07
Media
DS
7,01
0,21
6,85
0,06
7,06
0,05
7,15
0,46
7,06
0,05
69
Muestreo Ventana
2
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Fincas
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
Coberturas
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
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Guadual
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R2A
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TSBA
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a
b
AIS
a
b
Recuento
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1,04E+07
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Log Recuento
7,06
7,02
7,15
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6,73
6,89
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7,27
7,35
7,20
7,29
7,33
7,24
7,24
7,28
7,50
7,43
7,25
7,21
7,21
7,17
7,30
7,28
7,13
7,19
7,00
6,95
6,93
6,83
Media
DS
6,96
0,21
7,28
0,06
7,32
0,12
7,21
0,07
6,97
0,09
70
Muestreo Ventana
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Fincas
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Ramada
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
Coberturas
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
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Medio Replica
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TSBA
b
a
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b
a
AIS
b
a
b
a
b
a
NWRI
b
a
b
Recuento
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7,32
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7,46
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DS
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71
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Fincas
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
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La Comarca
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La Comarca
La Comarca
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La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
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La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
Coberturas
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
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b
a
b
a
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b
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7,54
7,31
7,21
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7,13
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6,85
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7,02
6,99
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7,22
Media
DS
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6,99
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0,06
72
Muestreo Ventana
2
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
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1
1
1
1
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1
1
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1
1
1
1
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Fincas
La Comarca
La Comarca
La Comarca
La Comarca
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
Coberturas
Guadual
Guadual
Guadual
Guadual
CF SS
CF SS
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Medio Replica
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b
AIS
a
b
Recuento
1,32E+07
1,48E+07
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1,15E+07
