QUÍMICA ANALÍTICA - 2015 TRABAJO PRÁCTICO: ESPECTROFOTOMETRIA

QUÍMICA ANALÍTICA - 2015
TRABAJO PRÁCTICO: ESPECTROFOTOMETRIA
LEY DE BEER- CURVA DE CALIBRACIÓN
ASISTIR AL LABORATORIO CON:
*GUARDAPOLVO
*GUANTES DE LATEX
*ANTEOJOS DE SEGURIDAD
*PROPIPETA
*TRAPO TIPO REJILLA O ROLLO DE PAPEL ABSORBENTE
*CUADERNO DE ANOTACIONES
*FIBRA INDELEBLE (PARA ROTULAR MATERIAL DE VIDRIO)
* PENDRIVE (opcional)
En el siguiente Trabajo Práctico deberá:
* Seleccionar la longitud de onda de trabajo adecuada para el análisis, examinando el espectro de una
solución de eritrosina (C20H6I4Na2O5).
* Realizar una curva de calibración a partir de una solución concentrada patrón de eritrosina; verificar el
cumplimiento de la Ley de Beer y aplicar el concepto de error fotométrico.
* Calcular la concentración de muestras incógnitas de eritrosina utilizando dicha curva.
Instrumental:
Espectrofotómetro Spectronic
Reactivos:
Solución patrón de eritrosina 52,0 ppm
Muestra incógnita A
Muestra incógnita B
Materiales:
-Gradilla con tubos de ensayo
-Matraces de 10,00; 25,00 y 50,00 mL
-Pipetas aforadas de 1,00; 2,00 mL
-Pipeta graduada de 5 mL calibrada cada 1,00 mL
-Pipeta graduada de 2 mL no calibrada
Eritrosina
Protocolo de trabajo:
1- Seleccionar la longitud de onda de trabajo adecuada para el análisis de una solución de eritrosina
observando el espectro adjunto.
2- La eritrosina cumple con la Ley de Beer en un amplio intervalo de concentraciones; se elige trabajar en el
siguiente rango: 2 a 10 g.mL-1. Preparar las soluciones para la construcción de la curva (5 puntos por
triplicado) a partir de la solución patrón de eritrosina, teniendo en cuenta el material volumétrico disponible.
Leer sus Absorbancias y extraer conclusiones.
3- Realizar el análisis de regresión de los datos experimentales.
4- Medir la absorbancia de las muestras incógnitas a la longitud de onda seleccionada y determinar la
concentración de las mismas. Indicar los resultados teniendo en cuenta el número de cifras significativas.
Informar además el límite de detección (LD).
IMPORTANTE
Concurrir al trabajo práctico con los cálculos de los puntos de concentración de la curva de calibración
resueltos. Considerar como mínimo cinco puntos y tener en cuenta el rango de interés mencionado en el
protocolo, la concentración de la solución patrón y los materiales disponibles.
1
527 nm
Análisis de regresión: Método de los mínimos cuadrados
La curva de calibración relaciona la cantidad medida (señal) y con la concentración conocida de una x serie
de patrones. Lo común y deseable es que el gráfico tienda a una línea recta, sin embargo no todos los datos
caen exactamente en la recta debido a los errores aleatorios que afectan el proceso de medición. El análisis
de regresión, empleando el método de mínimos cuadrados, permite obtener la ecuación de la recta que mejor
se ajusta a los datos experimentales, así como precisar la incertidumbre asociada a su uso. Cuando se emplea
el método de mínimos cuadrados, se debe partir de dos suposiciones:
1- Existe una relación lineal entre la variable medida (y) y la concentración del analito (x). La relación
matemática que describe esta relación se denomina modelo de regresión y se representa por la ecuación:
y=b+mx
donde b es la ordenada al origen y m es la pendiente
2- Cualquier desvío de los puntos individuales respecto de la recta es consecuencia de errores en la
medición; se da por hecho que no existe error en los valores de x.
El desvío de cada punto experimental (yi) respecto de la recta se denomina residuo. La recta obtenida por el
método de mínimos cuadrados es aquella que reduce al mínimo la suma de los cuadrados de los residuos
para todos los puntos. Además de proporcionar la recta que mejor ajusta a los datos experimentales, el
método también proporciona la desviación estándar de la pendiente (sm), desviación estándar de la
ordenada al origen (sb) y desviación estándar de la regresión (sr). Conociendo las desviaciones estándar,
podemos asignar cifras significativas a la pendiente y la ordenada al origen: el primer dígito de la desviación
estándar es la última cifra significativa de los parámetros mencionados. La desviación estándar de la
regresión es una estadística importante para evidenciar el error en los valores estimados de y. Cuanto menor
sea el error estándar del valor estimado, más cerca están los puntos de la línea de regresión.
