TECANA AMERICAN UNIVERSITY Accelerated Degree Program

TECANA AMERICAN UNIVERSITY
Accelerated Degree Program
Doctorate of Science in Biology- Parasitology & Medical Entomology
INFORME Nº 3
“CONTROL BIOLÓGICO DE VECTORES”
“El uso de hongos entomopatógenos para el control biorracional de
TRIATOMINAE, vectores de la enfermedad de Chagas”
M. Sc. Dalmiro José Cazorla Perfetti.
“Por la presente juro y doy fe que soy el único autor del presente informe y que su
contenido es fruto de mi trabajo, experiencia e investigación académica”.
Coro, 16 de Febrero de 2.008
1
INDICE GENERAL
Página
LISTA DE FIGURAS Y CUADROS……………………………………..
4
RESUMEN………………………………………………………………...
5
INTRODUCCIÒN………………………………………………………….
6
CAPÌTULOS
I
IMPORTANCIA DE LOS TRIATOMINOS EN LA SALUD
PÚBLICA…………………………………………….
8
Problemática actual de la enfermedad de Chagas en
Venezuela………………………………………….
II
CONTROL DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS……..
12
Generalidades……………………………………….
12
Control químico de las poblaciones triatominos….
III
10
14
CONTROL BIOLÓGICO DE LAS POBLACIONES
TRIATOMINAS………………………………………
Generalidades………………………………………
18
18
Uso de hongos entomopatógenos como bioplaguicidas
contra TRIATOMINAE……………………………
Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos…
IV
20
22
ESTUDIOS SOBRE EL USO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS NATIVOS COMO BIOPESTICIDAS CONTRA
TRIATOMINAE EN VENEZUELA…………………
2
28
Generalidades………………………………………
28
Germinación in Vitro ………………………………………
28
Esporulación in Vitro e In Vivo ………………………………
31
Ensayos de patogenicidad y virulencia de B. bassiana contra
vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela……….
35
Aspectos histopatológicos y ultraestructurales sobre la
relación B. bassiana-R.prolixus…………………………….
38
CONCLUSIONES…………………………………………………………….. 44
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………… 46
ANEXOS………………………………………………………………………. 67
A
B
Cadáveres esporulados de R. prolixus por efecto de B. bassiana…. 68
Acción ultraestructural de hifas de B. bassiana sobre tejidos de
R. prolixus………………………………………………………..
3
69
LISTA DE FIGURAS Y CUADROS
FIGURAS
Página
1
Ciclo vital de Trypanosoma cruzi………………………………
9
2
Esporas de 3 especies de hongos entomopatógenos……………
21
3
Ciclo de infección generalizado de un hongo entomopatógeno..
23
4
Conidias, tubo germinativo y apresorio de un hongo entomopatógeno………………………………………………………………
5
25
Adhesión, germinación e invasión de conidias de B. bassiana sobre
tegumento de R. prolixus y T. maculata………………………….
6
39
Invasión micelial de B. bassiana en hemocele y tegumento de
R. prolixus………………………………………………………....
7
40
Acción ultraestructural de hifas de B. bassiana sobre tejidos de
R. prolixus……………………………………………………
8
41
Fagocitosis, encapsulación y melanización de esporas de B.
bassiana por hemocitos de R. prolixus……………………
9
41
Fagocitosis, encapsulación y melanización de esporas de B.
bassiana por hemocitos de R. prolixus…………………………
42
CUADROS
1
Comparación de la capacidad de esporulación de ninfas
V de R. prolixus y T. maculata. …………………………………. 33
4
RESUMEN
Se hace un revisión sobre el uso e implementación de los hongos
entomopatógenos, con especial énfasis en el control de poblaciones triatominas,
vectores del Trypanosoma cruzi. Los estudios muestran que el rociamiento
intradomiciliar con insecticidas de origen químico representa una medida de
control profiláctica práctica y efectiva contra los vectores-triatominos, no
obstante, potencialmente representa un peligro para la salud del hombre y los
animales, además de la biósfera en general. El uso constante de insecticidas
químicos induce a mecanismos de resistencia en los insectos vectores. Como
alternativa a los insecticidas químicos, se ha venido implementando tanto a nivel
experimental como de campo, con resultados esperanzadores, la aplicación de
formulaciones de hongos entomopatógenos como bio-controladores de las
poblaciones triatominas, los cuales son más inocuos para los vertebrados. Las
esporas de los hifomicetos penetran por el tegumento sobre los insectos
hematófagos, tal como ocurre in extenso con las de B. bassiana sobre los
triatominos. En relación con los mecanismos de acción de los hifomicetos, y
particularmente en los aislados venezolanos, requieren de mayores estudios para
dilucidar las clases de metabolitos secundarios presentes y en qué cantidades, de
manera tal de poder utilizarlos en programas de control de vectores. En general, es
poco lo que se ha hecho sobre el empleo de especies de hifomicetos nativos en
TRIATOMINAE de Venezuela. Uno de los más estudiados es el aislado LF14, el
cual ha mostrado ser altamente patógeno para Rhodnius prolixus y Triatoma
maculata, siendo un patotipo que muestra una excelente adaptabilidad en su
capacidad de germinación y esporulación y patogenicidad a las condiciones
extremas del trópico venezolano. Además, los estudios histopatológicos y
ultraestructurales confirmaron que sus conidias penetran vía tegumento a sus
triatominos-hospedadores.
Palabras clave: Control biológico, hongos entomopatógenos, Triatominos,
enfermedad de Chagas.
5
INTRODUCCIÓN
El reciente hallazgo epidémico en la víspera de la Navidad de 2007, de más de
80 casos de la enfermedad de Chagas en el municipio Chacao de la Gran Caracas,
el más rico de Venezuela, confirma que esta enfermedad metaxénica está lejos de
ser eliminada y, dada su condición de enzootia, mucho menos erradicada.
En virtud de la elevada toxicidad de las drogas en uso (i.e, nifurtimox y
benznidazole), y de que aún no se ha desarrollado una vacuna efectiva, la única
medida profiláctica actual de control que evita la adquisición del Trypanosoma
cruzi, es mediante la aplicación de insecticidas de origen químico contra las
poblaciones triatominas involucradas en el ciclo doméstico de transmisión del
hemoflagelado, siendo impráctica e inviables esta medida contra las poblaciones
de vectores de hábitos
peridomésticos y selváticos. No obstante, el uso de
insecticidas de origen químico posee los incovenientes de que muchas veces los
insectos adquieren resistencia hacia ellos, además de que generan problemas de
toxicidad para el hombre, sus animales y el ecosistema en general. Por lo tanto,
urge la necesidad de implementar programas de control de los vectores de la
enfermedad de Chagas, enmarcados dentro de un diseño de Manejo Integral de
Plagas (MIP) con una visión más ecológica o biorracional.
En virtud de lo planteado, en el presente trabajo se realiza una investigación de
los estudios hechos hasta la fecha sobre aspectos de la implementación de agentes
biológicos, tanto macrobianos y microbianos, para el control biorracional de los
vectores de la enfermedad de Chagas, con especial énfasis acerca del uso de
hongos entomopatógenos, incluyéndose los estudios hechos en Venezuela con
aislados nativos.
La presente Monografía de Investigación fue organizada en cuatro Capítulos.
En el Capítulo I, se comenta la relevancia en la salud pública de los triatominos en
el contexto de la enfermedad de Chagas, abarcándose la realidad venezolana. En
el Capítulo II, se discutió acerca de las medidas que se implementan para el
control de la enfermedad de Chagas, particularmente sobre el manejo de las
poblaciones triatominas con los insecticidas de origen químico, haciendo hincapié
sobre sus inconvenientes. En relación con el Capítulo III, se diserta todo lo
6
relacionado con el empleo de agentes macrobianos y microbianos para el control
de las poblaciones triatominas, discutiéndose especialmente acerca del uso de
hongos hifomicetos, así como también de sus mecanismos de acción. Finalmente,
en el Capítulo IV se comenta acerca de los estudios hechos en Venezuela con
aislados y/o cepas nativas de hongos hifomicetos que han mostrado ser patógenos,
o han sido usados, para las especies triatominas. Estos estudios incluyen los de
tipo “In vitro” e “In vivo” de germinación, esporulación, patogenicidad y
virulencia, y de la relación íntima hifomiceto-TRIATOMINAE,
Con toda esta disertación, se propuso cumplir con los siguientes objetivos:
OBJETIVOS
Objetivo General
Discutir los aspectos más relevantes acerca del uso de hongos entomopatógenos
como elementos para el control biológico de poblaciones triatominas vectoras del
T. cruzi.
Objetivos Específicos
-
Analizar críticamente las medidas empleadas para el control de la
enfermedad de Chagas.
-
Discutir las ventajas y desventajas del empleo de insecticidas de origen
químico para el manejo de las poblaciones triatominas.
-
Describir los elementos macrobianos y microbianos empleados para el
control biológico de los vectores de la enfermedad de Chagas.
-
Discutir la relevancia de los hongos entomopatógenos hifomicetos como
elementos para el control biorracional de poblaciones triatominas.
-
Discernir el mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos sobre
sus hospedadores invertebrados.
-
Destacar los trabajos de investigación hechos en Venezuela sobre el uso de
especies nativas de hongos entomopatógenos sobre TRIATOMINAE.
7
CAPITULO I
IMPORTANCIA DE LOS TRIATOMINOS EN LA SALUD PÚBLICA
Los triatominos, o “vinchucas”, “chipos”, “barbeiros”, “kissing bugs” como
comúnmente se les denomina, entre otros nombres, en los idiomas español,
portugués e inglés en las diferentes regiones de América, son artrópodos de la
clase de los insectos. Dentro de INSECTA, se ubican en el orden HEMÍPTERA,
familia REDUVIIDAE, subfamilia TRIATOMINAE, cuyos integrantes resaltan,
dentro de sus características biológicas, por poseer hábitos estrictamente
hematofágicos (Lent & Wygodzinsky, 1979; Carcavallo et al., 1998). La
hematofagia de los triatominos los hace particularmente importantes dentro del
grupo de las enfermedades metaxénicas que afectan a los humanos, ya que son los
transmisores de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana (Lent &
Wygodzinsky, 1979; Mujica & Mesa, 2007). En la actualidad, la subfamilia
TRIATOMINAE se encuentra compuesta por cerca de 140 especies, agrupadas en
6 tribus y 18 géneros, incluyendo ALBERPROSENIINI (Alberprosenia),
BOLBODERINI
(Bolbodera,
LINSHCOSTEUSINII
Belminus,
(Linshcosteus),
Microtriatoma,
Parabelminus),
CAVERNICOLINI
(Cavernicola),
RHODNIINI (Rhodnius, Psammolestes) y TRIATOMINI (Triatoma, Meccus,
Hermanlentia, Eratyrus, Mepraia, Dipetalogaster, Panstrongylus, Nesotriatoma,
Paratriatoma) (Galvão et al. 2003; Forero et al., 2004; Poinar, 2005; Galvao &
Angulo, 2006; Berenguer & Blanchet, 2007; Sandoval, Pabón, Jurberg & Galvao,
2007). De éstos, las principales especies de importancia epidemiológica se
encuentran en los géneros Rhodnius (e.g., R. prolixus, R. pallescens), Triatoma
(e.g., T. infestans, T. dimidiata) y Panstrongylus (e.g., P. megistus) (Lent &
Wygodzinsky, 1979; Carcavallo et al., 1998).