1,31E+06
1,06E+06
8,78E+06
7,15E+06
1,38E+07
9,90E+06
1,09E+07
1,20E+07
7,35E+06
6,64E+06
1,21E+07
1,11E+08
6,79E+06
8,85E+05
1,01E+07
1,29E+07
9,82E+06
6,89E+06
Log Recuento
7,12
7,17
7,26
7,30
6,22
6,30
6,78
6,92
6,57
6,62
6,85
6,84
6,92
7,06
6,12
6,03
6,94
6,85
7,14
7,00
7,04
7,08
6,87
6,82
7,08
8,04
6,83
5,95
7,00
7,11
6,99
6,84
Media
DS
6,57
0,27
6,63
0,44
7,01
0,10
6,93
0,67
6,93
0,15
73
Muestreo Ventana
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Fincas
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
El Bolsillo
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Coberturas
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
Medio Replica
a
AIS
b
a
b
a
NWRI
b
a
b
a
b
a
R2A
b
a
b
a
b
a
TSBA
b
a
b
a
b
a
AIS
b
a
b
a
b
a
NWRI
b
a
b
Recuento
4,82E+06
8,46E+06
2,10E+07
2,39E+07
2,73E+07
3,00E+07
3,19E+07
2,94E+07
1,65E+07
1,47E+07
1,38E+07
1,26E+07
1,51E+07
1,08E+07
1,20E+07
1,01E+07
9,82E+06
8,64E+06
1,13E+07
8,98E+06
2,40E+06
2,73E+06
6,87E+05
3,84E+06
1,88E+07
2,31E+07
6,30E+06
8,32E+06
2,70E+07
1,59E+07
8,71E+06
1,01E+07
Log Recuento
6,68
6,93
7,32
7,38
7,44
7,48
7,50
7,47
7,22
7,17
7,14
7,10
7,18
7,03
7,08
7,00
6,99
6,94
7,05
6,95
6,38
6,44
5,84
6,58
7,27
7,36
6,80
6,92
7,43
7,20
6,94
7,00
Media
DS
7,43
0,07
7,14
0,06
7,00
0,06
6,65
0,58
7,05
0,23
74
Muestreo Ventana
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Fincas
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Coberturas
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
Medio Replica
a
b
a
R2A
b
a
b
a
b
a
TSBA
b
a
b
a
b
a
AIS
b
a
b
a
b
a
NWRI
b
a
b
a
b
a
R2A
b
a
b
a
TSBA
b
Recuento
1,87E+06
1,65E+07
3,90E+07
2,09E+07
3,07E+07
2,70E+07
1,72E+07
1,38E+06
7,79E+05
6,21E+05
1,44E+06
1,09E+06
5,15E+06
3,83E+06
4,87E+06
7,24E+05
6,69E+06
1,39E+07
2,53E+07
2,71E+07
1,54E+07
1,80E+07
2,13E+07
2,34E+07
1,13E+07
1,03E+07
1,44E+07
1,64E+07
1,40E+07
1,20E+07
7,55E+06
6,83E+06
Log Recuento
6,27
7,22
7,59
7,32
7,49
7,43
7,24
6,14
5,89
5,79
6,16
6,04
6,71
6,58
6,69
5,86
6,83
7,14
7,40
7,43
7,19
7,26
7,33
7,37
7,05
7,01
7,16
7,21
7,15
7,08
6,88
6,83
Media
DS
7,22
0,48
6,21
0,52
6,63
0,43
7,33
0,09
7,11
0,08
6,95
0,08
75
Muestreo Ventana
2
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
Fincas
Alegria
Alegria
Alegria
Alegria
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Coberturas
CF SS
CF SS
CF SS
CF SS
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Medio Replica
a
b
TSBA
a
b
a
b
a
AIS
b
a
b
a
b
a
NWRI
b
a
b
a
b
a
R2A
b
a
b
a
b
a
TSBA
b
a
b
a
AIS
b
Recuento
1,06E+07
1,09E+07
8,67E+06
9,78E+06
1,25E+06
1,28E+06
1,14E+06
1,43E+06
1,82E+06
1,75E+06
1,78E+06
2,08E+06
1,43E+06
1,65E+06
2,96E+06
3,81E+06
2,26E+07
6,52E+06
1,90E+07
1,97E+07
1,72E+07
1,99E+07
1,23E+06
9,60E+05
1,92E+06
1,56E+06
1,39E+06
1,22E+06
1,27E+07
7,94E+06
Log Recuento
7,02
7,04
6,94
6,99
6,10
6,11
6,06
6,16
6,26
6,24
6,25
6,32
6,16
6,22
6,47
6,58
7,36
6,81
7,28
7,30
7,24
7,30
6,09
5,98
6,28
6,19
6,14
6,09
7,10
6,90
Media
DS
6,15
0,08
6,33
0,16
7,21
0,20
6,13
0,10
7,04
0,12
76
Muestreo Ventana
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Fincas
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Bremen
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Coberturas
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Bosque
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Medio Replica
a
b
AIS
a
b
a
b
a
NWRI
b
a
b
a
b
a
R2A
b
a
b
a
b
a
TSBA
b
a
b
a
