fas586a - Tesis Electrónicas UACh

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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Ingenieria en Alimentos
Acción antimicrobiana de dos bacteriocinas lácticas
sobre Listeria monocytogenes adherida a una
superficie de acero inoxidable
Tesis presentada como parte de los requisito para optar al grado de
Licenciado en Ingeniería en Alimentos.
Profesor Patrocinante: Sra. Renate Schöbitz T. - Tecnólogo Médico – M.
Sc. - Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos.
Ruth Noemi Silva Rivas
Valdivia Chile 2004
Profesores Informantes
Sr. Erwin Carrasco R. - Ingeniero Civil Químico - Instituto de Ciencia y Tecnología
de los Alimentos.
Sra. Luz H. Molina C. - Profesor de Biología y Química - Instituto de Ciencia y
Tecnología de los Alimentos
Dedicatoria
A mis padres…
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Agradecimientos
A las primeras personas que quiero agradecer con todo el corazón es a mis padres
Elea y José Luis por su cariño y apoyo incondicional. A mis amigas Julie, Susana y
Jessica que estuvieron conmigo en los momentos que las necesité.
Deseo agradecer además muy sinceramente a mi profesora patrocinante Sra Renate
Schöbitz, por su paciencia y ayuda que me brindó en la realización de este proyecto.
Así también de manera especial a mi profesor informante Sr. Erwin Carrasco, quién
contribuyó enormemente en esta tesis ofreciéndome su tiempo y ayuda.
Así mismo agradezco a las profesoras Sade y Mariela, que me asesoraron en la parte
microbiológica y experimental, igualmente a Erica que siempre tuvo la disposición de
colaborarme.
Sin duda no puedo de dejar de agradecer parte del personal del ICYTAL ,
especialmente a don José y Alex que me prestaron su ayuda cuando lo requerí.
Además quiero agradecer a la Dra. Graciela Vignolo por su aporte, colaboración y
asistencia prestada. como también a la empresa AMG Danisco, de Argentina por la
donación de nisina (Nisaplin), parte importante en este estudio.
A todos ellos.
Muchas gracias
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RESUMEN
El objetivo general del presente trabajo fue, estudiar el efecto inhibidor de una
combinación de dos bacteriocinas lácticas en contra de L. monocytogenes, sobre una
superficie de acero inoxidable. Para ello se empleó la bacteriocina nisina y una
sustancia tipo bacteriocina (STB) de Carnobacterium piscicola L103, en contra de L.
monocytogenes Lsa 4/00, en caldo soya tripticasa (CST), a 10ºC y en células
adheridas a placas de acero inoxidable de 1 x 1cm. La recuperación de las células
viables a partir del CST fue determinada a las 0, 0,5, 1,5, 3, 24 y 48 h de exposición.
Los resultados mostraron que L. monocytogenes fue completamente inactivada
después de 24 h, por la combinación sinérgica de 100 UA/mL (5.000 UI/mL) de
nisina y 100 UA/mL de la STB de C. piscicola L103 . Nisina sola, también presentó
un efecto bactericida, en cambio, para la STB de C. piscicola L103 se obtuvo una
inhibición parcial, originándose células resistentes a las 24 h. Para la obtención de
biopelículas de L. monocytogenes sobre las placas de acero inoxidables, éstas fueron
incubadas con la bacteria durante 24 h a
25 ºC. La densidad inicial de L.
monocytogenes sobre las placas de acero inoxidable fue de 3,0 x 104 a 1,0 x105
ufc/cm2. Después de 0,5 y 24 h de contacto con las bacteriocinas a 10ºC, los
recuentos se redujeron en 1,5 a 4 unidades log. Con la combinación de bacteriocinas
la cantidad células de L. monocytogenes en la biopelícula llegó a <10 ufc/cm2
después de 24 h. El tratamiento combinado (Nis+STB), presentó un efecto sinérgico
frente a la biopelícula de Listeria. Los resultados indican que la combinación de
bacteriocinas puede ser usada en forma segura sobre superficies de acero inoxidable,
lográndose una efectiva inhibición de L. monocytogenes por 24 h. El uso de una
combinación de bacteriocinas tendría como ventaja reducir el desarrollo de células
resistentes de L. monocytogenes a las bacteriocinas.
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SUMMARY
The general objective of the present work was, to study the inhibitory effect of a
combination of two bacteriocins from lactic acid bacteria, against L. monocytogenes,
on a stainless steel surface.
The commercial bacteriocin nisin was used and a
bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) from Carnobacterium piscicola L103,
with L. monocytogenes Lsa 4/00 as the indicador organism. The test was done in
triptic soy broth (TSB) at 10ºC and with the in cells adhered to stainless steel plates
of 1 cm x 1cm. The recovery of the viable cells from the TSB was determined at 0,
0.5, 1.5, 3, 24 and 48 h of exposure. Results showed that L. monocytogenes was
completely inhibited after 24 h, by the combination of 100 AU/mL (5.000 IU/mL) of
nisin and 100 AU/mL of the BLIS of C. piscicola L103. Nisin alone, also presented a
bactericidal effect. For the STB of C. piscicola L103 a partial inhibition was
obtained, with resistant cells originating after 24 h. For the formation of biofilms of
L. monocytogenes the stainless steel plates were incubated with the bacterium for 24
h at 25 ºC. The initial density of L. monocytogenes on the stainless steel plates ranged
from 3.0 x 1.04
to 1.0 x105 cfu/cm2. After 0.5 and 24 h of contact with the
bacteriocin at 10ºC, the counts were reduced in 1.5 to 4 log cycle units. With the
combination of bacteriocins the amount of cells of L. monocytogenes on stainless
steel plates was reduced to < 10 cfu/cm2 after 24 h. The combined treatment (Nis+
BLIS) presented a synergic effect on the biofilm of Listeria. The results indicate that
the combination of bacteriocins can be effective on stainless steel surfaces, during
prolonged exposure. The use of a combination of bacteriocins will reduce the
development of bacteriocin resistant cells.
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1. INTRODUCCION
Los microorganismos presentes sobre las superficies de trabajo como acero
inoxidable, vidrio y plástico en las plantas procesadoras de alimentos, son una
potencial fuente de contaminación que puede llevar al deterioro de los alimentos o a
la transmisión de enfermedades. Listeria monocytogenes es uno de los patógenos que
forman estas biopelículas sobre las superficies, siendo difícil de remover o eliminar
con los métodos tradicionales de limpieza.
Dentro de la variedad de sanitizantes utilizados para destruir microorganismos en las
plantas procesadoras de alimentos, el cloro es uno de los más utilizados, por su fácil
aplicación y bajo costo, sin embargo, en presencia de las biopelículas pierde de
manera importante su efectividad, comparado con otros sanitizantes, como son los
amonios cuaternarios o el ácido peracético.
En este trabajo se estudió la utilización de sustancias antimicrobianas naturales como
las bacteriocinas, para destruir o inhibir a células de L. monocytogenes adheridas a
una superficie de acero inoxidable. Para ello se probaron distintos tratamientos en los
que se utilizaron en forma individual y en combinación las bacteriocinas, nisina y una
sustancia tipo bacteriocina de Carnobacterium piscicola.
Objetivo general:
Estudiar el efecto inhibidor de una combinación de dos bacteriocinas lácticas en
contra de Listeria monocytogenes sobre una superficie inerte.
Objetivos específicos:
Determinar el efecto antagónico de una combinación de dos bacteriocinas, nisina y la
sustancia tipo bacteriocina (STB) de C. piscicola L103 frente a L. monocytogenes Lsa
4/00, en un caldo de cultivo incubado a 10ºC
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Evaluar el efecto combinado de la STB de C. piscicola L 103 y nisina, a 10ºC, sobre
L. monocytogenes, adherida a la superficie de placas de acero inoxidable.
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2. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1. Biopelículas microbianas
La capacidad de algunos microorganismos de adherirse a superficies sólidas, para
crecer y formar posteriormente una biopelícula o biofilm, es un problema
ampliamente reconocido en la industria alimentaria. Ello puede tener como
consecuencia la transferencia de microorganismos, tanto de descomposición como
patógenos, desde la superficie de los equipos al alimento, con el consiguiente riesgo
de deterioro del producto, o peligro para la salud pública. Los biofilm son
comunidades complejas de microorganismos inmovilizados en superficies bióticas o
abióticas, normalmente inmersos en una matriz compuestas por polímeros
extracelulares, producidos por los microorganismos. Las biopelículas pueden estar
compuestas por una población que desarrolla una sola especie o una comunidad
derivada de múltiples especies bacterianas (DAVEY y O’TOOLE, 2000).
Los agregados bacterianos pueden formarse casi en cualquier ambiente hidratado que
tenga las condiciones nutritivas
apropiadas para
permitir su desarrollo. El
asentamiento de las bacterias también depende de las características hidrodinámicas
(flujo laminar o turbulento) del ambiente acuoso donde se están desarrollando
(KUEHN et al., 1998). Las biopelículas pueden ser responsables de la corrosión de
metales, obstrucción de flujo de fluidos en cañerías, reducciones en los procesos de
traspaso térmico, contaminación de catéteres médicos y transmisión de enfermedades
por alimentos contaminados. Así también pueden ser beneficiosas, al ser utilizadas en
la biodegradación de aguas residuales, producción y degradación de materia orgánica
y en la fijación de nitrógeno (DUNNE, 2002; DAVEY y O’TOOLE, 2000).
2.1.1. Etapas de adhesión de una bioplícula. El mecanismo de adhesión bacteriana a
una superficie y la formación posterior del biofilm es un proceso aún no aclarado. Se
han postulado diferentes modelos de adhesión en dos o tres etapas y hasta cinco
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etapas (DAVEY y O’TOOLE, 2000; WATNICK y KOLTER, 2000). Sin embargo, el
modelo de adhesión más aceptado es el señalado por Marshall et al., citado por
PEREZ et al. (1999), que ocurre en dos etapas: una primera, denominada “adhesión
reversible”, y una segunda, “adhesión irreversible”. La primera etapa, puede ocurrir
con un corto tiempo de contacto. En un experimento VANHAECKE et al. (1990),
encontraron que células de Pseudomonas se adhieren al acero inoxidable con 30 s de
contacto. Las bacterias se ponen en contacto con la superficie del material por
atracciones débiles como fuerzas electrostáticas de repulsión–atracción, interacciones
hidrofóbicas y fuerzas de Van der Waals. Durante esta etapa, las bacterias adheridas
pueden ser fácilmente removidas aplicando pequeñas fuerzas (CHMIELEWSKI y
FRANK, 2003). La etapa “irreversible” es dependiente del tiempo e involucra la
adhesión física de la célula a la superficie por un material complejo de polisacáridos,
producido por ellas mismas ( ZOTTOLA, 1994).
WATNICK y KOLTER (2000), describen cinco etapas en la formación de un biofilm
bacteriano. La FIGURA 1 representa esquemáticamente las etapas, para formar una
nueva biopelícula (bacterias amarillas) sobre una superficie ya colonizada por otras
especies bacterianas (bacterias rojas). Primero, las bacterias con ayuda de sus flagelos
nadan hacia la superficie, aproximándose tanto que su movilidad disminuye casi por
completo. Las bacterias forman una asociación transitoria con la superficie y/o con
otros microorganismos previamente adheridos a la superficie. Esta asociación
transitoria le permite a la bacteria la búsqueda de un lugar para asentarse. Cuando las
bacterias forman una asociación estable como miembro de una microcolonia, han
elegido la comunidad donde vivir. Finalmente producen exopolisacáridos (color café)
para formar un biofilm tridimensional o maduro. Cuando las condiciones ambientales
llegan a ser desfavorables, algunas de las bacterias pueden desprenderse de la matriz
para encontrar una superficie en un ambiente más favorable. Los autores mencionan
que en ambientes naturales el biofilm es casi invariablemente una comunidad de
múltiples especies microbianas, albergando bacterias que permanecen o transitan con
el propósito de transferir rápidamente elementos genético y ocupar distintos nichos
dentro del biofilm.
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FIGURA 1. Representación esquemática de las etapas para la adherencia de la célula
bacteriana a una superficie previamente colonizada.
FUENTE: WATNICK y KOLTER (2000).
2.1.2. Características de las biopelículas. La adhesión a un sustrato puede ser activa o
pasiva dependiendo de la motilidad de la célula. La adhesión pasiva es conducido por
gravedad, difusión y dinámica de fluidos. En la adherencia activa, la superficie
bacteriana de la célula facilita la adhesión inicial (CHMIELEWSKI y FRANK,
2003). Características superficiales de la célula, tales como la carga eléctrica
superficial, la hidrofobicidad, la existencia de flajelos y “pili”, y la producción de
polímeros extracelulares, pueden ser las responsable del mecanismo de fijación a una
superficie (PEREZ et al.,1999). Así, las bacterias tienen carga eléctrica negativa
debido principalmente, al exceso de grupos fosfato y carboxilo de su pared celular, y
esta electronegatividad favorecería su adhesión (LILLARD, 1985). La fijación a un
sustrato también se ve afectada por la hidrofobicidad de la superficie celular de la
bacteria. BENDINGER et al. (1993), estudiaron esta característica en varias bacterias
y encontraron que bacterias extremadamente hidrofóbicas tienen una muy baja
adhesión sobre el teflón y vidrio comparada con otras menos hidrofóbicas, así
también encontraron que un grupo de bacterias hidrofílicas tuvieron una adhesión
levemente mejor al vidrio que al teflón. En el caso de flagelos, se ha demostrado que
no solamente le permite a la bacteria moverse a un sitio específico, si no que además
constituyen un importante factor en el mecanismo inicial de adhesión.
VATANYOOPAISARN et al. (2000), mostraron que la existencia de flagelos en L.
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monocytogenes, fue determinante para la adhesión sobre el acero inoxidable. La
producción de sustancias polímeras extracelulares (EPS) por parte de las bacterias, es
otro mecanismo de fijación sobre las superficies. Pseudomonas, E, coli y Vibrio
colerae, cuando pierden su flagelo aumentan la producción de EPS para adherirse
sobre la superficie (DAVEY y O’TOOLE, 2000).
Factores tales como las condiciones de cultivo ( pH y temperatura), nivel de
nutrientes del medio, naturaleza de la superficie, composición de la comunidad
microbiana y la hidrodinámica del medio, alteran las propiedades fisicoquímicas de
la superficie de la célula, lo que influye en la adhesión y colonización bacteriana en
general y en particular de L. monocytogenes a un sustrato.
El mejoramiento de la adhesión bacteriana sobre superficies abióticas se ve
favorecida con el aumento de la temperatura, por ejemplo L. monocytogenes, puede
formar biopelículas a temperaturas de refrigeración (4ºC, 8ºC y 10ºC), sin embargo, a
temperaturas elevadas (21ºC, 25ºC y 30ºC), esto se ve favorecido, principalmente
porque L. monocytogenes presenta múltiples flagelos, los que facilitan la fijación
inicial y ayudan a la estabilidad de la biopelícula sobre el sustrato (HERALD y
ZOTTOLA, 1988; VATANYOOPAISARN et
al., 2000). Sin embargo a
temperaturas más elevadas (37ºC) esto se debe, posiblemente, a la producción de
proteínas asociadas a la superficie de la célula, en respuesta al estrés del calor
(SMOOT y PIERSON, 1998b), y no a la presencia de flagelos. A ésta temperatura, L.
monocytogenes pierde su flagelo y su superficie celular se hace menos
electronegativa.
También el pH al cual se elaboran los alimentos puede influir en la adherencia
microbiana. SMOOT y PIERSON (1998a), encontraron que la adhesión de L.
monocytogenes Scott A al acero inoxidable y al caucho ocurrió en soluciones
fuertemente iónicas. Ellos determinaron que a valores de pH entre 4,0 a 7,0 no hay
diferencias en la tasa de adhesión. Sin embargo, bajo condiciones alcalinas se observó
una disminución de ella. En un estudio posterior SMOOT y PIERSON (1998b),
encontraron que el pH alcalino afectó la adherencia de L. monocytogenes sólo en un
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corto tiempo de contacto (menor a 30 min). Cuando el tiempo de exposición se
extendió a 120 min, el pH en un rango de 4 a 9 no afectó la adherencia de este
patógeno.
La disponibilidad del nutriente tiene una influencia directa en la estructura de la
biopelícula y en la composición de la comunidad microbiana. Los estudios de KIM y
FRANK (1995), muestran el efecto de los nutrientes sobre el desarrollo del biofilm,
en cultivos puros de L. monocytogenes, indicando que bajos niveles de fosfato,
estimulan inicialmente el desarrollo del biofilm, sin embargo, a altos niveles,
producen un efecto contrario. El tipo de azúcar también provee una influencia en el
desarrollo del biofilm, donde manosa y trehalosa aumentan el espesor de la
biopelícula después de 12 días de incubación.
