fcs211c - Tesis Electrónicas UACh

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Bioquímica
Caracterización de la interacción de Gossypol con el
transportador de Hexosas Glut 1Tesis de grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y al Título
profesional de Bioquímico.
Profesor Patrocinante: Dr. Alejandro Reyes P. - Instituto de Bioquímica.
Claudio César Sánchez Hidalgo
Valdivia Chile 2003
1. RESUMEN
Gossypol, un disesquiterpeno policíclico natural, abundante en semillas de algodón, es un
eficiente bloqueador de la actividad funcional del transportador de hexosas GLUT1 en eritrocitos
humanos. Para caracterizar el mecanismo de la inhibición, en esta tesis analizamos el efecto de
gossypol sobre la unión de citocalasina B a GLUT1, desarrollamos ensayos de transporte de Dglucosa en eritrocitos humanos en condiciones infinito-cis, además de estudios de perturbación de
la fluorescencia intrínseca del transportador en membranas aisladas y en preparaciones del
transportador purificado y reconstituido en proteoliposomas. Por otro lado, realizamos cálculos
de reconocimiento molecular (“docking”) de gossypol sobre un modelo teórico para la estructura
terciaria de GLUT1. El desplazamiento de citocalasina B por gossypol resultó ser de carácter no
competitivo, lo cual indica que el sitio de unión para gossypol en GLUT1 es distinto al sitio de
unión para citocalasina B. Asimismo, gossypol apagó la fluorescencia de GLUT1 y a la vez,
aumentó la exposición de residuos de triptófano medido por el apagamiento por yoduro de la
fluorescencia del transportador. Estos efectos de gossypol fueron saturables y específicos, pues
apogossypol, un análogo estructural carente de los grupos aldehídos en las posiciones 8 y 8’, fue
incapaz de alterar la unión de citocalasina B o la fluorescencia del transportador. A su vez, los
ensayos de transporte mostraron que gossypol no alteró la afinidad del sitio de unión externo para
D-glucosa. Mediante los cálculos de reconocimiento molecular se identificó un posible sitio de
unión para gossypol accesible exofacialmente, en el entorno de Lys 114 y diferente al sitio de
unión externo para D-glucosa. Este resultado sugiere que gossypol inhibe al unirse a este sitio
externo estabilizando la conformación del transportador que mira hacia dentro de la célula.
SUMMARY
Gossypol, a natural polycyclic disesquiterpene found in cotton seeds, is an efficient blocker of the
functional activity of the hexose transporter GLUT1 in human erythrocytes.
In order to
characterize the mechanism of the inhibition, in this Thesis we analyzed the effect of gossypol on
the binding of cytochalasin B to GLUT1, developed D-glucose transport assays in human
erythrocytes in infinite-cis conditions and quenching studies of the intrinsic fluorescence of the
transporter in isolated membranes and preparations of purified transporter and reconstituted in
proteoliposomas. On the other hand, we made calculations of molecular recognition (“docking”)
of gossypol over a theoretical model for the tertiary structure of GLUT1. The displacement of
cytochalasin B by gossypol was noncompetitive, which indicates that the binding site for
gossypol in GLUT1 is different from the binding site for cytochalasin B. Furthermore, gossypol
quenched the GLUT1 fluorescence, and also increased the exposition of the tryptophan residues
as sensed by the quenching by iodide of the fluorescence of the transporter. These effects of
gossypol were saturable and specific, because apogossypol, a structural analog devoid of the
aldehydes groups 8 and 8’, was unable to alter to the binding of cytochalasin B or the
fluorescence of the transporter. Likewise, the transport assays showed that gossypol did not alter
the affinity of the external binding site for D-glucose. By means of the calculations of molecular
recognition (“docking”) a possible exofacially accessible binding site for gossypol was identified,
in the surroundings of Lys 114 and different from the external binding site for D-glucose. These
results suggest that gossypol inhibits by binding to this external site by stabilizing the inwardfacing conformation of the transporter.
2. INTRODUCCION
El movimiento de glucosa a través de la membrana biológica es facilitado y regulado por una
familia de glicoproteínas de transmembranas denominadas GLUTs, las cuales son parte de una
superfamilia mayor de transportadores facilitativos (Pao et al., 1998). La existencia de
transportadores facilitativos de hexosas en la membrana de eritrocitos fue inferida por Widdas
(1952) y desde entonces se han identificado 14 diferentes GLUTs en células de mamíferos, las
que difieren en su expresión tisular. GLUT1 se encuentra ampliamente distribuido en tejidos y
células fetales y adultas y parece proveer un suplemento basal de glucosa para muchas células
(Mueckler et al., 1985). GLUT2 es expresado en células hepáticas, ubicándose preferentemente a
nivel de los vasos sanguíneos (Fukamoto et al., 1988). Además presenta una alta expresión en las
células -pancreáticas (Orci et al., 1989) como también a nivel de la membrana basolateral de las
células de la mucosa intestinal, mientras que en riñón se localiza a nivel de la membrana
basolateral de las células epiteliales del túbulo contorneado proximal (Thorens et al., 1990).
GLUT3 se expresa preferentemente en células del parénquima de cerebro adulto (Kayano et al.,
1988; Nagamatsa et al., 1992), al igual que en hígado y corazón, pero en un nivel menor (Gould y
Holdman, 1993). La expresión de GLUT4 en la membrana celular se encuentra regulada por
insulina, expresándose entonces en células que responden a esta hormona con un rápido
incremento en la entrada de glucosa, siendo ejemplo de esto células de los músculos esquelético y
cardíaco (Mueckler, 1994). GLUT5 por su parte no es un transportador de D-glucosa sino que
está involucrado en el transporte de D-fructosa en tejidos especializados expresándose en la
membrana apical de las células del intestino delgado, además de riñón, cerebro, músculo
esquelético y tejido adiposo (Davidson et al, 1992), y células espermáticas humanas (Burant et al,
1992). GLUT8 en cambio, transporta glucosa y fructosa y se expresa preferentemente en la línea
germinal masculina, pero también se localiza en hígado, músculos y neuronas (Doege et al.,
2000; Ibberson et al., 2000). GLUT9 se expresa en cerebro y en leucocitos (Doege et al., 2001),
mientras que GLUT10 se lo ubica a nivel del hígado y del páncreas (McVie-Wylie et al., 2001).
Análisis más rigurosos para GLUT1-5 indican que ellos también difieren en sus propiedades
cinéticas y en su especificidad de sustrato (Mueckler, 1994).
El transportador de glucosa GLUT1 es el transportador facilitativo de hexosas más ampliamente
estudiado desde el punto de vista cinético y estructural debido a su relativa abundancia en la
membrana de eritrocitos humanos (~5% de las proteínas totales). La secuencia primaria de
GLUT1 se dedujo a partir de clones de cDNA humano (Mueckler et al., 1985) dando cuenta de
un polipéptido de 492 residuos aminoacídicos que exhibe una masa molecular de 54,117 kDa. La
predicción de su estructura secundaria consta de 12 dominios hidrofóbicos transmembranales, de
entre 20 a 25 aminoácidos en forma de -hélice alternados con cortos dominios hidrofílicos
(Mueckler et al., 1985). Así, los extremos C- y N-terminales se encuentran orientados de manera
intracelular, presentando además la proteína un sitio de glicosilación en Asn45 entre los
segmentos transmembrana 1 y 2, además de un gran segmento citoplasmático entre los dominios
transmembrana 6 y 7.
GLUT1 al ser un típico transportador de tipo facilitativo presenta la propiedad de transportar al
sustrato en forma bidireccional. La dirección neta del transporte se determina solamente por la
concentración relativa del sustrato en ambos lados de la membrana plasmática por lo que el ciclo
de transporte no requiere gasto energético. El carácter facilitado del transporte deja entrever de
manera indirecta la existencia de un sitio de unión para hexosas accesible desde la cara externa
(exofacial) y otro en la cara interna (endofacial) de la membrana plasmática. La presencia de
sitios de unión de orientación exo- y endofacial para los sustratos en GLUT1 se ha demostrado de
manera inequívoca, así como la existencia de un poro acuoso que participa en la translocación del
azúcar siendo accesible desde el medio acuoso externo (Carruthers, 1990). Recientemente Zúñiga
et al (2001) han descrito un modelo teórico para la estructura tridimensional de GLUT1 basado
en estudios indirectos que sugieren un cierto empaque de las hélices para lactosa permeasa y para
GLUT1, así como del análisis de su estructura secundaria, complementando con estudios de
minimización de energía y simulaciones de dinámica molecular. Dicha estructura presenta dos
canales, uno de los cuales atraviesa completamente la estructura comprendido por la posición
espacial de las hélices 2, 5, 7 y 11, presentando motivos QLS y residuos altamente conservados
que lo postulan como la vía de transporte de sustrato (canal principal). A su vez el segundo canal
está delimitado por las hélices 1,2,3 y 7, encontrándose abierto sólo al sitio endofacial donde se
sobrepone al canal principal. Según estudios previos (Olsowski et al., 1998; Olsowski et al.,
2000) este canal correspondería a un sitio exofacial accesible al solvente que serviría como vía
para sustratos distintos a las hexosas. Una característica relevante de la actividad de GLUT1 es su
alta estereoespecificidad ya que sólo facilita la entrada de D-hexosas (D-glucosa, D-manosa, Dgalactosa) pero es incapaz de aceptar estereoisómeros L como sustratos. Aparte de transportar
hexosas, se ha descrito que GLUT1, GLUT2 y GLUT4 también facilitan la entrada de la forma
oxidada de la vitamina C, el ácido deshidroascórbico, pero no de la forma reducida, el ácido
ascórbico (Vera et al., 1993). Además el transporte de D-glucosa a través de GLUT1 es saturable,
presentando un valor aparente para KM de entre 5 a 10 mM (Carruthers, 1990). Por otro lado,
ensayos de competencia realizados con una serie de análogos de glucosa, como 2-desoxi-Dglucosa (desoxiglucosa) y el análogo no metabolizable de glucosa 3-O-metil-D-glucosa
(metilglucosa) describen valores de Ki para GLUT1 de entre 20 a 26 mM en el caso de
metilglucosa y de 7 mM para desoxiglucosa (Bell et al., 1993).
