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Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008.
Trabajo Práctico N° 1: Cuantificación de carbohidratros totales de Pseudomonas
fluorescens C en diferentes condiciones nutricionales.
Objetivos:

Familiarizarse con técnicas de determinación de glúcidos, comprender el uso de la
espectrofotometría en técnicas bioquímicas y determinar el contenido de carbohidratos
totales de P. fluorescens C por el método de antrona.
Introducción:
Los glúcidos están ampliamente distribuidos en el mundo de los seres vivos y
desempeñan funciones estructurales y metabólicas. Las bacterias poseen un gran
número de carbohidratos diferentes: azúcares libres, derivados de azúcares,
polisacáridos simples (polímeros de azúcares) y polisacáridos complejos (polímeros de
azúcares diferentes, aminoazúcares, ácidos urónicos, etc). Algunas macromoléculas
contienen además componentes no glucídicos (lipopolisacáridos, peptidoglucanos,
ácidos teicoicos, ácidos nucleicos, glucoproteínas, etc).
Los métodos colorimétricos son útiles para estimar la cantidad de azúcares simples y
sus polímeros. Los ensayos más convenientes para carbohidratos totales involucran
calentamiento de las muestras con H2SO4 para hidrolizar los polisacáridos y deshidratar
los monosacáridos para obtener las formas furfural e hidroximetilfurfural de las
pentosas y hexosas respectivamente. Estas soluciones son luego tratadas con un rectivo
aromático (antrona o fenol) para producir un compuesto coloreado que se puede medir
espectrofotométricamente. Las pentosas, hexosas, heptosas y sus derivados, excepto
aminoazúcares, reaccionan generando un producto coloreado, mientras que las triosas y
tetrosas no.
Ningún método permite la determinación de todos los azúcares presentes en
bacterias, ya que diferentes glúcidos generan diferente intensidad de color a una cierta
longitud de onda. Sin embargo los métodos de antrona y fenol son los mas utilizados
por su simplicidad, rapidez y baja interferencia con otros componentes celulares, lo cual
los convierte en los métodos de elección para la determinación de un índice confiable de
“carbohidratos totales”.
Dos desventajas notables de estos métodos son:
1- Los azúcares individuales no pueden ser identificados
2- Trabajar con soluciones concentradas de ácidos o fenol es peligroso.
En el presente trabajo práctico se analizará si variaciones en las condiciones
nutricionales puede afectar el contenido glucídico de un microorganismo. Para ello se
realizará una curva de calibrado del método de antrona utilizando glucosa como
solución patrón y se determinará el contenido de carbohidratos totales de Pseudomonas
fluorescens C crecida en diferentes medios de cultivo.
PRECAUCIONES PARA TRABAJAR CON EL REACTIVO DE ANTRONA:
Este reactivo esta preparado con H2SO4 y éste es un ácido muy fuerte. Se debe evitar el
contacto con los ojos y la piel, y si hubiera exposición a este ácido, se debe lavar con
abundante cantidad de agua fría. La dilución del ácido con agua es muy exotérmica y la
solución resultante se vuelve muy caliente incluso hasta quemar la piel o romper el
contenedor. Esto se previene realizando las soluciones en baños de agua-hielo. Nunca se
debe agregar agua al ácido ya que puede producir salpicaduras, por eso NUNCA HAY
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QUE DARLE DE BEBER AL ACIDO!! sino que SIEMPRE se debe agregar el ácido al
agua.
Materiales y métodos:
A) Reactivos:

Soluciones estándares de glucosa: Se utilizarán soluciones madres de 20 g/ml, 40
g/ml, 60 g/ml y 80 g/ml con las cuales se realizará la curva de calibrado del método.

Solución de H2SO4: Preparar solución madre al 75% v/v. TENER EN CUENTA
LAS PRECAUCIONES PARA MANIPULAR ESTE ÁCIDO.

Reactivo de antrona: Preparar la solución agregando 100 mg de antrona a 2,5 ml
de etanol absoluto y llevar a un volumen final de 50 ml con H2SO4 al 75%. Agitar hasta
disolución. La solución debe ser preparada en el momento y conservar a 4 C a resguardo
de la luz en frasco color caramelo.
B) Técnica:
Cada grupo tendrá 1.5 ml de cultivo de P. fluorescens C crecida en un medio rico (por
ejemplo medio Luria-Bertani) y 1.5 ml de cultivo del microorganismo crecido en un
medio salino mínimo suplementado con colina como única fuente de C y N. A partir de
los cuales se realizará la determinación de carbohidratos totales.
1- Cosechar las células por centrifugación a 10000 rpm durante 3 min y descartar el
sobrenadante obtenido.
2- Resuspender el precipitado en solución fisiológica (NaCl 0.9 %) para lavar las
células y eliminar restos del medio de cultivo que pueden interferir en la
determinación. Centrifugar nuevamente a 10000 rpm durante 3 min y descartar el
sobrenadante.
3- Resuspender el precipitado en 700 l de H2O destilada. Esta muestra se utilizará
para la determinación de carbohidratos.
4- Rotular 7 tubos de vidrio como: B, T20, T40, T60, T80, LB, MM
5- Colocar en cada tubo 600 l de la solución madre o muestra correspondiente y 600
l de H2O en el tubo del blanco de reacción.
6- Enfriar los tubos y el reactivo de antrona en hielo.
7- Agregar 3 ml del reactivo de antrona frío a cada tubo y mezclar durante 5 minutos
en frío.
8- Transferir los tubos a un baño de agua a 100 C e incubar EXACTAMENTE
durante 10 minutos.
9- Retirar los tubos y colocar nuevamente en hielo.
10- Medir la absorbancia de cada tubo a 625 nm.
11- Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrón en
función de la concentración de los mismos.
12- Determinar la concentración de carbohidratos totales en cada unas de las muestras
problema utilizando la curva elaborada anteriormente.
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