8.36_Vázquez López - Universidad Autónoma de Querétaro

EXPRESIÓN DE LISOZIMA DE HUEVO DE GALLINA POR ASPERGILLUS NIGER
INMOVILIZADO EN ESPUM DE POLIURETANO COMO SISTEMA MODELO
Vázquez López, L.I; Romero Gómez, S.J
Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
RESUMEN
Se realizo el cultivo de Aspergillus niger en fermentación de fase sólida (SSF) en espuma de
poliuretano y en fermentación sumergida (SmF), utilizando como medio de crecimiento
medio B1 y se manejaron 4 distintos tratamientos de pH utilizando amortiguador de citratos a
pH 6.5 y amortiguador de acetatos a pH 4.5, con sus respectivos controles de pH 6.5 y 4.5 sin
amortiguador, se cosecho el hongo en periodos de 24hrs durante 72 hrs.; se realizaron tres
fermentaciones. Se comparo la eficiencia de los sistemas mediante la medición de biomasa,
pH, cantidad de proteínas por el método de Bradford, Azucares reductores usando ácido
dinitrosalicilico (DNS) (Wang, 2008), y la cuantificación de lisozima producida por ensayo de
actividad de esta.
Deacuerdo con los resultados obtenidos pudimos notar en la primer y segunda fermentación
que el sistema con amortiguador de acetatos a pH 4,5 no es favorable para el crecimiento del
hongo, por lo que este sistema fue descartado para la tercera fermentación.
También pudimos notar que se obtiene un mejor crecimiento del hongo en la SmF y a un pH
de 4.5 sin amortiguador en ambos tipos de fermentación. Por el lado de la actividad de
lisozima se presento mayor actividad de esta en la SSF y a un pH de 6.5 si amortiguador tanto
en SSF como en SmF. En cuanto a la cuantificación de proteína se obtuvieron mayores
cantidades en la SSF.
INTRODUCCIÓN
El uso en la industria de la fermentación de fase sólida (SSF) para el cultivo de
microorganismos es una importante herramienta para la producción de enzimas la cual ofrece
varias ventajas con respecto a la fermentación sumergida (SmF), entre las cuales esta la
localización de las hifas del hongo filamentoso durante su crecimiento, las cuales en una fase
sólida como es el poliuretano se introducen en este permitiendo la inmovilización del mismo
y la distribución por todo el sistema (Dynesen and Nielsen 2003); mientras que en una
fermentación sumergida este crece disperso por este provocando menores rendimientos
(Acuña-Argüelles et al. 1995).
En este trabajo se compara la eficiencia de la SSF con respecto a SmF en relación con la
producción de biomasa así como en la secreción de lisozima, la producción de proteínas
totales, y la medición de azucares reductores; para lo cual se utilizo Aspergillus niger
modificado para la producción de lisozima.
Aspergillus niger es un hongo filamentoso del grupo de los Deuteromicetos que se
caracterizan por no formar cuerpos fructificantes o basidiocarpos sino que se reproducen
exclusivamente en forma de micelios; presenta hifas septadas, esporas asexuales llamadas
conidiosporas contenidas en un conidioforo en forma de hisopo (en latín Aspergillus), las
esporas son de color negro (de ahí niger); no presenta ciclo sexual por lo que se incluye en los
hongos imperfectos junto a Penicillum
Aspergillus niger es considerado un organismo ideal para el estudio de los eucariota debido a
su fácil manipulación fácil crecimiento en medios de bajo costo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismo.
Se utilizaron esporas de Aspergillus niger obtenidas de un cultivo de Papa Dextrosa Agar
(PDA) 50ml de medio en un matraz Erlenmeyer de 250ml cultivado 72 hrs. Antes de su
utilización.
Las esporas se recuperaron con una solución estéril de TWEEN 20 (20ml de H2O + 0.1% de
TWEEN) la cual fue añadida junto con un agitador magnético y puesta en agitación para
desprender la esporas del micelio procurando no traerse trozos de este.
Sistemas de fermentación.
Medios.
El medio utilizado para las fermentaciones fue medio B1 conteniendo por litro de H2O: 34g
almidón, 34g de bactopeptona, 11.4g de sulfato de amonio, 0.5g de extracto de levadura y
20ml de solución salina de COBE; además se añadió 8ml de una solución de CaCl2, y buffer
de
Se realizaron 4 tratamientos distintos con buffer de citratos pH 6.5 y buffer de acetatos pH 4.5
y dos controles (Tabla 1)
TABLA 1 TRATAMIENTOS UTILIZADOS DURANTE LAS FERMENTACIONES
SSF Y SMF
Tratamiento
Control 4.5
Control 6.5
Citratos
Acetatos
ml de medio B1
152
152
136
136
ml de buffer
0
0
16
16
pH
4.5
6.5
6.5
4.5
Fermentación sumergida (SmF)
La fermentación fue realizada en matraces Erlenmeyer de 125ml a los cuales se les agrego
25ml del respectivo medio dependiendo del tratamiento e inoculaos con una cantidad de
esporas previamente calculada, manteniéndolos en una incubadora con agitación orbital a
30oc y 200 rpm.