Diversos estudios han podido establecer una gama de compuestos que son capaces de producir la
inhibición de la actividad transportadora de GLUT1. Es así como se reconoce entre ellos a
compuestos como floretina (LeFevre y Marshall, 1959) y forscolina, un diterpeno activador de la
adenilato ciclasa que al igual que floretina es capaz de inhibir el transporte de D-glucosa tanto en
adipocitos (Kashiwagi et al., 1983) como en eritrocitos humanos (Lavis et al., 1987). Por otro
lado la genisteína (4’, 5, 7-trihidroxiisoflavona), isoflavona presente principalmente en vegetales
y comestibles derivados de la soya (Barnes et al., 1995), se ha descrito que también inhibe de
manera importante la actividad funcional de los transportadores de glucosa (Vera et al., 1996).
Otros compuestos del grupo de los flavonoides como las flavonas miricetina y quercetina y la
isoflavona biochanina A, también afectan la actividad transportadora de GLUT1, inhibiendo la
incorporación de glucosa en eritrocitos humanos intactos (Vera et al., 2001). Citocalasina B, es
un alcaloide proveniente de hongos el cual bloquea eficientemente la actividad transportadora de
glucosa de GLUT1, y es el compuesto más estudiado en cuanto a su interacción con este
transportador. Citocalasina B se une a GLUT1 de manera desplazable por D-glucosa y otros
ligandos del transportador, pero no es afectada por otros azúcares, como D-sorbitol o L-glucosa,
que no son transportados. En la práctica, los ensayos de desplazamiento de citocalasina B unido
al transportador se usan generalmente para confirmar la interacción de compuestos que compiten
por el transporte de hexosas mediado por GLUT1.
Gossypol,[(2,2’-binaftaleno)-8,8’-dicarboxialdehído-1,1’,6,6’,7,7’-hexahidroxi-5,5’-diisopropil3,3’-dimetil] es una fitoalexina que se obtiene desde las glándulas pigmentarias de las plantas de
algodón y de otras especies del género Gossypium (familia Malvaceae). Gossypol exhibe una
variedad de efectos biológicos, que incluyen actividad antiespermática, anticancerígena,
antiparasítica y antiviral ( Montamat et al., 1982; Wichmann et al., 1982; Rikihisa y Lin, 1986;
Eid et al., 1988; Gonzalez-Garza y Said-Fernandez, 1988; Lin et al., 1989; Wu, 1989; Benz et al.,
1990; Deck et al., 1991). No obstante, el mayor interés suscitado por este sesquiterpeno se debe a
su habilidad de suprimir parcial y reversiblemente la función reproductiva masculina
(Qian y Wang, 1984; Segal, 1985). Este compuesto destruye elementos del epitelio seminífero
pero no altera la función endocrina del testículo. Sin embargo, sus efectos laterales, tales como
hipocalemia, diarrea, neuritis y parálisis han restringido su uso como contraceptivo masculino
(Waites et al., 1998). Por otro lado, gossypol exhibe una amplia variedad de efectos en células y
tejidos, incluyendo alteraciones en la función secretoria en cultivos de células de Sertoli
provenientes de rata (Monsees et al., 1998), detención de la hiperplasia prostática benigna de
células en crecimiento en la fase G0/G1 del ciclo celular (Shidaifat et al., 1997), además de
bloquear la comunicación célula-célula en células humanas y de ratas (Herve et al., 1996). Así
también se le atribuyen efectos sobre la depleción de ATP y la inactivación de los canales de
taurina sensibles a ATP (Ballatori et al., 1995), acción antiproliferativa sobre las células
cancerígenas del cáncer de mama humano (Gilbert et al., 1995), inducción de fragmentación
apoptótica de ADN y muerte celular en células HL-60 (Jarvis et al., 1994), así como
citotoxicidad in vivo e in vitro para líneas celulares provenientes de tumores del sistema nervioso
central (Coyle et al., 1994).
Gossypol es altamente lipofílico, demostrándose por estudios de fraccionamiento celular su
asociación a membranas mitocondrial, nuclear y plasmática. Concentraciones micromolares de
gossypol alteran muchas funciones asociadas con estas membranas, como por ejemplo la
fosforilación oxidativa y el transporte de electrones (Abou_Donia y Dieckert, 1974; Tso y Lee,
1981, Na+, K+ y Ca2+, Mg2+- ATPasas (Adeyemo et al., 1982; Breitbart et al., 1984) y adenilato
ciclasa (Ki entre 75 y 500 M) (Olgiati et al., 1984). Por otro lado también afecta el orden en la
membrana, la permeabilidad de los liposomas (Reyes et al., 1984) y el transporte de hexosas
sensible a insulina en adipocitos de rata, presentando en este último caso una Ki de 200 μM
(de-Peyster et al., 1986). Además inhibe reversiblemente a calcineurina con un valor Ki de 15 μM
(Baumgrass et al., 2001).
En nuestro laboratorio hemos encontrado que gossypol es un eficiente bloqueador del transporte
de análogos de D-glucosa en eritrocitos humanos, lo cual sugiere que este compuesto es capaz de
bloquear la actividad funcional del transportador de hexosas GLUT1. Este efecto inhibitorio
parece ser además dependiente del tiempo (Reyes, AM, comunicación personal). Este efecto
inhibitorio de gossypol también lo hemos encontrado al medir transporte de hexosas en células
mieloides humanas HL-60, que expresan fundamentalmente GLUT1, así como usando células
CHO que sobreexpresan GLUT1. Esto sugiere que este efecto de gossypol es independiente del
contexto celular donde se exprese el transportador. Por otro lado se ha demostrado que gossypol
es capaz de inhibir el transporte de glucosa en espermatozoides humanos en un rango de
concentraciones de 5 a 10 μM (Kanwar et al., 1990).
Con el propósito de caracterizar el mecanismo de la inhibición por gossypol, se realizarán
estudios detallados de la inhibición midiendo el eflujo de D-glucosa en eritrocitos humanos, que
permitirán comparar el comportamiento de la unión de gossypol al transportador con otros
inhibidores caracterizados de GLUT1. En adición la medición del patrón de fluorescencia de
GLUT1 nos permitirá evaluar la particular conformación adoptada por GLUT1 al unir gossypol.
Además analizaremos el efecto de este compuesto y de ciertos análogos estructurales sobre la
unión de citocalasina B a GLUT1, en membranas aisladas de eritrocitos humanos lo que nos dará
cuenta de la posible forma de interacción de gossypol con GLUT1. Por otro lado utilizaremos
cálculos de reconocimiento molecular para intentar identificar espacialmente el o los probables
sitios de unión de gossypol a GLUT1, como a la vez determinar el efecto y naturaleza química de
esta interacción sobre el transporte de hexosas por parte de GLUT1.
3. MATERIALES Y METODOS
3.1 MATERIALES
HEPES, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de mercurio, fosfato de potasio monobásico,
fosfato de sodio dibásico anhidro, sorbitol, metanol y dimetilsulfóxido se adquirieron de
J.T.Baker. D-glucosa, cloruro de magnesio, floretina citocalasina B, citocalasina E, apogossypol
y gossypol, fueron adquiridos de Sigma Chemical Co, MO, USA. Yoduro de potasio se adquirió
de Mallinckrodt. 3-O-[metil-³H]-D-glucosa (86,7 Ci/mmol), 2-[1,2-³H]-desoxi-D-glucosa (26,2
Ci/mmol), y [4-³H]-citocalasina B (11,9 Ci/mmol) fueron obtenidos de DuPont NEM. El
octilglucosido provenía de Pierce, mientras DEAE-celulosa provenía de Whatmann.
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Obtención y purificación de eritrocitos humanos
Para el aislamiento de eritrocitos se procedió según lo descrito por Fairbanks (1971) utilizándose
como fuente primaria unidades de sangre provenientes de la Unidad de Banco de Sangre del
Hospital Regional de Valdivia. El lavado de eritrocitos se efectuó con Hepes salino (Hepes 150
mM, cloruro de sodio 135 mM, cloruro de potasio 50 mM, cloruro de calcio 18 mM, cloruro de
magnesio 8 mM) centrifugando 3 veces las células a 4.000 rpm durante 5 min en una centrífuga
clínica. Posterior a cada centrifugación se procedió a extraer por aspiración el sobrenadante más
la capa de células blancas del pellet, obteniéndose así un concentrado exclusivo de eritrocitos
libres de glucosa y de los agentes propios para su uso médico. En este caso para cada
experimento se preparó el concentrado fresco, no obstante se puede almacenar a 4°C en Hepes
salino para su posterior utilización.
