Curso: Validación de Métodos de Ensayo. Montevideo. Junio de 2009. INFORME DE VALIDACIÓN 00 ZZZZ PQ44- Determinación DBO5 en efluentes líquidos Laboratorio: Curso: Validación de Métodos de Ensayo. Montevideo. Junio de 2009. INDICE Item 1 2 3 4 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 Título Introducción Software utilizado Abreviaturas Referencias Desarrollo Identidad del analito Selectividad / Especificidad Límite de detección Límite de cuantificación Rango de trabajo y linealidad Exactitud y veracidad Precisión Determinación de la incertidumbre analítica Sensibilidad Robustez Recuperación Pág 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 6 6 8 15 15 15 Curso: Validación de Métodos de Ensayo. Montevideo. Junio de 2009. 1. Introducción Con el objeto de validar el método analítico 00 LAME MA34- “Determinación DBO5 en efluentes líquidos” en el rango de DBO5 de 0 a 350 ppm, se describen en este informe una serie de evaluaciones aplicadas a la mayoría de los parámetros de performance delineados en la Guía para Validación de Métodos de Ensayo (OAA, 2003) 2. Software utilizado: Microsoft Excel 2000. Minitab 13. Microcal origin 6.0. 3. Abreviaturas CRM: Material de referencia certificado DBO: Demanda Bioquímica de Oxígeno DBO5: Demanda Bioquímica de Oxígeno (5 días) H0: Hipótesis nula H1: Hipótesis alternativa LC: Límite de cuantificación LD: Límite de detección Media Rec: Valor medio de recuperación MOB: Materia orgánica biodegradable capaz de producir DBO Rec: Recuperación s: Desviación estándar s Rec: Desviación estándar de los valores de recuperación t: Estadístico t T: Temperatura tcrit: Valor de t crítico uDBO5: Incertidumbre combinada estándar de la DBO5 UDBO5: Incertidumbre expandida de la DBO5 uRec: Incertidumbre estándar de recuperación Va: Volumen de agregado (“spike”) Vm: Volumen de muestra Vma: Volumen de muestra adicionada Vs: Volumen de solución patrón empleada para determinar FR Vv: Volúmenes varios empleados en el proceso de dilución (pipetas, matraces) A: Delta de absorbancia T: Variabilidad térmica V: Delta de volumen [...]: Denota concentración *: operador multiplicación 4. Referencias (1) (2) Guía para Validación de Métodos de Ensayo. Organismo Argentino de Acreditación. 2003. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC, Teddington: 1998. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM- CITAC Guide QUAM: 2000. EA-4/02, 1999. The Expression of uncertainty of measurement in calibration. “Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement” Second Edition – Eurachem. “Expresión de la Incertidumbre de Medida en las Calibraciones / Ensayos”, OAA, versión 1. (3) (4) (5) (6) Curso: Validación de Métodos de Ensayo. Montevideo. Junio de 2009. 5. Desarrollo Se asume que: Existe distribución normal para los resultados analíticos examinados. Los valores de concentraciones de los patrones están libres de incertidumbre a los efectos de los cálculos en las regresiones lineales. Nota 1: Los términos empleados “analizar”, “obtención del valor de DBO5”, “determinar DBO5” implican la aplicación de la totalidad del método a la muestra, lo que incluye la etapa inicial de homogeneización. Nota 2: Todas las soluciones analizadas son matriz coincidentes. 