La enfermedad de Chagas es una parasitosis ocasionada por el hemoprotozoario
flagelado, del orden Kinetoplastida, familia Trypanosomatidae, Trypanosoma
(Schizotrypanum) cruzi (Becerril & Romero, 2004; Carlier, Luquetti, Días,
Truyens & Kirchhoff, 2007). La manera natural más frecuente de su transmisión
es a través de las heces de los triatominos vectores (Fig. 1), mientras que en las
zonas urbanas la transmisión sanguínea, a través de las transfusiones, es la otra de
las vías más importantes; también cabe mencionar las vías de transmisión
8
congénita, y la oral, ya sea cuando las heces de los triatominos y/o la orina de
marsupiales (Didelphis sp.), donde se reproducen en sus glándulas anales,
contaminan alimentos, así como también por la ingestión de carnes crudas de
reservorios animales o por la lactancia materna (Becerril & Romero, 2004; PintoDías, 2005; Moreno et al., 2006; Carlier et al., 2007).
Desde el punto de vista clínico, en la enfermedad de Chagas se reconocen tres
etapas, a saber, una aguda de duración más corta y otra crónica más prolongada,
separadas por un período clínico asintomático o fase indeterminada; las dos
primeras fases usualmente se encuentran asociadas a lesiones cardíacas o del
tracto digestivo, y las cardiomiopatías particularmente asociadas a la fase crónica
hace de la tripanosomiasis americana la más letal de las enfermedades infeciosas
del hemisferio occidental (Cubillos-Garzón, Casas, Morillo & Bautista 2004;
Teixeira, Nitz, Guimaro, Gomes & Santos-Buch, 2006).
Figura 1. Ciclo vital de Trypanosoma cruzi.
Fuente: Tomado de
[http://www.vetmed.ucdavis.edu/mpvm/MPVM_students_0607/H4_Williams/lifecycle.gif]
9
La enfermedad de Chagas se encuentra distribuida exclusivamente en el
continente americano, entre el sur de los Estados Unidos de Norte América hasta
Argentina y el sur de Chile en la América del Sur. Esta dolencia es un serio
problema de salud pública, presentando el T. cruzi una gran variedad de cepas
einfecta a 150 especies de animales domésticos y silvestres. Desde comienzos de
los años 90, se crearon las denominadas Iniciativas oficiales para el control de la
transmisión vectorial y transfusional, incluyendo las del Cono Sur (1991), Andina
(1997), América Central y México (1998) y la del Amazonas (2004) (Gulh, 2007).
Estas “Iniciativas” han sido exitosas; así en Chile y Uruguay se ha logrado la
interrupción de la transmisión, lográndose por lo tanto la disminución de la
incidencia de la enfermedad de Chagas en América Latina (W.H.O., 2002; Gulh,
2007). Sin embargo, estos éxitos no han sido del todo homogéneos, existiendo
países del Cono Sur (Argentina, Bolivia, Paraguay), andinos (Colombia, Perú,
Ecuador, Venezuela) y todos los de Meso-América y México donde los controles
vectoriales han tenido diferentes grados de intensidad en las campañas con áreas
geográficas no abarcadas, debido a la falta de conocimientos bio-ecológicos sobre
las especies de triatominos-vectores (Gulh, 2007). En virtud de esto, se estima
que de las 360-400 millones de personas que viven en las áreas endémicas, por lo
menos 90 millones se encuentran expuestos de contraer la protozoosis, y entre 16
y 18 millones de personas están infectadas, con una incidencia anual entre 500 mil
a 1 millón de nuevos casos, falleciendo un tercio de los individuos crónicamente
afectados (Teixeira, Nascimento & Sturm, 2006; Teixeira et al., 2006).
Problemática actual de la enfermedad de Chagas en Venezuela
Después de que el médico brasileño C. Chagas hiciera el descubrimiento en
1909 de la dolencia, Tejera en 1919 hizo el primer reporte de la presencia de la
enfermedad de Chagas en Venezuela (Puigbó, 2001; Añez et al., 2003; Añez,
Crisante & Rojas, 2004). Para los años 30, 40 y 50 del siglo pasado, el médico
venezolano J.F.Torrealba mediante la implementación del xenodiagnóstico, indicó
que existían prevalencias entre 30-40% de la protozoosis en el país (Añez et al.,
2003; Añez, Crisante & Rojas, 2004; Feliciangeli et al., 2007). Con la puesta en
marcha de los programas de rociamiento de insecticidas de origen químico en los
años 60, se comenzó de una manera sistemática con el control de la dolencia. Sin
10
embargo, entre 1962 y 1971 se detectaron seroprevalencias en el territorio
nacional en algunos casos de más del 50%, incluyendo un 20,4% en el grupo
etareo entre 0-10, lo que evidenciaba una transmisión activa (Pifano, 1974; Aché
& Matos, 2001; Añez et al., 2003; Añez et al., 2004). En los años 80 del siglo XX,
los esfuerzos gubernamentales por reducir la prevalencia e incidencia se hicieron
más intensos, siendo considerado el país de la región andina con mayor
experiencia y tradición en el control de la parasitosis (Gulh, 2007); de acuerdo con
los datos suministrados por Aché & Matos (2001), entre 1958 y 1998 las tasas de
seroprevalencia cayeron de 44,5 hasta 9,2%, lo que redujo el área chagásica
nacional de 750.000 km2 a 365.000 km2. A pesar de esto, algunos autores
consideran que en el país existe una re-emergencia de la enfermedad de Chagas, al
detectarse casos agudos con 12,5% de mortalidad (Parada et al., 1996; Añez et al.,
1999b). En este mismo sentido, Añez et al. (2004) revelan mediante serodespistaje
en varios estados, incluyendo, entre otros, Anzoátegui, Monagas y Falcón, la
presencia de una proporción importante de individuos seropositivos; lo que
contrasta con lo que se afirma que la enfermedad de Chagas en Venezuela se
encuentra restringida a los estados Portuguesa, Lara y Barinas o a regiones
montañosas donde hay plantaciones cafeteras (Aché & Matos, 2001; Moncayo,
2003). Por lo tanto, el control y vigilancia epidemiológica de una enfermedad
metaxénica como lo es la enfermedad de Chagas no debe ser sometida a la
propaganda proselitista, toda vez que los triatominos son seres vivos con un
genoma que les permite la plasticidad de adaptarse a las circunstancias ecológicas
más diversas; lo dicho se hizo patente con la detección en la víspera de la Navidad
de 2007 de un brote epidémico de tripanosomiasis americana en pleno centro de la
capital de Venezuela (Barreto, 2007; Escalante & Bracci, 2007); sin embargo, en
el mundo académico-científico esta noticia no debió ser tan extraña, toda vez que
Feliciangeli (2005) llamó la atención, y alertó, acerca de la posible transmisión de
la enfermedad de Chagas en las zonas urbanas, especialmente en la región capital,
ya que constantemente se detectaba a ejemplares de P. geniculatus infectados con
T. cruzi, frecuentemente en el domicilio por los habitantes del D.F. y de los
estados Vargas y Miranda.
11
CAPITULO II
CONTROL DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Generalidades
Existen enfermedades, como por ejemplo la poliomelitis, en la que se puede
esperar una completa erradicación, i.e., una interrupción total de la transmisión.
En cambio existen aquellas en las que sólo es posible esperar su eliminación en
una escala de tiempo, y otras en las que sólo se puede esperar una reducción en su
transmisión (Silveira & Vinhaes, 1999).
No obstante de los resultados exitosos alcanzados hasta ahora, de acuerdo a las
autoridades sanitarias de Latinoamérica y
Venezuela, en las campañas anti-
chagásicas, desafortunadamente dada su condición de enzootia, es poco probable
que la tripanosomiasis americana sea una “enfermedad erradicable”: con toda
seguridad el parásito se transmitirá entre los reservorios y triatominos en los
ecotopos naturales, pudiéndose, inclusive, darse la reinfestación de las viviendas a
partir de los ciclos silvestres, además, la enorme variedad de especies de
resorvorios hace que sea imposible su erradicación; por otra parte, aún no se
cuenta con una medida inmunoprofiláctica efectiva, ya que los antígenos de T.
cruzi parecen estimular reacciones autoinmunes que hacen remota la posibilidad
de una vacuna (Kierszebaun, 1985, Dumonteil, 2007), y de que las drogas (e.g.,
Nifurtimox y Benznidazole) en uso no logran eliminar los parásitos remanentes de
tejidos (e.g., miocardio), además de su elevada toxicidad y problemas de
resistencia (Brener et al., 1993; W.H.O., 1997; Añez et al., 1999a; Castro, de
Mecca, & Bartel, 2006; Bartel et al., 2007; Rego et al., 2008), aunque se debe
indicar que una nueva droga triazólica denominada TAK-187 muestra resultados
esperanzadores contra el T. cruzi (Corrales et al., 2004); por lo tanto, a la luz de lo
discutido y de las evidencias actuales, esta dolencia es realmente poco susceptible
de ser “eliminada” (Morel, 1998; Schofield, Diotaiuti & Dujardin, 1999; Silveira
& Vinhaes, 1999)
Un programa de control de la enfermedad de Chagas debe tener presente que la
transmisión del T. cruzi se encuentra estrechamente relacionada con las
condiciones de pobreza de las poblaciones humanas endémicamente expuestas. En
12
este sentido, los triatominos domiciliados encuentran un ambiente favorable para
esconderse en las rendijas de las paredes de bahareques y techos de palma de las
viviendas pobres de las zonas rurales y de los barrios periféricos urbanos (Días,
1987a, b; 1992; Moncayo, 1999). Por otra parte, las amplias migraciones humanas
que ocurrieron en Latinoamérica en las décadas de los 70 y 80 del siglo pasado,
del campo hacia las ciudades incrementó la transmisión de la protozoosis por la
vía de las transfusiones sanguíneas, cambiando definitivamente los patrones
epidemiológicos (Días, 1987a, b; 1992; Guhl & Vallejo, 1999; Moncayo, 1999).
Asimismo, la necesidad de establecer nuevos acentamientos humanos en áreas
silvestres donde circula activamente el parásito aumenta el riesgo de colonización
y/o invasión intradomiciliar de los triatominos y, por lo tanto, de transmisión
activa, por la destrucción de los ecotopos naturales. Obviamente, ésto puede
causar la disminución, e inclusive la desaparición, de las fuentes alimentarias
naturales de los triatominos, conllevando a la invasión de las viviendas por estos
vectores para alimentarse sobre humanos (Días-Lima & Sherlock, 2000). En este
sentido, es oportuno señalar los hallazgos de Sampson-Ward & Urdaneta (1988),
y Herrera & Urdaneta (1992; 1997), quienes detectaron focos naturales de
tripanosomiasis americana en pleno valle de Caracas, DF, asociados a triatominos,
marsupiales y roedores sinantrópicos, lo que hace que potencialmente pueda
existir transmisión activa de la dolencia, especialmente en zonas de la capital
venezolana que exhiben un deficitario control sanitario (Herrera & Urdaneta,
1997), y más recientemente Reyes-Lugo & Rodríguez-Acosta (2000) encuentran
poblaciones intradomiciliarias de P. geniculatus, una especie considerada
habitualmente como de hábitos silvestres, en el municipio Hatillo aldedaño a
Caracas. Esto discutido se hizo patente recientemente en pleno Municipio Chacao
de Caracas, paradójicamente el municipio más rico de Venezuela, con el hallazgo
de un brote epidémico con más de 80 casos, al contaminarse mediante las heces
de triatominos infectados con el protozoo el jugo del almuerzo escolar (Barreto,
2007; Escalante & Bracci, 2007), tal como ocurrió durante los carnavales del 2005
en Florianópolis, estado de Santa Catarina, Brasil, por la ingestión de jugo de
caña, muriendo inclusive 5 de los 30 turistas argentinos infectados (Medina, Savio
& Hernández, 2005; Nolte, 2005) . Aunado a esta problemática, como ya fue
13
reseñado, existe la posibilidad de reinfestación y/o invasión de parte de las
especies triatominas de hábitos peridomésticos y selváticos, en áreas donde la
eliminación de los triatominos domésticos ha sido exitosa, lo cual se hace
epidemiológicamente más alarmante cuando el hecho ocurre por parte de las
especies con hábitos selváticos, e.g., T.
tibiamaculata (Pinto, 1926) y P.
geniculatus (Latreille, 1811) en la ciudad de Bahía y la isla de Marajó, en el
noreste y en el delta del río Amazonas de Brasil, respectivamente (Valente, 1999;
Días-Lima & Sherlock, 2000).