Las características del material podrían influir en la posibilidad de adhesión
bacteriana a una superficie, aunque hay resultados contradictorios. Dexter et al.,
citado por PEREZ et al. (1999), comprobaron que las bacterias se fijan, en mayor
número a superficies con carga electrostática alta, como el vidrio y en menor número,
a las que presentan menor carga electrostática, como el poliestireno. Esto también fue
encontrado para bacterias como L. monocytogenes quien presenta mayor adhesión
sobre superficies hidrofílicas (carga electrostática alta), como acero inoxidable y
vidrio, que en superficies hidrofóbicas como nylon y teflón (BLACKMAN y
FRANK, 1996; MAFU et al., 1990). Incluso algunos materiales como el caucho
presentan un efecto bacteriostático para bacterias como Salmonella tiphymurium y L.
monocytogenes (RONNER y WONG, 1993). Sin embargo, FLETCHER y LOEB
(1979) y PRINGLE y FLETCHER (1983), reportaron que la mayoría de las especies
microbianas aisladas de sustratos sumergidos en medios acuosos, exhiben mayores
niveles de adhesión a superficies hidrofóbicas que en superficies hidrofílicas .
La existencia de rugosidades, protuberancias, grietas, huecos y otras irregularidades
en la superficie del material en contacto con los alimentos, tiene también importancia
en la adhesión de los microorganismos. Así KRYSINSKI et al. (1992), demostraron
que las irregularidades de las superficies permiten a las bacterias escapar de las
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turbulencias del flujo y en consecuencia fijarse al material. Por ejemplo, Salmonella
enteriditis permanece en las grietas del vidrio (KORBER et al., 1997), incluso
después del tratamiento con fosfato trisódico.
Los biofilms han sido examinados en varias condiciones hidrodinámicas como flujos
laminares y turbulentos y fue demostrado que la estructura del biofilm cambian en
respuesta a las condiciones de flujo. Biofilm cultivados bajo flujo laminar forman
agregados con células de forma rugosas y redondas. Los biofilms desarrollados en
flujo turbulento constituyen agregados celulares con elongaciones que oscilan en el
fluido. Por otra parte, el desarrollo de un biofilm bajo flujo continuo, es polimorfo y
estructuralmente adaptado a cambios en la disponibilidad de nutriente ( Stoodley et.
al. citado por DAVEY y O’TOOLE, 2000)
Las superficies limpias sumergidas en una solución, son rápidamente cargadas por la
adsorción de moléculas orgánicas e iones. Este proceso es conocido como
preacondicionamiento (CHMIELEWSKY y FRANK, 2003). La adsorción de estas
moléculas orgánicas a la superficie pueden facilitar o dificultar la adhesión
bacteriana. En un estudio realizado por BARNES et al. (1999), demostraron que la
fijación bacteriana ocurre mejor en superficies preacondicionadas en presencia de
iones, tales como el cloruro de sodio y cloruro de calcio. Resulta también conocido, el
hecho de que la adsorción de proteínas afecta la fijación bacteriana. MITTELMAN
(1998), menciona que la leche y los componentes de la leche pueden adsorberse a la
superficie en un tiempo de 5 a 10 s, formando un film que puede fomentar o inhibir
la adhesión bacteriana. HELKE et al. (1993) y BARNES et al. (1999), describieron el
efecto de las proteínas lácteas sobre la adhesión de L. monocytogenes y S.
tiphymurium, al acero inoxidable y al caucho. La presencia en la superficie de los
componentes de la leche como la caseína, α-lactoalbúmina y/o β-lactoglobulina
reducen significativamente la fijación de ambos microorganismos. También se ha
demostrado que las proteína biológicamente activas como la nisina,
pueden
adsorberse a superficies tanto hidrófobicas como hidrofílicas, manteniendo su
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actividad para destruir células de L. monocytogenes que se han adherido a la
superficie (BOWER et al., 1998).
2.1.3. Destrucción de las biopelículas. El problema de la aglomeración bacteriana
ocurre especialmente en superficies de equipos inadecuadamente limpiados o en áreas
difíciles de limpiar como válvulas, cañerías, empalmes y conexiones. La higiene en
la industria de alimentos es una etapa dentro del proceso productivo. Los programas
de limpieza en plantas de alimentos incluyen, normalmente, una limpieza para
eliminar la suciedad orgánica e inorgánica, que permite arrastrar muchos
microorganismos presentes en las superficies. Posteriormente se realiza una
desinfección que inactiva dichos microorganismos. Para PEREZ et al. (1999), la fase
de limpieza es la etapa más importante para disminuir la adherencia de los
microorganismos a las superficies de equipos de procesados. De hecho se ha
demostrado que las bacterias que se disponen como biofilm, presentan una mayor
protección contra los sanitizantes, que aquellas que se encuentran en suspensión
(FRANK y KOFFI, 1990; STOPFORTH et al., 2002).
La resistencia de las bacterias a los desinfectantes aumenta con la edad del biofilm
(SHIN-HO-LEE y FRANK, 1991; FATEMI y FRANK, 1999). Es así como se ha
demostrado que los biofilm de L. monocytogenes formados en un día fueron
destruidos más rápidamente que los originados en siete días (OH y MARSHALL,
1996). La producción de exopolisacáridos por parte de las bacterias, estarían
asociados con el mecanismo de resistencia, ya que ellos tienen la capacidad de
prevenir el acceso de ciertos agentes antimicrobiales.
El tipo de superficie también puede influir en la efectividad de los sanitizantes.
RONNER y WONG (1993), encontraron que las biopelículas de L. monocytogenes y
S. typhimurium que crecieron sobre el caucho, fueron más resistentes a cuatro tipos
de sanitizantes que las biopelículas que crecieron sobre el acero inoxidable. Esta
resistencia pudo deberse a la baja eficiencia de los sanitizantes sobre superficies
porosas y al bajo crecimiento que hace mejorar la resistencia de las células a los
agentes antimicrobianos.
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En la lucha por eliminar estos microorganismos adheridos, la industria ha aumentado
las concentraciones de agentes sanitizantes químicos, lo cual resulta inaceptable,
puesto que las altas concentraciones de sanitizantes, puede plantear riesgo de salud a
los trabajadores, dar lugar a residuos químicos inaceptables en el producto, aumentar
el costo de producción y la contaminación del medio ambiente.
Para la reducción de biofilm de L. monocytogenes se han estudiado una variedad de
detergentes y sanitizantes, de los cuales existen unos más efectivos que otros, como el
ácido peracético que es más efectivo que el cloro para inactivar biofilms en presencia
de compuestos orgánicos. Sin embargo, en un estudio realizado por KRYSINSKI et
al. (1992), reportaron que, en general, los limpiadores químicos fueron más efectivos
que los sanitizantes para eliminar biofilm de L. monocytogenes sobre superficies de
acero inoxidable y plásticos.
Con el fin de aumentar la eficiencia en la eliminación de la resistencia bacteriana, se
ha llevado a ensayar una mezcla de sanitizantes, como también una combinación de
ellos con otros factores como el calor
(PICKETT y MURANO, 1996, OH y
MARSHALL, 1996). FRANK y KOFFI (1990), demostraron que una combinación
de calor y sanitizantes puede reducir las biopelículas de L. monocytogenes hasta en 5
ciclos logarítmicos. Esta reducción se obtuvo exponiendo las biopelículas por 5 min a
sanitizantes ácido aniónicos a 70ºC.
Prevención de la formación de biopelículas. Para evitar la formación de las
biopelículas en superficies de equipos en la industria de alimentos, ZOTTOLA
(2001), menciona en primer lugar el desarrollo de buenos programas de limpiado y
sanitizado, con suficiente tiempo y frecuencia y el diseño correcto de las superficies
de los equipos de proceso de alimentos y de plantas, para eliminar los nichos de
crecimiento microbiano. CHAVANT et al. (2002), demuestran que el uso de
superficies hidrofóbicas como el teflón en ambientes fríos, pueden minimizar el
desarrollo de biopelículas de L. monocytogenes en plantas de alimentos. DAESCHEL
et al. (1992) y BOWER et al. (1995), estudiaron que la adsorción de agentes
antimicrobianos a superficies en contacto con los alimentos, pueden impedir la
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adhesión de los microorganismos mientras liberen de su superficie pequeñas
cantidades del agente antimicrobiano. Ellos observaron que en superficies recubiertas
con nisina se produjo una disminución en la adhesión de L. monocytogenes.
2.2. Listeria monocytogenes
Listeriosis, es una enfermedad transmitida por los alimentos (E.T.A.) de baja
incidencia, causada por L. monocytogenes, pero con un alto impacto en la población
de riesgo, como mujeres embarazadas, individuos inmunodeprimidos y en personas
de edad avanzada. En estos grupos la tasa de mortalidad por listeriosis es alta
alcanzando un 20% a 30% (ROCOURT y COSSART, 1997; RYSER, 1998).
Diversos alimentos han estado asociado con brotes y casos esporádicos de listeriosis
tales como productos lácteos (queso, leche pasteurizada, etc ), productos cárnico
(carne envasada al vacío) y productos pesqueros (trucha y salmón ahumado).
La capacidad de Listeria de crecer a temperaturas entre 4ºC y 10ºC, de tolerar
concentraciones de sal de hasta un 12% y crecer a un pH bajo cercano a 4,5, hace
que este microorganismo esté ampliamente presente en la naturaleza (DUFFES, et al.,
1999), lo cual dificulta su control en alimentos, especialmente en aquellos que no
reciben cocción por parte del consumidor. Los alimentos mayormente implicados son
aquellos sometidos a procesos típicos de preservación como salado, ahumados en
frío y caliente, acidificación y refrigeración, es decir los llamados “alimentos listos
para el consumo” (WESSELS y HUSS,1996).
El ingreso de L. monocytogenes a las plantas de procesamiento de alimentos puede
ocurrir a través de la tierra en los zapatos de los trabajadores, en la ropa y en equipos
de transporte, por fecas de animales contaminados con la bacteria y posiblemente por
individuos portadores (ROCOURT y COSSART, 1997).
La materia prima parece ser otra vía en la llegada de L. monocytogenes a las plantas
de proceso de alimentos. En plantas procesadoras de pescado, la
principal
contaminación se presenta en la superficie del pescado fresco, es así como EKLUND
et al. (1995), encontraron L. monocytogenes en el limo, piel y cola del salmón.
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L. monocytogenes es un patógeno que tiene la capacidad de proliferar en ambientes
fríos y húmedos que son ideales para la formación de biofilm.
HERALD y
ZOTTOLA (1988) fueron los primeros en estudiar la adhesión de L. monocytogenes
sobre el acero inoxidable, publicándose posteriormente la adherencia a otras
superficies como el vidrio, hule, teflón, polipropileno y nylon, materiales
comúnmente usados en equipos y superficies de plantas de alimentos (BLACKMAN
y FRANK, 1996). La habilidad de L. monocytogenes para adherirse en un corto
tiempo de contacto a una superficie (MAFU et al., 1990) y formar biopelícula
representa una potencial fuente de contaminación para una variedad de materiales que
entran en contacto con la superficie.
Listeria puede encontrarse en todo tipo de ambientes de producción de alimentos,
tales como pisos, aguas estancadas, desagües y en equipos de procesamiento
(ROCOURT y COSSART, 1997), llegando a establecerse transitoriamente o
permanecer por meses o años en una planta o en una línea de producción (LUNDEN
et al., 2000, TOMPKIN, 2002).
2.3. Bacteriocinas de bacterias ácido lácticas
Estas sustancias son péptidos sintetizados ribosomalmente (MONTVILLE y
WINKOWSKI, 1997) por las bacterias ácido lácticas que exhiben un modo de acción
bactericida o bacteriostático en contra de especies bacterianas sensibles (NETTLES y
BAREFOOT, 1993). Generalmente son bacterias estrechamente relacionadas con la
cepa productora (McMULLEN y STILES, 1996; MONTVILLE y WINKOWSKI,
1997), entre las cuales se encuentra un amplio rango de bacterias gram positivas,
incluyendo microorganismos patógenos como L. monocytogenes, Staphylococcus
aureus y Clostridium botulinum (MURIANA, 1996 ).
Numerosas bacterias lácticas productoras de bacteriocinas han sido aislado de
alimentos tales como, carnes y productos lácteos fermentados, correspondientes a
cepas de Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, y Carnobacteriun. Algunas de
estas bacterias tienen la particularidad de secretar más de una bacteriocina. Entre
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éstas se conocen a C. piscicola LV17 y Lactobacillus sake que producen al menos
tres bacteriocinas distintas (McMULLEN y STILES, 1996) y que inhiben a otros
lactobacilos, bacterias ácido láctica y L. monocytogenes (NETTLES y BAREFOOT,
1993).
Dentro de las bacteriocinas más estudiadas durante más tiempo, se encuentra la nisina
que es sintetizada y secretada por un microorganismo lácteo, Lactococcus lactis
subsp. lactis. Esta bacteriocina es utilizada como conservador de alimentos y es la
única reconocida por la FDA (Food and Drug Administration), con la categoría
GRAS (Generally Recognized As Safe) (O’KEEFFE y HILL, 2000). Se produce en
forma natural en algunos productos lácteos y además se usa como aditivo en
industrias lácteas para prevenir el deterioro por bacterias Gram positivas, las que
incluye estreptococos, lactococos, lactobacilos, leuconostocs, pediococos, siendo
también efectiva en contra de esporas de Clostridium y Bacillus (THOMAS Y
WIMPENNY, 1996).
2.3.1. Características fisicoquímicas de las bacteriocinas. Las bacteriocinas de las
bacterias ácido lácticas (BAL) se caracterizan por presentar una serie de propiedades
comunes, tales como la sensibilidad a la acción de enzimas proteolíticas, su tolerancia
térmica, estabilidad a bajo pH y la acción antibacteriana.
La mayoría de las bacteriocinas son sensibles a enzimas proteolítica, tales como la
tripsina, α-quimiotripsina y pepsina (CHEN y HOOVER, 2003). Debido a su
naturaleza proteica, las bacteriocinas serían inactivadas durante su paso por el tracto
intestinal al ser ingeridas, por la acción de las enzimas de origen pancreático (tripsina
y α-quimiotripsina) y gástricas (pepsina), considerándose seguras para el consumidor
porque no causan riesgos como el uso de antibióticos, al no ser absorbidas como
compuestos activos por el organismo (O`KEEFFE y HILL, 2000).
Las bacteriocinas de las BAL son conocidas por ser activas a valores de pH ácido, lo
cual puede reflejar la adaptación de estas sustancias a las condiciones ambientales de
las bacterias que la producen (CINTAS et al., 2001). La nisina por ejemplo tiene su
18
máxima estabilidad y solubilidad a pH 2,0 decreciendo a pH 6,0, siendo
irreversiblemente inactivada a pH 7,0.
La termoestabilidad es otra característica común de las bacteriocinas de las BAL,
pudiendo ser sensible, dependiendo del estado de purificación y de factores como el
pH del medio, la fuerza iónica y la presencia de moléculas protectoras (MEDINA et
al., 1992). La resistencia de las bacteriocinas (extracto crudo) a un calentamiento o
autoclavado de 100 – 121ºC es una característica común (CINTAS et al., 2001). Sin
embargo, Barefoot y Klaenhammer citado por CINTAS et al. (2001), demostraron
que la estabilidad térmica decreció cuando se uso la bacteriocina lactocina B
parcialmente purificada. Igualmente LAMA (2002), encontró que la actividad de la
sustancia tipo bacteriocina de C. piscicola L103 parcialmente purificada disminuyó
en un 50% con respecto a su actividad inicial, al ser expuesta a tratamientos térmicos
de 63ºC, 95ºC y 100ºC. Sin embargo, la nisina permanece estable después de ser
calentada a 100ºC por 10 min a pH 2,0 (Hurt, citado por CINTAS et al., 2001).
En relación a actividad antibacteriana, las bacteriocinas poseen un modo de acción
bactericida o bacteriostático sobre células sensibles. Esta distinción es influenciada
por varios factores tales como la dosis de la bacteriocina, su grado de purificación, el
estado fisiológico de la cepa indicadora (fase de crecimiento) y condiciones
experimentales (temperatura y pH) (CINTAS et al., 2001).