Otro parámetro obtenido en el análisis de regresión es el coeficiente de determinación o de regresión, R2,
que indica la fracción de la variación total en y que se explica con el modelo lineal. Cuanto mayor es el valor
de este parámetro más confiable es el modelo lineal propuesto. El coeficiente casi siempre tiene un valor
cercano a la unidad, que es el máximo valor que puede alcanzar.
La desviación estándar de la concentración ( sc ) de la muestra incógnita medida M veces cuando se utiliza
una curva de calibración se puede calcular a partir de la siguiente ecuación simplificada:
2
sr 1
m M
Otra forma de calcular el error asociado al valor de concentración es realizar la propagación de las
incertidumbres asociadas a la pendiente, la ordenada al origen y del valor medido y, aplicando la reglas de
propagación de error ya discutidas. Esta forma de calcular la incertidumbre en la concentración no considera
que la pendiente y la ordenada al origen calculadas no son independientes entre sí. El tratamiento adecuado
de los datos se realiza a partir de la ecuación expresada anteriormente.
sc 
Propiedades analíticas básicas
Las propiedades analíticas básicas son fundamentalmente tres: precisión, sensibilidad y selectividad.
Precisión: “grado de concordancia entre un grupo de resultados obtenidos al aplicar repetitiva e
independientemente el mismo método analítico a alícuotas de la misma muestra” o “dispersión de estos
resultados entre sí con la media”. El concepto de dispersión es el contrario al de precisión: la precisión es
más alta cuanto menor es la dispersión.
Los parámetros para caracterizar la precisión de un conjunto de resultados se fundamentan en parámetros
estadísticos basados en las distribuciones normales o gaussianas. El parámetro más característico es la
desviación estándar, que se describe cualitativamente como la distancia desde la media y el punto de
inflexión de la campana de Gauss. La desviación estándar (s) tiene las mismas dimensiones que el resultado.
Sensibilidad: es una propiedad analítica asignable a un método analítico que puede definirse como su
“capacidad para discriminar entre concentraciones semejantes de analito” o su “capacidad para poder
detectar (análisis cualitativo) o determinar (análisis cuantitativo) pequeñas concentraciones de analito en la
muestra”. La sensibilidad será mayor cuanto más semejantes sean las concentraciones discriminadas o más
bajas las concentraciones que pueden detectarse. La definición más general de sensibilidad, S, es la “relación
de la señal con la concentración o variación de la señal analítica, y, con la variación de la concentración, C,
del analito.
y
y
S
S
C
C
En la curva de calibración, la sensibilidad está dada por la pendiente de la curva
Señal (y)= ordenada al origen + sensibilidad (S) . concentración(C)
La definición cuantitativa de sensibilidad se completa introduciendo los parámetros que definen las
concentraciones mínimas para ser detectadas o determinadas. El límite de detección es la concentración del
analito CLD que origina una señal que pueda diferenciarse estadísticamente de la señal del blanco. Para
calcular el límite de detección se utiliza la siguiente ecuación:
3s
C LD  b
S
donde sb es la desviación estándar de la ordenada al origen.
Selectividad: es una propiedad analítica básica atribuible a un método analítico que puede definirse como su
“capacidad para originar resultados que dependan de forma exclusiva del analito para su identificación o
cuantificación en la muestra”. Se materializa en las denominadas interferencias, que son perturbaciones que
alteran al proceso analítico y, por lo tanto, a los resultados analíticos, que se ven afectados por errores
sistemáticos.
