HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)

HPLC (High−performance Liquid Chromatography)
Antecedentes
Anteriormente a los años 70, pocos métodos cromatográficos confiables estaban disponibles comercialmente
para el científico del laboratorio. Durante los años 70, la mayoría de las separaciones químicas eran realizadas
usando una variedad de técnicas incluyendo la cromatografía de columna abierta, la cromatografía de papel, y
la cromatografía de capa delgada. Sin embargo, estas técnicas cromatográficas eran inadecuadas para la
cuantificación de compuestos y de la resolución entre compuestos similares. Durante este tiempo, la
cromatografía de presión líquida comenzó a ser utilizada para disminuir el tiempo del flujo, reduciendo así
tiempo en la purificación de los compuestos que son aislados por la columna cromatográfica. Sin embargo, los
rangos de los flujos eran inconsistentes, y la cuestión de que si era mejor tener un flujo constante o presión
constante fue discutida.
La cromatografía líquida de alta presión fue desarrollada a mediados de los años setenta y mejorada
rápidamente con el desarrollo de los materiales de embalaje de columna y de la conveniencia adicional de usar
detectores en línea. A fines de los 70's, los nuevos métodos incluyendo la cromatografía líquida de la fase
reversa permitieron una mejor separación entre los compuestos similares.
La última década ha presenciado un gran desarrollo de las microcolumnas, y otras columnas especializadas.
Las dimensiones de la columna típica del HPLC son: 30 milímetros de longitud con un diámetro interno entre
3−5 milímetros. El diámetro generalmente de las microcolumnas, o las columnas capilares, se extiende a
partir de 3 µm a 200 µm. El HPLC rápido, utiliza una columna que es más corta que la columna típica, con
una longitud de cerca de 3 milímetros de largo, y están apilados con partículas más pequeñas.
Descripción del HPLC
El HPLC preparatorio se refiere al proceso de aislamiento y purificación de compuestos. Importante es el
grado la pureza del soluto y el rendimiento de procesamiento, que es la cantidad de compuesto producida por
unidad de tiempo. Este se diferencia del HPLC analítico, donde se enfoca a obtener información sobre el
compuesto de la muestra. La información que puede ser obtenida incluye la identificación, la cuantificación, y
la resolución de un compuesto.
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Las separaciones químicas se pueden lograr usando HPLC utilizando el hecho de que ciertos compuestos
tienen diversos rangos de migración dadas una columna determinada y una fase móvil. De esta manera, el
cromatógrafo puede separar compuestos usando HPLC; el fragmento o el grado de la separación es
determinado sobre todo por la opción de fase inmóvil y fase móvil que tiene el aparato .
La purificación se refiere al proceso de separar o de extraer el compuesto buscado de otros compuestos o
contaminantes. Cada compuesto debe tener un pico característico bajo ciertas condiciones cromatográficas.
Dependiendo de qué necesita para ser separado y que tan cerca están relacionados a las muestras, el
cromatógrafo puede elegir las condiciones, tales como la fase móvil apropiada, permitiendo una separación
adecuada para recoger o para extraer el compuesto deseado mientras que se enjuaga a partir de la fase
inmóvil. La migración los compuestos y los contaminantes a través de la columna necesita ser bastante
diferente para poder ser recogida o para poder extraer el compuesto deseado de manera pura sin incurrir en
algún otro compuesto no deseado.
La identificación de compuestos de HPLC es la parte crucial de cualquier análisis HPLC. Para identificar el
compuesto de HPLC primero debe ser seleccionado un detector. Una vez que el detector se seleccione y se
fije a las configuraciones óptimas de la detección, un análisis de la separación debe ser desarrollado. Los
parámetros de este análisis deben ser tales que un pico limpio de una muestra conocida sea observado en el
cromatógrafo. El pico que se identifica debe tener un tiempo razonable de retención y se debe separar bien de
picos extraños en los niveles de la detección en los cuales el análisis será realizado. Para alterar el tiempo de
retención de un compuesto, varios parámetros pueden ser manipulados. El primero es la opción de la columna,
otra es la opción de la fase móvil , y la última es la opción del flujo.
La identificación de un compuesto de HPLC se logra investigando la literatura y por el ensayo y error. Una
muestra de un compuesto conocido se debe utilizar para asegurar la identificación del compuesto
desconocido. La identificación de compuestos puede ser más segura combinando dos o más métodos de
detección.