2.3.2. Clasificación de las bacteriocinas. Las bacteriocinas de las BAL descritas y
caracterizadas hasta la fecha muestran rasgos comunes, lo cual justifica su
clasificación dentro de 3 clases bien definida (CLEVELAND et al., 2001).
Clase I - los lantibióticos, son péptidos pequeños (<5 KDa), que contiene lantionina,
β-metil-lantionina, dehidrobutirina y dehidroalanina. La bacteriocina representativa
de este grupo es la nisina.
Clase II - corresponden a péptidos estables al calor no pertenecientes a los
lantibióticos, de peso molecular variable
identificar tres subclases:
(< 10 kDa). En éste grupo se puede
19
Clase II a - pequeños péptidos, con actividad en contra de Listeria, que tienen una
secuencia aminoacídica en su porción N-terminal. Los representantes característicos
de este subgrupo son la pediocina PA-1, carnobacteriocinas y sakacina A y P.
Clase
II b - son formadores de complejos de poración que consisten en
dos
diferentes péptidos. Ambos péptidos son necesarios para una mejor actividad
antimicrobiana. En esta clase se encuentran la lactococcina G y F y plantaricinas EF y
JK.
Clase II c - son péptidos pequeños termoestables, no modificados que se transportan
mediante péptidos líderes. En esta subclase se tiene a acidocina B y divergicina A.
Clase III - péptidos de mayor tamaño de 30 kDa, lábiles al calor. En esta clase se
encuentran las bacteriocinas lactacinas A y B, helveticinas V y J, acidofilicina A.
2.3.3.
Modo de acción de las bacteriocinas BAL. El modo de acción de las
bacteriocinas es complejo. La nisina de la clase I y la pediocina clase II son las más
estudiadas en este concepto y comparten algunas características en común. Actúan
generalmente a nivel de la membrana citoplasmática, destruyendo su integridad a
través de la formación de poros con la cual resulta la salida de compuestos pequeños,
pérdida de la fuerza motriz de protones necesaria para la producción de energía,
síntesis de proteínas o de ácidos nucleicos (CHIKINDAS et al., 1993; ABEE et al.,
1994a).
Un esquema del modelo de poración se presenta en la FIGURA 2. Los monómeros de
la bacteriocina se unen a la membrana citoplasmática a través de uniones
electrostática con los fosfolípidos cargados negativamente, luego se insertan con una
reorientación que depende del potencial de la membrana, el cual está influenciado
por
el pH y la composición
bacteriocinas
fosfolipídica.
La estructura secundaria de la
α-hélice o β-laminar forma dos caras, una hidrofílica
y
otra
hidrofóbica, la cual permite la formación de oligómeros que atravesarían la
membrana formando fácilmente los poros. El lado apolar de la molécula se situaría
próximo a los lípidos de la membrana, y el lado polar hacia el centro del poro. Como
20
consecuencia de esto se produciría la salida de iones K+, ATP, aminoácidos y
pequeñas moléculas, lo que produce una pérdida del potencial de la membrana,
consumo de las reservas energéticas, inhibición de la síntesis de macromoléculas
(ADN, ARN y proteínas), originando finalmente la muerte celular (MONTEVILLE y
WINKOWSKY, 1997; NUÑEZ et al., 2002).
FIGURA 2.
Interacción de monómeros de bacteriocina con la membrana
citoplasmática
FUENTE: Farías, citado por NUÑEZ et al. (2002).
Aunque la formación de poros y la pérdida del potencial de la membrana es la manera
común de actuar de las bacteriocinas, existen algunas diferencias en cada clase. La
nisina (clase I) no parece requerir de un receptor unido a la membrana de la célula
blanco, ya que reconoce la composición fosfolipídica de la célula (ABEE et al.,
1994a). En cambio para las bacteriocinas clase IIa se requiere de receptores
específicos de naturaleza proteica asociados a la membrana citoplasmática
(REQUENA y PELAEZ, 1995; CHIKINDAS et al., 1993). BRUNO y
MONTEVILLE (1993), EIJSINK et al. (1998), señalan que la región consenso N
terminal de las bacteriocinas clase II tiene un papel importante en la capacidad de
reconocimiento de la membrana de la célula blanco.
21
2.3.4. Desarrollo de resistencia a las bacteriocinas BAL. La presencia de sustancias
antibacterianas en un medio dado, eventualmente ocasionará variedades de bacterias
resistentes al componente. Según lo encontrado con los antibióticos terapéuticos,
también ocurren mutantes resistentes a las bacteriocinas. GRAVESEN et al. (2002a),
examinó las respuestas de un número de variedades de L. monocytogenes a la
pediocina PA-1 y a la nisina, encontrado una amplio rango de resistencia espontánea
a las dos bacteriocinas. La influencia del estrés ambiental (reducción de pH, baja
temperatura y la presencia de cloruro de sodio), parecen ser específicos para cada
bacteriocina; es decir estos factores no influyeron en la frecuencia de resistencia para
la pediocina PA-1, sin embargo, reducen la frecuencia de resistencia para nisina. La
resistencia espontánea puede desarrollarse por alteración y/o mutación de las células
o de los constituyentes moleculares de la membrana celular con la cual interactúan las
bacteriocinas (MURIANA, 1996). Este hecho queda demostrado por MING y
DAESCHEL, (1995), quienes observaron en mutantes espontáneo de L.
monocytogenes Scott A resistente a la nisina, cambios en la composición de los
ácidos grasos de la membrana y una alteración en la composición de fosfolípidos
comparada con L. monocytogenes sensible. Ellos señalan que los cambios en la
composición de la membrana están correlacionados con la resistencia espontánea. Las
cepas de L. monocytogenes resistentes a nisina mostraron tener cantidades inferiores
de tres fosfolípidos (fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol y bisfosfatidilgliceril
fosfato) comparado con niveles encontrado en células de L. monocytogenes sensible a
nisina. CRANDALL y MONTEVILLE (1998), no solamente reportaron cambios en
la membrana citoplasmática y en la pared celular, sino que además los mutantes de L.
monocytogenes resistente a nisina, requirieron de un catión divalente para resistir el
efecto inhibitorio cuando fueron nuevamente expuestos a nisina. Ellos prevendrían la
unión de la nisina a la pared celular y/o de la membrana citoplasmática.
La mayoría de los estudios dirigido hacia la resistencia de L. monocytogenes a las
bacteriocinas se han llevado acabo con la nisina (lantibiótico), que tiene un modo de
acción distinto al de las bacteriocinas clase IIa, cuyo mecanismo de resistencia es
complejo. RAMNATH et al., (2000), encontraron que el mecanismo de resistencia
22
para leucosina A (bacteriocina, clase IIa), parece no ser específica solo para ella, sino
que puede ser un mecanismo general para todas las bacteriocinas de la clase IIa.
Recientemente se reportó que la resistencia espontánea a las bacteriocinas de la
clase IIa estaría vinculada con cambios en la membrana celular y a la mutación de
una sub-unidad en una enzima específica, involucrada en la expresión del sistema
fosfotransferasa permeasa, que interviene en la fosforilación y en el transporte de
azúcares a la membrana. Ello sugiere que la mutación para ésta sub-unidad específica
localizada en la membrana blanco, cambia el sitio de reconocimiento para las
bacteriocinas de la clase IIa. (DUFFES et al., 2000, DALET et al., 2001,
GRAVESEN et al., 2002b).
Con el objetivo de combatir la resistencia que eventualmente puedan desarrollar las
bacterias a una bacteriocina, se propone usar una combinación de dos o más
bacteriocinas ( VIGNOLO et al., 2000).
23
3. MATERIAL Y METODOS
3.1. Cultivos bacterianos
3.1.1. Cepa de Carnobacterium piscicola L103. Carnobacterium piscicola L103 es
una bacteria láctica productora de una sustancia tipo bacteriocina (STB), que fue
aislada de carne envasada al vacío por SCHÖBITZ et al. (1999). La cepa se mantuvo
congelada a -18ºC, en caldo soya tripticasa con 1% de glicerol. Para su uso se cultivó
en caldo soya tripticasa ( ST) (Difco) a 25ºC por 24 h y se conservó en refrigeración
a 4ºC.
3.1.2. Cepa de L. monocytogenes. Para los ensayos de adherencia y actividad de las
bacteriocinas, se trabajó con la cepa indicadora de L. monocytogenes, Lsa 4/00
aislada a partir de salmón (Laboratorio de Microbiología, Instituto de Ciencia y
Tecnología de los Alimentos, UACH). La cepa se conservó congelada en caldo ST
(Difco) con 1% glicerol a -18ºC. Previo a su utilización se propagó en caldo ST a
32ºC por 24 h.
3.2. Medios de cultivo
Para la producción de la STB de C. piscicola L.103 se utilizó el medio de cultivo DMRS (SCHILLINGER y STILES, 1993), basado en el caldo MRS
(de Man
Rogosa Sharpe, sin acetato, con 20 g/L de sacarosa, en reemplazo de la dextrosa). El
caldo se preparó con buffer fosfato 20 mM (NaH2 PO4 + K2HPO4) pH 6,5 en lugar
de agua destilada, para tamponar el pH del medio durante el crecimiento de la
bacteria.
En
los ensayos de adherencia de L.
monocytogenes
sobre
placas de acero
inoxidable y en la prueba de antagonismo en caldo de L. monocytogenes con
bacteriocinas, se utilizó un medio pobre en nutrientes. Para ello se preparó el caldo
24
soya tripticasa (CST) (Difco) en proporciones de 10 g/L en lugar de 30g/L de la
formulación original (JEONG y FRANK, 1994).
3.3. Obtención del extracto crudo de la STB de C. piscicola
L103
Un cultivo de 24 h de C. piscicola L.103, (3.2) se centrifugó a 7.700 x g/15 min. Al
sobrenadante se le ajustó el pH a 6,5 con NaOH 1N, se esterilizó por filtración (filtro
Millipore de 0,22µm) y se conservó a -18ºC hasta su utilización.
Con el fin de aumentar la actividad de la STB de C. piscicola, inicialmente se
realizaron ensayos de purificación, utilizando métodos como el de ultrafiltración
descrito por DELGADO (2001), y de precipitación y filtración por tamiz realizada
por LAMA (2002). En el ANEXO 1 se presentan ambos metodologías utilizadas y
los resultados obtenidos. Debido a que la máxima actividad se obtuvo en el extracto
crudo (400 UA/mL), se utilizó éste para los ensayos del estudio (3.6 y 3.7).
3.4. Preparación de la bacteriocina, “nisina”
Nisina, bacteriocina conocida comercialmente como “Nisaplin” (donada por la
empresa AMG, Buenos Aires, Argentina y fabricada por Danisco), contiene 1,0 x 106
UI/g de actividad. Para su uso se preparó una solución madre diluyendo 100 mg de
nisina en 10 mL de HCl 0,02N obteniéndose una concentración de 10.000 UI/mL. El
pH se ajustó a 2,0 con NaOH 1N, y la solución fue esterilizada por filtración (filtro
Millipore de 0,22 µm). La concentración de la solución con la que se trabajó fue de
5.000 UI/mL, la cual se obtuvo por dilución, tomando 5 mL de la solución madre y
completando con CST a un volumen final de 10 mL.
3.5. Determinación de actividad de la nisina y de la STB de
C. piscicola L103
Para ambas bacteriocinas se determinó la actividad, utilizando la técnica de la “gota
sobre césped” descrita por BAREFOOT y KLAENHAMMER (1983). La prueba
25
consistió en preparar un césped con la cepa indicadora L. monocytogenes Lsa 4/00. El
césped se preparó inoculando 0,7 mL de un cultivo de 18 h de la cepa (3.1.2), diluida
100 veces en buffer fosfato 0,05 M pH 7,0 (NaH2PO4 + Na2HPO4), en un tubo con 7
mL de agar soya tripticasa (AST) semisólido (0,75% de agar). Este fue vertido sobre
una placa con 5 mL de AST, obteniéndose una concentración final de 1,0 x 105
ufc/mL, de la cepa indicadora en la placa. Para ambas bacteriocinas se realizaron
diluciones seriadas (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16), en buffer fosfato 0,05 M pH 7,0 y se
colocaron 20L de cada dilución en forma de gota sobre el césped con la cepa
indicadora. Las placas fueron incubadas a 25ºC ± 2ºC por 24 h. Las unidades de
actividad de las bacteriocinas (UA/mL), se determinaron mediante la observación de
halos de inhibición en las zonas de inoculación de las diluciones. La actividad fue
definida como el recíproco de la mayor dilución que presentó halo de inhibición,
expresándolo en unidades de actividad (UA/mL), de acuerdo a BAREFOOT y
KLAENHAMMER, (1983).
3.6. Destrucción de L. monocytogenes en presencia de una
combinación de dos bacteriocinas en un sistema “ in vitro”
Para la prueba de antagonismo en caldo se inocularon ambas bacteriocinas, nisina y
la STB de C. piscicola L103, en forma individual y combinadas, junto con L.
monocytogenes Lsa 4/00 (3.1.2), a 10ºC ± 2ºC.
Con el fin de obtener las bacteriocinas a una misma actividad para los distintos
tratamientos, fue necesario conocer previamente, la actividad de ambas bacteriocinas,
utilizando la técnica descrita anteriormente (3.5), resultando para la nisina
200
UA/mL (10.000 UI/mL) y para la STB C. piscicola de 400 UA/mL. Determinadas las
actividades de ambas bacteriocinas se procedió a diluirlas con caldos ST, mediante la
formula V1*C1 = V2*C2, fijándolas a una concentración de trabajo de 100 UA/mL
para todos los tratamientos según se señala en el CUADRO 1.
CUADRO 1. Tratamientos para la inhibición de L. monocytogenes en caldo en
presencia de dos bacteriocinas
26
Tratamientos
T1
T2
T3
T4 (control)
Bacteriocinas (mL)
Nisina
STB C.
piscicola
5
------2,5
2,5
1,25
-------
CST diluido
(mL)
Volumen total
(mL)
5
7,5
6,25
10
10
10
10
10
Todos los tratamientos fueron inoculados con 0,1 mL de un cultivo de 24 h de L.
monocytogenes ( 1,0 x 109 ufc/mL) diluido 15 veces en buffer fosfato pH 7,2 (6,6 x
107 ufc/mL). De esta dilución se agregaron 0,1 mL a 10 mL de caldo, llegando a una
concentración en los matraces de 5,2 x105 ufc/mL.
Posteriormente los matraces se incubaron a una temperatura de 10ºC ± 2ºC en un
agitador de movimiento recíproco con una velocidad de 60 oscilaciones por min
durante 48 h. En los tiempos 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 24 h y 48 h, se extrajeron alícuotas
para realizar los recuentos en placa de L. monocytogenes de todos los tratamiento.
Para poder contabilizar las colonias se efectuaron diluciones de 10-1 a 10-5 sembrando
0,1 mL de éstas en la superficie de placas con agar ST. Las placas fueron incubadas a
32ºC por 48 h.
También se procedió a chequear la resistencia de la cepa L. monocytogenes Lsa 4/00
a todas las bacteriocinas en los distintos tratamientos después de una exposición de
1,5 h. Sólo para la STB de C. piscicola se controló nuevamente a las 24 h y 48 h la
presencia de cepas resistentes, por encontrarse allí mayor desarrollo de L.
monocytogenes en la placas después de los tratamientos. Para esto se tomaron de las
placas 3 colonias, que resistieron al tratamiento de las diferentes bacteriocinas, las
que se cultivaron por 24 h a 32ºC en caldo ST. Después de cinco subcultivos
consecutivos en el mismo caldo, se realizó una prueba de sensibilidad a
las
bacteriocinas por la “técnica de la gota sobre césped”, descrita anteriormente (3.5).
Como control se utilizó
una
cepa sensible, de L. monocytogenes Lsa 4/00
proveniente de un cultivo que no había sido sometido a la acción de las bacteriocinas.
27
3.6.1. Obtención de las constantes de velocidad de inhibición de L. monocytogenes
frente a las bacteriocinas. A partir de los recuentos obtenidos de L. monocytogenes
de cada tratamiento, se determinaron las constantes cinéticas (k) o constantes de
velocidad de inhibición de este patógeno por las bacteriocinas. Para ello se estudió
una cinética de segundo orden (– dc/dt = k c2 ), que una vez integrada presenta la
siguiente expresión 1/c - 1/c0 = k*t , donde:
c = Concentración de microorganismos (ufc/mL)
co = Concentración inicial de microorganismos (ufc/mL)
k = Constante de velocidad de inhibición ( mL/ufc*h)
t = Tiempo
De acuerdo a esto se graficó la expresión 1/c versus t, obteniéndose una recta con
pendiente positiva, correspondiente a k (FROST y PEARSON, 1961) (ANEXO 4).