3.2.2 Preparación de membranas de eritrocitos humanos
La preparación se basa en la metódica descrita por Carruthers et al. (1986). Los eritrocitos se
colocan en botellas de centrífuga plásticos de 250 ml y son lavados tres veces con una solución
de fosfato salino pH 7,4. Para esto la sangre se centrifuga en una centrífuga Sorvall RC-5C a
4.500 rpm en rotor GSA por 10 min cada vez. Sobre los eritrocitos sedimentados se deposita una
capa blancuzca, que corresponde a las células de la línea blanca, la que se extrae fácilmente por
aspiración con una pipeta. Después del último lavado los eritrocitos son lisados por estrés
hipotónico al agregarles 5 volúmenes de 5 mM fosfato de sodio pH 7,4 por 10 min a 4°C. Las
membranas se colectan por centrifugación a 10.000 rpm por 25 min a 4°C; se descarta el
sobrenadante y se resuspende el precipitado en 10 mM fosfato de sodio pH 7,4. El proceso de
centrifugación y resuspensión se repite tres veces, para obtener membranas de eritrocitos
totalmente desprovistas de citoplasma. Las membranas se resuspenden finalmente en 10 mM
fosfato de sodio pH 7,4. Posteriormente estas membranas son tratadas con una solución básica
por 45 seg y luego resuspendidas en 5 mM fosfato pH 7,4 para los experimentos de perturbación
de fluorescencia con membranas o bien con 50 mM TRIS-HCl pH 7,4 para la posterior
purificación del transportador.
3.2.3 Purificación del transportador reconstituido en proteoliposomas
A la suspensión de membranas libre de proteínas periféricas (2,1 mg/ml aprox.), resuspendidas en
50 mM TRIS-HCl pH 7,4, se le agrega una solución consistente en 46 mM de octilglucosido y 2
mM de ditiotreitiol. Después de 20 min de agitación suave a 4°C la muestra se dispensa en un
tubo de policarbonato y se centrifuga en centrífuga Sorvall RC-5 en rotor SS-34, sin freno a
10.000 rpm durante 20 min. Se remueve cuidadosamente el sobrenadante, con una pipeta
evitando que se contamine con el sedimento. A la solución solubilizada se le agrega NaCl de tal
forma que quede 25 mM final. Este extracto se aplica a una columna de DEAE-celulosa que
previamente ha sido equilibrada con diez volúmenes de 50 mM TRIS-HCl pH 7,4 y luego con un
volumen de tampón de equilibrio y elución consistente en 34 mM octilglucosido, 50 mM TRISHCl pH 7,4, 25 mM NaCl, 2 mM DTT. Se recolectan fracciones de 1 ml desde la aplicación de la
muestra, luego se termina de eluir la columna con el mismo tampón de equilibrio y elución. Las
proteínas se detectan midiendo absorbancia a 280 nm y se combinan las fracciones del eluente
que contienen a la proteína transportadora. A las fracciones combinadas se les adiciona 25 μl de 4
M NaCl por cada ml (100 mM final) y 5 μl de 200 mM EDTA por cada ml (1 mM final). Esta
muestra se dializa contra 1 litro de tampón 50 mM Fosfato de sodio pH 7,4, 100 mM NaCl, 1
mM EDTA. La muestra dializada se almacena por no más de 5 días entre 0 y 4°C hasta ser
utilizada.
3.2.4 Ensayos de transporte de salida
Los eritrocitos (90 x 106 cels) se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min a una
concentración final de 10 mM OMG. Posterior a ello se centrifugaron a 5.000 rpm en una
centrifuga clínica por 3 min descartándose el sobrenadante. El concentrado celular se incubó a
4°C durante 20 min con una concentración de 0,2 μCi/μl 3H-OMG. El ensayo de transporte se
inicia al agregar 190 μl de Hepes salino que contiene diferentes concentraciones de gossypol
entre 0-300 μM, sobre 10 μl de células. Al cabo de 30 segundos el transporte se detiene por la
adición de al menos 8 volúmenes de solución de detención fría (PBS 1x; 100 μM floretina; 1,5
mM KI ; 10 μM HgCl2), las células se lavan 2 veces más con la misma solución. Finalmente las
células se lisaron con metanol y luego de centrifugar a 14.000 rpm con un rotor F-45-30-11
durante 5 min se transfirió el sobrenadante a viales de vidrio. Con el fin de cuantificar la
radiactividad presente se agregaron 2 ml de líquido de centelleo por vial y se cuantificó mediante
un contador de centelleo líquido Packard, Tri-carb 1600 TR.
3.2.5 Ensayos de desplazamiento de la unión de citocalasina B a membranas de
eritrocitos
La unión de citocalasina B al transportador se determinó según lo descrito por otros autores
(Gorga y Lienhard, 1981; Lavis et al., 1987; Vera et al., 1996). La unión a los transportadores de
glucosa funcionales se determinó por la diferencia entre la unión de citocalasina B en presencia
de 500 mM D-sorbitol y 500 mM D-glucosa, representando la unión específica y la unión
inespecífica de citocalasina B a las membranas de eritrocito, respectivamente.
La composición del ensayo fue de 0,1 μM citocalasina B, 0,05 μCi [4-³H]-citocalasina B, 10 μM
citocalasina E, 2 mg /ml proteína, 500 mM D-sorbitol o D-glucosa, y gossypol o apogossypol 0 a
300 μM en Hepes salino, en un volumen final de 150 μl. La mezcla se incubó 30 min a
temperatura ambiente y se centrifugó posteriormente a 15.000 rpm a 4°C por 15 min. Finalmente,
se descartó el sobrenadante y el sedimento fue resuspendido en 200 μl de 10 mM Tris-HCl, pH
8,0, 0,2 % SDS. Las membranas resuspendidas se transfirieron a un vial de vidrio al que se
agregó 2 ml líquido de centelleo, cuantificándose la radiactividad por medio de un contador de
centelleo Packard Tri-Carb 1600 TR.
3.2.6 Ensayo de eflujo de D-glucosa en eritrocitos humanos
El ensayo se basa en el procedimiento introducido por Sen-Widdas (Sen y Widdas, 1962) que
mide la variación de la dispersión de luz de una solución de eritrocitos producto del cambio de
volumen de las células cargadas con una concentración alta de D-glucosa al diluirlas en una
solución con baja glucosa. Se incubó un concentrado de eritrocitos a una concentración final 100
mM D-glucosa en Hepes salino durante 1 h a 32°C. Un volumen pequeño (5-6 μl) de estas
células se diluyeron rápidamente en 2,5 ml de Hepes salino, mantenido en una cubeta de cuarzo
de 3 ml termorregulada a 32°C, y se midió la intensidad de luz dispersada en un
espectrofluorímetro Perkin-Elmer LS 50. La longitud de onda de emisión y excitación se fijaron a
650 nm con ambos anchos de ranura fijadas a 5,0 nm. Las adiciones al medio se realizaron
directamente en la solución de dilución.
3.2.7 Perturbación de la fluorescencia de GLUT1
Se diluyeron en una cubeta de cuarzo 20 μl de membranas aisladas de eritrocitos (1,3 mg/ml
proteína) en 2,980 ml de fosfato salino (5mM Na2HPO4, 0,1 M NaCl, 0,1 mM EDTA pH 7,4).
Espectros de fluorescencia entre 310 a 390 nm se obtuvieron en un espectrofluorímetro PerkinElmer LS 50 luego de excitar a una longitud de onda de 295 nm con una ranura de emisión de 8,0
nm y una ranura de excitación de 2,5 nm. Se agregaron volúmenes crecientes de una solución
madre de yoduro de potasio para obtener concentraciones finales de KI entre 0 a 300 mM. Para
estudiar el efecto de gossypol sobre la perturbación de la fluorescencia de GLUT1 se fijaron
concentraciones entre 0 y 0,5 μM de este compuesto en fosfato salino.
3.2.8 Estudios de reconocimiento molecular de glucosa y de gossypol en el modelo teórico
para GLUT1
Los estudios de cálculos de reconocimiento molecular se llevaron a cabo utilizando el programa
Autodock 3.0.0 sobre la base operativa Linux Red Hat 7.0.1 instalada en un PC clúster Pentium
IV 1,7 Ghz- Athlon 1.8 Ghz- Athlon 1.8 Ghz. Para dichos estudios se contaba con un modelo
teórico para GLUT1 (Zuñiga et al., 2001). Dicho modelo se sometió a un relajamiento de 50 ps
en un campo de fuerza CVFF, teniendo la salvedad de restringir la zona transmembrana. Una vez
relajada la estructura se diseñaron grillas de 15x30x30 Å ubicadas en torno al canal central, de
acuerdo a lo descrito por Zuñiga et al (2001) y luego se procedió a calcular la energía libre para
el ajuste mediante reconocimiento molecular de glucosa a la zona de grillas en GLUT1.
Previo a intentar un cálculo de reconocimiento molecular con gossypol, fue necesario realizar
cálculos de minimización de energía para la molécula de gossypol. Esto se efectuó mediante un
campo de fuerza CVFF. Una vez que se contó con su conformación de mínima energía, se
procedió a calcular un reconocimiento molecular de gossypol contra GLUT1 en las mismas
condiciones de relajación que para los estudios de reconocimiento molecular de glucosa. Para
ello se diseñaron grillas de 60x60x60 Å que abarcaran la totalidad de la proteína.
Finalmente para calcular un reconocimiento molecular para glucosa sobre el complejo gossypolGLUT1, se relajó el complejo gossypol-GLUT1 durante 50 ps bajo un campo de fuerza CVFF.