La cuantificación de compuestos de HPLC es el proceso para determinar una concentración desconocida de
un compuesto en una solución conocida. Esto implica inyectar una serie de concentraciones conocidas de la
solución compuesta estándar sobre el HPLC para la detección. La cromatografía de estas concentraciones
conocidas dará una serie de picos que se correlacionen con la concentración del compuesto inyectado.
Debido al alto grado de flexibilidad del HPLC no encontrado en otros sistemas cromatográficos tiene la
capacidad de separar fácilmente una variedad amplia de mezclas químicas.
Hay muchas maneras de clasificar la cromatografía de columna líquida. Si esta clasificación se basa en la
naturaleza de la fase inmóvil y del proceso de la separación, peden ser especificados tres modos:
• cromatografía de la adsorción
• cromatografía de intercambio iónico
• cromatografía de la exclusión de la talla
Referente al primer tipo, dos modos se definen dependiendo de la polaridad relativa de las dos fases:
• cromatografía normal
• cromatografía inversa.
El aparato para la instrumentación del HPLC incluyen una bomba, un inyector, una columna, un detector y un
registrador o un sistema de los datos, conectados según lo mostrado en la figura de abajo. El corazón del
sistema es la columna donde ocurre la separación. Desde la fase inmóvil que se compone de partículas porosas
de la talla del micrómetro, se requiere una bomba de alta presión para mover la fase móvil a través de la
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columna. El proceso cromatográfico comienza inyectando el soluto sobre la tapa de la columna. La separación
de componentes ocurre mientras que los analitos y la fase móvil se bombean a través de la columna.
Eventualmente, cada componente se enjuaga de la columna como una banda estrecha (o pico) en el
registrador. La detección de los componentes del enjuague es importante, y éste puede ser selectivo o
universal, dependiendo del detector usado. La respuesta del detector a cada componente se visualiza en una
pantalla del registrador o del ordenador de carta y se conoce como cromatograma. Para recoger, para salvar y
para analizar los datos cromatográficos, los ordenadores, los integradores, y el otro equipo de proceso de datos
se utilizan con frecuencia
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Caso: La identificación y la cuantificación de 77 pesticidas en agua subterránea usando fase sólida
junto con microextracción líquido−líquido y fase inversa de cromatografía líquida.
Analytical Chemistry [H.W. Wilson − Gs]; Jul 15, 2000; Vandecasteele, Karel; Gaus, Irina;
Debreuck,William;
Objetivo: Realizar la cualificación y cuantificación de los compuestos presentes en el agua subterránea..
Este artículo describe un método para la extracción, separación, identificación, y la cuantificación de 77
pesticidas (neutros, ácidos, y básicos) incluyendo algunos metaloides del s−s−triazina. El método es
apropiado para muestras orgánicas altamente concentradas del agua subterránea. En el proceso de
investigación se realiza un estudio comparativo de una mezcla en fase sólida de ph controlado con
diversos solventes de desorción (acetonitrilo o acetonitrileo y diclorometano/metanol), con la finalidad
de conocer las concentraciones de los pesticidas. Los pesticidas en la muestra se separan usando
RP−HPLC y son detectados, e identificados por un diodo.
Ejemplos adicionales donde se aplica el HPLC
Tendencias Del Futuro
El HPLC continuará siendo una de las técnicas más importantes de la separación del laboratorio para los
propósitos analíticos y preparatorios. La biotecnología y las ciencias de vida es donde el HPLC será un
procedimiento crucial. Las compañías biotecnológicas continuarán utilizando el HPLC para probar al
gobierno que sus productos son no tóxicos, puros, y activos.. Las técnicas de la afinidad y de la
inmunoafinidad serán utilizadas con más frecuencia para la producción de farmacéuticos biotecnológicos
debido a la necesidad de ultrapurificación que ayudará a quitar todo el material indeseado de las células
huésped. El HPLC continuará siendo la herramienta principal en la purificación y la separación de proteínas,
de péptidos, y de nucleótidos. Columnas analíticas más pequeñas serán necesarias en el análisis del genoma
humano.
En cuanto a la ecología el desarrollo del HPLC implicaría vigilar los agentes de contaminación ambiental
detectando contaminantes metálicos en el agua, desarrollando separaciones rápidas para vigilar la
fermentación, y desarrollan métodos rápidos en la identificación de virus y bacterias. El HPLC solo o en
conjunto con otros métodos puede vigilar el uso indebido de drogas en los atletas. El uso de robots puede estar
cerca; una función importante podía ser manejar y cargar muestras peligrosas tal como la del SIDA, muestras
de viral/bacterial, radioisótopos, o contaminantes ambientales.
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