Métodos analíticos de separación. Seminario 12.

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL. PROBLEMAS 12.
MÉTODOS ANALÍTICOS DE SEPARACIÓN. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).
1- En una columna de sílica para HPLC se encuentra que un soluto eluye prácticamente con el frente de solvente cuando la
composición de la fase móvil es 50 % hexano-cloroformo. Diga cómo modificaría la composición de la fase móvil para obtener
una retención aceptable. ¿Con qué modo de cromatografía líquida está trabajando?
2- En una columna de trimetilsilano (TMS) para HPLC un soluto eluye a los 30 minutos cuando la composición de la fase móvil
es 10 % metanol-agua. Diga cómo modificaría la composición de la fase móvil para disminuir el tiempo de retención. ¿Con qué
modo de cromatografía líquida está trabajando?
3- En una columna de fase inversa, la dopamina tiene un tR = 31,3 minutos, mientras que el tiempo muerto, determinado con
NaNO2 a 254 nm, es 0,48 minutos para una fase móvil compuesta de 30 % (en volumen) de metanol y 70 % de agua. Calcular:
a) el factor de capacidad, k’, y diga si este valor es apropiado para una determinación cromatográfica de rutina. b) ¿Qué
composición de metanol se necesita en la fase móvil, si se desea que el tiempo de retención sea menor a 8 minutos?
4- La fuerza del solvente “P” indica la habilidad de la fase móvil para eluir solutos de una columna. Diferentes mezclas de
solventes orgánicos con agua pueden tener la misma fuerza para eluir un dado soluto. En RPLC, la “fuerza del solvente” se
relaciona directamente con la polaridad de dicha fase, que se puede calcular como: P’ = P’A φA + P’B φB, donde P’ es el índice
de polaridad, A y B son los solventes de la fase móvil y φ es la fracción volumétrica del solvente. En la siguiente tabla de
solventes miscibles en agua, se muestran valores de P’ para cromatografía líquida en fase inversa (RPLC) y sus respectivos
puntos de corte al UV.
Solvente
P’
Punto de corte (nm)
Solvente
P’
Punto de corte (nm)
Metanol
5,1
205
Etanol
1,8
210
Acetonitrilo
5,8
190
Tetrahidrofurano
4,0
212
Agua
10,2
a) ¿Qué mezcla producirá valores de k’ menores, una de 30 % de tetrahidrofurano-agua o de 40 % metanol-agua?
b) Si una separación se realizó con 20 % de acetonitrilo-agua pero de los 5 componentes, quedaron dos sin separar
completamente, ¿qué cambios en la fase móvil podría hacer para aumentar la resolución, sin cambiar la fuerza del
eluyente?
c) ¿Qué inconveniente tiene el empleo de tetrahidrofurano en la fase móvil si se desea efectuar el análisis de ésteres
de ácidos grasos (no aromáticos) empleando un detector UV-vis?
5- El sorbato, un aditivo antimicrobiano permitido en la formulación de alimentos, puede determinarse mediante
cromatografía líquida.
a) Se realizó el ensayo en un equipo que utilizaba una columna de ODS y una fase móvil compuesta por 20% de
metanol (P’=5,1) y 80% de solución buffer de pH 3 (considerar el valor de P’=10,2, correspondiente al agua). En estas
condiciones se observó que el antimicrobiano eluía a los 31,3 minutos, mientras que el NaNO2 demoraba 0,75
minutos en eluir. De acuerdo a los datos obtenidos, ¿son el tiempo de retención y el resultante valor de k’ adecuados?
b) ¿Qué composición de fase móvil permitiría reducir el tiempo de retención del aditivo a 6 minutos? ¿Esta mezcla
solvente tiene mayor o menor fuerza eluyente que la mezcla del inciso a)?
c) Explique qué metodología utilizaría para seleccionar la composición de la fase móvil más adecuada para esta
separación. Para la determinación del antimicrobiano por HPLC es requisito fundamental la regulación del pH de la
fase móvil ¿Por qué?
d) Explique detalladamente por qué es importante conocer, para los solventes orgánicos utilizados en HPLC,
propiedades tales como: viscosidad, índice de refracción y punto de corte.
6- La epicatequina es un polifenol de origen vegetal que tiene reconocidas propiedades antioxidantes. Se desea determinar
epicatequina en un extracto de hojas de té verde. Se conoce que este soluto es soluble en acetonitrilo e isopropanol. Además
pKa (1) = 6,89.
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Epicatequina
a) ¿Qué modo de cromatografía líquida puede emplear para la determinación del antioxidante?
b) Si se desea seleccionar el modo RPLC, ¿qué precaución debe tomar respecto del pH de la fase móvil
c) Cuando se realizó el ensayo en un equipo que utilizaba una columna de ODS y una fase móvil compuesta por 10%
de ACN (P’= 5,8) y 90% de agua (P’= 10,2) se observó que el antioxidante eluía a los 26 minutos, mientras que en las
mismas condiciones, cuando se inyectaba NaNO2, éste demoraba 1,05 minutos en eluir. De acuerdo a los datos
obtenidos, ¿es adecuado el tiempo de retención?
d) ¿Cómo modificaría la composición de la fase móvil para reducir el tiempo de retención a 6 minutos?
e) Explique qué metodología utilizaría para seleccionar la composición de la fase móvil más adecuada para esta
separación.
f) ¿Por qué es importante conocer para los solventes orgánicos utilizados en HPLC propiedades tales como:
viscosidad, índice de refracción y punto de corte.