De lo discutido se deriva la premisa de que la interrupción de la transmisión de
la enfermedad de Chagas se encuentra dirigida a la prevención de nuevos casos en
niños y jóvenes, ya sea mediante los controles vectorial en las viviendas humanas
y transfusional en los bancos de sangre; esto último se hace mediante screening
serológico de la sangre donada, descartándose las positivas a la presencia de T.
cruzi (Días, 1987a, b; 1992; Schumis, 1999; Moncayo, 1999). En cambio, las
poblaciones triatominas se controlan ya sea mediante mejoramiento físico de la
vivienda, o por el rociado de insecticidas de origen químico de las casas
infestadas, la cual es la medida mayormente implementada (Moncayo, 1999).
Control químico de las poblaciones triatominas
El uso de insecticidas residuales de origen químico es la medida más práctica y
rápida para interrumpir la transmisión vectorial de la enfermedad de Chagas,
siendo la aplicación de los plaguicidas dentro de las viviendas el método más
tradicional (Pinchin, Oliveira Filho, Fanara & Gilbert, 1980; W.H.O., 1999). El
combate químico de los triatominos comenzó con el uso de los organoclorados
(Diedlrín, HCH) en las décadas 50-60 del siglo XX, y continuó con la aplicación
de organofosforados (fenitrotión, malatión) en la década de 1970. Desde 1980-90,
se sustituyeron éstos casi exclusivamente por piretroides, lo que permitió bajar las
dosis de uso entre 10 y 20 veces, en la actualidad, preferentemente se utilizan
piretroides sintéticos de tercera generación (cianopiretroides) con base acuosa y
de aplicación foable, incluyendo deltametrina, beta-cipermetrina, beta-ciflutrina y
lamda-cihalotrina, los cuales poseen menor riesgo para el ser humano y el medio
14
ambiente (Pinchin et al., 1980; Zaim, Aitio & Nakashima, 2000; W.H.O., 1999;
Zerba, 2004).
Siendo la aplicación de insecticidas de origen químico la medida antivectorial
más implementada actualmente y práctica hasta el presente para el control y
prevencion de la enfermedad de Chagas, no obstante, también posee sus
inconvenientes, ya que éstos tienen una alta estabilidad química y física,
característica ésta que los hace persistentes en el ambiente (Murphy, 1980;
Mazzarri & Mazzarri, 1987). Uno de los inconvenientes más resaltantes es en
relación con los efectos tóxicos potenciales de éstos sobre la salud humana y de
los animales, tanto los de hábitos silvestres como aquellos domesticados por el
hombre y los organismos benéficos (e.g., polinizadores y enemigos naturales de
otros artrópodos dañinos), así como también a toda la biósfera en general, lo que
evidentemente alteraría el equilibrio natural de los ecosistemas con la subsecuente
contaminación de las aguas y los suelos (Murphy, 1980; Sosa-Gómez &
Moscardi, 1991; Cook et al., 1996). En este sentido, se tiene que anualmente
ocurren entre 10.000 a 20.000 decesos humanos en el globo terráqueo como
consecuencia de su aplicación, guarismos que se pueden incrementar hasta diez
veces más, particularmente en los denominados países en desarrollo (Andrade Carvalho, 1991; McConnell & Hruska, 1993; Klein-Schwartz & Smith, 1997).
Dentro de los efectos más severos de los insecticidas que se emplean para
controlar a las poblaciones triatominas, incluyendo a los organoclorados,
organofosforados, carbamatos y los piretroides, son los que afectan al sistema
nervioso al inhibir los canales iónicos y los químicos neurotransmisores, pudiendo
producir desde efectos clínicos tóxicos, especialmente los de tipo agudo, leves,
moderados y de gravedad, incluyendo, entre otros, desde debilidad, náuseas,
alteraciones de la marcha, convulsiones generalizadas, trastornos psíquicos hasta
la muerte por insuficiencia respiratoria y cardíaca (Organización Mundial de la
Salud, 1995; Pose, De Ben, Delfino & Burguer, 2000; Costa , Giordano ,
Guizzetti & Vitalone, 2007 ). Actualmente, existen numerosos estudios en los que
se viene demostrando la asociación entre el Mal de Parkinson, una dolencia
degenerativa del sistema nervioso central, y la exposición a pesticidas químicos
(Brown, Rumsby , Capleton , Rushton & Levy , 2006). En este mismo sentido, y
15
lo cual es alarmante, existen fuertes evidencias entre la aparición de varios tipos
de cánceres, especialmente leucemia en niños, ante la exposición a insecticidas
químicos, así como también con abortos, mortinatos y defectos congénitos
(García, 2003; Bassil et al., 2007).
Otro de los inconvenientes que ocasiona el uso de los insecticidas de origen
químico, es en lo referente a la aparición de poblaciones de insectos resistentes,
producto
de
su
aplicación
inadecuada
o
indiscriminada
(extensiva
e
intensivamente), o por la biología intrínseca del vector (e.g., fenómeno
preadaptaivo
de
pocos
individuos)
(Zerba,
2004).
Particularmente
en
TRIATOMINAE, se ha detectado dicha resistencia en R. prolixus en Venezuela
hacia carbamatos, piretroides, organofosforados y organoclorados, y T. maculata
hacia estos últimos compuestos (González-Valdivieso, Sánchez & Nocerino,
1971; Cockbum, 1972; Nocerino, 1976; Nelson & Colmenares, 1979; Vassena,
Picollo & Zerba, 2000; Soto Vivas & Molina de Fernández, 2001; Molina de
Fernández, Soto Vivas & Barazarte, 2004), y hacia los piretroides en T. infestans
en Argentina, Brasil y Perú, y P. herreri en este último país mecionado (Nelson &
Colmenares, 1979; Vasena et al., 2000; Yon et al., 2004; Zerba, 1999; 2004). Este
fenómeno trae como consecuencia que se tengan poblaciones triatominas fuera de
control, que exista un aumento en el uso y frecuencia del químico, con el
subsecuente mayor impacto sobre el ambiente y la biósfera (Zerba, 2004).
Dentro de los retos que se deben afrontar desde un punto de vista de la Salud
Pública en Venezuela, es en relación, antes que nada, en la evaluación de la
toxicidad crónica de los insecticidas de origen químico para la población humana
endémicamente expuesta. Esto se indica, ya que generalmente la preocupación
principal, probablemente porque posee mayor impacto, es con lo referente a la
toxicidad aguda. Por lo que hay que abocarse a la síntesis o extracción de
sustancias químicas que sean cada vez más inócuas, tanto para el hombre como
para toda la biósfera. Otro punto importante que pareciera estarse descuidando, es
en lo referente a la monitorización de la resistencia de las poblaciones triatominas
hacia los insecticidas químicos en uso; una problemática que se puede prevenir
con la vigilancia epidemiológica constante. Así mismo, debe exigirse la
16
investigación de la dinámica poblacional de los triatominos vectores,
especialmente los de hábitos peridomésticos y selváticos, los cuales tienden
invadir y adaptarse a la domiciliación donde se han diezmado los vectores de
hábitos tácitamente domésticos con rociamiento de insecticidas químicos.
17
CAPITULO III
CONTROL BIOLÓGICO DE LAS POBLACIONES TRIATOMINAS
Generalidades
Por todo lo anteriormente, parece pertinente proponer que un programa de
control y vigilancia epidemiológica de la enfermedad de Chagas debe involucrar
un Manejo Integral de Plagas (MIP), más aún cuando se sabe que los principales
vectores de Chagas en el país no son estrictamente domiciliarios. En efecto, a
pesar de que R. prolixus, principal vector de la tripanosomiasis americana en
Venezuela (Lent & Wygodzynsky, 1979; Días, 1992; W.H.O., 1997), puede
alcanzar altas densidades poblacionales dentro de la habitación humana, existen,
asimismo, poblaciones silvestres de esta especie que habitan en palmeras llaneras
indistinguibles morfométricamente de aquellas capturadas dentro del domicilio
(Schofield & Dujardin, 1999), por lo tanto, es muy probable que R. prolixus sea
un triatomino con un hábitat natural y silvestre con adaptación secundaria al
domicilio humano (Gamboa, 1963; Guerrero & Scorza, 1981). Por otra parte, T.
maculata, considerado como un vector alterno de la tripanosomiasis americana en
Venezuela (Días, 1992), es una especie distribuida en todo el territorio nacional
(Ramírez-Pérez, 1985; 1987; Galvao, Carcavallo, Rocha & Jurberg, 2003). Se le
captura en todos los hábitats, incluyendo el silvestre, el peridoméstico y dentro de
la habitación humana (Tonn, Otero, Mora, Espínola
& Carcavallo, 1978;
Ramírez- Pérez, 1985; Carcavallo et al., 1997). Se le tiene como una especie que
reemplaza a R. prolixus en el domicilio en aquellas zonas donde esta última es
eliminada por la acción humana (Zeledón, 1974). En este sentido, es oportuno
implementar como una medida alternativa a los insecticidas de origen químico,
aquellos que utilizan organismos vivos para reducir la transmisión del T. cruzi por
parte de los triatominos a la población endémicamente expuesta: es el
denominado control biológico. Este último puede definirse tal como lo propone
López –LLorca (1992): “la acción de parásitos, predadores o patógenos
(diferentes del hombre), que mantienen la densidad de población de otro
organismo más baja de la que existiría en su ausencia”, i.e, sus enemigos
naturales, los cuales pueden ser manipulados por el hombre o no. El control
18
biológico de plagas posee la desventaja de que se requiere paciencia,
entrenamiento y un mayor estudio biológico, ya que los enemigos naturales atacan
a un insecto-plaga específico, a diferencia de los agentes químicos que destruyen a
un amplia variedad de insectos; además, estos enemigos naturales muchas veces
son susceptibles a la acción de los pesticidas, lo que requiere mucho cuidado en su
manejo; así mismo, el control biológico también muchas veces es de acción lenta,
y en algunos organismos su producción masificada no siempre es rentable desde
el punto de vista económico (López –LLorca, 1992).