b
a
AIS
b
a
b
a
NWRI
b
a
Recuento
1,29E+07
1,60E+07
7,84E+06
1,12E+07
1,75E+07
1,46E+07
2,34E+07
2,52E+07
1,68E+07
1,79E+07
1,64E+07
1,32E+07
1,51E+07
1,34E+07
2,24E+07
1,94E+07
1,71E+07
1,34E+07
1,65E+07
1,11E+07
1,98E+07
1,21E+07
3,48E+06
4,74E+06
1,44E+07
1,16E+07
9,21E+06
1,07E+07
1,41E+06
1,47E+06
6,66E+06
Log Recuento
7,11
7,20
6,89
7,05
7,24
7,17
7,37
7,40
7,23
7,25
7,22
7,12
7,18
7,13
7,35
7,29
7,23
7,13
7,22
7,04
7,30
7,08
6,54
6,68
7,16
7,06
6,96
7,03
6,15
6,17
6,82
Media
DS
7,28
0,09
7,21
0,09
7,17
0,10
6,91
0,24
6,80
0,53
77
Muestreo Ventana
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Fincas
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Coberturas
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Pastizal
Medio Replica
b
NWRI
a
b
a
b
a
R2A
b
a
b
a
b
a
TSBA
b
a
b
a
b
a
AIS
b
a
b
a
b
a
NWRI
b
a
b
a
b
R2A
a
b
a
Recuento
9,18E+06
1,84E+07
2,53E+07
1,44E+07
1,25E+06
1,01E+07
1,33E+07
1,82E+06
1,59E+07
1,25E+07
1,15E+07
8,28E+06
7,02E+06
3,61E+06
5,42E+06
8,37E+06
7,54E+06
1,24E+07
1,21E+07
1,16E+07
1,05E+07
7,96E+06
7,82E+06
8,96E+06
1,02E+07
8,43E+06
9,20E+06
7,82E+06
7,96E+06
1,02E+07
8,96E+06
9,20E+06
Log Recuento
6,96
7,27
7,40
7,16
6,10
7,00
7,12
6,26
7,20
7,10
7,06
6,92
6,85
6,56
6,73
6,92
6,88
7,09
7,08
7,07
7,02
6,90
6,89
6,95
7,01
6,93
6,96
6,89
6,90
7,01
6,95
6,96
Media
DS
6,81
0,49
6,87
0,20
7,01
0,09
6,94
0,04
6,94
0,04
78
Muestreo Ventana
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Fincas
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Villa Ximena
Coberturas Medio Replica
R2A
Pastizal
b
Pastizal
a
Pastizal
b
Pastizal
a
TSBA
Pastizal
b
Pastizal
a
Pastizal
b
Recuento
8,43E+06
5,08E+06
3,98E+06
7,32E+06
7,47E+06
7,54E+06
9,96E+06
Log Recuento
6,93
6,71
6,60
6,86
6,87
6,88
7,00
Media
DS
6,82
0,14
79
ANEXO F. Distribución de los recuentos en medios de cultivo. Comparación de
medias utilizando Tukey-Kramer.
Cuenca del río La Vieja
BOSQUE
7
Log UFC/gps
6
AIS
NWRI
R2A
TSBA
Medio de cultivo
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2.61824
Abs(Dif)-LSD
R2A
R2A
NWRI
TSBA
AIS
-0.33651 0.04680 0.18846 0.27305
NWRI
0.04680 -0.31477 -0.17311 -0.08852
TSBA
0.18846 -0.17311 -0.31477 -0.23019
AIS
0.27305 -0.08852 -0.23019 -0.31477
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
80
PASTIZAL
8
Log UFC/gps
7
6
AIS
NWRI
R2A
TSBA
Medio de cultivo
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2.61662
Abs(Dif)-LSD
R2A
R2A
TSBA
NWRI
AIS
-0.21448 -0.08156 -0.07698 -0.05114
TSBA
-0.08156 -0.21448 -0.20989 -0.18406
NWRI
-0.07698 -0.20989 -0.21448 -0.18864
AIS
-0.05114 -0.18406 -0.18864 -0.21448
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
81
GUADUAL
7.9
7.7
7.5
Log UFC/gps
7.3
7.1
6.9
6.7
6.5
AIS
NWRI
R2A
TSBA
Medio de cultivo
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2.61662
Abs(Dif)-LSD
NWRI
R2A
TSBA
AIS
NWRI
-0.14471 -0.13471 -0.09804 0.02362
R2A
-0.13471 -0.14471 -0.10804 0.01362
TSBA
-0.09804 -0.10804 -0.14471 -0.02304
AIS
0.02362 0.01362 -0.02304 -0.14471
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
82
CAFETAL SIN SOMBRÍO
8
Log UFC/gps
7
6
AIS
NWRI
R2A
TSBA
Medio de cultivo
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2.61662
Abs(Dif)-LSD
R2A
NWRI
TSBA
AIS
R2A
-0.30206 -0.29414 0.04419 0.12419
NWRI
-0.29414 -0.30206 0.03628 0.11628
TSBA
0.04419 0.03628 -0.30206 -0.22206
AIS
0.12419 0.11628 -0.22206 -0.30206
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