5.1 Identidad del analito 5.1.1 Se confirma que el método responde a la presencia MOB por ser este un método estándar (Standard Method 5210 d ASTM) 5.1.2 El método responde con magnitudes directamente proporcionales frente al análisis de patrones DBO5 preparados en el laboratorio. Ver item 5.5 “Rango de trabajo y linealidad” 5.2 Selectividad / Especificidad De acuerdo a la bibliografía, una posible interferencia en la determinación de la DBO5 es la presencia potencial de bacterias nitrificantes o cloro. Este inconveniente se ve subsanado debido a que las muestras llegadas al laboratorio son generalmente estériles, debido a su tratamiento con cloro. El cloro a su vez, antes de la determinación, es tratado con tiosulfato de sodio en solución 0.025 N y agregado en cantidades estequiométricas a la muestra. Siempre y cuando la [Cloro] no sea superior a 1 ppm, caso desaconsejado por para determinar la DBO5. Ver apartado “Consideraciones especiales” en este instructivo. Adicionalmente debe recalcarse la afirmación del proveedor que expresa la ausencia de bacterias nitrificantes en el inóculo empleado para la siembra. 5.3 Límite de detección 5.3.1 Al los fines de obtener este parámetro se analizó una muestra de agua del aforo HDPE, que fue calcinada a fin de eliminar una porción importante de MOB. Esta agua debe considerarse como de bajo DBO ya que el tratamiento al la que se sometió no garantiza que se haya eliminado totalmente, ver tabla 2: Tabla 1. Blancos agua del aforo de HDPE. Valor inicial de TOC: 25 ppm Valor final de TOC: 1,0 ppm Replicas 1 2 3 4 5 DBO5 / ppm 13 13 14 14 14 Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 5 de 15 14 6 Media 13.67 S 0.52 Teniendo como referencia a la Guía Eurachem 3s. (2) se calcula el límite de detección como [Blanco] + LD = (13,67 + 3*0,52)ppm = 15,2 ppm 15 ppm 5.4 Límite de cuantificación 5.4.1 Al los fines de obtener este parámetro se utilizaron los datos de la tabla 3. Teniendo como referencia a la Guía Eurachem (2) se calcula el límite de cuantificación como [Blanco] + 6s. LC = (13,67 + 6*0,52)ppm = 16,79 ppm 17 ppm 5.5 Rango de trabajo y linealidad Para verificar al linealidad del método se comparó el valor del coeficiente de correlación R obtenido desde la determinación de patrones de MOB (RDBO5) contra el R (ROAA) = 0.995 valor sugerido por el OAA (1). Ver tabla 2 y Gráfico 1. Tabla 2. Valores de DBO5 para soluciones patrón de MBO5 DBO5 obtenida mg/L DBO5 esperada mg/L Media Réplica 1 Réplica 2 Blanco 25 50 75 100 200 2 30 48 79 114 205 4 27 52 79 106 192 3 29 50 79 110 199 Gráfico 1. DBO5 esperada vs DBO5 obtenida, rango de concentraciones (25 – 200) ppm DBO5 m edia obtenida / m g/L 250 200 150 100 y = 0.9865x + 4.1792 R2 = 0.9969 50 0 0 50 100 150 200 DBO5 esperada / m g/L Se obtiene que RDBO5 = 09984, por lo tanto RDBO5 > ROAA . 250 Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 6 de 15 Se verifica linealidad en el rango de trabajo evaluado. 5.6 Exactitud y veracidad Debido a la imposibilidad de disponer de un CRM, y aunque de menor jerarquía metrológica se efectuaron ensayos de recuperación con agregados de patrón (1) para DBO5 sobre muestras naturales. Ver tabla 3. Se contrastaron de hipótesis estadísticas a los fines de investigar los niveles de recuperación. Tabla 3. Niveles de recuperación para muestras adicionadas con patrón para DBO5 Réplica 1 / Réplica 2 / Réplica 3 / s / ppm ppm ppm ppm Muestra Canal 1 Blanco Canal 2 Blanco + 50 ppm 3 Factor de recuperación (FR) Canal 3 Muestra de LHC1 Canal 4 Muestra de LHC1 + 50 ppm 2 4 55 53 53 1.04 1.02 0.98 32 25 8 88 69 63 1.12 0.88 