3.6.2. Análisis de los datos. Los resultados de los recuentos de L. monocytogenes en
los distintos tratamientos se analizaron estadísticamente con el programa estadístico
Statgraphic 2.0, mediante análisis varianza multifactorial, con un nivel de confianza
de 95%, para determinar diferencia significativa entre los factores, bacteriocinas,
tiempo y los experimentos. Al registrarse diferencia significativa, se aplicó la prueba
de comparación múltiple de Tukey. Además se analizaron estadísticamente los
resultados de cada tratamiento de Listeria con bacteriocinas por análisis de varianza
simple, con el objeto de establecer en que tiempo se produce la reducción
significativa de L. monocytogenes. Previo a esto se realizó un chequeo de la varianza
mediante el test de Bartlett's. En caso de haber diferencia estadística, se aplicó la
prueba de comparación múltiple de Tukey.
Los resultados de las constantes de velocidad de inhibición en caldo fueron
estudiadas mediante un análisis de varianza simple con un 95% de confianza. Al
28
registrarse diferencias significativas se usó el test de Tukey. El experimento se
elaboró en duplicado con tres determinaciones para cada tratamiento.
3.7. Acción antagonista de la STB C. piscicola y nisina sobre
L. monocytogenes adherida a placas de acero inoxidable
3.7.1. Tratamiento preliminar de las placas de acero inoxidable. Se utilizaron placas
de acero inoxidable (Nº 304) de 4 mm de espesor con dimensiones de 1 x 1 cm. Estas
placas fueron
limpiadas de acuerdo a la
metodología
descrita por HOOD Y
ZOTTOLA (1997). La técnica consistió en el lavado de las placas con acetona por 30
min, un enjuague con agua destilada y un posterior remojado por 1 h en NaOH 1N.
Por último las placas fueron enjuagadas cinco veces con agua destilada y secadas al
aire. Posteriormente se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 min.
3.7.2. Adherencia de L. monocytogenes a las placas de acero inoxidable. Para la
formación de biopelículas sobre las placas de acero inoxidable, se procedió a inocular
1,5 mL de un cultivo de 24 h de L. monocytogenes Lsa 4/00 (concentración inicial
de 1,0 x 109 ufc/mL) en frascos Schott estériles (80 mL de capacidad) con 15 mL de
caldo ST diluido (3.2). Estos frascos fueron usados solo en los experimentos 2 y 3. En
el experimento 1 se usaron matraces Erlenmeyer de 25 mL. Posteriormente se agregó
con pinza estéril una placa de acero inoxidable por frasco. Después de 24 h de
incubación con agitación en shaker (50 rpm) a temperatura ambiente (21ºC - 25ºC),
las placas de acero inoxidable fueron removidas del medio con pinzas estériles y
colocadas en frascos estériles con 35 mL de una solución de sal triptona (triptona
0,1%, NaCl 0,85%), para un lavado con agitación a 50 rpm por 1 min (CHAVANT
et al., 2002). Este lavado se hizo dos veces con el objeto de eliminar las células que
no se fijaron a la placa de acero inoxidable. En la FIGURA 3 se presenta una imagen
del equipo que se usó para incubar las placas de acero inoxidable para la formación
de las biopelículas de L. monocytogenes, para luego ser expuestas a los distintos
tratamientos con bacteriocinas.
29
FIGURA 3. Formación de biopelículas de L. monocytogenes, por incubación de
placas de acero inoxidable con agitación por 24 h a temperatura ambiente (21ºC y
25ºC).
En la FIGURA 4 se muestra la biopelícula de L. monocytogenes que se formó sobre
el acero inoxidable después de 24 h de incubación con agitación, a temperatura
ambiente (21ºC – 25ºC ), en el caldo ST bajo en nutrientes. Una vez que se cumplió
el período de incubación, las placas fueron lavadas y secadas bajo campana de flujo
laminar (Pure Aire, American. Van Nuys. California). Para verificar el desarrollo de
las biopelículas sobre el acero, se procedió a colocar las placas con pinzas estériles
sobre una placa petri que contenía 12 mL de agar ST y se cubrieron con 7 mL de
mismo medio enfriado a 45ºC.
FIGURA 4. Crecimiento de las células de L. monocytogenes adheridas a placas de
acero inoxidable después de 24 h de incubación en CST a temperatura ambiente.
30
Acción de la STB y de la nisina sobre la biopelícula de L. monocytogenes. Las placas
con los microorganismos (L. monocytogenes) adheridos (3.7.2) fueron colocadas en
un volumen de 15 mL de las soluciones inhibidoras, nisina, STB de C. piscicola y la
combinación de ambas, de acuerdo a los tratamientos descritos anteriormente (3.6).
El medio que se usó para preparar las diferentes soluciones inhibidoras fue CST bajo
en nutrientes (3.2)
CUADRO 2.
Soluciones inhibidoras aplicadas sobre las
biopelículas de L.
monocytogenes
Tratamientos
T1 (control)
T2
T3
T4
Soluciones inhibidoras
Nisina
STB C.
piscicola
------7,5
------3,75
3,75
1,88
CST diluido
(mL)
Volumen
total (mL)
15
7,5
11,25
9,38
15
15
15
15
31
El tiempo de acción de las soluciones inhibidoras fue de 0,5 h y 24 h, con agitación
de 60 oscilaciones por min en un baño con temperatura regulada a 10ºC ± 2ºC. El
control del tiempo cero fue colocado directamente en el frasco que contenía los 5 mL
de la solución sal triptona (3.7.4), sin exponerlo a las bacteriocinas. Cumplido el
tiempo de exposición de las placas a los tratamientos, se procedió a neutralizar las
soluciones inhibidoras, sumergiendo las placas en 15 mL proteasa bovina (1mg/mL)
(AHN y STILES, 1990), por 3 min con agitación en shaker.
Metodología para el recuento de células resistentes adheridas sobre las placas de
acero inoxidable. Finalizado el tiempo de neutralización de las bacteriocinas con la
proteasa (3.7.3), se procedió a desprender las células adheridas a las placas de acero
que sobrevivieron a los tratamientos. Para ello se utilizó el procedimiento descrito
por CHAVANT et. al. (2002). Cada placa de acero inoxidable, fue colocada en un
frasco que contenía 5 mL de la solución de sal triptona estéril pH 7,2 (3.7.2) y fue
sometida a sonicado (Sonicador Modelo Ultrasonik 2 QT/H, 220V 50/60 HZ) por un
tiempo de 2 min. El tiempo de sonicado se determinó después de varios ensayos preexperimentales en los cuales se probaron distintos tiempos de sonicado y tipos de
envases, teniendo como referencia el sonicado de 3 min definido por CHAVANT et
al. (2002) (ANEXO 2). Para este trabajo el tiempo de sonicado que se estableció fue
aquel que presentó el mayor recuento de células viables por cm2 a partir de la
solución de triptona y ausencia de desarrollo de colonias de L. monocytogenes
adherida sobre las placas de acero inoxidable (ANEXO 2.2). Para la enumeración de
células viables desprendidas, se realizó un recuento en placa sobre agar ST, usando
las diluciones apropiadas en buffer fosfato pH 7,2. Las placas fueron incubadas a
32ºC ± 2ºC por 48 h.
Todos los tratamientos se efectuaron con tres repeticiones. Los recuentos de L.
monocytogenes a las 0,5 h y 24 h se analizaron estadísticamente mediante el análisis
multifactorial, a fin de determinar diferencias significativas entre los tratamientos y
experimentos. Al comprobarse diferencias significativas se utilizó la prueba de
comparación múltiple de Tukey.
32
3.7.5.
Constantes de inhibición de biopeliculas de L. monocytogenes por
bacteriocionas. De los recuentos de células viables de L. monocytogenes, obtenidas
de los procedimientos anteriores (3.7.4), se determinaron las constantes de velocidad
de inhibición (k), para cada tratamiento, aplicándose el criterio que se utilizó
anteriormente en la determinación de (k) en caldo (3.6.1). Los resultados de los
experimentos fueron analizados por el test Kruskal-Wallis al verificarse por prueba
de Bartlett's que existió diferencia significativa entre las desviaciones estándar al
95% de confianza entre las constantes de velocidad.
33
4. RESULTADOS Y DISCUSION
4.1. Destrucción de L. monocytogenes en presencia de dos
bacteriocinas en un sistema “in vitro”
La primera parte de este trabajo consistió en conocer el efecto bactericida o
bacteriostático de la nisina y la STB de C. piscicola L103 empleadas en forma
separada y en conjunto, en contra de L. monocytogenes Lsa 4/00 en caldo soya
tripticasa (CST), a 10ºC. Los resultados de los recuentos de Listeria, expuesta a 100
UA/mL a las bacteriocinas se presentan en la FIGURA 5 y corresponden al promedio
de dos experimentos separados (ANEXO 3.1). Debido a que no arrojaron diferencias
significativa (p>0,05) entre experimentos, se procedió a analizarlos en conjunto
(ANEXO 3.1.1), determinándose, diferencias (p<0,05) entre las bacteriocinas y el
tiempo.
FIGURA 5.
Recuentos de L. monocytogenes en caldo
ST a 10ºC
diferentes tratamientos con bacteriocinas.
*) Los valores corresponden al promedio de 2 experimentos, cada uno con 3 repeticiones .
frente a
34
En la gráfica se puede observar una diferencia inicial, de los recuentos de L.
monocytogenes en presencia de nisina y la combinación de Nis+STB, comparado con
el tratamiento control. La reducción significativa (p<0,05) en 2,4 ciclos logarítmicos
en el tiempo cero, ha sido publicado para otras bacteriocinas, donde los niveles
iniciales de L. monocytogenes, se reducen dependiendo principalmente de la
concentración y de la actividad de la bacteriocina. NIELSEN et al. (1990),
informaron sobre el efecto inhibidor de una bacteriocina producida por Pediococcus
acidilactici a diferentes concentraciones sobre L. monocytogenes en carne. Ellos
señalaron que cuando se usó un inóculo elevado de L. monocytogenes y una
concentración pequeña de bacteriocina la población de Listeria se redujo en 1 ciclo
logarítmico, los primeros 2 min. Sin embargo, cuando se aplicó una concentración de
5.000 UA/mL de la bacteriocina la población disminuyó en 2 ciclos logarítmicos, en
los primeros 2 min. También WINSKOUSKI et al, (1994), obtuvieron después de 2 a
4 min de exposición, una reducción en la población inicial de L. monocytogenes, en
2,6 ciclos logarítmicos, al agregar nisina a una concentración de 1,5 µg/mL. Esta
rápida acción producida por la ruptura de la membrana citoplasmática se debe según
ABEE et al. (1994b), a la salida total de iones K+, en aproximadamente 20 s, de las
células de L. monocytogenes.
En la FIGURA 5 se observa también, diferencias significativas (p<0,05) entre el
control del cultivo de L. monocytogenes sin bacteriocina y los cultivos de L.
monocytogenes en presencia de las bacteriocinas. El análisis estadístico (ANEXO
3.1.1), arrojó para todos los tratamientos con bacteriocina una reducción significativa
en los recuentos de L. monocytogenes, incluso para la STB de C. piscicola L103.
El tratamiento más efectivo para reducir a L. monocytogenes, fue en presencia de la
combinación de nisina con STB de C. piscicola L103 (Nis+STB), el cual arrojó
recuentos inferiores al límite de la detección para la técnica de siembra en superficie
(<10 ufc/mL), a las 24 h y 48 h.
En este tratamiento la población de L.
monocytogenes disminuyó en 3,2 ciclos logarítmicos a las 24 h lo que se mantuvo a
las 48 h. El análisis estadístico demostró que la disminución de este patógeno, fue
35
significativa (p<0,05) para todos los tiempos respecto al valor inicial (tiempo cero).
Ello indicaría que la combinación Nis+STB tuvo una acción bactericida sobre el
crecimiento de esta bacteria (ANEXO 3.1.2). Estos resultados demuestran que, la
acción combinada entre ambas bacteriocinas, nisina y la STB C. piscicola de L103,
tuvo un efecto sinérgico en contra de L. monocytogenes. Esta interacción positiva
(sinergismo) entre dos bacteriocinas ha sido ya reportada para la pediocina
AcH/nisina, (HANLIN et al.,1993), lactacina B y F con nisina y pediocina AcH y
lacticina 481/pediocina AcH
(MULET- POWELL et al., 1998). En un trabajo
reciente, BOUTTEFROY y MILLIERE (2000), estudiaron el efecto simultáneo y
retrasado de la adición de nisina (50 UI/mL) y curvacina 13 (160 UA/mL), sobre L.
monocytogenes. Ellos mostraron que todas las combinaciones de bacteriocinas
provocaron un efecto de inhibición mayor que el obtenido con solo una bacteriocina.
Sin embargo, solo después de 48 h se alcanzó recuentos bajo el nivel de detección,
cuando ambas bacteriocinas fueron agregadas simultáneamente en el tiempo cero.
Este fenómeno obedece a las diferencias en la sensibilidad y resistencia bacteriana de
las células gram-positiva, las cuales tendrían diferentes receptores específicos en la
superficie celular, para las diferentes bacteriocinas, pudiendo prevenir los variantes
espontáneos resistentes a cualquiera de las bacteriocinas.
VIGNOLO et al. (2000), verificaron que, la combinación de 3 bacteriocinas puede
tener un mayor efecto bactericida sobre Listeria. Ellos estudiaron la efectividad
bactericida de tres bacteriocinas, nisina, enterocina CRL35 y lactocina 705, en forma
individual y combinada, sobre dos cepas de L. monocytogenes y una cepa de L.
inocua, observando que la capacidad bactericida se alcanzó más rápidamente cuando
las tres bacteriocinas se encontraban juntas, arrojando recuentos inferior a 10 ufc/mL,
para todas las cepas de Listeria. Esta inhibición drástica de células viables fue
detectado después de una 1h de inoculación a 30ºC de la mezcla. Los autores sugieren
que esta efectividad corresponde a la diferencia en el mecanismo de acción, por
pertenecer a distinta clases de bacteriocinas.
36
La nisina sola, fue el segundo tratamiento más efectivo en contra de L.
monocytogenes, reduciendo significativamente (p<0,05) la población en 2,7 ciclos
logarítmicos (ANEXO 3.1.3), desde un recuento inicial de 1,9 x 103 ufc/mL a un
recuento inferior a 10 ufc/ mL al término del experimento (48 h). Este resultado
frente a
L. monocytogenes, también fue observado por BOUTTEFROY y
MILLIERE (2000), quienes usando una concentración mas baja (125 UI/mL) a la
utilizada en este estudio (5.000 UI/mL), obtuvieron una disminución en la población
de 4 ciclos logarítmicos después de las 4 h. La acción bactericida se mantuvo durante
las 240 h del experimento. Sin embargo, en varios estudios se ha publicado que nisina
produce un efecto parcialmente bactericida en contra de L. monocytogenes,
mostrando posteriormente un crecimiento de las células patógenas (SCHILLINGER
et al., 1998; VIGNOLO et al., 2000). Sin embargo, en este trabajo no se observó tal
efecto, encontrándose una sobrevivencia de L. monocytogenes o variantes
espontáneos, resistentes a nisina, muy baja (<10 ufc/mL), probablemente por la alta
concentración de nisina usada (5.000 UI/mL) y el corto período controlado.
BOUTTEFROY y MILLIERE (2000), señalaron que la frecuencia de sobrevivientes
a nisina se reduce con un aumento en la concentración de la bacteriocina, estimando
una frecuencia de resistencia de 10-9 para cepas de L. monocytogenes que
sobrevivieron a 1.000 UI/mL de nisina.
El tratamiento menos efectivo para inhibir a L. monocytogenes fue la STB de C.
piscicola L103, comparado con la nisina y la combinación de ambas, sin embargo,
también se observó diferencia con respecto al control. El análisis estadístico reveló
una reducción significativa (p<0,05) en el cultivo de L. monocytogenes después de las
24 h, con una disminución de 0,67 ciclos logarítmicos. Posteriormente a las 48 h, la
población de L. monocytogenes presentó nuevamente un aumento. Ello podría indicar
que la STB de C. piscicola L103 solo exhibió un efecto bacteriostático sobre Listeria
. Este crecimiento que se presenta posterior a una reducción puede deberse a una
insuficiente cantidad de la STB de C. piscicola utilizada para inhibir e interactuar con
todas las células de L. monocytogenes. En este estudio, la actividad de la STB de C.
piscicola L103 fue de 400 UA/mL y la actividad a la cual se trabajó fue de 100
37
UA/mL, lo que implicó diluir la STB, teniendo una menor cantidad de sustancia
antimicrobiana para destruir completamente la población de células disponibles. Sin
embargo, SCHÖBITZ et al. (2003), consiguieron reducciones significativas de L.
monocytogenes Lsa 4/00, con 400 UA/mL de la STB C. piscicola L103 en caldo ST
a 5ºC, logrando disminuir la población en 4,5 ciclos log a los 3 días, en comparación
al recuento inicial.