Una vez minimizada la energía de interacción del complejo gossypol-GLUT1 se efectuó un
nuevo cálculo de reconocimiento molecular para glucosa, conservando las mismas condiciones
de grilla usadas en el cálculo sobre GLUT1.
4. RESULTADOS
4.1 Ensayos de eflujo de D-glucosa en presencia de gossypol y
apogossypol en eritrocitos, utilizando dispersión de luz
En primer lugar decidimos probar el efecto de gossypol sobre el transporte de D-glucosa usando
la técnica descrita por Sen y Widdas (Sen y Widdas, 1962) que emplea dispersión de luz. El
modelo experimental se basa en el cambio de tamaño de los eritrocitos al ser incubados en un
medio de alta concentración de glucosa, los cuales al ser sometidos a un rápido cambio de
osmolaridad dan paso a la salida de D-glucosa lo que conlleva eventualmente un aumento en la
luz dispersada. Este aumento de la dispersión de luz es función de la velocidad de transporte de
D-glucosa desde el interior de las células (Figura 1). Estos datos se ajustaron a una curva
monoexponencial de la cual se extrae el valor de constante de velocidad (k) para alcanzar el
equilibrio osmótico. Un inhibidor del transporte de hexosas mediado por GLUT1, debiera
mostrar un claro aumento en el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio osmótico a medida
que se incrementa la concentración del inhibidor; en otras palabras los valores de k debieran
disminuir (Figura 1). En nuestras manos usando diferentes preparaciones de eritrocitos cargados
con D-glucosa 100 mM el valor de k fue cercano a 0,06-0,12 seg-1 a 32°C.
El transporte de salida de glucosa mediado por GLUT1 se vio afectado de forma negativa por
gossypol (Figura 2). Se observó que a medida que se incrementó la concentración del
sesquiterpeno en el medio de dilución de los eritrocitos se produjo una notable disminución en la
velocidad de salida. Al analizar estos datos con un modelo clásico de inhibición se pudo estimar
para la constante de inhibición (Ki) un valor de aproximadamente 2 μM (Figura 2).
FIGURA 1. Efecto de gossypol sobre el tiempo de equilibrio osmótico en ensayos de salida. Se
registra la dispersión de luz en función del tiempo en eritrocitos incubados a 32°C. Estos datos se
ajustaron a una curva monoexponencial de la cual se extrae el valor de constante de velocidad (k)
para alcanzar el equilibrio osmótico. Las distintas concentraciones de gossypol fueron: 0 μM (A),
5 μM (B) y 15 μM (C).
Por otro lado, apogossypol, un análogo que difiere estructuralmente de gossypol exclusivamente
en que no presenta los grupos aldehídos en posiciones 8, 8’, fue incapaz de producir efecto
inhibitorio sobre el eflujo facilitativo del azúcar. Es sabido que los sesquiterpenos afectan
indirectamente la permeabilidad de las membranas biológicas, por lo que el efecto inhibitorio
podría ser causado por esta propiedad, por esto los datos obtenidos con apogossypol se
constituyen en un resultado importante, pues apogossypol también muestra la propiedad de
alterar la fluidez de membranas. Este hecho nos permite descartar la noción que la inhibición de
GLUT1 por gossypol se deba a este efecto inespecífico, sino que el efecto inhibitorio sería por
interacción directa entre gossypol y la proteína GLUT1. En otras palabras, apogossypol se
constituye en un control negativo del efecto de gossypol en la membrana plasmática a la hora de
afectar el transporte de glucosa (Figura 2). En los casos de otros inhibidores bien estudiados,
como citocalasina B y floretina utilizando esta técnica se han determinado valores de Ki de 0,5
μM (Bloch, 1973) y 5,0 μM (datos no publicados), respectivamente.
4.2 Ensayos de transporte de salida de OMG en presencia de
gossypol
Otra manera de probar el efecto de gossypol sobre la funcionalidad de GLUT1 es utilizando un
análogo de glucosa marcado radiactivamente para medir transporte. Decidimos usar esta
metodología para lo cual seleccionamos a metilglucosa (OMG), dado que esta hexosa es un
azúcar que es no metabolizable y por lo tanto se acumula pasivamente en la célula. En estudios
previos se ha mostrado que gossypol es un eficiente bloqueador del transporte de entrada de
OMG en eritrocitos humanos y otros tipos celulares (datos no publicados). Como los ensayos
usando dispersión de luz evalúan indirectamente la salida de glucosa desde las células, probamos
35
la acción de gossypol al ensayar directamente la salida de OMG marcado desde los eritrocitos.
FIGURA 2. Efecto de gossypol y apogossypol sobre el transporte de glucosa mediado por
GLUT1. El experimento se realizó monitoreando la dispersión de luz producida por eritrocitos
incubados a 32°C al ser sometidos a un gradiente osmótico de D-glucosa. Los símbolos
representan las diferentes concentraciones de gossypol (●) y apogossypol (○). Para gossypol la
línea sólida representa el resultado del ajuste no lineal de los datos a una ecuación de inhibición
simple. Cada símbolo representa el promedio ± una desviación estándar de tres determinaciones
independientes.
La figura 3 representa los resultados de la velocidad del transporte de salida de OMG en función
de la presencia de diferentes niveles de gossypol. Es claro que se afecta la actividad de GLUT1
36
en estas condiciones y se logró estimar un valor de Ki de 7 μM para gossypol. Asimismo,
gossypol inhibió el intercambio de OMG en condiciones de equilibrio, con un valor de Ki cercano
a 60 μM (datos no mostrados). Estos resultados apuntan persuasivamente a que gossypol afecta
directamente la capacidad del transportador GLUT1 para permitir el transporte de hexosas.
4.3 Ensayos del efecto de gossypol sobre el sitio externo de glucosa
Hemos mostrado que gossypol afecta en forma directa la capacidad funcional del transportador
GLUT1 de facilitar el transporte de hexosas. Una pregunta pertinente es ¿Gossypol compite por
el sitio externo de unión de glucosa? Esta interrogante nace de la necesidad de evaluar el posible
sitio de unión de gossypol a GLUT1. Una posibilidad atrayente es que gossypol se una a un sitio
en el transportador que sea accesible externamente; este sitio puede o no tener regiones que se
compartan con el sitio externo de unión de D-glucosa. Para probar esta posibilidad usamos el
abordaje sugerido por Sen y Widdas, quienes estiman el valor de constante de disociación del
sitio externo para D-glucosa en GLUT1 al medir el transporte de salida del azúcar en presencia
de distintas concentraciones de glucosa en el medio externo. Al evaluar estos resultados como
tiempo de salida en función de la concentración de D-glucosa en el medio externo (gráficos de
Sen-Widdas) se obtuvo una línea recta en la cual el intercepto en la abscisa corresponde al valor
de Kd para glucosa en el sitio externo.
FIGURA 3. Efecto de gossypol sobre el transporte de salida de metilglucosa. Las células (40x106
células/ensayo) se incubaron a 10 mM OMG y 0,2 μCi del sustrato para luego medir el transporte
de salida por 30 segundos a 4°C en presencia de distintas concentraciones de gossypol entre 0 a
100 μM. La línea sólida corresponde a un ajuste cinético simple. Cada símbolo representa el
prmedio ± una desviación estándar de cuatro determinaciones independientes.
37
En nuestras manos, pudimos estimar un valor de Kd cercano a 2 mM (Figura 4A). Gossypol
afectó el tiempo de salida de D-glucosa en presencia de diferentes niveles de glucosa externa,
pero no fue capaz de alterar la afinidad de D-glucosa por el sitio de unión externo. Como
controles evaluamos la acción de dos conocidos inhibidores de GLUT1: citocalasina B y floretina
(Kd para D-glucosa en presencia de citocalasina B y floretina de 4 mM y 12 mM respectivamente
(Bloch, 1973). Así se conoce que citocalasina B presenta un sitio de unión interno a GLUT1,
distinto al sitio de unión interno para glucosa. Por otro lado se sabe también que floretina se une
por la cara exofacial del transportador, compitiendo por el sitio externo de unión a glucosa. De
acuerdo con lo anterior, citocalasina B no alteró la afinidad de glucosa por su sitio de unión
externo (Figura 4B), en cambio, floretina produjo un significativo aumento en el valor de Kd para
glucosa externa. Estos resultados nos muestran que este ensayo permite discriminar si el
38
inhibidor afecta el sitio externo para glucosa en el transportador, y nos permite concluir que el
sitio de unión para gossypol no coincide con el sitio de unión externo para D-glucosa.
4.4 Perturbación de la fluorescencia de GLUT1 por gossypol en
membranas aisladas de eritrocitos
Nuestros resultados proveen evidencia funcional que gossypol afecta al transportador GLUT1 y
que este efecto no obedece a una perturbación inespecífica. Decidimos entonces obtener pruebas
que gossypol se une en forma directa al transportador. Para ello planteamos probar medidas de
fluorescencia del transportador en membranas aisladas de eritrocitos.
FIGURA 4. Gráfico de Sen-Widdas. Protección de glucosa sobre el efecto de gossypol. Se
monitoreó la dispersión de luz en eritrocitos incubados a 32°C luego de ser sometidos a un
gradiente osmótico en presencia de distintas concentraciones de glucosa en el medio externo.
Panel A: controles (○) 0 μM gossypol, (□) 0,5 μM citocalasina B, (∆) 5 μM floretina. Panel B:
efecto de gossypol; (●) 0 μM, (■) 5 μM, (▲) 7 μM.