1.10 15 24 9 71 75 62 Factor de recuperación (FR) 1.12 1.02 1.06 FR medio: 1.04 S Rec / ppm: 0.076 uRec / ppm: 0.025 uRec_rel: 0.024 Factor de recuperación (FR) Canal 5 Muestra de LHC2 Canal 6 Muestra de LHC2 + 50ppm T: 1.48 Tcrit (n-1=8): 2.31 0.031 0.133 0.050 Se postula: H0: Existe recuperación total del analito (no existen diferencias estadísticamente significativas entre la media de los niveles de recuperación de las muestras adicionadas. H1: No existe recuperación total del analito (existen diferencias estadísticamente significativas entre la media de los niveles de recuperación de las muestras adicionadas. Se plantea: La comparación del estadístico t con el valor de tcrítico de acuerdo a: estadístico t = |1- Rec| / uRec Se concluye: Aceptar H0 pues el estadístico t < Valor crítico de t . Por lo tanto (con los pocos datos disponibles) existe recuperación total del analito en el nivel de DBO5 50 ppm, estudiada. Por lo tanto se puede asegurar trazabilidad a este nivel de concentración. 5.7 Precisión Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 7 de 15 Se efectuaron determinaciones de DBO5 por sextuplicado (seis canales) sobre varios días y sobre dos operadores. Se empleó un patrón fresco para DBO5 de concentración (50 + 9) ppm por cada tanda de determinaciones. En función de estos datos se calculó el parámetro de precisión global (s global) dado por la desviación estándar de todas las determinaciones. Ver tablas 4. Tabla 4. Controles sobre patrones para DBO5. DBO5 / ppm Fecha dentificación dentificaci 00 Canal # del patrón LAMA ME02 1 2 3 4 5 T amb. Laborat / °C 6 Jun-03 Hach Cat 14866-10 55 56 56 55 56 59 --- Jul-03 Hach Cat 14866-10 45 58 49 58 53 55 21 Ago-03 Hach Cat 14866-10 Lote 48 A1280 44 54 53 49 51 21 Sep-03 Hach Cat 14866-10 Lote 53 A1280 58 46 44 55 47 21 Oct-03 Hach Cat 14866-10 Lote 55 A1285 53 48 45 58 42 21 Dic-03 Hach Cat 14866-10 Lote 52 A1280 45 55 43 51 46 21 Dic-03 Hach Cat 14866-10 Lote 49 A1280 52 48 52 47 54 21 Ene-04 Hach Cat 14866-10 Lote 52 a1280 48 47 54 51 46 21 Feb-04 Hach Cat 14866-10 Lot A1280 50 64 54 52 55 --- 51 MEDIA / ppm 51.4 s global / ppm 4.7 srel global 0.092 Histograma. Controles sobre patrones para DBO5. Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 8 de 15 10 Frecuencia 8 6 4 2 0 40 45 50 55 60 65 DBO5 / ppm A partir de datos de la tabla 4 se obtuvo que: La precisión intermedia del método en el nivel de concentración 50 ppm (máxima variabilidad obtenible en el laboratorio) a partir del cálculo de la desviación estándar relativa de los 54 datos tabulados. Precisión intermedia porcentual = srel global * 100 = 9.2 % 5.8 Determinación de la incertidumbre analítica 5.8.1 Cálculo de la incertidumbre combinada estándar La expresión para el cálculo de la DBO5 en una muestra está dada por: 1 DBO5 Rm kFR FD ecuación 1 Donde: Rm: Respuesta instrumental generada por la muestra k: Constante de calibración del equipo. FR: Factor de recuperación. FD: Factor de dilución de la muestra (en caso de ser esta necesaria). Empleando los datos de la validación “in house” y considerando trazables a las pipetas (los volúmenes reales medido entran en el intervalo de tolerancia) se plantea una estrategia alternativa para la estimación de la incertidumbre. Se muestra el siguiente diagrama causa-efecto: Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 9 de 15 Precisión DBO5 Bias Diagrama espina de pescado La expresión para