Fermentación de fase sólida (SSF)
Esta fermentación se realizo en matraces Erlenmeyer de 250ml a los cuales se les añadió un
gr. de espuma de poliuretano (PUF) la cual fue previamente cortada en cubos de 0.5cm, estos
fueron lavados tres veces con agua destilada para eliminar impurezas y puestos a secar
durante toda loa noche en un horno a 75oC. Después de agregar el 1g de la espuma se
agregaron 25ml del respectivo medio a cada matraz y se puso en una incubadora con agitación
orbital a 30oc y 200 rpm. Es importante señalar que los matraces de ambas fermentaciones
fueron esterilizados a 121oC durante 15min. El medio B1 fue previamente esterilizado a
110oC durante 10min con el objetivo de evitar la degradación de la glucosa o la
caramelización del medio
Obtención de las muestras y la enzima
La cosecha de las muestras se realizo a las 24, 48 y 72hrs. De incubadas las muestras.
Para la cosecha de la SmF se utilizo la filtración de los medios en un embudo con papel filtro
del No1 recolectando alrededor de 5ml del medio para el análisis de pH, cuantificación de
proteínas, análisis de azucares reductores y actividad de la lisozima. La biomasa retenida en
el papel filtro fue lavada 3 veces con 100ml de agua destilada y puesta a secar una noche en
un horno o secador para la determinación de la biomasa en peso seco.
Para la cosecha de la SSF se utilizó filtrado al vació del poliuretano en un embudo Buchner
mediante la presión de este para extraer el medio; de igual manera que la SmF se tomo una
muestra del medio para su posterior análisis; se realizo 3 lavados del PUF con agua destilada
en el mismo embudo hasta inundar el PUF este fue puesto a secar en un horno toda la noche
para la determinación de la biomasa en peso seco.
Análisis de las muestras.
Biomasa. Esta fue determinada como se explico anteriormente utilizando la biomasa retenida
en el papel filtro en el caso de la SmF y la retenida en el PUF en el caso de la SSF.
pH. Se utilizo un potenciómetro para determinar el cambio de pH durante la determinación
tomando el pH de las muestras recuperadas en la cosecha.
Proteínas totales. Esta se determino utilizando el método de Bradford para cuantificación de
proteínas.
Azucares reductores. Estos se determinaron utilizando el método colorimetrico del ácido
dinitrosalicilico (DNS) (Wang, 2008).
Actividad de la Lisozima. Esta se determino mediante la técnica con Micrococcus
lysodeikticus
RESULTADOS
Deacuerdo con los resultados obtenidos pudimos notar en la primer y segunda fermentación
que el sistema con amortiguador de acetatos a pH 4,5 no es favorable para el crecimiento del
hongo, por lo que este sistema fue descartado para la tercera fermentación.
También pudimos notar que se obtiene un mejor crecimiento del hongo en la SmF en la cual
se obtuvo un mayor crecimiento en el tratamiento de pH de 4.5 sin amortiguador seguido del
tratamiento con amortiguador de citratos y al final el control a pH de 6.5 en la fermentación
SmF se obtuvo un mayor crecimiento en el control pH 6.5, seguido del control 4.5 y después
el tratamiento con citratos sin embrago cabe mencionar que el crecimiento fue casi el mismo
variando solo un poco esta fermentación.
Por el lado de la actividad de lisozima se presento mayor actividad de esta en la SSF a un pH
de 6.5 si amortiguador seguido de control 4.5 y al final el tratamiento con citrato mientras que
en SmF también se obtuvo mejor rendimiento en el control a pH 6.5 pero se obtuvo mayor
actividad en citratos que en control 4.5 a diferencia de SSF.
En cuanto a la cuantificación de proteína se obtuvieron mayores cantidades en la SSF casi el
doble en el tratamiento control 4.5 y 6.5 que en SmF de manera independiente en la SSF se
presento mayor cantidad de proteína en control 4.5 y 6.5 mientras que en citratos no se obtuvo
casi actividad ni incremento.
Para azucares reductos se observo que los resultados en SSF se presento mayor actividad en
control 6.5 sin embargo cabe mencionar que los resultados fueron muy similares en los 3
tratamientos mientras que en SmF se obtuvo una actividad mucho mas marcada en el control
6.5 que en los otros tratamientos.
Por ultimo en la curva de pH se observaron resultados no esperados ya que se presento un
incremento en el pH de las muestras contrario a lo que se esperaba en ambas fermentaciones
CONCLUSIONES.
En base a los resultados obtenidos podemos notar que se obtuvo una mayor cantidad de
biomasa en la SmF que en la SSF lo que nos haría suponer que esta es mejor sin embrago al
analizar los resultados de las actividades podemos observar que hay mayor actividad en la
SSF por consecuencia podemos concluir que la fermentación en fase sólida (SSF) es mejor
que la fermentación sumergida ya que aunque crece mas biomasa en la SmF se presentan
mejores actividades en la SSF posiblemente a las condiciones en que el hongo crece ya que en
la SSF este se distribuye de mejor manera al tener un medio sólido (el PUF) lo que le permite
llevar acabo mejor sus funciones mientras que en la SmF este crece disperso en el medio lo
cual podría provocar su degradación o un descenso en la actividad del mismo.
En cuanto a las mejores condiciones de crecimiento pudimos observar que la adición de un
amortiguador no tiene relevancia en el desarrollo del hongo y que este crece igual y aun mejor
sin el amortiguador por lo que faltan mas estudios para lograr la optimización de la SSF
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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and properties of three pectinolyticactivities produced by Aspergillus niger in submergedand
solid-state fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:808–814. (1995)
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Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol., 40: 15-24. (2003)
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