Para el control biológico de los triatominos, en varios países de Centro y Sur
América, e inclusive de Asia, se han estudiado y utilizado numerosos insectos
entomófagos (bioplaguicida macrobiano), incluyendo predadores de los órdenes
Orthóptera, Hemíptera, Coleóptera, Díptera e Hymenóptera, estando en este
último orden las especies parasitoides de las familias Aphelinidae, Eupelmidae,
Encyrtidae y Scelionidae (De Santis, Loiacono & Coscaron, 1987). En nuestro
país, desde los trabajos pioneros de Ortiz & Alvarez (1959), se han estudiado y
ensayado las avispas de las especies Telenomus costalimai, T. capito (Scelionidae)
y Ooencyrtus venatorius (Encyrtidae) contra los huevos de R. prolixus
(Feliciangeli, 1973; 1976; De Santis, Sarmiento, Rabinovich & Feliciangeli,
1975-1976; De Santis et al., 1987), desafortunadamente, sin embargo, hasta los
momentos su implementación rutinaria y comercial no es un hecho tangible para
el control de la protozoosis. Más recientemente, se ha reportado la potencialidad
de ácaros (Pimeliaphilus plumifer) de la familia Pterygosomatidae como posible
biocontroladores de las poblaciones triatominas, al observarse que éstos causan en
Meccus pallidipennis mortalidad, la reducción de la muda, y de la fertilidad de las
hembras debido a la desnutrición por la infestación de estos ácaros (MartínezSánchez, Camacho, Quintero-Martínez & Alejandre-Aguilar, 2007). Para
Schofield (1990) este tipo de herramienta biológica posee la desventaja de no ser
efectivo en pruebas de campo y por ser muy costoso, siendo “irrelevante ya que
la mortalidad inducida por una liberación inundativa puede ser fácilmente
compensada, los depredadores o los parasitoides rápidamente alcanzarían
niveles de equilibrio que no afectaría al nivel de población de chipos (porque esta
no es la forma en que las poblaciones de chipos son reguladas”, no obstante, este
19
autor no menciona la desventaja de la toxicidad que eventualmente puedan
ocasionar los insecticidas de origen químico a los vertebrados, incluyendo al
hombre.
El control microbiano se puede referir como la rama del control biológico que
emplea microorganismos (bacterias, viurus, hongos, nemátodos, protozoarios)
para disminuir y controlar las poblaciones de artrópodos- plagas (López –LLorca,
1992; Lecuona, 1996). En relación con el uso de las bacterias en TRIATOMINAE,
Lima , dos Santos , da Silva , Rabinovitch (1994) han obtenido resultados exitosos
con la aplicación de Bacillus thuringiensis, bacteria Gram-positiva que es uno de
los agentes microbianos más extensamente utilizado en los programas de MIP
(Lacey & Siegel 2000), sobre T. vitticeps, bajo condiciones de laboratorio.
De interés ha resultado el aislamiento en T. infestans del virus Triatoma-virus
(TrV), el cual es un picorna-like virus; su aplicación en estos insectos les paraliza
las piernas y les impide la ecdisis.
Su transmisión vertical (transovárica) y
horizontal (vía oral-fecal) hace que se tengan expectativas acerca de su utilización
como herramienta en futuros programas de control biológico de triatominos
(Muscio,Torre & Scodeller, 1987; Muscio, La Torre, Bonder & Scodeller, 1997;
Rozas-Dennis, Cazzaniga & Guérin, 2002).
Uso de hongos entomopatógenoas como bioplaguicidas contra
TRIATOMINAE.
Otro de los microorganismos que se han implementado contra TRIATOMINAE
son los hongos (División Eumycota) filamentosos mitospóricos del orden
Hypocreales (Fig. 2) [(Ascomycota, que fueron clasificados anteriormente en la
clase Hiphomicetos, Fungi Imperfectis: Deuteromicotina) (Dolinshy & Lacey,
2007)], particularmente las especies Beauveria bassiana y Metarhizium
anisopliae (Fig. 2), aunque también se han ensayado en menor grado los
entomopatógenos B. brongniartii, Nomuarea rileyi, Paecilomyces fumosoroseus,
Evlachovaea sp., Penicillium corylophilum y Aspergillus giganteus (Mora Costa,
1978; Sherlock & Guitton, 1982; Silva & Messias, 1986; Messias, Daoust &
Roberts, 1986; Romaña, Fargues & Pays, 1987; Luz & Fargues, 1997; 1998; Luz,
Silva, Cordeiro & Tigano, 1998a; 1999; Fargues & Luz, 2000; Lara da Costa ,
Lage de Moraes & Galvão, 2003; Luz, Rocha & Silva, 2004).
20
Beauveria bassiana
Metarhizium anisopliae
Verticillium lecanii
Figura 2. Esporas de 3 especies de hongos entomopatógenos
Fuente: Tomado de [www.invasive.org/hwa/pathogens.cfm]
Los hongos superan a los insectos y/o artrópodos en general debido a su ciclo
de vida corto (alto potencial reproductivo), producen esporas de resistencia o
tienen fases saprofíticas en la ausencia de sus hospedadores. Además, los hongos
pueden ser modificados con las nuevas herramientas biotecnológicas, y
son
generalmente inocuos para los organismos que no son sus hospedadores. Por lo
general, los hongos se pueden producir masivamente y a bajos costos (LópezLLorca, 1992; Zambrano, García, Zambrano, Linares & Molina, 1992; Dolinshy
& Lacey, 2007).
Los hongos mitospóricos B. bassiana y M. anisopliae infectan especies
diferentes de insectos de varios órdenes, aunque se tienen aislados altamente
específicos, siendo las especies entomopatógenas más empleadas a nivel mundial
(Ferrón, Hurpin & Robert, 1972; Fargues, 1976); particularmente B. bassiana es
capaz de infectar a más de 700 especies insectos (Barbercheck & Kaya, 1990;
Goettel & Inglis, 1997). Los mismos son unos excelentes candidatos para ser
utilizados como bioinsecticidas contra los vectores del Mal de Chagas, debido a
que establecen la infección por contacto, no debiendo ser ingeridos por estos
hemípteros de hábitos hematofágicos estrictos (Luz, Tigano, Silva, Cordeiro &
Aljanabi, 1998b). Varios investigadores han probado cepas de estos hongos con
una alta virulencia contra varias especies triatominas de importancia
epidemiológica, incluyendo, entre otras, R. prolixus, T. infestans, T. brasiliensis y
P. megistus, con resultados alentadores (Romaña, Fargues & Pays, 1987; Luz &
Fargues, 1997; 1998; Luz, Silva, Cordeiro
& Tigano, 1998a; Luz, Tigano,
Aljanabi, 1998b; Luz et la., 1999; Fargues & Luz, 2000), inclusive a nivel de
campo con resultados promisorios (Luz, Nery, Magalhaes & Tigano, 2004; Luz &
21
Batagin, 2005). No obstante, como bien lo señalan Goettel & Inglis (1997), los
hongos son organismos que dependen de numerosos factores, tanto bióticos como
abióticos, que pueden determinar o influenciar su acción patógena sobre los
insectos. Estos incluyen la cepa (aislado) o especie de hongo, el estado fisiológico
del hospedador, la nutrición, los mecanismos de defensa, los microorganismos
cuticulares y epicuticulares, y otros diversos factores como los de tipo ambiental
(temperatura, humedad relativa, luz, etc.). Los ensayos a nivel de laboratorio
deben tratar de imitar, lo mayor posible,
las condiciones ecológicas que
predominan en la naturaleza, ya que los insectos son más susceptibles en las
condiciones controladas de laboratorio que en las del medio ambiente donde ellos
habitan (Goettel & Inglis,1997).
Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos
Antes de entrar a estudiar directamente el mecanismo de acción de los hongos
entompatógenos, se debe describir, aunque no tan extensamente, la estructura de
la pared celular de los hongos. Esta se encuentra constituida por polisacáridos,
principalmente quitina, que también se encuentra en los artrópodos, y es de tipo
estructural; además posee proteínas, que son glicoproteínas, con galactosa y
manosa; lípidos (ácidos grasos); pigmentos, básicamente compuestos de melanina,
y sales inorgánicas (Ruiz, 1991; Wessels, 1999; Pucheta, Flores, Rodríguez & De
la Torres, 2006).
A diferencia de otros organismos patogénicos de artrópodos (e.g., virus,
bacterias), los hongos entomopatógenos pueden invadir a sus hospeadores a través
del exoesqueleto, ya sea por adherencia de sus esporas en las partes bucales,
tegumento y/o los espiráculos (Carruthers & Hural, 1990; Khachatourians &
Valencia, 1999;; Holder & Keyhani, 2005; Pucheta et al., 2006; Holder, Kirkland,
Lewis & Keyhani, 2007).
De una manera general (Fig. 3), se puede dividir los eventos que desarrollan los
hongos para parasitar a sus hospedadores artrópodos-plagas en las siguientes
fases: i) germinación; ii) formación de apresorios; iii) formación de estructuras de
penetración; iv) colonización, y v) reproducción (Pucheta et al., 2006).
22
Figura 3. Ciclo de infección generalizado de un hongo entomopatógeno.
Fuente: Tomado de [www.invasive.org/hwa/pathogens.cfm]
El proceso se inicia cuando la espora o conidio viable (Fig. 4), encuentra un
lugar propicio sobre la cutícula o tegumento de sus hospedadores artrópodos, para
establecer la relación patógeno-hospedador; para ello, la superficie de la pared
celular del hongo debe adherirse a la cutícula; mediante herramientas de la
Biofísica, varios estudios han indicado que existen asociaciones inespecíficas y
específicas, detacándose que iones Ca++ y Mg++ logran disminuir las fuerzas de
repulsión electrostáticas entre ambas superficies al modificar la hidrofobicidad,
que es determinada en parte a proteínas denominadas hidrofobinas que
disminuyen la tensión superficial del agua y carbohidratos, facilitándose la unión
pared celular fúngica-cutícula del invertebrado. Luego, un proceso de enlace aún
más específico se da a través de la partcipación de estructuras con actividad
parecida a lectinas (Fargues, 1984; Boucias, Pendland, & Latge, 1988; Doss,
Potter., Soeldner, Christian & Fukunaga, 1995; Wosten, De Vries. & Wessels,
1993; Soeldner, Christian & Fukunaga, 1995; Holder & Keyhani, 2005; Kwan et
al., 2006; Pucheta et al., 2006; Holder et al., 2007). Es importante resaltar que,
como bien lo indican Fargues (1984), Khachatourians & Valencia (1999) y Holder
et al. (2007), la conformación
lipídica de la superficie
de la epicutícula
determinará el éxito o el fracaso de la eficacia entomopatogénica de las esporas
23
fúngicas, ya que este paso es primordial para que se instaure la micosis; en este
sentido, existen grupos de insectos, como los Homópteros, que al poseer un
epicutícula demasiado grasosa impide la efectividad de las esporas muy
hidrofílicas.