39
En primer lugar probamos la influencia de gossypol sobre los espectros de emisión de
preparaciones del transportador GLUT1 reconstituido en proteoliposomas. En la figura 5 se
aprecia el efecto de la adición de gossypol sobre la fluorescencia intrínseca de las membranas. Es
claro que gossypol produce una disminución notable de la fluorescencia intrínseca de las
preparaciones en el rango sub-micromolar de concentraciones. Parte de este decremento se
debería al efecto de filtro interno por la absorbancia de gossypol.
Una estrategia alternativa que adoptamos fue analizar el apagamiento de la fluorescencia
intrínseca de GLUT1 producido por yoduro de potasio (KI). Es conocido que KI apantalla la
fluorescencia de residuos de triptófano en proteínas mediante un mecanismo de transferencia de
energía. La eficiencia del apagamiento es una medida entonces de cuantos y cuan accesibles se
encuentran los triptófanos en la proteína. En el caso de las membranas de eritrocitos, yoduro
40
apagó la fluorescencia en forma lineal en el intervalo de 0-300 mM (Figura 6A). Los datos se
pueden analizar mediante la ecuación de Stern-Volmer:
F/F0 = 1 + Ksv [yoduro]
donde F0 y F corresponden a las intensidades en ausencia y presencia del apagador
respectivamente, y Ksv corresponde a la constante de apagamiento de Stern-Volmer.
Concentraciones crecientes de gossypol producen un aumento en la eficiencia de apagamiento
causada por yoduro. Este efecto se explicaría sobre la base que gossypol vuelve más accesible los
residuos de triptófanos. Las constantes de Stern-Volmer aumentan de una manera dependiente de
la concentración de gossypol y este efecto fue saturable (Figura 6B). De estos datos se pudo
estimar un valor de 0,15 μM para la constante de disociación de gossypol.
FIGURA 5. Espectro de fluorescencia de GLUT1 purificado y reconstituido en proteoliposomas.
Panel A: Se midió el espectro de fluorescencia (λexc 295 nm) en presencia de 0 μM (verde), 0,05
μM (amarillo), 0,1 μM (azul), 0,5 μM (rosa) y 1,0 μM (cian) gossypol. Panel B: se grafican los
valores de fluorescencia a 340 nm en función de la concentración de gossypol. La línea
representa un ajuste a una curva cinética simple.
Para descartar la factibilidad que yoduro perturbe residuos de proteínas distintas al
transportador GLUT1 en las preparaciones de membranas, se llevaron a cabo algunos
ensayos de apagamiento con GLUT1 purificado y reconstituido. La figura 7 muestra que
yoduro apantalla la fluorescencia del GLUT1 reconstituido. Concentraciones crecientes de
gossypol inducen un aumento en la eficiencia de apagamiento. Los datos son entonces
cualitativamente similares a los obtenidos usando membranas aisladas de eritrocitos.
Estas determinaciones de fluorescencia proveen pruebas convincentes que gossypol
perturba en forma directa el microambiente de residuos triptófanos en el transportador
GLUT1. La interpretación más simple de este efecto es proponer que existe en el
transportador un sitio al cual se puede unir gossypol, unión que explicaría las variaciones
en su fluorescencia intrínseca.
FIGURA 6. Apagamiento por yoduro de la fluorescencia intrínseca de GLUT1 aislado de
membranas de eritrocitos humanos. Panel A: gráfico de Stern-Volmer para el efecto de
gossypol sobre el apagamiento por yoduro. Las concentraciones de gossypol corresponden
a 0 μM (●); 0,05 μM(○); 0,1 μM (■); 0,25 μM (□) y 0,5 μM (▲). Panel B: Análisis de las
pendientes del gráfico de Stern-Volmer en función de la concentración de gossypol. La
línea sólida representa un ajuste no lineal de cinética simple.
FIGURA 7. Apagamiento por yoduro de la fluorescencia de GLUT1 purificado y
reconstituido en proteoliposomas. El transportador GLUT1 se purifica a partir de
membranas aisladas de eritrocitos humanos como se describe en Materiales y Métodos. Se
analizó el efecto de yoduro sobre la fluorescencia de la proteína en presencia de gossypol 0
μM (■), 0,1 μM (○) y 0,5 μM (●).
4.5 Desplazamiento de citocalasina B por gossypol y apogossypol
en membranas aisladas
El desplazamiento de citocalsina B se ha usado frecuentemente para probar la interacción
de distintos ligandos con el transportador GLUT1. Se considera que si un compuesto es
capaz de desplazar a citocalasina B desde su sitio de unión, es prueba que el compuesto se
une al transportador. Se sabe que citocalasina B se une a GLUT1 por la cara citoplasmática
del transportador e inhibe su actividad transportadora con un valor de Ki de 0,1 μM.
En la figura 8 panel A se muestra la capacidad de gossypol y de apogossypol de desplazar
la unión específica (desplazamiento por D-glucosa) en la unión de citocalasina B a
membranas de eritrocitos. Gossypol presentó un evidente efecto de desplazamiento sobre la
unión de citocalasina B a GLUT1 con un valor estimado de Ki de 30 μM. En contraste, con
apogossypol no se observa efecto sobre la unión de citocalasina B a membranas. Se
confirma entonces que apogossypol es incapaz de unirse al transportador.
Por otro lado, el panel B muestra que gossypol desplazó la unión de citocalasina B a
membranas de manera no competitiva lo cual sugiere que existe un sitio de unión para
gossypol distinto al de citocalasina B. En acuerdo con lo anterior, se observa que el gráfico
secundario de las pendientes e interceptos del panel B, permiten extrapolar un valor de Kd
cercano a 20 μM para la unión de gossypol a las membranas de eritrocitos. Se comprueba
así que gossypol se une al transportador GLUT1 en membranas aisladas y en la proteína
reconstituida.
FIGURA 8. Desplazamiento de citocalasina B por gossypol. Panel A: curva de
desplazamiento de citocalasina B, (●) gossypol, (○) apogossypol. Panel B: gráfico de
dobles recíprocos para el efecto de diferentes concentraciones de gossypol sobre la unión
de citocalasina B. Los símbolos corresponden a gossypol 5 μM (●), 10 μM (○), 15 μM (▼)
y 20 μM (▽). Panel C: gráfico secundario de pendientes e interceptos de los datos del panel
B, (●) pendientes; (○)interceptos.
4.6 Estudios de reconocimiento molecular de glucosa y gossypol
en el modelo teórico para GLUT1
Tomando como base el modelo teórico para la conformación espacial de GLUT1 propuesto
por Zúñiga et al (2001), diseñamos estudios de reconocimiento molecular asistido por
computador (“docking”) para gossypol sobre GLUT1. En una fase inicial se caracterizó el
reconocimiento molecular de glucosa a través del canal principal del transportador, que está
delimitado por las hélices 2,5,7 y 11. Así pudimos estimar las interacciones energéticas de
glucosa a medida que seguía su vía de transporte (ver más adelante) así como su posible
orientación espacial (Figura 9). Para analizar el modo de unión de gossypol al
transportador, fue necesario obtener la estructura de mínima energía para la molécula. Con
esta estructura se probó un reconocimiento molecular usando grillas que abarcaban el
volumen completo de la proteína. Se recurrió al programa Autodock 3.0.0 el cual permite
realizar procesos automatizados al establecer volúmenes de reconocimiento molecular en la
proteína, conocidas como grillas. Así se obtuvieron las posibles disposiciones espaciales de
la molécula de gossypol en torno a toda la superficie de GLUT1 (Figura 10), así como una
estimación de la energía involucrada en su interacción con GLUT1. La conformación de
más baja energía para gossypol, correspondió a aquella en la cual gossypol está ubicada en
una zona extracelular muy cerca de la boca del canal central y del putativo sitio de unión
externo para glucosa (Figura 11). Este dato muestra que gossypol se uniría a un sitio
externo en GLUT1, explicando los resultados experimentales que indican que gossypol no
perturba el sitio de unión externo (exofacial) para glucosa en el transportador.
Al estudiar en detalle el entorno del putativo sitio de unión para gossypol en GLUT1,
utilizando el programa Insight II en una plataforma Silicon graphics O2, se encontró que
existen varios residuos de lisina en el entorno. La figura 12 nos muestra que existen 5
residuos en una esfera de 30 Å de radio, centrada en la posición del grupo 8’ aldehído del
gossypol, las cuales corresponden a Lys183, Lys300, Lys117, Lys38 y Lys114. De estos
residuos la más cercana al grupo aldehído de la molécula de gossypol fue Lys114, con una
distancia de aproximadamente 8 Å (Figura 12).
FIGURA 9. Reconocimiento molecular de glucosa sobre GLUT1. El cálculo se realizó
utilizando como referencia al canal central de GLUT1 propuesto por Zuñiga et al (2001), el
cual está conformado por las hélices 2, 5, 7 y 11. Los distintos colores de las moléculas de
glucosa representan las conformaciones de menor energía para cada grilla. Panel Derecho:
vista frontal. Panel Izquierdo: vista superior.
FIGURA 10. Reconocimiento molecular para gossypol en GLUT1. El reconocimiento
molecular se realizó utilizando grillas de 60x60x60 Å, que comprenden el total del volumen
de la proteína. En distintos colores muestran las conformaciones de menor energía para
cada grilla.
FIGURA 11. Reconocimiento molecular para gossypol y glucosa en GLUT1. La figura
exhibe las conformaciones de menor energía calculadas para el reconocimiento molecular
de D-glucosa (gris) y de gossypol (rosa).Los segmentos transmembrana están representados
en color naranja. Panel derecho: vista de referencia con gossypol. Panel izquierdo: vista de
referencia con D-glucosa.