el cálculo de la incertidumbre combinada puede formularse de la siguiente manera: u TOC [TOC ] uPrecisión _rel 2 uBias 2 ecuación 2 Donde: uPrecisión_rel: Incertidumbre estándar relativa asociada al método en condiciones intermedias de precisión (máxima variabilidad obtenible en el laboratorio). Los datos a utilizar se muestran en la tabla 4, (item 5.7, estudio de la precisión intermedia del método). Este modelo de estimación de la incertidumbre postula que en uPrecisión_rel se incluyen todas las variabilidades aleatorias que ocurren en el procedimiento analítico dentro del laboratorio a lo largo de un período de tiempo lo suficientemente largo, tanto aquellas generadas en la etapa de pretratamiento de muestra como las producidas durante la etapa de lectura instrumental. También esta contenida la dispersión entre analistas, días y equipos empleados en el laboratorio. El modelo también supone que uPrecisión_rel es constante a lo largo del intervalo de concentraciones de trabajo. Desde la tabla 4 obtenemos una estimación de la precisión intermedia en base a patrones de control srel global = 0.092 Este valor posiblemente nos de un sobreestimación de la incertidumbre por precisión ya que una muestra normal sufre menos tratamiento volumétrico que el aplicado al patrón de control que se ha utilizado para obtener uPrecision_rel a lo largo del ensayo de precisión (item 5.7) Tenemos que: u srel _ global V PC VPC 2 2 u otrasfuent es 2 ecuación3 donde uV PC es la incertidumbre estándar asociada al volumen final del patrón de control. Ver ítem 5.8.3.1. uotrasfuentes: es la incertidumbre estándar relativa referida al resto de las fuentes que generan incertidumbre en el ensayo de precisión intermedia. Ejemplos son las fluctuaciones de temperatura, variación de otras magnitudes de influencia, variabilidad entre los operadores, etc. Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 10 de 15 la incertidumbre estándar de precisión debida a la muestra es: u u P r ecisión _ rel V MUESTRA VMUESTRA 2 2 u otrasfuent es 2 ecuación 4 Donde uVmuestra : se refiere a la incertidumbre estándar asociada al volumen tomado de muestra. Ver item 5.3.8.2 uotrasfuentes: es la incertidumbre estándar relativa referida al resto de las fuentes que generan incertidumbre en el ensayo de precisión intermedia. Ejemplos son las fluctuaciones de temperatura, variación de otras magnitudes de influencia, variabilidad entre los operadores, etc. Sustituyendo la ecuación 3 en la 4, nos queda que: u u P r ecisión _ rel V MUESTRA VMUESTRA 2 2 2 u srel _ global2 V PC VPC 2 por lo tanto u u Pr ecisión _ rel V MUESTRA VMUESTRA u srel _ global2 V PC VPC 2 Sustituyendo en la expresión anterior por los valores obtenidos en la tabla 4, anexos 5.8.3.2 y 5.8.3.3 resulta que: u Pr ecisión _ rel 0.0015 2 0.092 2 0.0073 2 0.092 srel _ global Se concluye por lo tanto que los distintos tratamientos volumétricos aplicados sobre muestras y patrones de control no afectan de manera significativa al valor encontrado para el ensayo de precisión intermedia. Nota la repetibilidad de las pipeta junto a la variabilidad por diferencias de temperatura está incluida en uPrecisión_rel. uBias: Incertidumbre estándar del sesgo del método obtenida como incertidumbre del factor de recuperación, uFR. El modelo empleado para la estimación de la incertidumbre también supone que uFR es constante a lo largo del intervalo de concentraciones de