Después que ocurre la adhesión de la espora, esta necesita germinar, proceso
que es disparado por carbohidratos que actúan como mensajeros y que están
presentes en el exoesqueleto de los artrópodos (Hegedus & Khachatourians, 1995;
Khachatourians, 1996; Pucheta et al., 2006). Al entrar en contacto con el
tegumento, las esporas deben encontrar el sustrato nutricional (Carbono,
Nitrógeno y otros elementos) y las condiciones ambientales de alta humedad,
temperatura y luz necesarias para su germinación; la cubierta mucigilanosa de las
esporas posee propiedades antidesecantes que las ayudan a conservar su
hidratación; con esto, las esporas lograrán hincharse (Hegedus & Khachatourians,
1995; Khachatourians, 1996; Pucheta et al., 2006). Una vez que ocurre el
hinchamiento, se forma un tubo germinativo o haustorio (Fig. 4) y un apresorio
(Fig.4), mediante el crecimiento apical de la pared celular, el cual es estimulado
por un flujo iónico (Ca++ y H+) (Riquelme, Reynaga, Gires & Bartnicki, 1998;
Harold, 1999; Wessels, 1999; Pucheta et al., 2006). El tubo germinativo permite
reconocer los receptores a nivel del tegumento donde se fijará la hifa, y con el
apresorio (hifa de penetración) el hongo logra anclarse a la cutícula del
hospedador, y posteriormente penetrar hacia el celoma del artrópodo (Wessels,
1999; Hajek & Eastburn, 2003; Pucheta et al., 2006). Ahora, el hongo logra
penetrar mediante mecanismos físicos producto de la presión mecánica del
apresorio, y químicos, mediante la excresión de enzimas hidrolíticas, incluyendo,
entre otras, proteasas, lipasas, quitinasas, quitobiasas, lipooxigenasas, las cuales
logran degradar la cutícula del hospedador, apreciándose síntomas de histólisis, y
adicionalmente le ayudan a la penetración mecánica y proporciona nutrientes al
hongo (St Leger, 1995; St. Leger, Joshi, Bidochka, Rizzo & Roberts, 1996;
Monzón, 2001; Pucheta et al., 2006). Al estar la cutícula compuesta en hasta un
70% de proteínas, las proteasas juegan un papel fundamental en el proceso de
hidrólisis cuticular (St Leger, 1995; St. Leger et al., 1996).
24
Figura 4. Conidias, tubo germinativo y apresorio de un hongo entomopatógeno.
Fuente: [http://www2.scielo.org.ve/img/fbpe/inci/v31n12/art06img02.gif]
Una vez que el hongo logra penetrar, la hifa se ensancha y se ramifica
formando cuerpos hifales secundarios (blastosporos), invadiendo todas las capas
cuticulares, y luego se expande hacia los órganos internos del insecto (e.g.,
túbulos de Malpighi, cuerpos grasos) y todo el hemocele, produciendo cambios
patológicos como convulsiones, carencia de coordinación y comportamientos
alterados, logrando su colonización total después de la muerte del artrópodo
(Tanada & Kaya 1993; Pucheta et al., 2006); el deceso del insecto se produce por
los cambios pato1ógicos en el hemocele, acción histolítica, el bloqueo mecánico
del aparato digestivo, secundario al crecimiento de las hifas, y por la producción
de metabolitos secundarios denominados micotoxinas, las cuales aunque son de
baja toxicidad para los vertebrados, para los insectos son altamente tóxicas,
teniendo por lo tanto una vital importancia en el ciclo de la relación hospedadorhifomiceto, al causarles desde la degeneración de tejidos producto de la pérdida de
la integridad estructural de las membranas, seguido de la deshidratación de las
células por pérdida de fluidos (Gillespie & Claydon, 1989; Tanada & Kaya 1993;
Pucheta et al., 2006); existen, desde el punto de vista químico, varios tipos de
metabolitos secundarios (microtoxinas) involucrados en la acción patogénica de
los hongos; en este sentido, primeramente tenemos varias clases de ácidos
25
orgánicos (e.g., ácido oxálico, ácido dipicolínico) (Claydon & Grove, 1982;
Hegedus & Khachatourians, 1995; Asaff, García-Rojas, Viniegra-González, de la
Torre, 2006); otra familia de compuestos bioquímicos, es el grupo de las toxinas
peptídicas cíclicas y lineales, siendo los disipéptidos una de las mejor estudiadas
(Pucheta et al., 2006); el primer compuesto de disipéptidos aislado fue
beauvericina, a partir de B. bassiana, la cual actúa sinergícamente con otros
compuestos (Billich & Zocher, 1988; Pucheta et al., 2006). Los metabolitos
secundarios de naturaleza peptídica mejor estudiados, son las destruxinas, que se
han aislados a partir de M. anisopliae, y que actúan a nivel de la síntesis de ADN,
ARN y de proteínas de los hospedadores- artrópodos (Quiot, Vey & Vago, 1985;
Gillespie & Claydon, 1989; Monzón, 2001; Pucheta et al., 2006).
Posteriormente de la invasión miceliar interna general, si la disponibilidad de
agua es alta y la temperatura adecuada, la fase reproductiva del hongo se da en
dos etapas: miceliación y esporulación, entonces emerge fuera del insecto
atravesando la cutícula, especialmente por las áreas más débiles, espiráculos,
regiones intersegmentales, esporulando sobre la superficie de la momia del
hospedador, y logrando producir suficiente inóculo para infectar a otros insectos;
por el contrario, si las condiciones son secas, el proceso reproductivo fúngico se
detiene, y sólo se observan los insectos momificados y no cubierto por una capa
algonodosa (miceliación) o por una especie de polvillo blanco, verde o lila
(esporulación) (Gillespie & Claydon, 1989; Tanada & Kaya 1993; Goettel &
Inglis, 1997; Pucheta et al., 2006). Es significativo señalar, como bien lo indican
Pucheta et al. (2006), que durante la invasión miceliar dentro del hemocele,
además de nutrientes, el hongo también se encuentra expuesto a la acción de la
respuesta inmune celular de los hemocitos y/o de compuestos bioquímicos de la
humoral del artrópodo-hospedador, tales como la fagocitosis, melanización y la
encapsulación, para la cual el hongo también ha desarrollado mecanismos de
defensa y evasión, pero si el artrópodo se encuentra en un estado de
inmunodeficiencia, ya sea por efectos biótico y/o abióticos, entonces la acción de
los hongos es más rápido (Tanada & Kaya 1993; Hayek & St Leger, 1994;
Hegedus & Khachatourians, 1995; Rendón & Balcázar, 2003).
26
Siendo los mecanismos patogénicos de los hongos entomopatógenos un
proceso complejo, que aún le falta mucho por dilucidarse, es necesario por lo
tanto aumentar la investigación en estos aspectos. Con esto se puede indagar, en
primer lugar, las cepas y aislados de los entomopatógenos que posean las
características específicas para un artrópodo en particular o situaciones del
trópico, especialmente del ambiente venezolano. Así mismo, comprender estos
mecanismos, permitirá obtener y seleccionar los patotipos que produzcan mayor
cantidad de esporas y metabolitos secundarios (micotoxinas) más virulentos, e
inclusive manipularlos genéticamente, para ser empleados en futuros programas
de MIP, especialmente en control de TRIATOMINAE. También, cabe la
posibilidad de aislar los metabolitos secundarios o micotoxinas altamente
entomotóxicas especie-específico, y sintetizarlas artificialmente, en un intento por
lograr su comercialización.
Uno de los grandes retos que debe proponerse la comunidad científica
internacional y particularmente la nacional, especialmente en estos momentos en
que la temática del calentamiento global se encuentra sobre el tapete y sus
consecuencias catastróficas predicitivas son apocalípticas, es en lo relacionado de
convencer, o de sensibilizarlas, a las autoridades sanitarias encargadas del
Programa de Control de Vectores acerca de al menos disminuir el uso de las
cantidades de insecticidas químicos, y que se implementen concomitantemente
otras alternativas, todo dentro de un amplio programa de manejo integrado con
visión ecologistas; esto por supuesto incluye el empleo de control macro y
microbiano de vectores.
27
CAPITULO IV
ESTUDIOS SOBRE EL USO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
NATIVOS COMO BIOPESTICIDAS CONTRA TRIATOMINAE EN
VENEZUELA.
Generalidades
En Venezuela, los bioinsecticidas autóctonos con hongos hifomicetos se han
implementado con un rotundo éxito en el control biorracional como parte de un
Manejo
Integrado
de
Plagas
(MIP)
de
interés
agrícola,
siendo
su
comercialización un hecho tangible con patentes de un aceptable nivel
eficiencia/costo
(Zambrano, García, Zambrano, Linares
& Molina, 1992;
Fernández & Colmenares, 1997; Alcalá de Marcano, Marcano & Morales, 1999;
Pavone, 2003; Montilla, Camacho, Quintero & Cardozo, 2006; Linares & Salazar,
2008). Sin embargo, su utilización y aplicación para el manejo de poblaciones de
insectos de interés médico-sanitario ha sido prácticamente de poca importancia o
de limitada implementación (e.g., Scorza-Dágert & Cova, 2006; Cova & ScorzaDágert, 2006, para el caso de Musca domestica, y Agudelo-Silva & Wassink,
1984 para el de Aedes ageypti).
Es un hecho bien documentado que los hongos hifomicetos exhiben un amplio
rango de variabilidad genética (St Leger, Alee, May, Staples & Roberts, 1992;
Luz et al., 1998b; Couteauddier, Viaud & Neuveglise, 1998), por lo que es
importante identificar la variabilidad biológica, bioquímica, genética y fisiológica
existente entre los distintos aislados y especies, de manera tal que permita
seleccionar los mejores patotipos adaptados a las condiciones del trópico
venezolano, para ser utilizados efectivamente como potenciales micoinsecticidas
contra las especies triatominas selváticas, peridomésticas y/o domésticas de
Venezuela. En esta sección se documentará los estudios, en el sentido más amplio
posible, hechos hasta el presente con cepas y/o aislados autóctonos de hongos
entomopatógenos empleados contra especies de TRIATOMINAE, especialmente
contra los principales vectores (i.e, R. prolixus y/o T. maculata).
Germinación in Vitro
Al ser la germinación de los conidios uno de los primeros eventos para que
ocurra la infección fúngica, y por lo tanto las epizootias, resulta importante y
28
relevante estudiar la influencia de los factores, especialmente a nivel estresante,
incluyendo los ambientales (e.g., temperatura), sobre el proceso germinativo, en
un intento por comprender y clarificar cómo se genera el proceso de infección de
los hongos entompatógenos sobre sus hospedadores invertebrados. Sin embargo,
se debe tener siempre presente que a pesar de que los medios artificiales “In
Vitro” representan una herramienta útil para obtener información sobre la
influencia de los factores ambientales en el proceso germinativo de los conidios,
hay diferencias con las condiciones naturales existentes en la cutícula de los
insectos, así como también la complejidad de la interacción de esta estructura con
los conidios (Luz y Fargues, 1997; Lecuona et al., 2001).
De acuerdo a la bibliografía consultada, el único trabajo hecho en Venezuela
sobre el proceso germinativo en hifomicetos autóctonos ensayados o que hayan
mostrado patogenicidad sobre especies de triatominos, especialmente los
principales vectores, se debe a Cazorla, Morales & Acosta (2007). Estos
investigadores realizaron ensayos “In Vitro” sobre medio sólido (agar-Lactrimel)
acerca de la influencia de gradientes térmicos (6- 40ºC), salinos (4 – 70%
concentración salina [NaCl]) y pH (1,32 - 12) sobre la capacidad de germinación
de un aislado autóctono o nativo (LF 14) de B. bassiana, proveniente del Estado
Trujillo, en la región andino-venezolana, el cual ha demostrado en ensayos
previos ser altamente virulento contra R. prolixus y T. maculata (Cazorla et al.,
2005a), principales vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela. Los
bioensayos revelaron que las conidias del aislado LF14, con excepción de las
temperaturas extremas de 6 y 40 ºC, son capaces del germinar en el rango térmico
12-35ºC, incrementándose significativamente los porcentajes de germinación
desde los 12-15 ºC hasta 19-34ºC, y alcanzándose % >99 en el rango 21-34ºC.