La existencia de cepas naturalmente resistentes y/o aquellas que desarrollan
resistencia a la STB de C. piscicola, podría ser otra explicación al crecimiento de L.
monocytogenes, después de una reducción en los recuentos. La adaptación de la
membrana celular es probablemente uno de los varios mecanismos involucrados en la
resistencia de L. monocytogenes a la clase IIa de las bacteriocinas, clase a la cual
pertenece C. piscicola (VADYVALOO et al., 2002). Igualmente otros mecanismos
pueden estar implicados en el desarrollo de resistencia. Por ejemplo RAMNATH et
al. (2000) encontró que la resistencia de una cepa de L. monocytogenes a la leucocina
A está asociada a la ausencia de una proteína especifica en la membrana celular.
Indistintamente GRAVESEN et al. (2002b), corroboraron que los cambios de
expresión en dos proteínas, son parte del mecanismo de resistencia a las
bacteriocinas clase IIa.
4.1.1.
Determinación de las constantes de velocidad de inhibición de L.
monocytogenes con nisina, STB y la combinanación de ambas. Mediante el cálculo
de las constantes cinéticas ( k, mL/ufc*h) (ANEXO 4.1), se puede predecir la
velocidad de inhibición de estas sustancias antimicrobianas frente a L.
monocytogenes, comprobándose que la constante cinética del tratamiento Nis+STB
resultó ser la más alta, lo que indicaría una mayor velocidad de inhibición para L.
monocytogenes (FIGURA 6), comparada a los otros tratamientos, donde se usó las
bacteriocinas en forma separada (p<0,05) (ANEXO 4.2). Estos resultados corroboran
que existe una interacción positiva entre ambas bacteriocinas, nisina y STB de C.
piscicola L103, con un efecto sinérgico en contra de L. monocytogenes. En las
FIGURAS 7 y 8 se puede observar la superioridad de la constante de velocidad de
38
inhibición del tratamiento Nis+STB con respecto a las otras dos bacteriocinas,
determinándose que la combinación (Nis+STB) en las condiciones usadas fue 6,0
veces más rápida que nisina sola (FIGURA 7) y 15.900 veces más rápida que la STB
de C. piscicola L103 sola (FIGURA 8), para reducir L. monocytogenes.
FIGURA 6.
Constantes de velocidad (k) de inhibición de L. monocytogenes
expuestas a las diferentes bacteriocinas en caldo ST incubado, a 10ºC.
FIGURA 7. Representación de la superioridad de la constante de velocidad de
inhibición de la combinación Nis+STB con respecto a Nisina.
39
FIGURA 8. Representación de la superioridad de la constante de velocidad de
inhibición de nisina y la combinación Nis+STB con respecto a la STB de C. piscicola
L103 sola.
Se puede observar también que la constante de velocidad de inhibición de L.
monocytogenes con nisina fue superior en 2500 veces con respecto a la constante de
40
la STB de C. pisicicola L103, existiendo diferencia significativa (p<0,05) entre ellas.
Ello indicaría que la actividad de ambas bacteriocinas no fue la misma, como se
estableció en el material y método de este trabajo. A pesar que las actividades de
ambas bactericocinas no fueron equivalentes, se logró un efecto sinérgico de ellas
sobre L. monocytogenes. KALCHAYANAND et al. (1994), señalaron que para
conseguir un efecto sinérgico entre las bacteriocinas, se debe trabajar a un mismo
nivel de actividad final de las bacteriocinas en UA/mL, así como trabajar con la
actividad que produce el máximo efecto de inhibición en la población susceptible.
4.1.2. Determinación de cepas de L. monocytogenes resistentes a las bacteriocinas.
A continuación se presentan los resultados de la capacidad de inhibición de las
bacteriocinas nisina, STB C. piscicola L103 y la combinación de ambas, sobre cepas
de L. monocytogenes Lsa 4/00 sensible y sus variantes resistentes, obtenidas después
de la exposición a los diferentes antimicrobianos durante 1,5 h en el caldo ST diluido
(3.6).
La sensibilidad o resistencia a las bacteriocinas se determinó por presencia o ausencia
de halos de inhibición al añadir 20 µL de las bacteriocinas sobre el césped con la
cepa de L. monocytogenes resistente y/o sensible luego de 5 ciclos de crecimiento
consecutivos en caldo ST a 24 h. Los resultados de sensibilidad (+) y resistencia (-) a
100 UA/mL de las bacteriocinas nisina y STB C. piscicola L103 y la combinación de
ambas bacteriocinas son presentados en el CUADRO 3
Las colonias de L. monocytogenes que fueron resistentes a los tratamientos con
bacteriocinas por un tiempo de 1,5 h, volvieron a ser sensibles a las distintas
bacteriocinas, presentando halos de inhibición sobre el agar. Estos resultados son
confirmados en la FIGURA 5, donde la población de L. monocytogenes, siguió
reduciéndose después de las 1,5 h de exposición a las diferentes bacteriocinas.
Las cepas sensible (control) mostraron halos totalmente nítidos ante todas las
bacteriocinas usadas. Estos fueron observados en distintas diluciones dependiendo de
la bacteriocina. Para la nisina, la mayor dilución que presentó halo de inhibición fue
41
1:4, resultando 200 UA/mL, para la STB la inhibición se presentó en la dilución 1:2
(100 UA/mL) y para la combinación (Nis+STB), se encontró halo en la dilución 1:8
(400 UA/mL). Las cepas originalmente resistentes presentaron zonas de inhibición en
las mismas diluciones que en la cepa control. Sin embargo, en el caso de la STB, el
último halo que fue observado era difuso, mostrando crecimiento en el interior. Cabe
destacar que estos halos difusos fueron igualmente considerados como sensibles.
CUADRO 3. Pruebas
de inhibición con cepas de L. monocytogenes Lsa 4/00
resistentes a los distintos tratamientos con bacteriocinas después de una exposición
de 1,5 h.
Colonias de Listeria resistentes a
los tratamientos con
- Nisina
- STB de C. piscicola L103
- Nis + STB de C. piscicola L103
- Control (cepa sin exposición a
bacteriocinas)
Prueba de inhibición con bacteriocinas
Nisina
STB
Nis+STB
+ + +1)
NR
NR
NR
+++
NR
NR
NR
+++
+++
+++
+++
sensible(+); (-) resistente; (NR) análisis no realizado
1) Resultado de 3 colonias distintas
L. monocytogenes ha mostrado ser resistente a bajas concentraciones de nisina. Sin
embargo, VIGNOLO et al. (2000), en un estudio de sensibilidad realizado en varias
cepas de Listeria, encontraron que todas las variantes de Listeria fueron resistentes a
nisina a concentraciones sobre 2.000 UI/mL . El mecanismo de resistencia de las
cepas de Listeria a nisina (clase I) es atribuido a cambios en la composición de ácidos
grasos y fosfolípidos en la membrana citoplásmica (MING y DAESCHEL, 1995),
como también alteraciones en la pared celular (CRANDALL y MONTEVILLE,
1998), determinándose que la reducción de poros en la membrana citoplasmática por
la nisina está relacionada con la reducción de los fosfolípidos aniónicos y la baja
fluidez de la membrana.
Para la STB de C. piscicola, además se comprobó su resistencia a las 24 h y 48 h de
exposición por encontrarse mayor desarrollo de L. monocytogenes en este
42
tratamiento.
En el CUADRO 4, se observan
las cepas de L. monocytogenes
resistentes a la STB de C. piscicola L 103 por un período de 24 h y 48 h.
CUADRO 4. Resistencia de L. monocytogenes Lsa 4/00 expuestas a la STB de C.
piscicola.
Colonias de Listeria resistentes a la STB de
C. piscicola
24 h (CR a las 24 h)
48 h (CR a las 48 h)
Control (sin exposición a la STB)
Prueba de inhibición con STB de C.
piscicola
+ - -1)
--+++
sensible (+); (-) Resistente
(CR) cepa resistente
1) Resultado de 3 colonias
En general las cepas que sobrevivieron un mayor tiempo a la exposición de la STB
presentaron resistencia total al ser nuevamente expuestas a 100 UA/mL de la STB.
Resultados similares obtuvieron SCHÖBITZ et al. (2003), al poner en contacto la
STB de C. piscicola de actividad 800 UA/mL sobre cepas de L. monocytogenes
resistentes a 400 UA/mL de la STB de C. piscicola L103. Ellos estimaron una
resistencia total de 93% de las colonias al no encontrar zonas de inhibición. Sin
embargo, en este cuadro se observa que hay una cepa resistente CR a las 24 h que
manifestó cierto grado de sensibilidad, mostrando un halo difuso con desarrollo
bacteriano en el interior, BOUTTEFROY y MILLIERE (2000), lo describen como
una inhibición parcial. El desarrollo de resistencia total o parcial de las cepas de L.
monocytogenes explicarían el crecimiento de ésta en presencia de la STB (FIGURA
5). El mecanismo de resistencia de L. monocytogenes a las bacteriocinas de la clase
IIa parece estar involucrada con la modificación del sitio receptor letal de las
bacteriocinas. En este sentido GRAVESEN et al. (2002b), examinaron ocho mutantes
de L. monocytogenes resistentes a las bacteriocinas de la clase IIa, pediocina PA-1 y
leucocina A. La mutación común encontradas en todas la cepas mutantes resistentes
era la falta de una proteína. Ellos definieron que la resistencia de L. monocytogenes y
43
otras bacterias gram positivas a las bacteriocinas está fundamentalmente relacionado
a este sitio común, independiente de cepa, del tipo de bacteriocina de la clase IIa y de
las condiciones ambientales usadas en el estudio.
4.2. Inactivación de células adheridas a placas de acero
inoxidable
Estudios previos han demostrado los efectos de los sanitizantes comerciales sobre
biofilm bacterianos puros de patógenos bajo condiciones de laboratorio en caldo
nutritivo como medio de crecimiento ( BLACKMAN y FRANK, 1996). Sin embargo,
este trabajo mostró la acción del uso de antimicrobianos naturales, como las
bacteriocinas, sobre biopelículas de L. monocytogenes.
Las FIGURAS 9 muestran las curvas de sobrevivencia de células de L.
monocytogenes adheridas a placas de acero inoxidable, después de estar expuesta a
los tratamientos con bacteriocinas. El experimento 1 difiere significativamente
(p<0,05) (ANEXO 5.1.1) de los experimentos 2 y 3, por lo cual se procedió a
analizarlos en forma separada (ANEXO 5.1.2; ANEXO 5.1.3). El bajo recuento de
células viables en el experimento 1 pudo deberse a la baja densidad inicial (3,2
x 104 ufc/cm2 comparado con
1,0 x 105 ufc/cm2) de la biopelícula sobre las superficies. BROWN y GAUTHIER
(1993), indican que, el aumento en la densidad celular, mejoró la resistencia en un
biofilm de P. aeruginosa al yodo.
FIGURA 9.
nactivación de células de L. monocytogenes adheridas sobre acero
inoxidable expuesta a las bacteriocinas
nisina, STB C. piscicola L103 y la
combinación de ambas (Nis+STB). Exp. 1(A) y Exp. 2 y 3 (B)
44
Los tratamientos con bacteriocinas tuvieron en general un efecto favorable en la
eliminación de biopelículas de L. monocytogenes a los tiempos controlados de 0,5 h y
24 h. Efectos similares encontraron NEL et al (2002)
cuando usaron las
bacteriocinas, pediocina PD-1, plantaricina 423 y nisina sobre células de un biofilm
maduro de Oenococcus oeni. Ellos informaron que la adición de PD-1 sobre el
biofilm de O. oeni resultó en una drástica disminución del número de células viables,
a medida que aumentaba el tiempo de contacto (de 1 h a 5 h) y la actividad de la
bacteriocina. Así también señalaron que la PD-1 no solamente inhibe las células en el
45
biofilm, si no que además es eficiente en la remoción de las células no viables en el
biofilm, condición que no cumplen las otras dos bacteriocinas. En su estudio también
señalan que la nisina es efectiva para destruir los microorganismos en la biopelícula,
pero a altos niveles de actividad (1.000 UA/mL a 3.000 UA/mL). Sin embargo, en el
presente trabajo la disminución de las células adheridas al termino del experimento
no solamente se observó en las biopelículas tratadas, sino también en el control,
tratamiento que no fue expuesto a sustancias antimicrobianas. Ello indicaría que la
alta remoción de las bacterias pudo ser ayudada por ciertos factores externos, como la
agitación, que se mantuvo durante 24 h que estuvo en contacto con las bacteriocinas.
FRANK y CHMIELEWSKI (1997), encontraron reducciones significativa en la
población Staphylococcus aureus, al combinar 20 s de remoción física con
inactivación química.
Otro probable agente involucrado en la separación de las células de las placas de
acero inoxidable podría ser el estrés provocado por la temperatura. En este trabajo las
biopelículas fueron cultivadas a una temperatura de 21ºC a 25ºC y posteriormente
fueron sumergidas en las soluciones antimicrobianas por 24 h a una temperatura de
10ºC. Este cambio drástico de temperatura podría inducir a cambios en el
metabolismo de la célula, llevándolas a separarse de la superficie. La edad del
biofilm y la producción de sustancia extracelulares también confieren resistencia a los
agentes antimicrobianos. En este caso se trató de un biofilm de L. monocytogenes de
24 h y la producción de material extracelular en L. monocytogenes, ocurriría después
de dos días de contacto (JEONG y FRANK, 1994) o probablemente no se produciría
según ZOTTOLA (2001), sugiriendo que la adherencia de L. monocytogenes es
reversible.
Para verificar si la disminución de los recuentos en el control se debió a la agitación o
a otras causas, se realizó un nuevo experimento (ANEXO 6). En éste, las placas con
las biopelículas y las bacteriocinas junto con el control, fueron agitadas solo por
media hora, luego se dejaron a 10ºC durante 24 h. Los resultados nuevamente
arrojaron una reducción en los recuentos en el control, que no fue significativo en el
46
corto período de agitación. Sin embargo, los recuentos microbianos del periodo sin
agitación (24 h), se encontró un descenso significativo (p<0,05) de las biopelículas en
el control, de 4,6 Log a 4 Log (ANEXO 6.0; ANEXO 6.2). Esto podría indicar que
existen otros mecanismos involucrados en la separación de las células de una
superficie, que aún no han sido aclarado. CHAE y SCHRAFT, (2001) y CHAVANT
et al (2002), reportaron resultados similares para biopelículas de L. monocytogenes,
donde la reducción ocurrió después de 2 días y después de 24 h respectivamente. La
explicación que señalan CHAE y SCHRAFT (2001), a éste hecho, es que células de
Listeria pueden activamente desligarse durante ciertas fases de crecimiento del
biofilm. WONG et al. (2002) señalaron que el declive de un biofilm de V.
parahaemoliticus sobre superficies sólidas pudo deberse a la limitación de nutrientes
o la acumulación de metabolitos con propiedades inhibitorias.