3
Efecto del ruido instrumental en la precisión de los análisis espectrofotómetricos
La exactitud y precisión de los análisis espectrofotométricos a menudo viene limitada por el ruido o
incertidumbre asociados al instrumento. Por otra parte, una medida espectrofotométrica comprende tres
etapas: el ajuste del 0% de T, el ajuste del 100% de T y la medida del %T con la muestra colocada en la
trayectoria de la radiación. El ruido asociado a cada una de estas etapas se combina para dar un valor final
de T con una incertidumbre neta. La relación entre el ruido encontrado en la medición T y la incertidumbre
en la concentración, puede obtenerse a partir de la ley de Beer como se indica a continuación:
c = - ( 1 /  b ) . log T = - ( 0,434 /  b ) . ln T
Luego de obtener la derivada parcial de esta ecuación respecto a T, manteniendo constante b y c (sus
incertidumbres son despreciables) y de realizar una serie de procesos matemáticos se obtiene la siguiente
expresión:
c / c = 0,434 . T / T log T
Para un número limitado de medidas, se reemplazan las desviaciones estándar de la población c y T por
las desviaciones estándar de una muestra sc y sT obteniéndose:
sc / c = 0,434 . sT / T log T
Esta ecuación permite relacionar la desviación estándar relativa de la concentración (sc / c) con la desviación
estándar absoluta de la medida de la transmitancia (sT ó  T). Experimentalmente sT puede conocerse de la
siguiente manera:
- Elegir una de las soluciones del protocolo y medir 20 veces la transmitancia, llevando antes de cada lectura
a 100 %T con el blanco.
- Calcular  T o sT siguiendo los pasos que se indican a continuación:
Tmedia =  Ti / 20
sT = [  (Ti - Tmedia)2 / (20 - 1) ]½
CUESTIONARIO
1) Justifique la elección de la longitud de onda de trabajo para poder construir la curva de A vs.
concentración a partir del espectro dibujado en la guía.
2) ¿Qué características debe tener el equipo con el cual se obtuvo el espectro de eritrosina?
3) ¿Por qué en un método analítico la pendiente de una curva se asocia con la sensibilidad?
4) ¿Qué ventajas encuentra cuando hace uso de una curva de calibrado respecto de utilizar un testigo
único?
5) ¿Puede la calidad de un instrumento afectar la incertidumbre en la lectura de la Transmitancia?
MEDIDAS GENERALES PARA MANTENER HIGIENE Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
* CONOCER LA UBICACIÓN DE ELEMENTOS DE SEGURIDAD, TALES COMO MATAFUEGO Y LAVAOJOS.
* NO COMER NI BEBER EN EL LABORATORIO.
*UTILIZAR GUARDAPOLVO (PREFERENTEMENTE DE ALGODÓN Y MANGAS LARGAS) ABROCHADO.
* EVITAR EL USO DE ACCESORIOS COLGANTES (AROS, PULSERAS, COLLARES, ETC.) Y USAR EL CABELLO
RECOGIDO.
* CONSERVAR LAS MESADAS DESPEJADAS, SIN ABRIGOS NI OBJETOS PERSONALES.
* MANTENER EL ORDEN Y LA LIMPIEZA DEL LUGAR QUE LE HA SIDO ASIGNADO.
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Uso del programa Photometrix
La aplicación Photometrix se puede descargar desde Google Play Store, en
dispositivos que posean como sistema operativo Android 4.0.3 o cualquier otra versión
superior. Tamaño 1.7 M
La aplicación funciona midiendo la reflectancia de las muestras para determinar
su composición, por lo que es importante que la luz sea constante en las fotografías
tomadas.
Una vez abierta la aplicación, seleccionar en el menú principal la opción “Univariate Analysis”. Se
desplegará un menú con las siguientes opciones:
En la esquina superior derecha se encuentra un botón con forma de
engranaje, que nos permitirá configurar la aplicación. Verificar que el número
de muestras sea 5, y seleccionar como Región de interés la opción 32x32.
Para proceder a la calibración, seleccionar la opción “Calibration” y hacer
click en “Capture Images”. Ingresar la concentración de la solución a medir en
la esquina superior derecha, y sacar la foto de la misma con el botón “Capture
image”. El cuadrado verde que se observa indica la región de la imagen que se
va a utilizar para calibrar, por lo que es importante que se enfoque sobre el seno
de la solución. Proceder con el resto de las soluciones de calibrado.
Al finalizar la calibración y seleccionar la opción “Save”, se abre la siguiente pantalla:
Los diferentes canales representan longitudes de onda, ubicándose en primer
lugar la curva que presenta el mejor ajuste a los datos experimentales. Al
seleccionar un canal, se graficará la curva correspondiente.
Para determinar la concentración de las muestras incógnita, volver al menú “Univariate Analysis” y
seleccionar la opción “Sampling”. Capturar la imagen de la muestra de la misma forma que se realizó en
la curva de calibrado y presionar “Save”. Seleccionar el set de calibración correspondiente y elegir la
curva de mejor ajuste. Se abrirá un gráfico que muestra la curva de calibración, y en azul, la muestra
interpolada y su concentración predicha:
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