83
Cuenca del río El Otún
CEBOLLA
7
Log UFC/gps
6
AIS
NWRI
R2A
TSBA
Medio de cultivo
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2.61662
Abs(Dif)-LSD
NWRI
R2A
AIS
TSBA
NWRI
-0.27017 -0.15142 -0.08058 0.04275
R2A
-0.15142 -0.27017 -0.19933 -0.07600
AIS
-0.08058 -0.19933 -0.27017 -0.14683
TSBA
0.04275 -0.07600 -0.14683 -0.27017
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
84
BOSQUE
Log UFC/gps
7
AIS
NWRI
R2A
TSBA
Medio de cultivo
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2.61662
Abs(Dif)-LSD
R2A
R2A
NWRI
TSBA
AIS
-0.28263 -0.23554 -0.10846 -0.04971
NWRI
-0.23554 -0.28263 -0.15554 -0.09679
TSBA
-0.10846 -0.15554 -0.28263 -0.22388
AIS
-0.04971 -0.09679 -0.22388 -0.28263
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
85
GUADUAL
8
Log UFC/gps
7
6
AIS
NWRI
R2A
TSBA
Medio de cultivo
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2.61662
Abs(Dif)-LSD
NWRI
AIS
R2A
TSBA
NWRI
-0.28600 0.00942 0.03525 0.17734
AIS
0.00942 -0.28600 -0.26016 -0.11808
R2A
0.03525 -0.26016 -0.28600 -0.14391
TSBA
0.17734 -0.11808 -0.14391 -0.28600
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
86
FORESTALES
7
Log UFC/gps
6
AIS
NWRI
R2A
TSBA
Medio de cultivo
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD
q*
2.61662
Abs(Dif)-LSD
R2A
TSBA
NWRI
AIS
R2A
-0.39740 -0.18906 -0.13073 -0.04406
TSBA
-0.18906 -0.39740 -0.33906 -0.25240
NWRI
-0.13073 -0.33906 -0.39740 -0.31073
AIS
-0.04406 -0.25240 -0.31073 -0.39740
Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias.
87
ANEXO G. Libreta de campo
Características sitios de muestreo
Cuenca del río La Vieja
Finca La Ilusión (Bosque)
Presencia de árboles de gran altura con raíces tubulares, con un diámetro de altura del
pecho superior a los 2m. Los tres cuadrantes del muestreo se ubicaron en la falda occidental
del parche del bosque.
La ramada (Pastizal)
El pastizal tiene una antigüedad cercana a los 20 años. Se aprovecha para ganado Cebú de
leche.
La ramada (Guadual)
Fragmento de guadual asociado al curso de agua, cuyo cause esta en la parte baja de un
barranco empinado. La mayoría del guadual esta al costado occidental. La cobertura
corresponde a grupos de pocas guaduas en la orilla de la quebrada
La comarca (Guadual)
Finca con amplios jardines, sectores de guadual y un lago con lodos. El guadual del
muestreo se localiza a lado y lado de una quebrada de aproximadamente 10 m de ancho. La
extensión del guadual es de más de 50 m de ancho con una leve pendiente.
El bolsillo (Cafetal sin sombrío)
Esta finca tiene sectores de cafetal antiguo, donde se encuentra cafetal sin sombrío por lo
menos desde hace 25 años. Una parte de la finca presentó cafetal con plátano en un sector
con una pendiente considerable (30º) y en otro cultivos de plátano y yuca.
Además
presenta ganado lanar de subsistencia.
El cafetal con sombrío donde se tomaron las primeras muestras tubo predominio de
gusanos en el dosel laxo; el sotobosque presenta algunas moráceas y el piso estaba tapizado
conbalsaminaceas, conmelinas, verbenaceas y gesneriaceas adhesivas. El terreno era plano.
Se le aplican agroquímicos y existe la presencia de broca.
88
La alegría (Cafetal sin sombrío)
Presente un cafetal con plátano y una densa y gruesa capa de hojarasca con grandes aportes
de plátano. Tiene una antigüedad de 35 años. El terreno es más o menos pendiente cerca del
río. Se aplican agroquímicos de la variedad caturro.