En la FIGURA 9 también se observa que los tratamientos con nisina y Nis+STB
inactivaron significativamente las células adheridas de L. monocytogenes.
combinación Nis+STB arrojó recuentos inferiores a 10 ufc/cm2
La
en todos los
experimentos, los cuales fueron significativos (p<0,05) (ANEXO 5.1.2; ANEXO
5.1.3), con respecto al control y al número inicial de células adheridas. Nisina sola,
igualmente redujo la población bacteriana significativamente (p<0,05), obteniendo al
término del experimento recuentos inferiores a 100 ufc/cm2. El tratamiento que
presentó diferencias en la inhibición de biopelículas de L. monocytogenes fue la STB
de C. piscicola L103. En el primer experimento (FIGURA, 9A), este tratamiento no
tuvo diferencia con el control (ANEXO 5.1.2), lo que indicaría su poca capacidad de
penetrar en la biopelícula y provocar una reducción de la bacteria. En cambio, en los
experimentos 2 y 3 (FIGURA 9 B) y en la figura del ANEXO 6.1 se observa una
disminución significativa (P<0,05), de células adheridas con respecto al control. La
diferencia encontrada podría deberse a la baja cantidad de células adheridas en el
primer experimento (FIGURA 9 A), lo que podría aumentar la resistencia, de las
células a los agentes antimicrobianos
según RONNER y WONG (1993). Sin
embargo, BROWN y GAUTHIER (1993) señalan que la resistencia de las células
mejora al aumentar la densidad. Cabe mencionar que las diferencias en la densidad
47
inicial en las biopelículas en los experimentos pudo estar influenciado por los
distintos envases de cultivo usados. En el experimento 1, se usaron envases de menor
superficie de área que en los experimentos 2 y 3, lo cual parece influir en el desarrollo
del biofilm (EDSTROM, s/f )
Los sanitizantes químicos comúnmente usados en las industrias alimentaria obtienen
reducciones bacterianas de 3 a 5 unidades logarítmicas en un tiempo breve
(STOPFORTH et al., 2002). Las bacteriocinas en cambio reducen las células
adheridas en 1,5 a 4 ciclos logarítmicos en un tiempo prolongado, con respecto al
valor inicial y de 1,6 a 2 ciclos log en comparación al control. Una desventaja en
términos prácticos porque las industrias buscan reducir el
procedimiento de
desinfección, requiriendo desinfectantes que produzcan una efectividad en un tiempo
mínimo (BEST et al., 1990). Una característica que permitiría utilizarlas en plantas
procesadoras de alimentos es que pueden permanecer sobre superficies, por períodos
prolongados, sin provocar residuos tóxicos en los alimentos ni contaminación del
medio ambiente a diferencia de los químicos. Fuera de evaluar la concentración
mínima de éstas sustancias para ser efectivas, resulta una ventaja sobre los
sanitizantes químicos comúnmente usados.
Es importante aclarar que este estudio fue llevado a cabo bajo condiciones de
laboratorio. Las superficies de plantas de procesos de alimentos son usualmente
colonizadas por comunidades microbianas con
diversidad de especies que
representan un amplio rango de actividades fisiológicas que aumentan la resistencia a
la desinfección (ARIZCUN et al., 1998)
4.3.
Velocidades de inhibición de células adheridas de
Listeria por bacteriocinas.
La rapidez de inhibición de L. monocytogenes en las biopelículas tratadas con
bacteriocinas, se pudo relacionar con la constante, para ello se usó el procedimiento
descrito en 3.6.1 y el ANEXO 4. Las constantes cinéticas (mL/ufc*h), resultaron de la
regresión lineal (1/c = a+k*t) de la ecuación de segundo orden 1/c - 1/c0 = k*t
48
(ANEXO 5.2). La figura 10 presenta gráficamente el promedio de las constantes de
inhibición de L. monocytogenes adherida sobre placas de acero inoxidable después
de ser incubadas en presencia de distintas bacteriocinas.
FIGURA 10. Constantes de velocidad (k) de inhibición de las biopelículas de L.
monocytogenes expuestas a los diferentes tratamientos con bacteriocinas, a 10ºC.
Al observar la constante de cinéticas de los tres experimentos se pudo determinar que
los tratamientos con nisina y la Nis+STB difieren significativamente (p<0,05) del
control (biopelícula no expuesta a la bacteriocina) (ANEXO 5.2.4). La combinación
de Nis+STB es el tratamiento que inhibe o elimina más rápidamente las células de L.
monocytogenes adheridas a una placa de acero inoxidable. Esta interacción sinérgica
entre nisina y la STB de C. piscicola se observó también anteriormente en caldo
(
4.1; 4.1.1).
La STB de C. piscicola no mostró tener una velocidad de remoción de bacterias
adheridas distinta del control. Sin embargo, hay que mencionar que la cinética de
velocidad obtenidas en biopeliculas de L. monocytogenes por las bacteriocinas se
determinó analizando solo tres puntos (0, 0,5 y 24 h), para cada tratamiento, el bajo
49
número de determinaciones podría inducir a algún error en las conclusiones. En
estudios futuros la cinética de remoción de biopeliculas con bacteriocinas debería
hacerse con un seguimiento a intervalos de tiempo más cortos.
Al comparar las constantes de velocidad de inhibición de L. monocytogenes por las
bacteriocinas en el caldo (ANEXO 4.1) y en las biopelículas (ANEXO 5.2), se pudo
determinar que las constantes de velocidad fue mayor en las biopelículas. El
tratamiento de Nis+STB fue superior 4 veces en la biopelícula que en el caldo. Nisina
en cambio presenta diferencia con respecto al caldo de 17 veces en el experimento 1 y
en los experimentos 2 y 3 fue solo 2 veces. Por otro lado la cinética de inhibición de
biopelículas de Listeria con la STB de C. piscicola, mostró una superioridad
significativa con respecto caldo. Estos resultados difieren a lo encontrado en
literatura, ya que los sanitizantes son mucho más efectivos en células en suspensión
que en biofilm (OH y MARSHALL, 1996 ). Esto lleva a determinar que existen otros
factores que no se han considerado, que aumentarían la separación de las bacterias de
las placas. Esto llevaría a señalar que el tratamiento de sonicado usado para remover
las células de las superficie de acero, podría también incrementar la lisis de las
células adheridas a las superficies, por un efecto combinado entre ambos
tratamientos. El mecanismo acción por ultrasonido se atribuye generalmente a la
cavitación, microburbujas formadas por las ondas de sonido que estallan en la pared
celular, produciendo poros en la membrana celular. Sin embargo, se hicieron ensayos
pre-experimentales que determinaron el tiempo necesario para soltar las células de L.
monocytogenes de las placas de acero inoxidable sin destruir las células.
La utilización de las bacteriocinas sobre biopelículas de L. monocytogenes podría ser
favorable para contrarrestar la adhesión de este patógeno sobre las superficies de
acero inoxidable, por lo tanto se debe seguir estudiando, para obtener resultados más
concretos.
50
5. CONCLUSIONES
La combinación de nisina con la sustancia tipo bacteriocina (STB) de C. piscicola
L103 y nisina sola tuvieron un efecto bactericida sobre L. monocytogenes en caldo
soya tripticasa (CST) a 10ºC La STB de C. piscicola L103 sola, presentó un efecto
bacteriostático sobre el patógeno
La combinación de ambas bacteriocinas, nisina y la STB de C. piscicola L103
mostraron un efecto sinérgico para inhibir a L. monocytogenes Lsa 4/00, reduciendo
la población a niveles no detectables (<10 ufc/mL) en 24 h a 10ºC.
La constante de inhibición de L. monocytogenes frente a la combinación de Nis+STB
fue significativamente superior a las constantes con nisina sola y la STB de C.
piscicola sola.
Las cepas resistentes que sobrevivieron a la exposición durante 1,5 h a los distintos
tratamientos fueron, después de 5 ciclos de crecimiento, nuevamente sensibles a las
bacteriocinas. Las cepas resistentes a la STB de C. piscicola por un tiempo de
exposición 24 h y 48 h, se mantuvieron resistentes al ser nuevamente puesta en
contacto con la bacteriocina.
La aplicación de los distintos tratamientos con bacteriocinas sobre L. monocytogenes
adherida sobre la superficie de acero inoxidable, arrojaron que las bacteriocinas
nisina y la combinación Nis+STB redujeron significativamente los recuentos
microbianos en 3,5 y 4 ciclos log con respecto al valor inicial y en comparación al
control en 1,6 y 2 ciclos log.
BIBLIOGRAFIA
51
ABEE, T., KLAENHAMMER, T. y LETELLIER, L. 1994a. Kinetic studies of
lactacin F, a bacteriocin produced by Lactobacillus johnsonii that form poration
complex in the cytoplasmic membrane. Appl. Environ. Microbiol. 60 (3): 1006-1013.
ABEE, T., ROMBOUTS, F., HUGENHOLTZ, J., GUIHARD, G. y LETELLIER, L.
1994b. Mode of action of nisin Z against Listeria monocytogenes Scott A grown at
high and low temperatures. Appl. Environ.Microbiol. 60 (4): 1962-1968.
AHN, C. y STILES, M. 1990. Plasmid – associated bacteriocin production by a strain
of Carnobacterium piscicola from meat. Appl. Environ. Microbiol. 56 (8): 2503-2510
ARIZCUN, C., VASSEUR, C. y LABADIE, J. 1998. Effect of several
decontamination procedures on Listeria monocytogenes growing in biofilm.J. Food
Prot. 61 (6): 731-734.
BAREFOOT, S. y KLAENHAMMER, R. 1983. Detection and activity of lactacin B,
a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophylus. Appl. Environ. Microbiol. 45
(6): 1808-1815.
BARNES, L., LO, M., ADAMS, M., y CHAMBERLAIN, H.1999. Effect of milk
proteins on adhesion of bacteria to stainless steel surfaces. Appl. Environ. Microbiol.
65 (10): 4543-4548.
BENDINGER, B., RIJNAARTS, H., ALTENDORF, K. y ZEHNDER, A. 1993.
Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related
to the presence and chain length of mycolic acids. Appl. Environ. Microbiol. 59 (11):
3973-3977.
BEST, M., KENNEDY, M. y COATES, F. 1990. Efficacy of a variety of disinfectans
against Listeria spp. Appl. Environ. Microbiol. 56 (2): 377-380.
BLACKMAN, I. y FRANK, J. 1996. Growth of Listeria monocytogenes as a biofilm
on various food processing surfaces. J. Food Prot. 59 (8): 827-839.
BOUTTEFROY, A. y MILLIERE J.-B. 2000. Nisin-curvaticin 13 combinations for
avoiding the regrowth of bacteriocin resistant cells of Listeria monocytogenes ATCC
15313. Int. J. Food Microbiol. 62: 65-75.
BOWER, C., MCGUIRE, J. y DAESCHEL, M. 1995. Suppression of Listeria
monocytogenes colonization following adsorption of nisin onto silica surfaces. Appl.
Environ. Microbiol. 61 (3): 992-997.
52
BOWER, C., DAESCHEL, M. y MCGUIRE, J. 1998. Protein antimicrobial barriers
to bacterial adhesion. J. Dairy Sci. 81 (10): 2771-2778.
BRUNO, M. y MONTVILLE, T. 1993. Common mechanistic action of bacteriocins
from lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 59 (9): 3003-3010.
BROWN, M. y GAUTHIER, J. 1993. Cell density and growth phase as factor in the
resistance of a biofilm of Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27 853) to iodine. Appl.
Environ. Microbiol. 59 (7): 2320-2322
CHAE, M. y SCHRAFT, H. 2001. Cell viability of Listeria monocytogenes biofilms.
Food Microbiology. 18: 103-112
CHAVANT, P.; MARTINIE, B.; MEYLHEUC, T.; BELLON-FONTAINE, M. y
HEBRAUD, M. 2002. Listeria monocytogenes LO28 : Surface physicochemical
properties and ability to form biofilms at different temperatures and growth phases.
Appl. Environ. Microbiol. 68 (2): 728-737.
CHEN, H. y HOOVER, D. 2003. Bacteriocins and their food applications. Copr. Rev
in Food Sci and Food Safety. 2: 82-100.
CHIKINDAS, M., GARCIA, M., .DRIESSEN, A., LEDEBOER, NISSEN, J. NES I.,
ABEE, T., KONINGS, W. y VENEMA, G. 1993. Pediocin PA-1 a bacteriocin from
Pediococcus acidilactici
PAC1.0, forms hydrophilic pores in the cytoplasmic
membrana of target cells. Appl. environ. Microbiol. 59 (11): 3577-3584 .
CHMIELEWSKI, R., FRANK , J. 2003 Biofilm formation and control in food
processing facilities. Copr. Rev. in Food Sci. and Food Safety. 2: 22-32
CINTAS, L., CASAUS, M., HERRANZ, C. NES, I. y HERNANDEZ, P.2001.
Review: Bacteriocins of lactic acid bacteria. Food Sci. Tech. Int. 7 (4): 281-305.
CLEVELAND, J., MONTVILLE, T., NES, I. y CHIKINDAS, M. 2001.
Bacteriocins: safe, natural antimicrobils for food preservation. Int. J. Food Microbiol.
71: 1-20
CRANDALL, A. y MONTVILLE, T. 1998. Nisin resistance in Listeria
monocytogenes ATCC 700302 is a complex phenotype. Appl. Environ.Microbiol. 64
(1): 232-237.
53
DAESCHEL, M., MCGUIRE, J. y AL-MAKHLAFI, H. 1992. Antimicrobial activity
of nisin adsorbed to hydrophilic and hydrophobic silicon surfaces. J. Food Prot. 55
(9): 731-735
DALET, K., CENATIEMPO, Y., COSSART, P. y HECHARD, Y. 2001. A σ54
dependent PTS permease of the mannose family is responsible for sensitivity of
Listeria monocytogenes to mesentericin Y 105. Microbiology 147: 3263-3269.
DAVEY, M. y O’TOOLE, G. 2000. Microbial biofilm: from ecology to molecular
genetics. Microbiol. Mol. Biol. Revs. 64 (4): 847-867.
DELGADO, R. 2001. Efecto de una bacteriocina de Carnobacterium piscicola
parcialmente purificada sobre salmón fresco refrigerado. Tesis Lic. Ing. Alimentos.
Valdivia. Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias p 27-30
DUFFES, F., CORRE, C., LEROL, F., DOUSSET, X. y BOYAVAL, P. 1999.
Inhibition of Listeria monocytogenes by in situ produced and semipurified
bacteriocins of Carnobacterium spp. on vacuum-packed, refrigerated cold-smoked
salmon. J. Food Prot. 62 (12): 1394-1403.
DUFFES, F., JENOE, P. y
BOYAVAL, P. 2000. Use of two-dimensional
electrophoresis to study differential protein expression in divercin V41-resistant and
wild-type strains of Listeria monocytogenes. Appl. environ. Microbiol. 66 (10): 43184324
DUNNE M. W. 2002. Bacterial Adhesion: Seen Any Good Biofilms Lately? Clin.
microbiol. Rev.15 (2): 155-166
EDSTROM. s/f. Biofilm. Disponible: http://www.edstrom.com/resources.cfm? docid=146. Leído Marzo 2004.
EIJSINK, V., SKEIE, M., MIDDELHOVEN, P., BRURBERG, M. y NESS I. 1998.
Comparative studies of class IIa bacteriocins of lactic acid bacteria. Appl. Environ.
Microbiol. 64 (9): 3275-3281.
EKLUND, M., POYSKY, F., PARANJPYE, R., LASHBROOK, L., PETERSON, M.
y PELROY, G. 1995 Incidencea and sources of Listeria monocytogenes in cold
smoked fishery products and processing plants. J. Food Prot. 58 (5): 502-508.
FATEMI, P. y FRANK, J. 1999. Inactivation of Listeria monocytogenes/
Pseudomonas biofilms by peracid sanitizers. J. Food Prot. 62 (7): 761-765.
54
FLETCHER, M. y LOEB, G. 1979. Influence of substratum characteristics on the
attachment of a marine Pseudomonad to solid surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 37
(1): 67-72.
FRANK, J. y CHMIELEWSKI, R. 1997. Effectiveness of sanitation with quaternary
ammonium compound or chlorine on stainless steel and other domestic foodpreparation surfaces. J. Food Prot. 60 (1): 43-47.
FRANK, J. y KOFFI, R. 1990. Surface-adherent growth of Listeria monocytogenes in
associated with increased resistance to surfactant sanitizers and heat. J. Food Prot.53
(7): 550-554.
FROST, A. A. y PEARSON, R.G.1961 In. Kinetic and mechanism second edition
New york. London, John Wiley & Sons, Inc. Toppan Company, Ltd., Tokyo, Japan.
Chapter 2 pp 8-26
GRAVESEN, A., JYDEGAARD A., MENDES DA SILVA, A. J.,HANSEN, T. B. y
KNØCHEL, S. 2002a. Frequency of
bacteriocin resistance development and
associated fitness costs in Listeria monocytogenes. Appl. Environ Microbiol 68 (2):
756-764.
GRAVESEN, A., RAMNATH, M., RECHINGER, K., ANDERSEN, N., JANSCH,
L., HECHARD, Y., HASTINGS, J. y KNØCHEL, S. 2002b. High-level resistance to
class IIa bacteriocins is associated with one general mechanism in Listeria
monocytogenes Microbiology. 148 (8): 2361-2369.
HANLIN, M., KALCHAYANAND, N., RAY, P. y RAY, B. 1993. Bacteriocins of
lactic acid bacteria in combination have greater antibacterial activity. J. Food Prot.
56 (3): 252-255.