trabajo. Sus componentes principales se exponen en la siguiente expresión Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 11 de 15 2 u glu gliad 1 FR 2 uFR uFr _ precisión glu gliad k 2 ecuación 5 Donde: u[glu + gli]ad: : Incertidumbre estándar del patrón para DBO5 empleado para efectuar las adiciones. Dilución de ampolla conteniendo glucosa y glutámico BOD Standard Hach Cat 14866-10 (50 + 9) mg/L trazable NIST. Puesto que el proveedor no da nivel de confianza se supone que la distribución es de tipo triangular u glu gliad 9 ppm 6 3.67 ppm FR: Factor de recuperación: Este parámetro es utilizado como estimador del sesgo del método analítico, incluye a la mayoría de los errores sistemáticos que se introducen en la etapa de tratamiento de la muestra y lectura instrumental. Empleando los datos del ítem 5.6 “Exactitud y veracidad”, tabla 3, obtenidos en condiciones de repetibilidad (período corto de tiempo), se determina que: 1 FR = 0; en el nivel de concentración DBO5 50 ppm k 2 El término uFr_precision se refiere a la incertidumbre asociada a la precisión en la determinación del factor de recuperación que incluye la repetibilidad del material volumétrico empleado en la constitución de las soluciones patrón (adición a blanco de matriz) analizadas. Desde el ítem 5.6 “Exactitud y veracidad”, tabla 3, obtenemos que: uFr_precision = uRec_rel = 0.024 La ecuación 5 queda: 2 3.67 ppm 0.0242 0.0772 uFR 50 ppm Sustituyendo en la ecuación 2 obtenemos: u DBO 5 DBO 5 u DBO 5 DBO 5 uPrecisión _rel 2 uBias 2 0.092 2 0.0772 2 DBO 5 0.12 ppm Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 12 de 15 Gráfico 2: Comparación de las fuentes de incertidumbres relativas analizadas. Combinada estándar Patrón DBO5 Bias Precisión 0 2 4 6 8 10 12 14 Incertidum bre relativa % 5.8.2 Cálculo de la incertidumbre expandida De la definición: “La incertidumbre expandida de medida se ha obtenido multiplicando la incertidumbre típica de medición por el factor de cobertura k=2 que, para una distribución normal, corresponde a una probabilidad de cobertura de aproximadamente el 95%”, tenemos que U DBO 5 2 u DBO 5 Sustituyendo por la ecuación 3 obtenemos: U DBO 5 2 DBO 5 uPrecisión _rel 2 uBias 2 U DBO 5 2 xDBO 5 0.092 2 0.0772 2 DBO 5 0.24 ppm Notas importantes: Los efectos producidos por las variaciones de temperatura en el laboratorio están incluidos en la incertidumbre estándar relativa asociada a la precisión del método analítico (uPrecisión_rel) evaluada en condiciones intermedias de precisión (la máxima variabilidad obtenible en el laboratorio). Se postula que la incertidumbre relativa expandida es constante en todo el intervalo de concentraciones de trabajo 5.8.3 Anexos complementarios al cálculo de la incertidumbre 5.8.3.1 Información metrólogica referida al material volumétrico empleado en la determinación de la DBO5: Probeta de 100 mL para medir volumen de muestra Incertidumbre + 0.30 mL Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 13 de 15 Incertidumbre estándar (distribución rectangular): 0.30m L 3 0.17m L Calibrado por Sartorius N° certif CV402032 Matraz 1 litro para preparar patrones Incertidumbre + 3.00ml Incertidumbre estándar (distribución rectangular): 3.0m L 3 1.73m L calibrado por ¿????? Patrón BOD Standard Hach N° cat 14866 commodity Number 14866-10 fecha de análisis 8/1/2001 (vence agosto 2006) lot N°A1215 Contenido de glucosa y glutámico de 5880 a 6380 ppm (resultado