CH
H
7- Las aminas aromáticas heterocíclicas 3 son compuestos
tóxicos
(mutagénicos/cancerígenos)
que aparecen en
N básicos
N
N
N
NH
NH
N
H
2
2
alimentos proteicos cocidos a altas temperaturas (frituras, grillados). Se desea determinar Trp-P-1, Trp_P-2 y norharmano en
NH2
un extracto de carne comercial. Se conoce que
estos solutos son soluble en acetonitrilo e isopropanol
pero muy poco solubles
CH
N
3
N
en agua. Los valores de pKa de grupos
NH2 están cercanos a 9.
AaC
PhIP
H
N
MeAaC
H
N
H3C
NH2
N
N
N
CH3
CH3
Trp-P-1
H
N
NH2
Trp-P-2
Norharmano
a) ¿Qué modo de cromatografía líquida podría emplear para la determinación de estas aminas?
b) Si se desea seleccionar el modo RPLC, ¿qué precaución debe tomar respecto del pH de la fase móvil
c) ¿En qué orden de elución predice que saldrán estos compuestos tanto en el modo normal como en el modo
inverso?
Preguntas adicionales
i. ¿Por qué la fuerza del eluyente (fase móvil) incrementa a medida que la polaridad disminuye en cromatografía líquida de fase
inversa (RP-HPLC), mientras que en el modo normal (NP-HPLC) la fuerza incrementa con el aumento de la polaridad del
solvente? Dé ejemplos de los solventes típicos y columnas usados en ambos modos de cromatografía.
ii. ¿Cuáles son las ventajas de realizar una elución en gradiente en HPLC? Porqué realiza siempre un gradiente de menor a
mayor fuerza del eluyente y no a la inversa?
iii. Diga qué modo de cromatografía usaría para separar los componentes de una mezcla en los siguientes casos:
a) moléculas neutras de bajo peso molecular (< 2000) solubles en hexano
b) moléculas neutras de bajo peso molecular (< 2000) solubles en acetonitrilo
c) moléculas iónicas de bajo peso molecular (< 2000).
d) ¿es posible emplear RP o NP-HPLC para separar moléculas iónicas? Justifique.
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iv- La quercetina es un pigmento vegetal que tiene propiedades antihistamínicas y antiinflamatorias. Se desea determinar
quercetina en un extracto vegetal. Se conoce que este soluto es insoluble en hexano, prácticamente insoluble en agua y
soluble en acetonitrilo e isopropanol. Además pKa (1) = 7,03 y pKa (2) = 9,15.
a) Sugiera si el modo normal o inverso sería el más apropiado para su determinación mediante HPLC.
b) Se inyectó este soluto en una columna ODS que contiene trazas metálicas, de 15 x 0.46 cm, empleando 30 % de
acetonitrilo, 70 % de agua y no se observó la elución del soluto, sugiera que pudo haber ocurrido.
c) En base a los valores de pKa, discutir que podría ocurrir con la retención si se trabaja a pH=11 (suponiendo que la
fase estacionaria soporta este pH) y a qué pH debería trabajar si desea retener este analito en una fase estacionaria
ODS sin trazas metálicas.
Quercitina
Respuestas.
1- FM no polar, FE polar  NP-HPLC.
2- FM polar, FE no polar  RP-HPLC.
3- a) k’1 = 64.2. b) Para que el tiempo de retención sea inferior a 8 minutos, la composición de la FM tiene que ser como mínimo 54% CH3OH +
46%H2O.
4- a) En RP-HPLC, el solvente más fuerte es el correspondiente a la mezcla 2: fuerza FM  a medida que P’  (P’ ε  k’). b) Para aumentar
la resolución puedo disminuir la concentración de acetonitrilo en la FM (la FE es no polar y, dado que los solutos salen juntos, implica que éstos
dos tienen poca afinidad por la FE. Por lo tanto, se requiere que la FE interactúe en mayor grado con los solutos. Esto se logra aumentando la
polaridad de la FM). c) La acetona absorbe en el UV, por lo tanto, si es empleada en la FM, impide la detección de los solutos de interés.
iv-a) Posibilidades: NP-HPLC, FE:sílica, FM:hexano+acetonitrilo/isopropanol. RP-HPLC, FE: ODS/TMS, FM:agua+acetonitrilo/isopropanol. Siendo
factible el análisis por ambos modos de HPLC, se prefiere RP-HPLC ya que se emplea agua como solvente, en lugar de hexano. b) El soluto queda
retenido en la columna ya que, al no ser soluble en agua, probablemente esta composición de FM no sea lo suficientemente fuer te para
arrastrarlo. Este problema podría solucionarse si se aumentara la concentración de acetonitrilo en la fase móvil. c) El pH de trabajo debe ser
inferior a pKa(1), ya que es necesario que la quercitina esté poco disociada.
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