FIGURA 12. Análisis del entorno del sitio de unión propuesto para gossypol. Se muestra
un acercamiento de la estructura del complejo mostrando la estructura del sitio de unión de
gossypol. La proteína se representa en un modelo de alambre que indica la disposición de
los carbonos a. Se muestran las cadenas laterales de residuos de lisina cercanos a gossypol
y la disposiciones de residuos hidrofóbicos en el entorno a Lys 114 (amarillo). Se aprecia la
proximidad del grupo amino de la cadena lateral de Lys 114 con respecto al grupo aldehído
de gossypol.
FIGURA 13. Energías libres de reconocimiento molecular de glucosa en GLUT1. Los datos
corresponden a las conformaciones de más baja energía que adoptaría la molécula de
glucosa en su paso por el canal central del transportador GLUT1 libre (○) como en el
transportador unido a gossypol (●). Los cálculos de energía para el reconocimiento
molecular se realizaron mediante el programa Autodock 3.0.0.
Finalmente, evaluamos el efecto que produce gossypol sobre la energía de interacción
involucrada en el transporte de glucosa. Para ello, procedimos a llevar a cabo un nuevo
ciclo de reconocimiento molecular de glucosa en el canal central, pero esta vez en el
modelo obtenido para la interacción gossypol-GLUT1. En la figura 13 se muestra las
energías libres para las conformaciones en ausencia y presencia de gossypol. Como se
aprecia, gossypol aumenta la energía libre necesaria para que glucosa interactúe con el
canal principal del transportador, lo cual es concordante con una inhibición del transporte
de glucosa al encontrarse unido gossypol.
5. DISCUSION
Existen en la literatura esencialmente dos mecanismos descritos para explicar la regulación
de la actividad funcional de GLUT1 por ligandos distintos a los sustratos. El primero
comprende la unión competitiva de inhibidores y de análogos no transportables de los
sustratos naturales a los sitios de unión externo o interno del transportador, como sería la
maltosa y la floretina. Un mecanismo diferente corresponde a aquellos compuestos que se
unen en sitios diferentes a los sitios de unión de azúcares y actúan por tanto a través de
estabilizar una conformación no funcional del transportador. Por ejemplo se ha determinado
que citocalasina B se une a un sitio accesible internamente, el cual debido a la diferente
naturaleza del ligando, debiera ser diferente que el sitio de unión interno para D-glucosa.
Gossypol surge como un compuesto interesante pues se ha demostrado que este
sesquiterpeno produce diferentes respuestas fisiológicas en distintos tipos celulares. Estos
efectos se han explicado en parte por dos tipos de mecanismos: a) gossypol produce
alteraciones
en
la
fluidez
y
permeabilidad
de
membranas
biológicas
(de-Peyster et al., 1986) y b) su unión directa a proteínas y enzimas que produce cambios
en su actividad funcional (Olgiati y Toscano, 1983; Olgiati et al., 1984).
En el caso del transportador GLUT1, se ha visto que gossypol es un eficiente inhibidor en
ensayos de transporte en condiciones de salida en eritrocitos humanos, en un intervalo
micromolar de concentraciones. Este efecto es congruente con la determinación en ensayos
de entrada y usando otros tipos celulares (Vera J.C, y Reyes A., datos no publicados). Es
posible proponer que gossypol se une a un sitio discreto en GLUT1, lo cual condiciona un
cambio en su actividad funcional. Esta proposición es apoyada por los siguientes
argumentos: a) el análogo apogossypol, que también se ha descrito que afecta la fluidez y
permeabilidad de membrana, es incapaz de inhibir GLUT1, b) gossypol desplaza a
citocalasina B de su sitio de unión en GLUT1, mientras apogossypol no lo hace, c)
gossypol perturba el espectro de fluorescencia de GLUT1 purificado y reconstituido en
proteoliposomas, siendo el efecto saturable, d) gossypol altera la exposición de residuos de
triptofano del transportador al ensayar por apagamiento de su fluorescencia con yoduro y
este efecto también fue saturable.
Cabe preguntarse entonces si este sitio discreto de unión para gossypol se encuentra
accesible por la cara externa o interna del transportador. Datos previos sugieren que la
inhibición de GLUT1 por gossypol al menos en eritrocitos humanos es dependiente del
tiempo. Vale decir, si se agrega gossypol junto con los sustratos al comienzo de ensayos de
entrada no se observa inhibición (Reyes, A.M., resultados no publicados). Sin embargo el
efecto de gossypol se hace evidente al preincubar las células con el sesquiterpeno por 10
min. Este hecho sugiere que existe una etapa previa lenta antes de alcanzar la forma
inhibida del trasportador (complejo GLUT1- gossypol). Es posible pensar al menos dos
posibilidades: a) gossypol necesita traspasar la membrana hacia el interior para ejercer su
efecto inhibitorio; esta opción implicaría que el sitio de unión para gossypol sería accesible
internamente, b) se produce un cambio conformación lento o una etapa de modificación
química entre gossypol y GLUT1 en la cara externa del transportador, en forma previa a la
inhibición.
GLUT 1 es el principal transportador facilitativo de hexosas por lo cual ha sido
ampliamente investigado, lo que ha permitido su caracterización cinética y funcional
llevando además a proponer modelos para su estructura tridimensional. Por otro lado
gossypol se ha descrito como un sesquiterpeno policíclico abundante en las semillas de
algodón, el cual se ha investigado principalmente como un agente anticonceptivo
masculino. Si bien es cierto los estudios tradicionales de sustratos inhibidores de la función
transportadora de GLUT1 se han enfocado en la acción de flavonoides y metilxantinas, los
datos obtenidos en la inhibición del transporte de glucosa en espermatozoides humanos
(Kanwar et al., 1990), nos han llevado al estudio de la caracterización de dicho
sesquiterpeno como inhibidor para con GLUT1. Dichos estudios de caracterización cinética
y funcional, tanto como los realizados en función de los modelos estructurales para GLUT1
nos han permitido definir con cierto detalle la interacción gossypol-GLUT1 teorizando
sobre la naturaleza covalente de la unión del inhibidor a la proteína transportadora lo que
conllevaría a ésta a sufrir una modificación química en su estructura.
La determinación del sitio de unión de un compuesto a GLUT1 se aborda principalmente
comparando su comportamiento en base al de moléculas de las cuales se han realizado
exhaustivos estudios, siendo así el caso de citocalasina B y floretina en el transportador
GLUT1. Citocalasina B es un alcaloide aislado de hongos que bloquea eficientemente la
actividad de los transportadores de glucosa (Bloch, 1973), siendo el compuesto más
estudiado
en
cuanto
a
su
interacción
con
GLUT1
(Walmsley et al., 1994; Sultzman y Carruthers, 1999; Gottschalk et al., 2000). Citocalasina
B se une a GLUT1 en un sitio interno, de manera desplazable por D-glucosa y por otros
ligandos que se unen al transportador, pero no es afectada por otros azúcares tales como Dsorbitol
o
L-glucosa,
las
cuales
no
son
transportadas
(Basketter y Widdas, 1978; Deves y Krupka, 1978). Por otro lado, floretina se une al
transportador por un sitio que es accesible desde la cara exofacial en la cual compite con Dglucosa
y
otras
hexosas
en
la
unión
al
sitio
externo
(LeFevre y Marshall, 1959; Krupka, 1985).
Luego de haber visualizado el efecto de gossypol sobre el transporte de glucosa, estudiamos
las características de unión con respecto a citocalasina B y floretina. En primera instancia
analizamos el efecto de D-glucosa sobre la unión de gossypol a GLUT1. Si el inhibidor
compite por el sitio de unión externa de glucosa se apreciará un efecto competitivo en
relación al comportamiento presentado por floretina a la hora de realizar su estudio en un
gráfico de Sen-Widdas, en cambio si no compite por el sitio externo se debe esperar un
comportamiento similar al de citocalasina B para el mismo caso (Bloch, 1973). Una vez
obtenido el resultado pudimos observar que gossypol no compite con el sitio de unión
externa de glucosa, ya que no se presenta competitivo frente al resultado obtenido para
floretina, sino que lo hace competitivamente con respecto a citocalasina B. En concreto,
gossypol no compite por el sitio de unión externa de glucosa, uniéndose entonces a un sitio
distinto. En otro sentido, el desplazamiento de citocalasina B en ensayos con membranas
aisladas de eritrocitos por parte de gossypol indica a su vez que gossypol no compite por el
sitio de unión de este alcaloide a GLUT1, por lo tanto el sitio de unión de gossypol a
GLUT1 es distinto al sitio interno de unión para citocalasina B.
Se sabe que los terpenos y por ende sus derivados como los sesquiterpenos siendo el caso
de
gossypol,
producen
alteraciones
en
la
permeabilidad
de
membrana
(Reyes et al., 1984; de-Peyster et al., 1986), por lo que cabe preguntarse si el efecto sobre
la funcionabilidad de GLUT1 es cometido por una interacción directa del inhibidor con
GLUT1 o si lo hace de forma indirecta. Una forma de control para dicho evento lo presentó
apogossypol, un análogo de gossypol que se presentó incapaz de inhibir la función
transportadora de GLUT1, lo que conlleva a suponer que el efecto inhibitorio es mediado
por una unión directa de gossypol al transportador. Otra forma de evidenciar la unión
directa es analizar el efecto de gossypol sobre la perturbación de la fluorescencia intrínseca
de GLUT1 dada principalmente por los residuos de triptófanos contenidos en su estructura.