Bremen (Bosque)
El sector del muestreo esta en la horilla del sendero didactivo en un terreno poco inclinado
(4º) con un sotobosque denso. El diámetro a la altura de pecho de la mayoría de los
individuos es menor a los 10 cm y los individuos mayores tienen un diámetro de hasta 70
cm. Existe un reclutamiento importante de moráceas. Existen helechos con un diámetro
de 10 cm de una altura de 3,5 m. Helechos con vernación húmeda y viscosa de 50 a 70 cm
de alto.
Villa Ximena (Pastizal)
Producción de leche tecnificada. En un terreno mas o menos plano con pasto alto. Algunos
árboles de sombra ubicados a la orilla del camino. Cuadrantes descubiertos.
Ventana El Otún
Santa Helena (Bosque)
Relicto de bosque suscesional, reconocido localmente como un rastrojo. Ubicado en la
parte alta del valle en este sector de la cuenca, al borde de la carretera.
Mandalay (Guadual)
Guadual en la vega del río. Cobertura uniforme con abunante presencia hojas de guadua en
el suelo. Yemas espinosas. Las cepas de los individuos conforman un dosel largo y
discontinuo de aproximadamente 7 metros de altura. Los tres cuadrantes distan entre si por
100 m.
Playa rica (Forestal)
Plantación forestal de ciprés a lo largo de varias colinas a 2106 msnm.
Sotobosque
completamente despejado. Árboles jóvenes de ciprés con diámetro a la altura del pecho de
20 a 50 cm. El piso tiene un tapete continuo de hojas de ciprés y varios montones de
ramas. El segundo cuadrante se tomó de un valle a un estado sucecional avanzado.
89
Lisbrán (Forestal)
Plantación de pinos de más o menos 15 m de alto con un diámetro a la altura al pecho de 20
a 60 cm
Variables fisicoquímicas
Primer evento de muestreo
Finca
La Granja
(Bosque)
La Ramada
(Pastizal)
La Ramada
(Guadual)
La Comarca
(Guadual)
El Bolsillo
(Cafetal sin
sombrío)
La Alegría
(Cafetal sin
sombrío)
Bremen
(Bosque)
Villa Ximena
(Pastizal)
Macarena
(Cebolla)
Santa Helena
(Bosque)
Punto
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
Densidad
Temperatura
cobertura
°C
vegetal
21,8
96,38
22,1
94,288
21,8
91,56
27,8
1,61
24,6
0,784
27,9
0,368
22,4
22,3
22,1
22,3
22
22,2
22,2
23,8
23
22,2
22,9
23,4
17,7
18,1
17,9
22,6
22,7
22,9
22,1
22,1
22,7
18,7
18,9
18,9
90,796
90,952
94,332
92,096
96,412
91,888
96,204
37,704
83,1
94,956
94,228
92,096
95,528
96,464
97,4
85,752
83,34
82,164
85,752
83,34
82,164
95,788
86,584
97,92
Hojarasca
o altura de
pasto (cm)
pH*
0,9
1
3,1
20,4
23,4
8,6
5,1
5,2
5,9
4,8
10,3
5,7
3
2
3,6
22,2
4
0,7
5,76
10,9
3
11,56
38,2
24,6
11,56
38,2
24,6
2,1
4,8
3,9
5,8
6,16
6,18
5,46
5,62
3,55
5,74
5,74
5,71
5,51
5,56
5,11
5,42
5,46
5,14
5,47
5,84
5,01
4,66
3,74
4,15
5,52
5,1
5,89
5,84
6,2
6,09
4,78
4,86
4,86
90
Bella Vista
(Cebolla)
Mandalay
(Cebolla)
La Playa
(Guadual)
Playa Rica
(Forestales)
Lisbrán
(Forestales)
La Pastora
(Bosque)