Hallazgos similares a los de este estudio observaron Luz & Fargues (1997) en
Francia, con el aislado INRA 297 del hifomiceto, igualmente patogénico para R.
prolixus, al obtener elevados porcentajes de germinación (>95%) “In Vitro en el
rango térmico entre 20-35°C. Por contraste, Lecuona et al. (2001) reportaron tan
sólo 3% de germinación para la cepa argentina Bb10 de B. bassiana, patógena
para T. infestans, expuesta a 34°C. Estas diferencias de respuestas detectadas
pudieran estar relacionadas con la variabilidad genética entre las cepas; por lo que
29
urge la necesidad de caracterizar las cepas molecularmente (e.g., patrones de
ADN) y relacionarlos con los patrones de germinación.
Cuando se hace el análisis de la influencia de los gradientes salinos (NaCl),
Cazorla et al. (2007) observaron que las conidias disminuían significativamente
los porcentajes de germinación con el incremento de la [NaCl], inhibiéndose
totalmente el proceso germinativo a partir de la [NaCl] del 7%. Es bien conocido
que la Humedad Relativa (HR) y la disponibilidad de agua son factores
ambientales críticos para que ocurra la germinación en los hongos hifomicetos
(Goettel & Inglis, 1997), por lo que un aumento en la concentración salina puede
conllevar primeramente a una disminución de la actividad acuosa, probablemente
por un efecto osmótico, o pudiera tener un efecto tóxico (Lerner, 1985; Vacher,
Dizes, Espínola & Castillo, 1994). A pesar de esto, los conidios del aislado LF14
lograron germinar en % >95 en [NaCl] del 5%, la cual es si se quiere elevada. En
virtud de la influencia de la temperatura y la HR sobre la germinación de los
conidios, los futuros diseños de MIP en el caso particular para el control de las
poblaciones de triatominos, deben tener presente las condiciones microclimáticas
que prevalecen en los refugios (palmeras, grietas de paredes, etc.) de los
triatominos-vectores. En este sentido, Heder, Guerin & Eugster (2006) refieren
que, en una región endémica del estado Portuguesa, al occidente de los llanos de
Venezuela, las poblaciones de R. prolixus en ayuno prolongado prefieren
refugiarse en aquellos sitios de las palmeras, grietas de las paredes y techos de
palma donde las temperaturas son más bajas y la HR más elevada, como un
intento de los insectos por regular su balance hídrico y energético, cuya única
fuente alimentaria y de agua proviene de la sangre de los vertebrados.
Teng (1962) ha señalado que algunas cepas de B. bassiana no logran germinar
a pH 10, sin embargo, Cazorla et al. (2007) encontraron que el aislado nativo
LF14 de este hifomiceto alcanza un amplio rango de tolerancia (germinación
>99%) hacia rangos de pH extremos (ácidos: 3-4 y básicos: 10), lo cual es
significatvo, toda vez que los cambios de pH extremos pueden alterar
significativamente las funciones biológicas, como por ejemplo, los enlaces de
hidrógeno de las enzimas, bicapa lipídica y el ADN (Hallsworth & Magan, 1996).
Es significativo comentar que el pH puede regular la expresión de los genes
30
involucrados en la secreción de las proteasas de M. anisopliae, que degradan la
cutícula de los insectos, además de otros factores de virulencia, proceso de
relevancia para el éxito de un hongo entomopatógeno durante la invasión y
colonización de sus hospedadores artrópodos (St. Leger, Joshi & Roberts, 1998;
St. Leger, Nelson & Screen, 1999).
A pesar de esta tolerancia mostrada por los hongos entomopatógenos hacia
factores estresantes medio ambientales, no obstante no se conoce bien el
mecanismo de esta resistencia. Sin embargo, se sabe por ejemplo que la
acumulación de solutos compatibles osmóticamente (e.g., manitol, trehalosa,
glicerol) en las vacuolas de B. bassiana, y de otros dos hifomicetos
entomopatógenos: M. anisopliae y P. farinosus, ayudan a las membranas y
proteínas de éstos a protegerse de los factores ambientales estresantes (Hallsworth
& Magan, 1996). En virtud de esto comentado, en futuros trabajos los ensayos se
deben enfocar en tratar el incrementar aún más la resistencia y tolerancia, así
como también acelerar la germinación, de los conidios del aislado LF14 de B.
bassiana hacia los factores estresantes del medio ambiente mediante la adición al
medio de cultivo de polioles y/o trehalosa, las cuales son sustancias de ajuste
osmótico. En este sentido, Halworth y Magan (1996), al manipular las
concentraciones de glicerol y eritritol en conidios.de B. bassiana y M. anisopliae,
pudieron incrementar la capacidad de las mismas para germinar bajo condiciones
de muy escasa actividad acuosa.
Por su amplia tolerancia y resistencia hacia factores ambientales estresantes, el
aislado nativo LF14 de B. bassiana aparece como un potencial patotipo para ser
implementado en futuros programas de MIP contra TRIATOMINAE. No obstante,
aún se deben realizar otra serie de estudios con otras variables físicas y/o
biológicas. En este sentido, por sólo nombrar algunas relevantes, es necesario
observar el efecto inhibitorio o sinérgico, entre los conidios y los diferentes
insecticidas de origen químico empleados actualmente en Venezuela para el
control de las poblaciones triatominas, así como el efecto de los rayos
ultravioletas y la composición selectiva de los medios de cultivo.
Esporulación “In Vitro” e “In Vivo”.
31
Además de la intensidad y capacidad de infectividad de un hifomiceto, la
intensidad y cuantificación de la producción de conidias cadavéricas (i.e.,
esporulación o conidiación), y su subsiguiente capacidad para dispersarse dentro
de la población de insectos sanos, son factores relevantes que deben tomarse en
cuenta para la implementación de un programa biorracional-integral con hongos
entomopatógenos, así como también debe estimarse cuál es la producción de la
esporulación “in Vitro” en medios artificiales selectivos (Thomas et al., 1995; Luz
& Fargues, 1998; Sun et al., 2002). Esto señalado es particularmente relevante en
el caso de los vectores de la enfermedad de Chagas con hábitos peridomésticos y
selváticos, tal como ocurre con T. maculata y P. geniculatus, ya que los
insecticidas de origen químico son imprácticos para su control, pudiendo por lo
tanto adquirir éstos potencialmente hábitos domésticos (Harry et al., 1992; Luz &
Fargues, 1998; Luz et al., 1998b; 2004). De aquí que bajo condiciones ambientales
favorables, el control microbiano de los hospedadores-artrópodos depende de la
dispersión y abundancia de la esporulación fúngica de los cadáveres momificados
para expandirse en el seno de la población sana de hospedadores (Luz & Fargues,
1998). Es bien conocido que las condiciones ambientales (e.g., HR) influyen
notablemente sobre la esporulación de los cadáveres de los insectos, sin embargo
son pocos los trabajos hechos en triatominos.
Como bien lo señalan Luz & Fargues (1998), las condiciones microclimáticas,
que muchas veces se rige por una curva bimodal pluviométrica, en los hábitats
selvático, peridoméstico y doméstico de los triatominos en el medio
latinoamericano y particularmente el venezolano, habla a favor de considerar la
época de lluvia como la mejor para los hongos entomopatógenos, cuando la HR es
elevada. Esto último expresado encuentra apoyo en los trabajos de Cazorla et al.
(2005b), quienes determinaron la capacidad del aislado nativo LF14 de B.
bassiana para producir conidias a partir de cadáveres de ninfas de V estadio de R.
prolixus y T. maculata, previamente expuestos a un inóculo de 1x107
conidios/mL, y mantenidos a 26ºC y regímenes variables de alta (>90%) y baja
(50-55%) HR. La obtención de conidias de B. bassiana/ml de agua destilada, a
partir de cadáveres de R. prolixus y T. maculata fue significativamente mayor a
90% de HR, que los de T. maculata expuestos a baja HR de 50-55% (Cuadro 1).
32
Cuadro I
Comparación de la capacidad de esporulación de ninfas V de Rhodnius
prolixus y Triatoma maculata.
ESPORULACIÓN (Conidias/cadáver)
++
GRUPO DE NINFAS V
±
D.S.
a
Triatoma maculata/ HR: >90%
808.917 ± 649.841
Triatoma maculata/ HR: 55%
215.413 b ± 197.537
Rhodnius prolixus/ HR: >90%
1.752.305 c ± 2.119.406
++
En el análisis de comparación múltiple cuando dos medias posean letras iguales sus
diferencias resultaron estadísticamente no significativas (p>0,05)
Fuente: [Cazorla et al. (2005b)]
Los ensayos de otros investigadores de otros países coinciden con
estos
resultados, al requerir los cadáveres de los triatominos elevados niveles de HR
para su elevada esporulación (Gerson et al., 1979; Ramoska, 1984; Luz
&
Fargues, 1998).
Basados en estos resultados, aunque muy preliminares, desde un punto de vista
pragmático, se sugiere que las aplicaciones fúngicas en los futuros Programas de
Control de vectores de la enfermedad de Chagas, deben realizarse durante las
épocas de invierno cuando la atmósfera de los sitios o hábitats de los triatominos
se encuentre saturada, ya que la HR pareciera ser crucial para que el aislado LF 14
pueda reciclarse.
En relación con los bioensayos de esporulación “In Vitro” con cepas nativas
que han demostrado su infectividad hacia los vectores de T. cruzi en Venezuela,
de acuerdo a lo que se ha indagado, sólo existe el realizado por Cazorla, Morales
& Acosta (2006), quienes trabajaron similarmente con el aislado nativo LF14
sobre medio artificial sólido agar-Lactrimel, en un intento por determinar su
capacidad de esporulación a estreses de pH (2-12) y salinos ([NaCl]: 1-50%). Los
autores observaron que aunque este aislado obtuvo su mayor biomasa entre los pH
4 y 6,8 es capaz de esporular en todos los pH ácidos y básicos expuestos, lo que
contrasta con los resultados de otros investigadores. En efecto, según Rojas
(2004) a B. bassiana se le clasifica, de acuerdo a su tolerancia hacia gradientes de
pH, como un hongo alcalófilo, i.e, que sólo se desarrolla a pH 9-10. Por su parte,
Halworth y Magan (1996) indican que B. bassiana crece mejor en un rango de pH
entre 5 y 8, mientras que Teng (1962) refiere que el pH 6 es más efectivo para la
33
esporulación de este hifoomiceto. Una característica relevante que poseen los
hongos entomopatógenos es que, a diferencia de otras especies fúngicas, pueden
regular su pH citosólico con mayor eficacia, lo cual es muy importante cuando se
requiere la producción industrial de sus formulaciones, toda vez que se inhiben
otros organismos contaminantes (e.g., bacterias) sin afectar su propio medio,
además que les puede permitir soportar mejor los “shock osmóticos” en medios de
baja disponibilidad de agua, al poder acumular polioles citosólicos en sus
membranas (Halworth y Magan, 1996).
Cuando se hace el análisis de la producción de conidias del aislado LF14 ante el
estrés salino, se observó que decrece significativamente con el incremento de la
[NaCl], inhibiéndose completamente la conidiación a 15% de [NaCl] del medio,
donde el hifomiceto no soporta los estreses hídricos, osmóticos y los efectos
tóxicos (Lerner, 1985; Halworth y Magan, 1996). Si se comparan estos resultados
con los obtenidos por otros investigadores con otras especies de hifomicetos,
pareciera haber un proceso especie-dependiente hacia la tolerancia del estrés
salino-osmótico. En efecto, Mert & Dizbay (1977) reportaron que P. lilacinum no
logró esporular “In Vitro” a una [NaCl] del 5%, mientras por el contrario
Aspergillus níger desarrolló satisfactoriamente su conidiciación
a esta
concentración salina. Por su parte, Mert & Ekmekçi (1987) encontraron que la
salinidad posee un efecto inhibitorio sobre la producción de conidias de A. flavus
y estimulante para Penicilium chrysogenum.