Es por esto que se realizaron ensayos del efecto de gossypol sobre el apagamiento de la
fluorescencia de GLUT1 producto de yoduro de potasio, el cual es un compuesto
hidrofílico que interactúa principalmente con los residuos de triptófanos expuestos al
solvente produciendo un apagamiento a la hora de capturar el espectro de fluorescencia del
transportador. Primero que todo la longitud de onda de excitación se eligió a 295 nm para
así evitar la interferencia de la fluorescencia de los triptófanos por parte de los residuos de
tirosina, mientras que el intervalo del espectro, se relacionó a la emisión de los triptófanos
que presentan un pico de emisión a los 328 nm aproximadamente. Los primeros estudios se
realizaron con el trasportador purificado y reconstituido en proteoliposomas obteniéndose
un apagamiento altamente eficiente por parte de yoduro al interactuar gossypol con
GLUT1. Luego los ensayos se realizaron en membranas, no observandose diferencias
significativas en los resultados. Entonces volviendo al aumento de eficiencia de
apagamiento por parte de KI, ¿cómo sucede esto? la explicación más lógica se presenta al
pensar que al momento de interactuar GLUT1 con gossypol el transportador sufre un
cambio en su conformación tal que expone más los residuos de triptófano al medio de
solvatación implicando por ello un mayor contacto de los residuos con el apagador,
incrementando de esta forma el apagamiento producido por este. Además, el efecto de
gossypol sobre el apagamiento producido por yoduro fue de carácter saturable, lo cual es
propio de la unión directa de un compuesto a la proteína.
Visualizado ya algunas características de la interacción de gossypol con GLUT1, era hora
de establecer el sitio de unión de gossypol al transportador. Obedeciendo a lo anterior
diseñamos estudios de reconocimiento molecular debido a esta necesidad de localizar un
putativo sitio de unión para gossypol en el transportador de hexosas GLUT1. Si bien es
cierto se puede obtener una idea de la orientación superficial de la unión de la molécula
(unión endo o exo-facial) a GLUT1 mediante una caracterización cinética, nos planteamos
la idea de ver la posible conformación espacial de esta unión y así poder obtener un patrón
teórico que orientaran los estudios para la respuesta si es que es posible, teóricamente
hablando, de que esta interacción conlleve una modificación química del transportador. Es
así como los estudios se iniciaron tomando como base el modelo teórico para la
conformación espacial de GLUT1 propuesto por Zúñiga et al (2001). De esta manera el
estudio se enfoca en su fase inicial en caracterizar el transporte de glucosa a través del canal
principal del transportador que está delimitado por las hélices 2, 5, 7, 10 y 11, el cual es
responsable de dicho evento. Así, se pudo obtener las interacciones energéticas de glucosa
a medida que seguía su vía de transporte. Por otro lado necesitábamos conocer el putativo
sitio de unión de gossypol al transportador, para lo cual se recurrió al programa Autodock
3.0.0 en el afán de establecer la disposición espacial de más baja energía, por lo tanto más
probable, para la interacción gossypol-GLUT1. Así se obtuvo una disposición de la
molécula de gossypol de forma exofacial, la cual es muy próxima a la boca del canal
principal de GLUT1. Es de pensar, entonces que gossypol pueda estar perturbando la
conformación espacial del transportador específicamente afectando la accesibilidad de
glucosa hacia su sitio de unión para ser transportada. Para establecer dicha relación fue que
se procedió a observar el comportamiento energético del paso de glucosa a través del poro
transportador ahora con gossypol unido a GLUT1. El resultado concuerda con lo esperado,
ya que el perfil energético para la interacción de glucosa con el canal se vio modificado,
aumentando la energía necesaria para el transporte. ¿Qué significa esto en concreto? En
primer lugar se deduce que gossypol afecta la unión externa de glucosa al transportador al
producir un cambio conformacional lo cual se ve traducido en el aumento de la energía
necesaria para interactuar con su sitio de unión. En segunda instancia, la interacción
gossypol-GLUT1 afecta la disposición conformacional de todo el canal principal no sólo
así al sitio de unión externa para glucosa. Por último, todos estos resultados se traducirían
en una inhibición del transporte de glucosa a través de GLUT1, lo cual es concordante con
los resultados experimentales sobre la acción de gossypol sobre la funcionabilidad de
GLUT1.
Ahora, para profundizar el estudio teórico sobre la interacción gossypol- GLUT1,
analizamos el entorno al cual se ve enfrentado gossypol al unirse a GLUT1, tanto así, como
la naturaleza de dicha interacción. Una característica química funcional de gossypol es la
presencia de grupos aldehídos en su estructura. Como sabemos, los grupos aldehídos son
extremadamente reactivos pudiéndose tratar entonces la interacción gossypol-GLUT1 de
naturaleza química covalente. Para esto es necesaria la presencia en el entorno inmediato al
sitio de unión de una fuente electrónica apropiada para producir dicha clase de unión. Los
residuos de lisina cumplen a cabalidad esta condición al poseer una cadena lateral
altamente ionizable (pKa de cadena lateral cercano a 10,0).
Por otro lado, hemos encontrado experimentalmente que apogossypol, un análogo de
gossypol cuya única diferencia estructural es la ausencia de los grupos aldehídos, no es
capaz de afectar la funcionalidad transportadora de GLUT1 ni de desplazar la unión de
citocalasina B de la proteína, lo cual indica que los grupos aldehídos podrían ser
fundamentales en la interacción gossypol-GLUT1.
Es por esto que se midió la distancia entre los grupos aldehídos de gossypol y la cadena
lateral de las lisinas localizadas en el entorno inmediato al sitio de unión a gossypol. Los
residuos Lys183, Lys300, Lys117, Lys38 se encuentran a más de 17 Å de distancia a los
grupos aldehídos de gossypol, mientras que la Lys114 resultó ser la más próxima a
gossypol con una distancia de aproximadamente 8 Å con el aliciente de encontrarse en un
ambiente hidrófobo ya que a menos de 3 Å se encuentran los residuos Tyr293 y Trp65,
además de Leu64 y Ala70, los cuales contribuirían a bajar el pKa de la Lys114
convirtiéndola en el mejor candidato para reaccionar con el grupo aldehído de gossypol. Es
decir el residuo Lys114 sería teóricamente fundamental a la hora de establecerse la unión
gossypol-GLUT1, la cual sería de carácter covalente. Ahora bien si esto fuese cierto lo
primero a probar sería la naturaleza de la interacción. Es por ello que aprovechando la
propiedad de los aldehídos de formar bases de Schiff al ser reducida químicamente, nos
propusimos realizar experimentos de reversibilidad donde se espera que la unión gossypolGLUT1 al ser tratada con borohidruro de sodio sea de carácter irreversible por lo que no se
espera ver un recuperación en la tasa de transporte de glucosa. Estos estudios de
reversibilidad no nos han dado resultados concluyentes, pero si han orientado nuevos
estudios en cuanto a la naturaleza de la unión gossypol-GLUT1. Por otro lado se espera
poder contar en un futuro cercano con células mutantes para Lys114, producto de mutación
sitio-dirigida, las cuales serían ensayadas para el transporte de glucosa en presencia de
gossypol con el objetivo de validar la participación de este residuo en la unión de gossypol
al transportador.
En conclusión, gossypol es capaz de inhibir el transporte de glucosa mediado por GLUT1,
uniéndose a un sitio distinto al de citocalasina B, floretina y glucosa no presentándose un
efecto inhibitorio producto de la alteración de la membrana celular. Por otro lado el
putativo sitio de unión para gossypol se encontraría en la cara exofacial del transportador,
donde establecería una unión química fuerte con el residuo de lisina 114 en la cual el grupo
químico aldehído presente en la estructura de gossypol cumpliría un factor clave para el
evento de modificación química del transportador.
BIBLIOGRAFIA
Abou_Donia, M.B. y Dieckert, J.W. (1974). Gossypol: uncoupling of respiratory chain
and oxidative phosphorylation. Life Sci 14, 1955-1963.
Adeyemo, O., Chang, C.Y., Segal, S.J. y Koide, S.S. (1982). Gossypol action on the
production and utilization of ATP in sea urchin spermatozoa. Arch Androl 9, 343-349.
Ballatori, N., Truong, AT., Jackson, P.S., Strange, K. y Boyer, J.L. (1995). ATP depletion
and inactivation of an ATP-sensitive taurine channel by classic ion channel blockers. Mol
Pharmacol 48, 472-476.
Basketter, D.A. y Widdas, W.F. (1978). Asymmetry of the hexose transfer system in
human erythrocytes. Comparison of the effects of cytochalasin B, phloretin and maltose as
competitive inhibitors. J Physio/ 278, 389-401.
Baumgrass, R , Weiwad, M., Erdmann, F , Liu, J.O., Wunderlich, D., Grabley, S. y
Fischer, G. (2001). Reversible inhibition of calcineurin by the polyphenolic aldehyde
gossypol. J Biol Chem 276, 47914-47921.
Bell, G.I., Burant, C.F., Takeda, J. y Gould, G.W. (1993). Structure and function of
mammalian facilitative sugar transporters. J Biol Chem 268, 19161-19164.
Benz, C.C., Keniry, M.A., Ford, J.M., Townsend, A.J., Cox, F.W., Palayoor, S., Matlin,
S.A., Hait, W.N. y Cowan, K.H. (1990). Biochemical correlates of the antitumor and
antimitochondrial properties of gossypol enantiomers. Mol Pharmacol 37, 840-847.