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
24,6
23,5
23,56
19,3
19,3
19,1
18,7
19,1
18
21,2
20,9
22,4
20
20,54
19,7
15,8
16,2
16,3
2,24
0,628
1.2
96,256
84,66
92,98
92,616
88,456
92,98
76,704
69,788
61,884
75,248
82,424
82,892
95,06
93,708
91,212
41,8
48,4
52,2
4,1
5
2,4
0,6
2,4
1,2
0,4
0,58
0,6
9
5,6
5
2,2
3,3
2,1
6,56
6,14
5,93
5,56
5,78
5,71
5,16
5,24
5,45
5,2
4,65
5,1
4,22
4,41
3,85
5,85
5,95
5,88
* Variable determinada en USBA
Segundo evento de muestreo
Finca
La Granja
(Bosque)
La Ramada
(Pastizal)
La Ramada
(Guadual)
La Comarca
(Guadual)
El Bolsillo
(Cafetal sin
sombrío)
Punto
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
Temperatura
°C
21,3
18,3
22
26,2
26
26
23,4
22,8
23
23
22,6
22,6
21,8
21,8
22
Densidad
cobertura
vegetal
96
98,7
95,94
0,32
0,21
0,21
96,88
96,57
95,94
99,32
97,71
96,98
93,5
87,88
74,05
Hojarasca
o altura
de pasto
(cm)
1,4
3,1
1,9
26,8
21,8
30,8
5
6,2
4,6
11
11,4
6
3,2
3,7
2,2
pH *
5,85
5,88
5
6,43
6,35
6,21
6,37
6,46
6,4
6,25
6,2
6,17
5,95
5,59
6,12
91
La Alegría
(Cafetal sin
sombrío)
Bremen (Bosque)
Villa Ximena
(Pastizal)
Macarena
(Cebolla)
Santa Helena
(Bosque)
Bella Vista
(Cebolla)
Mandalay
(Cebolla)
La Playa
(Guadual)
Playa Rica
(forestales)
Lisbrán
(forestales)
La Pastora
(Bosque)
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
P1
P2
P3
23,4
23
23
95,06
97,3
97,76
20,4
21,6
20,8
18,7
19,6
23,8
16,3
18,5
15,1
23,7
20,9
20,8
ND
16,2
17
95,11
ND
95,11
16,3
19,4
19,7
17,9
18,9
19,6
11,9
11,8
11,6
91,11
96,67
90,17
5,6
7,2
4,5
80,03
61,52
69,01
ND
ND
ND
ND
ND
ND
82,53
0,16
28,03
ND
98,7
98,13
16
ND
16
72,23
81,18
87,52
86,95
90,64
74,94
ND
ND
ND
5,6
3,4
2,8
18,1
18
18
29
13,8
20
43,28
34,8
42,3
9,3
4,9
5,2
50,9
54,2
56,4
ND
98,7
98,13
5,3
ND
8,2
6,2
0,8
0,7
4
6,3
4,3
5,2
2,8
4,1
5,66
6,6
6,55
5,28
5,06
5,01
4,4
5,1
5,68
5,92
6,12
6,03
6,07
5,63
5,57
5,63
5,82
5,83
6,03
6,06
6,01
5,67
5,72
5,8
5,56
5,52
5,84
5,12
5,52
4,98
5,88
5,81
5,84
ND: No determinado
* Variable determinada en USBA
92
ANEXO H. Correlación de variables fisicoquímicas con el recuento de
heterótrofos
Análisis no paramétrico: Test de Spearman
Variable
by Variable
Prob>|Rho|
Temperatura
pH
pH
Hojarasca
Hojarasca
Hojarasca
Heterótrofos
Heterótrofos
Heterótrofos
Heterótrofos
%H
%H
Temperatura
%H
Temperatura
pH
%H
Temperatura
pH
Hojarasca
0,0028
<.0001
0,0088
0,8669
0,3905
0,6314
0,3140
0,2963
0,6332
0,0938
Índice Rho menor a 0.05 indica correlación entre las variables
93
ANEXO I. RECUENTOS MEDIO R2A
Muestreo
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Ventana
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
La Vieja
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
El Otún
Sistema productivo
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Ganadería de carne
Ganadería de carne
Ganadería de carne
Ganadería de leche