Sun, Fuxa & Herderson (2002) trabajando con aislados de M. anisopliae y B.
bassiana patogénicos para termites (Orden Isóptera) del género Coptotermes,
encontraron una correlación altamente positiva entre la producción de conidias
“In Vivo” e “In Vitro”, concluyendo que esto permite realizar ensayos
preliminares “In Vitro”, que son más rápidos, con una gran cantidad de aislados
para proyectar cuáles serán aquellos con la más alta esporulación “In Vivo”. Por lo
que a juzgar por la elevada biomasa obtenida “In Vitro” (hasta 89,7 x 106
conidias/mL) e “In Vivo” (Cuadro 1), y su alta resistencia hacia condiciones
ambientales estresantes, se ratifica lo expresado con los bioensayos de
germinación, de la buena potencialidad que posee el aislado LF14 como
micropesticida en un programa de control vectorial contra TRIATOMINAE en
34
Venezuela. Sin embargo, su formulación definitiva hacia el medio ambiente,
requerirá realizar otra serie de bioensayos, con otras variables bióticas y abióticas.
Así mismo, lo cual es muy importante, se debe evaluar su inocuidad para el
modelo vertebrado (e.g., animales de laboratorio), a pesar de que generalmente los
hongos entomopatógenos son adecuadamente bioseguros. Sin embargo, en
algunos casos, especialmente en individuos inmunosuprimidos, B. bassiana se ha
encontrado involucrada en procesos patológicos, como por ejemplo en los de tipo
alérgico (Westwood, Huang & Keyhani, 2006) u otros de tipo degenerativos del
sistema nervioso central (Schmidt, Schubert, Huang, Stoyanova & Hamburger,
2003).
Ensayos de patogenicidad y virulencia de B. bassiana contra vectores de la
enfermedad de Chagas en Venezuela
Hasta donde se ha podido indagar, los primeros trabajos documentados acerca
de la implementación de hongos hifomicetos nativos contra TRIATOMINAE de
Venezuela fueron hechos por Zambrano, Sepúlveda & De Sepúlveda (1991) y
Guédez, Oviedo & Márquez (1995) al aplicar formulaciones de B. bassiana y B.
brongniiartii sobre R. prolixus, respectivamente. Estos fueron resultados
preliminares presentados a manera de Resúmenes en los Congresos Venezolanos
de Entomología, por lo que la obtención de mayores detalles es limitado.
Similarmente se da lo expresado en el más reciente trabajo sobre el tópico, el de
Cazorla et al. (2005a), quienes estimaron la patogenicidad de B. bassiana (LF14)
contra R. prolixus y T. maculata.
Cazorla (2006) realiza una serie de ensayos, si se quiere más amplios y
detallados, acerca de la evaluación de la patogenicidad y virulencia del aislado
nativo (LF14) de B. bassiana hacia R. prolixus y T. maculata, incluyendo
variables físicas (temperatura, HR) y biológicas (inóculo, estadio de desarrollo).
A pesar de que todos los estadios de desarrollo de los artrópodos- plagas son
susceptibles a la acción de los hongos entomopatógenos, existen reportes que
indican una susceptibilidad diferencial entre los estadios imaginales y
preimaginales para la infección fúngica (Romaña & Fargues, 1992); por lo que en
el primero de estos ensayos, Cazorla (2006) evalúa el efecto diferencial de la
virulencia de este aislado nativo sobre todos los estadios de desarrollo de R.
prolixus y T. maculata, incluyendo ninfas y adultos, y variando la cantidad del
35
inóculo (1 x 105, 3 x 105, 1 x 106, 3 x 106, 1 x 107 y 3 x 107 conidias/ml) para
observar la virulencia del hifomiceto, bajo condiciones de 26 °C y >90% HR. Los
análisis de supervivencia mostraron, de una manera general, que los estadios
ninfales I y II, tanto de R. prolixus como de T. maculata, son menos susceptibles
que los estadios III, IV, V y los adultos a la acción del aislado LF14 de B.
bassiana. Las ninfas I y las de II estadio jamás alcanzaron porcentajes de
mortalidad del 100%, aún a la concentración de conidias de 3 x 107 en el caso de
R. prolixus. Por lo tanto, la susceptibilidad de R. prolixus y T. maculata se
incrementa con la edad. A pesar de esto, se puede afirmar que el aislado LF14 de
B. bassiana causó una alta mortalidad, especialmente hacia los estadios de mayor
edad y a mayores inóculos, presentando así mismo conidiación visible en la
mayoría de los cadáveres. Los resultados de Cazorla (2006) son similares a los
que encontraron Romaña & Fargues (1992), quienes al infectar con la cepa INRA
297 a varios estadios de desarrollo de R. prolixus detectaron que el estadio ninfal
I es 700 veces menos susceptible que las ninfas V y los adultos. Contrastando con
estos resultados, Zambrano et al. (1991) encuentran que los estadios II y III de R.
prolixus son más susceptibles a la cepa 1389 de B. bassiana, cuando se inocularon
todos los estadios ninfales con 3x106 conidias/ml. Por lo tanto, debe decirse, tal
como lo sostienen Romaña & Fargues (1992), que la susceptibilidad de los
estadios larvales depende de la especie del hospedador y del aislado fúngico. Esto
expresado también se observa en otras especies de insectos. En este sentido, por
ejemplo Fargues (1972) encontró que en el coleóptero Leptinotarsa decemlineata
la susceptibilidad hacia B. bassiana decreció con la edad. Mientras que por el
contrario, las larvas más viejas de Melolontha melolontha, otra especie de
escarabajo, fueron más susceptibles hacia B. brongniartii (Ferrón, 1967). Como
bien lo señalan Romaña & Fargues (1992), la susceptibilidad hacia el estadio de
adulto se encuentra poco estudiado. Así, adultos del escarabajo L. decemlineata,
no fueron susceptibles hacia los aislados de Beauveria patogénicos para sus larvas
(Bajan & Kmitowa, 1969). Por contraste, los adultos de los coleópteros
Acanthoscelides obtectus o Oryctes rhinoceros fueron altamente susceptibles a B.
brongniartii y M. anisopliae (Ferrón & Robert, 1975; Ferrón, P., Robert, P. &
Deotte, 1975).
36
A pesar de que es bien conocido que los hongos dependen de la HR para poder
desarrollarse (Luz et al., 1998b), los ensayos del aislado LF14 sobre R. prolixus a
baja HR del 55% demostró que éste puede causar altos porcentajes de mortalidad,
de hasta el 100%. En lo que respecta a la influencia de la temperatura sobre la
susceptibilidad de los estadios de R. prolixus, se encontró un rango óptimo de la
acción del aislado LF14 entre 15 y 30 °C (% de mortalidad >90), lo cual coincide
con los resultados de germinación óptimos encontrados para este aislado por
Cazorla et al. (2007).
Debido al hecho de que la infección de los insectos depende de la temperatura y
la HR, estos ensayos fueron hechos bajo condiciones favorables de temperatura
(26°C) y HR (>90%) y a rangos extremos de temperatura y baja HR (55%). Por lo
tanto, podemos concluir que el aislado LF14 de B. bassiana es altamente patógeno
para R. prolixus y T. maculata.
Otro hecho a resaltar es que se observó, de una manera general en todos lo
estadios de R. prolixus, un efecto Dosis-dependiente, al tenerse mayores
porcentajes de mortalidad con el aumento de la concentración de conidias, o que
la supervivencia disminuye con el aumento de este parámetro. Este efecto, de que
la respuesta de mortalidad depende de la dosis del inóculo, es bien conocido en la
literatura del área (Ferrón, 1978; Hall & Papierock, 1982), y particularmente en
los triatominos (Luz et al., 1998b; Lecuona et al., 2001; Vásquez, Saldarriaga &
Chaverra, 2005). Sin embargo, resulta interesante discutir el caso observado por
Pineda, Saldarriaga & Gómez (2002) en ninfas de V estadio de R. ecuadoriensis
expuestos a B. bassiana a similares condiciones de HR y temperatura, al detectar
porcentajes de mortalidad del 100% en todos los inóculos ensayados. Como bien
lo señalan Vázquez et al. (2005), esto demuestra que especies muy relacionadas
de hospedadores pueden dar respuestas diferentes a la misma cepa del hongo.
Las diferencias mostradas en la respuesta diferencial de patogenicidad hacia los
diferentes estadios de R. prolixus y T. maculata, nos lleva a porponer al aislado
LF14 como un buen candidato para el control microbiano de estos vectores en
ambientes en los cuales se favorezca la infección micótica. Estos último
expresado es particularmente importante para el caso de una especie
peridoméstica como T. maculata, ya que el ambiente peridoméstico es uno de los
37
puntos críticos en el control de vectores de la enfermedad de Chagas (Romaña &
Fargues, 1992; Luz et al., 2004). Este comentario se refuerza por el hallazgo de
que se observó que una alta proporción de los insectos presentaron el hongo
después de morir, demostrándose su deceso por la acción del hifomiceto, por lo
que estos cadáveres constituyen una fuente potencial de infección para otros
insectos que habitan tanto en el domicilio como el peridomicilio, factor relevante
para el control natural a nivel de campo (Luz et al., 2004; Vásquez et al., 2005).
Esto último discutido es importante recalcarlo, ya que la mayoría de los
programas de control de triatominos se basan en el control químico de vectorestriatominos a nivel del domicilio. Sin embargo, los focos silvestres permiten las
reinfestaciones domiciliares, lo cual podría contrarrestarse mediante el uso de
hongos entomopatógenos, tales como Beauveria, aunque siempre enmarcado
dentro de un programa de MIP.
Aspectos histopatológicos y ultraestructurales sobre la relación B. bassianaR.prolixus/T. maculata.
A pesar de que existen varios trabajos que demuestran la patogenicidad y
virulencia de varios aislados y cepas de hongos hifomicetos (e.g., Metarhizium,
Beauveria) sobre las especies triatominas (Mora Costa, 1978; Sherlock & Guitton,
1982; Silva & Messias, 1986; Messias, Daoust & Roberts, 1986; Romaña,
Fargues & Pays, 1987; Luz & Fargues, 1997; 1998; Luz, Silva, Cordeiro &
Tigano, 1998a; 1999; Fargues & Luz, 2000; Lara da Costa , Lage de Moraes &
Galvão, 2003), es poco lo que se sabe acerca de los mecanismos de patogenicidad
envueltos de los hongos hifomicetos sobre los triatominos; mecanismos que por lo
demás, se han estudiado en otras especies de insectos (Maramorosch & Shope,
1975; Iwanaga & Lee, 2005). De acuerdo a la bibliografía consultada, los
primeros, y aparentemente los únicos, trabajos sobre este tópico corresponden a
Cazorla et al. (2005b, c) y Cazorla (2006), quienes implementaron mediante
técnicas convencionales histológicas y de tinción (e.g., hematoxilina-eosina) y de
Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) los estudios histopatológicos y
ultraestructurales de la acción del aislado LF14 de B. bassiana sobre R. prolixus
y T. maculata; con esto, se pretendió en primera instancia verificar que la causa de
la muerte de los insectos se debía al hifomiceto, tal como se hizo en ensayos
previos (Cazorla et al., 2005a; Cazorla, 2006). Así mismo, en estos trabajos se
38
detalló los eventos (adhesión, germinación, penetración, colonización y
conidiación) y daños que ocasiona el hongo a los triatominos. Con la comprensión
de los mecanismos de patogenicidad, se podrá contribuir en futuros bioensayos
para seleccionar los mejores patotipos de los hifomicetos adaptados a las
condiciones de nuestro trópico.