hallad 6280.0ppm) Traceable a SRM:84J incertidumbre estándar (distribución triangular): 250ppm 6 102.1 ppm 5.8.3.2 Incertidumbre estándar del patrón de control empleado para la determinación de la precisión. Los patrones empleados para efectuar los controles sobre los ensayos de DBO5 y cuyos datos se utilizaron para evaluar la precisión del método (item 5.7), se confeccionaron de la siguiente manera: 1) Patrón padre: Disolución a 1 L de la ampolla “standard Hach N° cat 14866“ (patrón padre) 2) Patrón hijo: Dilución a 1 L de 33 mL de patrón padre. 3) Patrón control: Dilución a 200 mL de 40 mL de patrón hijo. La concentración de glucosa mas ácido glutámico está dada por: Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 14 de 15 [ gla glo] m ( gla glo) V PC 1000*V1 *V 2 * m ( gla glo) V3 * (V 4 V5 ) 2 ecuación 6 donde : [ gla glo] :Concentración de glucosa y ácido glutámicoen patrónfinal( 50 ppm;cont rolde calidad) V1 : Alícuota( 33 mL) tomadacon probetade 100 mL de patrónpadre ( 6000ppm)para posteriordilución V2 : Alícuota( 40 mL) tomadacon probetade 100 mL de patrónhijo ( 200 ppm)para posteriordilución m[ gla glo] : masa de glucosa y ácido glutámicocont enidaen ampollastandardHach N cat 14866 V PC : Volumen final para el patrónde cont rol V3 : Volúmen finalde dilución para patrónpadre e hijo (matrazde 1000mL) V4 : Volúmen parcialde agua tomadocon probetade 100 mL (100mL) a completarsobre V2 para elaborar patrónfinal( 50 ppm;cont rolde calidad) V5 : Volúmen parcialde agua tomadocon probetade 100 mL (60 mL) a completarsobre V2 para elaborar patrónfinal( 50 ppm;cont rolde calidad) Debido a que la masa de glucosa mas glutamicono sufren fluct uaciones de sus valorespor si mismos (comosi lo hacen los volúmenestomadosa lo largo del ensayode precision), dividimosambos miembrosde la ecuación 6 por m ( gla glo) y la transformamosen una expresiónpurament evolumétrica V3 * (V 4 V5 ) 1000*V1 *V 2 2 V PC ecuación 7 La incertidumbre asociada al volumenfinaldel patrónde cont roles : u [VPC uV V PC * 1 V1 2 2 uV3 u V2 V 2* V 2 3 uV4 2 uV5 2 tenemosque : u (V4 V5 ) u [ gla glo] uV V PC * 1 V1 2 u V2 V 2 2 u [VPC u [VPC V PC 2 2 u (V4 V5 ) (V V ) 5 4 2 por lo tanto: u 2 * V3 V 3 uV4 2 uV5 2 (V 4 V5 ) 2 2 ecuación8 0.17m L 0.17m L 1.73m L 0.17m L V PC * 2* 2* 1000m L 160m L 33m L1 40m L 2 2 2 0.0073 5.8.3.3 Incertidumbre estándar del volumen de la muestra El volumen de muestra necesario para la determinación (160 mL) se toma dos veces con una probeta de 100 mL. La expresión es la siguiente: Informe de Validación. SACQ - Sergio Chesniuk Página 15 de 15 Vmuestra V1 V2 160m L V1 100m L (medido con probetade 100 mL) V2 60m L (medido con probetade 100 mL) la incertidumbre vienedada por : uVmuestra uV1 2 uV2 2 2 * 0.17m L 0.24m L 2 uVmuestra 0.24m L 0.0015 Vmuestra 160m L 5.9 Sensibilidad Este parámetro puede ser obtenido de bibliografía, adicionalmente puede extraerse desde la pendiente de las curvas de trabajo obtenidas en 5.5 (DBO5 esperada vs DBO5 obtenida). 5.10 Robustez No se considera necesario el estudio de este parámetro ya que fue evaluado en su etapa de estandarización y a la vez la operación tiene un alto grado de automatización. Eventualmente podrían efectuarse ensayos referidos al tiempo de homogeneización de la muestra. 5.11 Recuperación Este parámetro fue evaluado en 5.6. Lic. Sergio Chesniuk Informe de de Validación Página 16 de 15 DOW RESTRICTED - For internal use only