Ganadería de leche
Áreas protegidas
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Plantaciones forestales
Plantaciones forestales
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Ganadería de carne
Ganadería de carne
Ganadería de carne
Ganadería de leche
Ganadería de leche
Áreas protegidas
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Cultivos mixtos
Plantaciones forestales
Plantaciones forestales
Cobertura
CFSSb
CFSS
Guadual
Guadual
Bosque
Bosque
Pastizal
Pastizal
Bosque
Bosque
Cebolla
Cebolla
Guadual
Guadual
Forestales
Forestales
CF SS
CF SS
Guadual
Guadual
Bosque
Bosque
Pastizal
Pastizal
Bosque
Bosque
Cebolla
Cebolla
Guadual
Guadual
Forestales
Forestales
Finca
El Bolsillo
Alegría
La Comarca
La Ramada
Bremen
La Granja
La Ramada
Villa Ximena
La Pastora
Santa Helena
Macarena
Bella Vista
Mandalay
La Playa
Playa Rica
Lisbrán
El Bolsillo
Alegría
La Comarca
La Ramada
Bremen
La Granja
La Ramada
Villa Ximena
La Pastora
Santa Helena
Macarena
Bella Vista
Mandalay
La Playa
Playa Rica
Lisbrán
Log UFCc/gps
7.01 ± 0.10
7.22 ± 0.48
7.28 ± 0.15
7.32 ± 0.12
7.21 ± 0.20
6.89 ± 0.59
7.40 ± 0.39
6.81 ± 0.49
6.46 ± 0.08
7.58 ± 0.08
6.87 ± 0.11
6.87 ± 0.47
6.87 ± 0.46
6.68 ± 0.42
6.37 ± 0.38
6.94 ± 0.26
7.14 ± 0.06
7.11 ± 0.08
6.99 ± 0.88
7.32 ± 0.15
7.21 ± 0.09
7.30 ± 0.07
7.15 ± 0.46
6.94 ± 0.04
6.72 ± 0.28
7.23 ± 0.07
7.04 ± 0.12
7.19 ± 0.14
7.24 ± 0.45
6.97 ± 0.37
7.23 ± 0.03
7.25 ± 0.12
94
ANEXO J. CARACTERIZACIÓN MICROSCÓPICA DE COLONIAS EN
MEDIO R2A
La Vieja
Evento de muestreo 1
Bosque
23
3
9
29
CF SS
27
8
6
41
Guadual
25
0
5
30
Pastizal
19
11
15
45
Total
general
94
22
35
151
Coloración de c Bosque
Gram negativo
16
Gram positivo
19
Total general
35
CF SS
21
20
41
Guadual
19
11
30
Pastizal
18
27
45
Total
general
74
77
151
Morfología
Bacilo
Coco
Coco bacilo
Total general
La Vieja
Evento de muestreo 2
Morfología
Bacilo
Coco
Coco bacilo
Total general
Bosque
27
5
8
40
Coloración de
Gram
Gram negativo
Gram positivo
Total general
Bosque
14
26
40
CF SS
23
5
6
34
CF SS
16
18
34
Guadual
19
3
12
34
Guadual
20
14
34
Pastizal
33
4
14
51
Pastizal
20
31
51
Total
general
102
17
40
159
Total
general
70
89
159
El Otún
Evento de muestreo 1
Morfologia
Bacilo
Coco
Coco bacilo
Total general
Bosque
16
5
5
26
Cebolla
21
3
9
33
Forestales
19
7
3
29
Guadual
20
2
6
28
Total
general
76
17
23
116
xcv
Coloración de
Gram
Gram negativo
Gram positivo
Total general
Bosque
7
19
26
Cebolla
14
19
33
Forestales
7
22
29
Guadual
12
16
28
Total
general
40
76
116
El Otún
Evento de muestreo 2
Morfología
Bacilo
Coco
Coco bacilo
Total general
Bosque
16
7
5
28
Cebolla
31
5
5
42
Forestales
21
10
2
33
Guadual
23
2
7
32
Total
general
91
24
19
135
Coloración de
Gram
Gram negativo
Gram positivo
Total general
Bosque
8
20
28
Cebolla
13
29
42
Forestales
5
28
33
Guadual
14
18
32
Total
general
40
95
135
.