HELKE, D., SOMERS, E. y WONG, A. 1993. Attachment of Listeria
monocytogenes and Salmonella typhimurium to stainless steel and buna-n in the
presence of milk and individual milk components. J. Food Prot. 56 (6): 479-484.
HERALD, P. y ZOTTOLA, E. 1988. Attachment of Listeria monocytogenes to
stainless steel surfaces at various temperatures and pH values. J. Food Sci. 53 (5):
1549-1552.
55
HOOD, S. y ZOTTOLA, E. 1997. Growth media and surface conditioning influence
the adherence of Pseudamonas fragi, Salmonella typhimurium, and Listeria
monocytogenes cells to stainless steel. J. Food Prot. 60 (9): 1034-1037.
JEONG, D. y FRANK , J. 1994 . Growth of Listeria monocytogenes at 10 ºC in
biofilms with microorganisms isolated from meat and dairy processing environments.
J. Food Prot. 57 (7): 576-586.
KALCHAYANAND, N., SIKES, T., DUNNE, C. y RAY, B. 1994. Hidrostatic
pressure and electroporation have increased bactericidal efficiency in combination
with bacteriocin. Appl. Environ. Microbiol. 60 (11): 4174-4177.
KIM, K. y FRANK, J. 1995. Effect of nutrients on biofilm formation by Listeria
monocytogenes on stainless steel. J. Food Prot. 58 (1): 24- 28.
KRYSINSKI, E.; BROWN, L. y MARCHISELLO, T. 1992. Effect of cleaners and
sanitizers on Listeria monocytogenes attached to product contact surfaces. J. Food
Prot. 55 (4): 246 -251.
KORBER, D., CHOI, A., WOLFAARDT, G., INGHAM, S. y CALDWELL, D.
1997. Substratum topography influences susceptibility of Salmonella enteritidis
biofilm to trisodium phosphate. Appl. Environ. Microbiol. 63 (9):3352-3358.
KUEHN, M.,HAUSNER, M., BUNGARTZ, H., WAGNER, M., WILDERER, P. y
WUERTZ,
S. 1998.
Automated confocal laser
Semiautomated Image Processing for Analysis of
scanning
microscopy and
Biofilms.
Appl. Environ.
Microbiol. 64 (11): 4115-4127.
LAMA, P. 2002. Caracterización de una bacteriocina producida por una bacteria
ácido láctica de carne envasada al vacío. Tesis Lic. Ing. Alimentos. Valdivia.
Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias. pp 29-30-44.
LILLARD, H. S.1985 Bacterial cell characteristics and conditions influencing their
adhesion to poultry skin. J. Food Prot. 48: 803-807.
LEE, S.-H. y FRANK, J. 1991. Inactivation of surface-adherent Listeria
monocytogenes hypochlorite and heat. J. Food Prot. 54 (1): 4 - 6.
LUNDEN, J., MIETTINEN, M., AUTIO, T. y KORKEALA, H. 2000. Persistent
Listeria monocytogenes strains show enhanced adherence to food contact surface
after short contact times. J. Food Prot. 63 (9):1204-1207.
56
MAFU, A., ROY, D., GOULET, J. y MAGNY, P. 1990. Attachment of Listeria
monocytogenes to stainless steel, glass, polypropylene, and rubber surfaces after short
contact times. J. Food Prot. 53 (9): 742-746.
McMULLEN, L. y STILES, M. 1996. Potential for use bacteriocin-producing lactic
acid bacteria in the preservation of meats. J. Food Prot. Supplement:/ 64-71.
MEDINA, M., GAYA, P. y NUÑEZ, M. 1992. Bacteriocinas producidas por
bacterias lácticas. Revista Española de Lechería. Febrero 28-33.
MITTELMAN M. W.1998. Symposium: biofilms: Development and control structure
and functional characteristics of bacterial biofilms in fluid processing operations. J.
Dairy Sci. 81 (10): 2760-2764.
MING, X. y DAESCHEL, M. 1995. Correlation of cellular phospholipid content with
nisin resistance of Listeria monocytoges Scott A. J. Food Prot. 58 (4): 416-420.
MONTVILLE, T.,y WINKOWSKI. 1997. In: Food Microbiology. Fundamentals and
frontiers. Editors M. Doyle. American Society for Microbiology . pp 557-577.
MULET-POWELL, N., LACOSTE-ARMYNOT, A., VIÑAS, M. y SIMEON DE
BUOCHBERG, M. 1998. Interactions between pairs of bacteriocins from lactic
bacteria. J. Food Prot. 61 (9): 1210-1212.
MURIANA, P. M. 1996. Bacteriocins for control of Lísteria spp. in food. J. Food
Prot. Supplement:/ 54-63.
NEL, H., BAUER, R., WOLFAARDTG. y DICKS, L. 2002. Effect of bacteriocins
pediocin PD-1, plantaracin 423, and nisin on the biofilms of Oenococcus oeni on a
stainless steel. Am. J. Enol. Vitic. 53 (3):191-196.
NETTLES, C. y BAREFOOT, S. 1993. Biochemical and genetic characteristics of
bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria. J. Food Prot. 50 (4): 338-356.
NIELSEN, J., DICKSON ,J. y CROUSE, J. 1990. Use of a bacteriocin produced by
Pediococcus acidilactici to inhibit Listeria monocytogenes associated with fresh
meat. Appl. Environ. Microbiol. 56 (7): 2142-2145.
NUÑEZ, G.,CAYRE, M., CASTRO, M. y GARRO, O. 2002. Efectividad y modo de
acción
de
nisina
sobre
Lactobacillus
fructivorans.
Disponible:
http://www.unne.edu.ar/cyt/2002/08-Exactas/E-004.pdf. Leído: Marzo 2004.
57
OH, D.-H. y MARSHALL, D. 1996. Monolaurin and acetic acid inactivation of
Listeria monocytogenes attached to stainless steel. J. Food Prot. 59 (3): 249 -252.
O’KEEFFE, T. y HILL, C. 2000. Bacteriocins. En:
Enciclopedy of food
microbiology. Robinson, Batt, Palet. Academic Press. Londres, Gran Bretaña pp 185189
PEREZ, J., SALMERON, J., ALBISU, M. y
CASAS, C. 1999. Formación de
películas biológicas en la industria alimentaria (Biofilms in the food industry). Food
Sci. and Tech. Int. 5 (1): 25-30.
PICKETT, E. y MURANO, E. 1996. Sensitivity of Listeria monocytogenes to
sanitizers after exposure to a chemical shock. J. Food Prot. 59 (4): 374-378.
PRINGLE, J. y FLETCHER, M. 1983. Influence of substratum wettability on
attachment of freshwater bacteria to solid surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 45 (3):
811-817
RAMNATH, M., BEUKES, M., TAMURA, K. y HASTINGS, J. 2000. Absence of a
putative mannose-specific phosphotransferase system enzyme IIAB component in a
leucocin A-resistant strain of Listeria monocytogenes, as shown by two-dimensional
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis. Appl. Environ.
Microbiol. 66 (7): 3098-3101.
REQUENA, T. y PELAEZ, C.1995. Actividad antimicrobiana de bacterias lácticas.
Producción bacteriana. Rev. Esp. Cienc. Tecnol. Aliment. 35 (1): 19-44
ROCOURT, J. y COSSART, P.1997. In: Food microbiology. Fundamentals and
frontiers. Editors M. Doyle. American Society for Microbiology. pp 337- 352.
RONNER, A. y WONG, A. 1993. Biofilm development and sanitizer inactivation of
Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium on stainless steel and buna-n
rubber. J. Food Prot. 56 (9):750-758.
RYSER, E. 1998. In: Applied Dairy Microbiology. Public Health Concerns. Editado
por Marth, E. y Steele, J. pp 263-404.
SCHILLINGER, U., CHUNG, H., KEPPLER, K. y HOLZAPFEL, H. 1998. Use of
bacteriocinogenic lactic acid bacteria to inhibit spontaneous ninsin-resistant mutants
of Listeria monocytogenes Scott A. J. Appl. Microbiol. 85: 657-663.
58
SCHILLINGER, U. y STILES, M. 1993. Bacteriocin production by Carnobacterium
piscicola LV 61. Int. J. Food Microbiol. 20: 131-141.
SCHÖBITZ, R., ZAROR, T., LEON, O. y COSTA, M. 1999. A bacteriocin from
Carnobacterium piscicola for the control of Listeria monocytogenes in vacuumpackaged meat. Food Microbiol. 16: 249-255.
SCHÖBITZ, R., SUAZO, V., COSTA, M. y CIAMPI, L. 2003. Effects of a
bacteriocin-like inhibitory from Carnobacterium piscicola against human and salmon
isolates of Listeria monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 84: 237-244.
SHIN-HO-LEE, FRANK, J. 1991. Inactivation of surface adherent Listeria
monocytogenes. hypochlorite and heat. J. Food Prot. 54(1): 4-6.
SMOOT, L. y PIERSON, M. 1998a. Influence of environmental stress on the kinetic
and strength of attachment of Listeria monocytogenes Scott A to bunan-n rubber and
stainless steel. J. Food Prot. 61(10): 1286-1292.
SMOOT, L. y PIERSON, M. 1998b. Effect of environmental stress on the ability of
Listeria monocytogenes Scott A to attach to food contact surfaces. J. Food Prot.
61(10): 1293-1298.
STOPFORTH, J. SAMELIS, J., SOFOS, J., KENDALL, P. y SMITH, G. 2002.
Biofilm formation by acid-adapted and nonadapted Listeria monocytogenes in fresh
beef decontamination washings and its subsequent inactivation with sanitizer. J. Food
Prot. 65 (11): 1717-1727.
THOMAS, L. y WIMPENNY, J. 1996. Investigation of the Effect of Combined
variations in temperature, pH, and NaCl concentration on nisin inhibition of Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus. Appl. Environ. Microbiol. 62 (6): 20062012
TOMPKIN, R. B. 2002. Control of Listeria monocytogenes in the food-processing
environment. J. Food Prot. 65 (4): 709-725.
VADYVALOO, V., HASTINGS, J., VAN DER MERWE, M. y RAUTENBACH, M.
2002. Membranes of class IIa bacteriocin-resistant Listeria
monocytogenes cells
contain increased levels of desaturated and short-acyl-chain phosphatidylglycerols.
Appl. Envriron. Microbiol. 68 (11): 5223-523
59
VANHAECKE, E., REMON, J., MOORS, M, RAES, F., DE RUDDER, D. y VAN
PETEGHEM, A. 1990. Kinetics of Pseudomonas aeruginosa adhesion to 304 and
316-L stainless steel: role of cell surface hydrophobicity. Appl. Environ. Microbiol.
56 (3):788-795
VATANYOOPAISARN, S., NAZLI, A., DODD, C., REES, C., y WAITES W. 2000.
Effect of flagella on initial attachment of Listeria monocytogenes to stainless steel.
Appl. Environ. Microbiol. 66 (2): 860-863.
VIGNOLO, G., PALACIOS, J., FARIAS, M., SESMA, F., SCHILLINGER, U.,
HOLZAPFEL, W. 2000. Combined effect of bacteriocins on the survival of various
Listeria species in broth and meat system. Curr. Microbiol 41: 410-416.
WATNICK, P., y KOLTER, R. 2000. Biofilms, city of microbes J. Bacteriol. 182
(10): 2675-2679.
WESSELS, S. y HUSS, H. 1996. Suitability of Lactococcus lactis subsp. Lactis
ATCC as a protective culture for lightly preserved fish products. Food Microbiology
13 (4): 323-332.
WINKOWSKI, K., BRUNO, M. y MONTVILLE, T. 1994. Correlation of
bioenergetic parameters with cell death in Listeria monocytogenes cells exposed to
nisin. Appl. Environ. Microbiol. 60 (11): 4186-4188.
WONG, H., CHUNG, Y., y YU, J. 2002. Attachment and inactivation of Vibrio
parahaemolyticus on stainless steel and glass surface. Food Microbiology. 19: 341350.
ZOTTOLA, E. A. 1994. Microbial attachment and biofilm formation: A new problem
for the food industry?. 48 (7) 107-114.
ZOTTOLA, E. 2001. Reflections on Salmonella and other “wee beasties” in foods.
Food Technology 55(9): 60-67.
ANEXOS
ANEXO 1.
Procedimientos ensayados para la
purificación parcial de una STB de C. piscicola L 103
60
1.1. Purificación por Ultrafiltración. Para la purificación de la STB se utilizó el
método de ultrafiltación descrito por DELGADO (2001), para lo cual se utilizó un
equipo Millipore de 140 mm de diámetro de membrana circular, con filtros de 30 KD,
10 KD (Millipore Corporation, U.S.A.) y 3 KD (Diaflo Amicon, U.S.A.), con una
diafiltración final en 3 KD. El procedimiento consistió en hacer pasar un volumen
de 200 mL del extracto crudo de la STB C. piscicola L103 previamente centrifugado
(7.700 x g/15 min) por cada membrana en el orden mencionado anteriormente a una
presión constante de 60 Psi, obteniéndose un retenido y un permeado. El retenido una
vez díafiltrado en la membrana de 3KD con agua desionizada (10 mL) fue retirado
por succión manual, esterilizado por filtración (filtro 0,22 µm) y almacenado a
-
18ºC.
Se obtuvo inhibición en el permeado de las dos primeras membranas utilizadas,
posteriormente se determinó las unidades de actividad (UA/mL) al retenido de la
membrana 3KD, obteniendo resultados de 100 UA/mL valor inferior a las unidades
de actividad determinadas para el extracto crudo de la STB C. piscicola de 400
UA/mL.
1.2. Purificación parcial de la STB por precipitación y filtración por tamiz. Para la
purificación de la sustancia tipo bacteriocina (STB), se siguió el protocolo
especificado por LAMA (2002).
1.2.1.
Precipitación con sulfato de amonio. El sobrenadante obtenido de la
centrifugación de un cultivo de 24 h de C. piscicola L103 fue sometido a una
precipitación con sulfato de amonio (NH4)2SO4 (Merk) al 65% de saturación, este se
agregó lentamente bajo agitación manual constante, en un ambiente de refrigeración
(4°C± 2°C). Posteriormente , la mezcla se dejó en reposo durante 30 min, a 4°C, para
permitir la precipitación de las proteínas. Trascurrido este periodo la solución se
centrifugó a 7.700 x g por 30 min , obteniéndose un pellet, el cual fue resuspendido
en 5 mL. de buffer fosfato (NaH2PO4 + Na2HPO4) 0,05 M a pH 7,0.
61
1.2.2. Separación por cromatografía de filtración por tamiz. En esta etapa se procedió
a la separación del sulfato de amonio y a la purificación parcial de la bacteriocina
obtenida en (1.2.1). Se realizó una cromatografía en Sephdex G-50 (Sigma), para lo
cual se montó una columna de 1,0 cm de diámetro y 35 cm de largo, a la que se le
adiciona la
solución
tampón de TRIS-HCL 20 mM y NaCl 50 mM, pH 7,5,
dejándolo escurrir hasta la mitad de la columna, para eliminar burbujas. En seguida se
agrega el Sephadex G-50 hasta completar una altura de 30 cm de la columna. Para
equilibrar la columna y obtener el pH igual en ambos extremos de esta,se procedió a
pasar TRIS-HCL 20 mM y NaCl 50mM con un flujo de 1mL/min como máximo.
Una vez equilibrada la columna, se procedió a colocar 2,0 mL del pellet obtenido en
el paso anterior (1.2.1). La muestra fue eluída agregando continuamente tampón
TRIS-HCL 20 mM y NaCl 50 mM y se recolectaron en tubos fracciones de 2,5 mL .
A las fracciones recolectadas se les midió la absorbancia a 280nm, con el fin de
obtener las fracciones con proteínas y determinar las unidades de actividad (UA/mL),
de la bacteriocina según lo descrito anteriormente.
De acuerdo a las pruebas de actividad que se hicieron para comprobar la actividad de
la STB, se obtuvo la actividad de 100 UA/mL, inferior a la encontrada en el extracto
crudo (400 UA/mL).
ANEXO 2. Determinación del tiempo de sonicado para
separar las células de L. monocytogenes adheridas a las
placas de acero inoxidable
El objetivo del ensayo fue determinar las condiciones óptimas de sonicado que
permitieron desprender las células de L. monocytogenes adheridas a las placas sin
destruirlas, para enumerarlas mediante el recuento en superficie. Para la prueba se
utilizó como referencia el tiempo de 3 min usado por CHAVANT et al., (2002).