Haciéndose el análisis de las fotomicrografías por microscopía fotónica del
trabajo de Cazorla et al. (2005b, c) y Cazorla (2006), se revela la adhesión de
numerosas conidias al tegumento de los triatominos, tal como se evidencia en la
Figura 5, aunque sin tener un sitio específico para este evento.
Figura 5. Adhesión, germinación e invasión de conidias de B. bassiana sobre
tegumento de R. prolixus y T. maculata.
Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006]
Tal como lo mencionan Hegedus & Khachatourians (1995), la cutícula es una
de las principales barreras de defensa que poseen los insectos contra agentes
externos, sin embargo es poco lo que se sabe acerca de cómo los insectos
reconocen al hongo como algo extraño (Hayek & St. Leger, 1994). Resultados
similares a éstos han obtenido otros investigadores en otras especies de insectos
(Vey & Fargues, 1977; Bittencourt, Masca-Renhas & Faccini, 1999; García,
Monteiro & Szabó, 2004). En la misma Fig. 5, se evidencia la germinación de las
conidias sobre la superficie de la cutícula del insecto, proceso que dura entre las
12 y 18 horas después de la infección. Por su parte, la penetración via tegumento
ocurre entre las 18 y 48 horas después de la infección (Fig.5). La penetración del
hongo por el tegumento es un hallazgo particularmente promisorio, ya que los
insectos hematófagos como los triatominos, dejan su aparato bucal fijo a la
39
superficie de sus hospedadores vertebrados, por lo que la vía oral no es viable
para la penetración. Por lo tanto, una germinación y penetración rápida por la
cutícula de los insectos son dos características importantes para la virulencia de
los aislados (García et al., 2004). A pesar de que la epicutícula tiene varias capas,
las mismas son proclives a la acción de las enzimas de los hongos (Hayek & St.
Leger, 1994). Además se debe acotar que existen otros factores, como la
humedad, la inhabilidad para utilizar los nutrientes disponibles, o la ausencia de
otro factor necesario para el reconocimiento en la superficie durante la adhesión,
así como también la presencia de otros que son inhnibitorios del proceso (e.g.,
fenoles, quinonas, lípidos) (Hayek & St. Leger, 1994).
La colonización del hemocele ocurrió de una manera masiva (Fig. 6), dándose
Figura 6. Invasión micelial de B. bassiana en hemocele y tegumento de R.
prolixus.
Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006]
la esporulación por las aberturas empezando por las coxas y tórax, hasta
finalmente invadir mediante el micelio externamente todo el cadáver, que se torna
blaquecino (Anexo A).
Nótese que las hifas invaden todos los tejidos (músculos, sistema digestivo),
hasta colapsar y fenecer el insecto (Figs.6, 7 y Anexo B). En este sentido, se
detalla la aparición de una región electrontransparente en el sitio donde penetran
las hifas, lo que sugiere una acción exoenzimas degradando los tejidos (Fig. 7).
40
Figura 7. Acción ultraestructural de hifas de B. bassiana sobre tejidos de R.
prolixus.
Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006]
En el Anexo B es particularmente apreciable la acción patogénica de las hifas
sobre los tejidos del insecto, donde se aprecia así mismo, una apertura traqueolar
por donde logran penetrar generalmente las hifas del hifomiceto.
Las barreras de tipo físico, e.g., el exoesqueleto y la membrana peritrófica, son
las primeras líneas de defensa de los insectos, las cuales sin embargo no pueden
evitar la invasión de los microorganismos patógenos (Maramorosch & Shope,
1975; Iwanaga & Lee, 2005), tal como ocurrió en el caso presentado por Cazorla
et al. (2005a, b) del aislado LF14 de B. bassiana contra R. prolixus y T. maculata.
Resulta interesante resaltar y analizar la respuesta inmune celular (RC) del
hemocele de estas especies de TRIATOMINAE, ejercida por los hemocitos, sobre
las esporas del aislado LF14 de este hifomiceto, tal como se observa en las
Figuras 8 y 9. Se aprecia visiblemente cómo los hemocitos, en un intento por
resistir la invasión, fagocitan, encapsulan y melanizan, hasta finalmente fenecer,
las esporas del hongo hifomiceto.
41
Figura 8. Fagocitosis, encapsulación y melanización de esporas de B. bassiana
por hemocitos de R. prolixus.
Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006]
Figura 9. Fagocitosis, encapsulación y melanización de esporas de B. bassiana
por hemocitos de R. prolixus.
Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006]
Como bien lo señalan Leclerc and Reichhart (2004), Waterfield, Wren &
Ffrench-Constant (2004) y Abraham & Jacobs-Lorena (2004), una vez que un
patógeno penetra al hemocele, se encuentra expuesto a la respuesta humoral (RH)
y celular (RC) de los insectos. La de tipo humoral comprende la producción de
péptidos antimicrobianos, incluyendo proteínas antifúngicas (Natori, Shiraishi,
Hori & Kobayashi, 1999), la inducción de la síntesis de lectinas y la activación del
sistema pro- fenoloxidasa; sin embargo, se debe recalcar que la RH no es tan
distinta de la RC, toda vez que la RH modula la RC (Iwanaga & Lee, 2005).
La fagocitosis es una de las primeras líneas de defensa celular del hemocele de
los artrópodos contra cuerpos extraños, la cual es ejercida por lo hemocitos, que
los encapsulan y luego los melanizan formando capas concéntricas de nódulos
(Nappi, 1975; Söderhäll & Cerenius, 1992; Hayek & St. Leger, 1994; Hegedus &
Khachatourians, 1995; Rendón & Balcázar, 2003). Es bien sabido que la
melanización es un mecanismo de defensa de los artrópodos, incluidos los
insectos (Nappi, 1975; Rendon & Balcazar, 2003; Iwanaga & Lee, 2005).La
fenoloxidasa es la enzima responsable de la melanización observada en crustáceos
e insectos, actuando también en la reparación de las heridas y la esclerotización de
la cutícula (Söderhäll & Cerenius, 1992; Iwanaga & Lee, 2005). Esta última es
responsable de la oxidación de fenoles en quinonas, los cuales se polimerizan en
melanina y son altamente tóxicas. La melanina es un pigmento pardo-negro, al
42
cual se le adjudican diversas propiedades biológicas tal como la inhibición de la
actividad de enzimas bacterianas y fúngicas (Smith y Söderhäll, 1983; Iwanaga &
Lee, 2005). Por su parte, la encapsulación es un mecanismo de defensa
multicelular para eliminar sustancias externas que normalmente no pueden ser
eliminadas exclusivamente por lo mecanismos humorales del insecto, aunque se
han aislado proteínas de encapsulación que ayudan al proceso de defensa
(Johanson, Lind, Holmblad, Thörnqist & Söderhäll, 1995; Vázquez et al., 1998;
Iwanaga & Lee, 2005). Estas cápsulas se encuentran fuertemente melanizadas, y
actúan cuando una partícula es demasiado grande para ser fagocitada, muchos
hemocitos cubren a la partícula grande formando capas alrededor de ella
(Söderhäll & Cerenius, 1992). Götz & Vey (1974) revelaron que larvas de
Chironomus inyectadas con esporas de B. bassiana fueron encapsuladas,
atribuyendo este fenómeno a la fenoloxidasa (Nappi, 1975).
A pesar de todo lo comentado, en las cepas hipervirulentas de B. bassiana los
hemocitos de los insectos son incapaces de frenar al crecimiento de los hongos,
como pareciera ser el caso del aislado LF14, no formándose la encapsulación o las
blastosporas germinan libremente fuera de los hemocitos (Hung, Bocias & Vey,
1993; Hayek & St. Leger, 1994).
Evidentemente, aún faltan muchos estudios para la implementación definitiva
de un programa de MIP para el control de los vectores de la enfermedad de
Chagas en Venezuela. Para llegar a aplicar las esporas de hongos
entomopatógenos a nivel de campo, es necesario conocer con mayores detalles los
inconcevientes, desde el punto de vista biológico y de los factores físicoambientales, que deberá afrontar un programa de esta magnitud. Y lo que es
similarmente importante, sensibilizar a la comunidad venezolana, incluyendo a las
autoridades sanitarias y la científica y la comunidad en general, acerca de la
necesidad de implementar el control de vectores desde un punto de vista
ecológico-biorracional.
43
CONCLUSIONES
-
A pesar de que desde los años 60 del siglo XX se ha logrado disminuir las
poblaciones triatominas intradomiciliares y por ende las tasas de infección,
no obstante, éstos se adaptan a las nuevas circunstancias biológicas y
ecológicas, por lo que la enfermedad de Chagas aún representa un
problema de Salud Pública en Venezuela.
-
El rociamiento intradomiciliar con insecticidas de origen químico aún
representa la medida profiláctica más práctica y efectiva para evitar la
transmisión del Trypanosoma cruzi.
-
A pesar de su efectividad a nivel intradomiciliar, los insecticidas de origen
químico son imprácticos, inviables ecológicamente e inefectivos contra las
poblaciones de especies triatominas de hábitos peridomésticos y
selváticos.
-
El uso indiscriminado de los insecticidas de origen químico, pueden
potencialmente conducir a problemas de toxicidad aguda y crónica para la
salud humana y sus animales, además de toda la vida del planeta tierra.
-
Así mismo, el uso indiscriminado y/o su inadecuada implementación de
los insecticidas de origen químico podría generar problemas de resistencia
en las poblaciones triatominas.
-
El control microbiano con hongos hifomicetos de las poblaciones de
vectores del Mal de Chagas representa una alternativa ecológicamente
viable.
-
Los estudios acerca del uso de hongos hifomicetos para el control de
vectores de enfermedades metaxénicas, incluyendo a los triatominos, son
escasos en Venezuela.
-
Se debe profundizar los estudios sobre el mecanismo de acción de los
hongos entomopatógenos, especialmente en la búsqueda de metabolitos
secundarios (micotoxinas) potencialmente utilizables en programas de
control de plagas.
-
El aislado nativo LF14 de Beauveria bassiana ha demostrado ser
patogénico y altamente virulento hacia poblaciones de Rhodnius prolixus y
44
Triatoma maculata, principales vectores de la enfermedad de Chagas en
Venezuela.
-
Los estadios más longevos de R. prolixus y T. maculata son más
susceptibles a la acción patogénica del aislado nativo LF14.
-
El aislado nativo LF14 de B. bassiana es capaz de germinar y esporular
“In Vitro” e “In vivo”, bajo condiciones extremas de variables
ambientales.
-
Los estudios histopatológicos y ultraestructurales de la relación íntima
entre B. bassiana (LF14) y sus hospedadores triatominos confirman que
las conidias del hifomiceto invanden a éstos por el tegumento. Además, se
evidenció la importancia de los hemocitos en la inmunidad del hemocele
de los triatominos frente a las esporas de B. bassiana, y se sugiere la
acción exo-enzimática de sus hifas.
45
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66
ANEXOS
67
ANEXO A
Cadáveres esporulados de R. prolixus por efecto de
B. bassiana
Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006]
68
ANEXO B
Acción ultraestructural de hifas de B. bassiana sobre tejidos de R. prolixus.
Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006]
69