Bloch, R. (1973). Inhibition of glucose transport in the human erythrocyte by cytochalasin
B. Biochemistry 12, 4799-4801.
Breitbart, H., Rubinstein, S. y Nass_Arden, L. (1984). Effect of gossypol-acetic acid on
calcium transport and ATPase activity in plasma membranes from ram and bull
spermatozoa. Int J Androl 7, 439-447.
Coyle, T., Levante, S., Shetler, M. y Winfield, J. (1994). In vitro and in vivo cytotoxicity
of gossypol against central nervous system tumor cell lines. J Neurooncol 19, 25-35.
Deck, L.M., Vander_Jagt, D.L. y Royer, R.E. (1991). Gossypol and derivatives: a new
class of aldose reductase inhibitors. J Med Chem 34, 3301-3305.
de-Peyster, A., Hyslop, P.A., Kuhn, C.E. y Sauerheber, R.D. (1986). Membrane
structural/functional perturbations induced by gossypol. Effects on membrane order,
liposome permeability, and insulin-sensitive hexose transport. Biochem Pharmacol 35,
3293-3300.
Deves, R. y Krupka, R.M. (1978). Cytochalasin B and the kinetics of inhibition of
biological transport: a case of asymmetric binding to the glucose carrier. Biochim Biophys
Acta 510, 339-348.
Eid, J.E., Ueno, H., Wang, C.C. y Donelson, I.E. (1988). Gossypol-induced death of
African trypanosomes. Exp Parasitol 66, 140-142.
Gilbert, N.E., O_Reilly, I.E., Chang, C.J., Lin, Y.C. y Brueggemeier, R.W. (1995).
Antiproliferative activity of gossypol and gossypolone on human breast cancer cells. Life
Sci 57, 61-67.
Gonzalez-Garza, M.T. y Said-Fernandez, S. (1988). Entamoeba histolytica: potent in
vitro antiamoebic effect of gossypol. Exp Parasitol 66, 253-255.
Gorga, F.R. y Lienhard, G.E. (1981). Equilibria and kinetics of ligand binding to the
human erythrocyte glucose transporter. Evidence for an alternating conformation model
for transport. Biochemistry 20, 5108-5113.
Gottschalk, I., Lundqvist, A., Zeng, C.M., Hagglund, C.L., Zuo, S.S., Brekkan, E., Eaker,
D. y Lundahl, P. (2000). Conversion between two cytochalasin B-binding states of the
human GLUT1 glucose transporter. Eur J Biochem 267, 6875-6882.
Herve, J.C., Pluciennik, F., Bastide, B., Cronier, L., Verrecchia, F., Malassine, A., Joffre,
M. y Deleze, J. (1996). Contraceptive gossypol blocks cell-to-cell communication in human
and rat cells. Eur J Pharmacol 313, 243-255.
Jarvis, W.D., Turner, A.J., Povirk, L.F., Traylor, R.S. y Grant, S. (1994). Induction of
apoptotic DNA fragmentation and cell death in FIL-60 human promyelocytic leukemia
cells by pharmacological inhibitors of protein kinase C. Cancer Res 54, 1707-1714.
Kanwar, U., Kaur, R., Chadha, S. y Sanyal, S. (1990). Gossypol-induced inhibition of
glucose uptake in human ejaculated spermatozoa may be mediated by lipid peroxidation.
Contraception 42, 573-587.
Krupka, R.M. (1985). Asymmetrical binding of phloretin to the glucose transport system of
human erythrocytes. J Membr Biol 83, 71-80.
Lavis, V.R., Lee, D.P. y Shenolikar, S. (1987). Evidence that forskolin binds to the glucose
transporter of human erythrocytes. J Biol Chem 262, 14571-14575.
LeFevre, P.G. y Marshall, J.K. (1959). The attachment of phloretin and analogues to human
erythrocytes in connection with inhibition of sugar transport J Biol Chem 234, 3022-3026.
Lin, T.S., Schinazi, R., Griffith, B.P., August, E.M., Eriksson, B.F., Zheng, O.K., Huang,
L.A. y Prusoff, W.H. (1989). Selective inhibition of human immunodeficiency virus type 1
replication by the (-) but not the (+) enantiomer of gossypol. Antimicrob Agents Chemother
33, 2149-2151.
Monsees, T.K., Winterstein, U., Schill, W.B. y Miska, W. (1998). Influence of gossypol on
the secretory function of cultured rat sertoli cells. Toxicon 36, 813-816.
Montamat, E.E., Burgos, C., Gerez_de_Burgos, N.M., Rovai, L.E., Blanco, A. y Segura,
E.L. (1982). Inhibitory action of gossypol on enzymes and growth of Trypanosoma cruzi.
Science 218, 288-289.
Mueckler, M, Caruso, C., Baldwin, S.A., Panico, M, Blench, I., Morris, H.R., Allard, W.J.,
Lienhard, G.E. y Lodish, H.F. (1985). Sequence and structure of a human glucose
transporter. Science 229, 941-945.
Olgiati, K.L., Toscano, D.G., Atkins, W.M. y Toscano, W.A. (1984). Gossypol inhibition
of adenylate cyclase. Arch Biochem Biophys 231, 411-415.
Olgiati, K.L. y Toscano, W.A. (1983). Kinetics of gossypol inhibition of bovine lactate
dehydrogenase X. Biochem Biophys Res Commun 115, 180-185.
Olsowski, A., Monden, I. y Keller, K. (1998). Cysteine-scanning mutagenesis of flanking
regions at the boundary between external loop I or IV and transmembrane segment II or VII
in the GLUT1 glucose transporter. Biochemistry 37, 10738-10745.
Olsowski, A., Monden, I., Krause, G. y Keller, K. (2000). Cysteine scanning mutagenesis
of helices 2 and 7 in GLUT1 identifies an exofacial cleft in both transmembrane segments.
Biochemistry 39, 2469-2474.
Pao, S.S., Paulsen, I.T. y Saier, M.H. (1998). Major facilitator superfamily. Microbiol Mol
Biol Rev 62, 1-34.
Qian, S.Z. y Wang, Z.G. (1984). Gossypol: a potential antifertility agent for males. Annu
Rev Pharmacol Toxicol 24,329-360.
Reyes, J., Alien, J., Tanphaichitr, N., Bellve, A.R. y Benos, D.J. (1984). Molecular
mechanisms of gossypol action on lipid membranes. J Biol Chem 259, 9607-9615.
Rikihisa, Y. y Lin, Y.C. (1986). Taenia taeniaeformis: inhibition of metacestode
development in the rat by gossypol. Exp Parasitol 61, 127-133.
Segal, S.J. (1985). Gossypol. A potential contraceptive for men, Plenum Press, New York.
Sen, A.K. y Widdas, W.F. (1962). Determination of the temperature and pH dependence of
glucose transfer across the human erythrocyte membrane measured by glucose exit J.
Physiol. 160, 392-403.
Shidaifat, F., Canatan, H., Kulp, S.K., Sugimoto, Y., Zhang, Y., Brueggemeier, R.W.,
Somers, W.J., Chang, W.Y., Wang, H.C. y Lin, Y.C. (1997). Gossypol arrests human
benign prostatic hyperplastic cell growth at GO/G1 phase of the cell cycle. Anticancer Res
17, 1003-1009.
Sultzman, L.A. y Carruthers, A. (1999). Stop-flow analysis of cooperative interactions
between GLUT1 sugar import and export sites. Biochemistry 38, 6640-6650.
Tso, W.W. y Lee, C.S. (1981). Variations of gossypol sensitivity in boar spermatozoal
electron transport chain segments. Contraception 24, 569-576.
Vera, J.C., Reyes, A.M., Carcamo, J.G., Velasquez, F.V., Rivas, C.I., Zhang, R.H., Strobel,
P., Iribarren, R., Scher, H.I. y Slebe, J.C. (1996). Genistein is a natural inhibitor of hexose
and dehydroascorbic acid transport through the glucose transporter, GLUT1. J Biol Chem
271, 8719-8724.
Vera, J.C., Reyes, A.M., Velasquez, F.V., Rivas, C.I., Zhang, R.H., Strobel, P., Slebe, J.C.,
Nunez_Alarcon, J. y Golde, D.W. (2001). Direct inhibition of the hexose transporter
GLUT1 by tyrosine kinase inhibitors. Biochemistry 40, 777-790.
Waites, G.M., Wang, C. y Griffin, P.O. (1998). Gossypol: reasons for its failure to be
accepted as a safe, reversible male antifertility drug. Int J Androl 21, 8-12.
Walmsley, A.R., Lowe, A.G. y Henderson, P.J. (1994). The kinetics and thermodynamics
of the binding of cytochalasin B to sugar transporters. Eur J Biochem 221, 513-522.
Wichmann, K., Varied, A. y Luukkainen, T. (1982). Inhibiting herpes simplex virus type 2
infection in human epithelial cells by gossypol, a potent spermicidal and contraceptive
agent. Am J Obstet Gynecol 142, 593-594.
Wu, D. (1989). An overview of the clinical pharmacology and therapeutic potential of
gossypol as a male contraceptive agent and in gynaecological disease. Drugs 38, 333-341.
Zuniga, F.A., Shi, G., Haller, J.F., Rubashkin, A., Flynn, D.R., Iserovich, P. y Fischbarg, J.
(2001). A three-dimensional model of the human facilitative glucose transporter Glutl. J
Biol Chem 276, 44970-44975.