Para los primeros ensayos se utilizaron frascos de conserva de 3,0 cm diámetro y de
2,0 cm de alto (volumen 10 mL), posteriormente se discontinuó su uso, debido a que
62
el equipo de sonicado ( Modelo Ultrasonik 2 QT/H, 220V 50/60 HZ) no podía
contener un nivel de agua inferior a 5 cm, para lo cual se buscaron nuevos envases
que pudieran cumplir con lo especificado, utilizándose frascos ámbar que tenían 4
cm (volumen 15 mL), los que se usaron en forma suspendida en un soporte de metal
en el baño del sonicdador.
Obtenida la biopelícula, de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente en
material y método (3.7.2 ), se procedió a colocar cada placa de acero inoxidable en un
frasco con 5 mL del buffer salino estéril (Triptona 0,1% y NaCl 0,85%), pH 7,2
(CHAVANT et al., 2002), para sonicar a los distintos tiempos. Posteriormente se
hizo un recuento de células viables por la técnica en superficie, realizando las
diluciones apropiadas y finalmente los recuentos son expresados en ufc/cm2. En los
dos ensayos realizados se trabajo con tres repeticiones, para cada tiempo. El
promedio de las tres repeticiones de cada pre-experimento, realizados en los frascos
conserveros, se muestran a continuación.
2.1. Promedios obtenidos de 3 repeticiones en cada ensayo.
Tiempo (min)
2,5 (EI)
2,5 (EII)
3,0 (EI)
3,0 (EII)
3,25 (EI)
3,25 (EII)
3,5 (EI)
3,5 (EII)
Número de colonias
adheridas en la placa
después del sonicado
10
7
7
3
4
3
0
---------
E(I): Ensayo I
E(II): Ensayo II
no se determinó por encontrarse contaminación
Rcto ufc/cm2
3,0 x104
1,9 x104
1,4 x10 4
8,7 x103
1,7 x 103
2,1 x 103
7,1 x102
---------
63
Para verificar si el tiempo de sonicado fue suficiente para soltar las células, las placas
de acero fueron secadas bajo campana de flujo laminar y sembradas en profundidad.
La siembra consistió en colocar las placas en una placa Petri que contenía 12 mL de
agar ST posteriormente se cubrió con 7 mL del mismo medio enfriado a 45ºC. Las
placas se incubaron a 32ºC por 48 h (FIGURA 4).
Los datos obtenidos sirvieron como referencia para determinar el nuevo tiempo para
los envases definitivos que se usaron en el estudio. Para ello se procedió nuevamente
a realizar un pre-experimento, teniendo como referencia el
tiempo de 2,5 min,
determinado anteriormente por contener el mayor recuento en la superficie ( ufc/cm2)
y un número relativamente bajo de colonias adherida a la placa de acero inoxidable.
El segundo ensayo consistió en someter ambos frascos( los frascos conserveros y los
frascos mas altos) con las biopelículas formadas a tiempos de sonicado de 2,5 min y
2 min para los frascos definitivos (2,5 cm de diámetro y 4 cm de longitud), se bajo el
tiempo tomando en cuenta que el espesor del vidrio el cual era más delgado que el
frasco conservero. Los resultados se presentan en el siguiente anexo.
2.2. Datos que se obtuvieron en el segundo ensayo para determinar el tiempo de
sonicado.
Tiempo (min)
2,5 (fc)
2,5 (fc)
2,5 (fd)
2,5 (fd)
2,0 (fd)
2,0 (fd)
(fc): Frasco conservero
(fd): Frasco delgado
Número de colonias
adheridas en la placa
después del sonicado
4
2
2
1
0
3
Rcto ufc/cm2
4,0 x104
4,2 x104
3,0 x10 4
3,2 x104
5,0 x10 4
3,6 x104
64
Al comparar el tiempo entre los frascos (fd) se determinó que el tiempo de 2 min era
suficiente para despegar las células adheridas de L. monocytogenes a las placas de
acero inoxidable, por encontrarse un mayor recuento de colonias (ufc/ cm2) en el
buffer de sonicado, y pocas colonias adherida a la placa de acero.
ANEXO 3. Análisis estadísticos para el recuento de L.
monocytogenes frente a las bacteriocinas
3.1.
Recuentos de sobreviviencia de L. monocytogenes expuesta a diferentes
bacteriocinas en caldo ST pobre en nutrientes a 10 ºC
Bacteriocinas
Nisina
Nis+STB
STB C. pisc.
Control
Exp 1
Exp 2
Log ufc/mL
Prom
Total Log
ufc/mL
Tiempo
Log ufc/mL
Desv. Stan
0
0,5
1,5
3
24
48
3,35
2,77
2,31
2,69
1,70
0,43
3,20
2,86
2,85
2,67
1,20
0,55
3,27
2,81
2,58
2,68
1,45
0,49
0,18
0,18
0,37
0,37
0,32
0,47
0
0,5
1,5
3
24
48
3,51
2,61
2,00
1,11
0,14
0,14
3,19
2,68
2,48
1,63
0,14
0,14
3,35
2,64
2,24
1,37
0,14
0,14
0,33
0,34
0,61
0,60
0,00
0,00
0
0,5
1,5
3
24
48
5,39
5,33
5,28
5,21
4,80
5,17
5,56
5,55
5,51
5,45
4,79
5,31
5,48
5,44
5,39
5,33
4,80
5,24
0,13
0,21
0,18
0,20
0,03
0,16
0
0,5
1,5
3
24
5,74
5,66
5,61
5,58
6,42
5,77
5,75
5,94
6,00
6,29
5,75
5,70
5,78
5,79
6,35
0,04
0,06
0,22
0,23
0,07
65
48
7,31
7,24
7,27
0,24
3.1.1. Análisis de varianza para el estudio de Inhibición de L. monocytogenes frente a
los tratamientos con bacteriocinas
66
3.1.2. Análisis de varianza para la sobrevivencia de L. monocytogenes , expuesta al
tratamiento de combinación de la nisina y la STB de C. piscicola ( Nis+STB) según
el tiempo
67
3.1.3. Análisis de varianza para la sobrevivencia de L. monocytogenes, expuesta al
tratamiento con nisina según el tiempo
68
3.1.4. Análisis de varianza para la sobrevivencia de L. monocytogenes, expuesta al
tratamiento con la STB de C. piscicola según el tiempo.
69
70
ANEXO 4. Constantes de velocidad de inhibición de L.
monocytogenes
frente a las bacteriocinas en caldo a
10ºC
Según se mostró anteriormente todas las bacteriocinas reducen L. monocytogenes, por
ello se analizó la cinética de inhibición de Listeria sometida a las bacteriocinas. A
continuación se muestran los resultados de las cinéticas de destrucción de L.
monocytogenes, expuesta a diferentes bacteriocinas en caldo.
Según los datos experimentales obtenidos, el tipo
de cinética que obedece la
inactivación de L. monocytogenes por las bacteriocinas, correspondió a una cinética
de segundo orden 1/c-1/c0 = k*t.
Conforme a esto se graficó la expresión 1/c versus t, aplicando un ajuste lineal,
obteniéndose una recta, con pendiente positiva igual a k (FROST y PEARSON,
1961). Mediante esta gráfica se obtuvieron las constantes cinéticas para cada
tratamiento con bacteriocina. Cabe destacar que la constante cinética tiene directa
relación con la velocidad de reacción (r) teniendo así que r = k*[c]2. El tratamiento
control que solo contiene Listeria, presenta una cinética de crecimiento, de primer
orden, correspondiente a la siguiente expresión ln (c0 / c) = k * t.
La siguiente figura muestra como se obtuvo la constante cinética de inhibición de L.
monocytogenes en función de una de las bacteriocinas. Como se observa el mejor
ajuste de los datos experimentales obtenidos correspondió a un ajuste lineal. Este
procedimiento se efectuó en todos los tratamientos con bacteriocinas, para cada una
de las repeticiones de los dos experimentos realizados. Para el tratamiento control,
solo Listeria la constante cinética k se obtuvo con la ecuación de primer orden
mencionada anteriormente, la cual resultó en una velocidad de crecimiento de 0,0686
h-1. Este valor fue el promedio obtenido de ambos experimentos.
71
Determinación de la constante de velocidad de Inhibición de L. monocytogenes con la
bacteriocina (Nis+STB) en caldo a 10ºC.
Como se observa en este gráfico se tienen puntos solo hasta las 3 horas. Los puntos
de las 24 h y 48 h no fueron considerados por encontrarse recuentos inferiores al
límite de la detección para la técnica de siembra en superficie (<10 ufc /mL). Esto sé
aplicó en los tratamientos de nisina y la combinación de Nis+STB donde ocurrió una
reducción inferior a 10 ufc/ mL. Para obtención de la cinética de inhibición L.
monocytogenes con STB de C. piscicola L103 se consideró solo hasta las 24 h ya
que a partir de este punto comienza un crecimiento de L. monocytogenes, como se
observó en la FIGURA 5.
Al comprobarse que todos los tratamientos de inhibición de L. monocytogenes en
presencia de las bacteriocinas correspondieron a cinética de segundo orden, se pudo
comparar las velocidades de inhibición.
4.1.
Constantes cinética de inhibición de L. monocytogenes por diferentes
bacteriocinas en caldo a 10ºC
72
Tratamientos
Nisina
Nis+STB
STB
Control
Constante de
inhibicion k
(ml/ufc*h)
r2
A
0,0019
0,0014
0,0006
0,0016
0,0021
0,0002
0,8897
0,9934
0,9832
0,9924
0,997
0,7125
0,0034
0,0004
0,0004
0,001
0,0004
0,0005
0,0086
0,008
0,0065
0,0084
0,0082
0,0081
0,9766
0,9823
0,9996
0,9957
0,7687
0,8497
0,0017
0.0006
0,0002
0,0005
0,0035
0,0062
5,00E-07
5,00E-07
4,00E-07
6,00E-07
5,00E-07
5,00E-07
0,9994
0,9784
0,9805
0,9881
0,9951
0,9952
5E-06
6E-06
5E-06
2E-06
2E-06
2E-06
0,0579 *
0,0782
0,9533
0,9805
* La constante cinética k ( h -1) del control mostrada en este cuadro corresponde a una
cinética de crecimiento de primer orden
4.2. Análisis de varianza para estudiar las constantes de inhibición de L.
monocytogenes frente a las bacteriocinas en caldo ST a 10ºC.
73
ANEXO 5.
inhibición
Análisis estadísticos para estudiar la
de L. monocytogenes adherida sobre una
superficie de acero inoxidable
5.1. Recuentos de células viables en las biopelículas de L. monocytogenes posterior
a los tratamientos con bacteriocinas
Tratamientos
Tiempo
Prom Exp1
Log ufc/cm2
Prom Exp2
Log ufc/cm2
Prom Exp3
Log ufc/cm2
74
Nisina
0
0,5
24
4,559 ± 0,07
1,949 ± 0,12
0,544 ± 0,00
4,999 ± 0,10
2,374 ± 0,26
1,113 ± 0,49
5,064 ± 0,14DS
2,223 ± 0,29
1,397 ± 0,00
Nis+STB
0
0,5
24
4,559 ± 0,07
0,828 ± 0,49
0,544 ± 0,00
4,999 ± 0,10
1,272 ± 0,67
0,544 ± 0,00
5,064 ± 0,14
1,505 ± 0,83
0,544 ± 0,00
STB C. piscicola
0
0,5
24
4,559 ± 0,07
3,690 ± 0,49
2,875 ± 0,62
4,999 ± 0,10
3,958 ± 0,07
2,948 ± 0,66
5,064 ± 0,14
3,972 ± 0,13
3,012 ± 0,21
Control
0
0,5
24
4,559 ± 0,07
3,913 ± 0,35
3,510 ± 0,04
4,999 ± 0,10
4,858 ± 0,04
3,374 ± 0,22
5,064 ± 0,14
4,919 ± 0,03
3,688 ± 0,28
DS: Desviación Standard
5.1.1. Análisis de varianza para determinar diferencias entre los experimentos 1, 2 y
3, el tiempo y los tratamientos
75
5.1.2. Análisis de varianza para estudiar la reducción de L. monocytogenes sobre
placas de acero inoxidables frente a las bacteriocinas. Exp 1
76
5.1.3. Análisis de varianza para estudiar la reducción de L. monocytogenes sobre
placas de acero inoxidable, frente a las bacteriocinas. Experimentos 2 y 3
77
5.2. Resultados de las constantes de inhibición en biopelículas de L. monocytogenes
Experimento
I
II
Tratamientos k (cm2/ufc*h)
r2
nisina
nisina
nisina
stb+nis
stb
stb
stb
control
control
0,0266
0,0266
0,0159
0,0799
1,00E-05
2,00E-05
0,0003
1,00E-05
1,00E-05
1
1
1
1
0,8974
0,3914
0,9988
1
0,9996
nisina
nisina
nisina
stb+nis
stb+nis
stb
stb
stb
control
control
control
0,0015
0,0047
0,0016
0,0266
0,0799
2,00E-05
0,0003
2,00E-05
1,00E-05
2,00E-05
3,00E-05
1
0,998
0,9848
1
1
0,9974
1
0,9809
0,9409
1
0,9998
nisina
0,0015
0,9506
78
III
nisina
nisina
stb+nis
stb+nis
stb
stb
stb
control
control
control
0,0015
0,0016
0,016
0,0267
5,00E-05
0,0001
2,00E-05
1,00E-05
1,00E-05
4,00E-06
0,9708
0,9983
1
1
0,9974
1
0,9583
0,9403
1
0,9994
5.2.1. Análisis de varianza entre las constantes de inhibición de L. monocytogenes
sobre placas de acero inoxidables por las bacteriocinas (experimentos 1, 2 y 3)
79
5.2.2. Test de Kruskal-Wallis para determinar diferencia entre las constantes de
inhibición del experimento 1
5.2.3.
Test de Kruskal-Wallis para determinar diferencia entre las contantes de
inhibición de los experimentos 2 y 3
5.2.4.
Resumen de
análisis estadísticos para las constantes de inhibición de
biopelículas de L. monocytogenes en presencia de bacteriocinas.
Experimentos
Tratamientos
k (mL//ufc*h) #)
R2
Intercepto
80
1,0E-05a
1,1E-04ab
0,023c
0,0799d *)
2,00-05a
1,1E-04ab
2,6E-03e
0,053 d
8,0E-06a
1,2E-04ab
1,50E-03e
0,02135d
control
STB
nisina
Nis+STB
control
STB
nisina
Nis+STB
control
STB
nisina
Nis+STB
A
I
IIB
IIIB
0,9788
0,7628
1
1
0,9998
0,9748
0,9982
1
0,9996
0,9852
0,9732
1
4,33E-05
1,70E-04
2,67E-05
3,00E-05
7,33E-06
3,90E-05
8,00E-04
2,00E-05
8,00E-06
4,33E-05
3,03E-03
9,00E-06
#
Promedio de constante de velocidad de inhibición (k) obtenido de tres determinaciones.
*)
Valor único, otros valores del tratamiento inferiores al limite de detección..
AB
Letras mayúsculas determinan diferencia significativa entre los experimentos a un nivel de
confianza del 95% (ANEXO 5.2.1)
abcde
Letras minúsculas determinan diferencia significativa entre los tratamientos (ANEXO 5.2. 2)
ANEXO 6. Repetición del experimento con un período
sin agitación
Recuento de células viables en las biopelículas de Listeria después de exponer a las
bacteriocinas con agitación (0,5 h) y sin agitación (24h)
Tratamientos
Tiempo
Nisina
0
0,5
24
Determinaciones Log ufc/cm2
1
2
3
4,845
4,903
4,954
1,698
2
2,653
0,544
0,544
0,544
Nis+STB
0
0,5
24
4,845
1,397
0,544
4,903
0,544
0,544
4,954
0,544
0,544
4,901 ± 0,05
0,828 ± 0,49
0,544 ± 0,00
0
0,5
4,845
3,86
4,903
3,89
4,954
3,845
4,901 ± 0,05
3,865 ± 0,02
STB
Promedios
ufc/cm2
4,901 ± 0,05DS
2,117 ± 0,48
0,544 ± 0,00
81
Control
24
2,544
3,114
2,796
2,818 ± 0,28
0
0,5
24
4,845
4,602
3,83
4,903
4,813
4,114
4,954
4,615
4,21
4,901 ± 0,05
4,677 ± 0,11
4,051 ± 0,20
SD: Desviación Standard
6.1.
Grafico de células de L. monocytogenes adherida a las placas de acero
inoxidable, después de los tratamientos con bacteriocinas
6.2. Análisis estadístico solo en el tratamiento control para determinar diferencia
significativa según el tiempo.
82