.
.
.
ANEXO K. DIFERENCIAS DE LOS RECUENTOS ENTRE COBERTURAS
Primer evento de muestreo
xcvi
ANEXO K. DIFERENCIAS DE LOS RECUENTOS ENTRE COBERTURAS
Primer evento de muestreo
Cuenca del río La Vieja
8
Log UFC/gps
7
6
Bosque
CF SS
Guadual
Pastizal
Cobertura
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums)
Level
Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0
Bosque
12
292,5
24,3750
-0,024
CF SS
12
266
22,1667
-0,655
Guadual
12
372,5
31,0417
1,858
Pastizal
12
245
20,4167
-1,155
Prueba de Chi cuadrado
ChiSquare
3,9788
DF
3
Prob>ChiSq
0,2638
xcvii
Segundo evento de muestreo
Cuenca del río La Vieja
7,6
7,5
7,4
Log UFC/gps
7,3
7,2
7,1
7
6,9
6,8
Bosque
CF SS
Guadual
Pastizal
Cobertura
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums)
Level
Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0
Bosque
12
400,5
33,3750
2,525
CF SS
12
257
21,4167
-0,869
Guadual
12
281,5
23,4583
-0,286
Pastizal
12
237
19,7500
-1,346
Prueba de Chi cuadrado
ChiSquare DF Prob>ChiSq
6,8578 3
0,0766
xcviii
Primer evento de muestreo
Cuenca del río Otún
7
Log UFC/gps
6
Bosque
Cebolla
Forestales Guadual
Cobertura
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums)
Level
Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0
Bosque
12
353,5
29,4583
1,405
Cebolla
12
311,5
25,9583
0,405
Forestales
12
232
19,3333
-1,465
Guadual
12
279
23,2500
-0,345
Prueba de Chi cuadrado
ChiSquare
DF
Prob>ChiSq
3,3676
3
0,3383
xcix
Segundo evento de muestreo
Cuenca del río Otún
7,6
7,4
7,2
Log UFC/gps
7
6,8
6,6
6,4
6,2
Bosque
Cebolla
Forestales Guadual
Cobertura
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums)
Level
Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0
Bosque
12
240
20,0000
-1,275
Cebolla
12
238
19,8333
-1,322
Forestales
12
374,5
31,2083
1,906
Guadual
12
323,5
26,9583
0,691
Prueba de Chi cuadrado
ChiSquare
5,7055
DF
3
Prob>ChiSq
0,1269
c
ANEXO L. DIFERENCIAS DE LAS ABUNDANCIAS RELATIVAS ENTRE
LAS COBERTURAS
Cuenca del río la Vieja
Análisis de una vía Anova
Análisis de Varianza
Source
DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F
Cobertura 3
1,2005000
0,400167
0,795825
Error
4
3,1833000
C. Total
7
4,3838000
0,5028
0,7006
ci
Cuenca del río El Otún
Análisis de una vía Anova
Análisis de Varianza
Source
DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F
Cobertura 3
3,469338
1,15645
3,54594
Error
4
14,183750
C. Total
7
17,653087
0,3261
0,8079
cii
ANEXO M. DIFERENCIAS DE LOS RECUENTOS ENTRE EVENTOS DE
MUESTREO
Cuenca del río La Vieja
8
Log UFC/gps 7
6
1
2
Evento de muestreo
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums)
Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0
1
48
2454
51,1250
0,920
2
48
2202
45,8750
-0,920
Prueba de Chi cuadrado
ChiSquare DF Prob>ChiSq
0,8529
1
0,3557
ciii
Cuenca del río Otún
7
Log UFC/gps
6
1
2
Evento de muestreo
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums)
Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0
1
48
1824
38,0000
-3,690
2
48
2832
59,0000
3,690
Prueba de Chi cuadrado
ChiSquare DF Prob>ChiSq
13,6448
1
0,0002
civ