Article 2

ARTICLE IN PRESS
Med Clin (Barc). 2009;132(14):529–536
www.elsevier.es/medicinaclinica
Original
Valor pronóstico de los marcadores moleculares en el carcinoma
broncogénico
Ricardo Garcı́a Luján a,, Esther Conde Gallego b, Fernando López Rı́os b, José Luis Martı́n De Nicolás c,
Montserrat Sánchez Céspedes d, Cristina Garcı́a Quero e y Ángel López Encuentra a
a
Servicio de Neumologı́a, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid, España
Servicio de Anatomı́a Patológica, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid, España
c
Servicio de Cirugı́a Torácica, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid, España
d
Departamento de Patologı́a Molecular, Centro Nacional Investigaciones Oncológicas, Madrid, España
e
Servicio de Neumologı́a, Hospital Universitario La Paz, Madrid, España
b
I N F O R M A C I Ó N D E L A R T Í C U L O
R E S U M E N
Historia del artı́culo:
Recibido el 28 de mayo de 2008
Aceptado el 24 de octubre de 2008
On-line el 14 de abril de 2009
Fundamentos y objetivo: Estudio pronóstico de marcadores moleculares implicados en la carcinogénesis del
carcinoma broncogénico (CB), en pacientes con CB no microcı́tico (CBNM) resecado en estadios iniciales.
Material y método: Estudio observacional y de cohorte de pacientes con CBNM en estadios iniciales
intervenidos en el Hospital 12 de Octubre de Madrid entre el 1 de octubre de 1993 y el 30 de septiembre de
1997. Se estudiaron 32 proteı́nas con un análisis inmunohistoquı́mico semicuantitativo. Se realizó un análisis
de la expresión de cada proteı́na en relación con la supervivencia a 5 años mediante las pruebas de WilcoxonGehan y log rank, aceptando como significativo un valor de po0,05.
Resultados: El número final de pacientes incluidos fue de 146. La supervivencia a 5 años fue del 37,7%. De las
32 proteı́nas, hemos encontrado tres con significado pronóstico a 5 años: la expresión de RB, asociada a mejor
pronóstico (p ¼ 0,01), y la expresión de p27 (p ¼ 0,03) y Ki67 (p ¼ 0,04), asociadas a peor pronóstico. En el
análisis según histologı́a no hay ninguna proteı́na con valor pronóstico en CB epidermoide, mientras que hay
cinco en adenocarcinomas.
Conclusiones: En esta serie de CBNM resecado hay 3 marcadores moleculares con valor pronóstico a largo
plazo en la población general y cinco en adenocarcinomas. Probablemente, en el futuro los factores moleculares
se unan a los de extensión anatómica y clı́nicos en una clasificación pronóstica multidimensional en CB.
& 2008 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
Palabras clave:
Carcinoma broncogénico
Biologı́a molecular
Pronóstico
Inmunohistoquı́mica
Prognostic value study of lung cancer molecular markers
A B S T R A C T
Keywords:
Lung cancer
Molecular biology
Prognosis
Immunohistochemistry
Background and objective: The aim of this study was to determine the prognostic value of molecular
markers (proteins) of different paths of lung cancer development in patients with non small cell lung
carcinoma (NSCLC) in initial stages.
Material and method: Observational, cohort study in patients with NSCLC that was initially treated
surgically in our hospital between October 1993 and September 1997. Thirty-two proteins were selected.
The study consisted of the elaboration of tissue arrays with samples from resected tumour, using a
semiquantitative immunohistochemical study. A prognosis analysis was done with the expression of each
protein and calculation of the overall 5-year survival rate. The Wilcoxon-Gehan and Log-Rank tests were
used for statistical comparisons, with po.05 being considered to indicate a significant result.
Results: One hundred and forty six patients were studied. The overall 5-year survival rate was 37.7%. From 32
proteins studied, three were statistically associated with overall 5-year survival rate. RB protein expression in
resected NSCLC was a positive prognostic factor (P ¼ .01). P27 (P ¼ .03) and Ki67 (P ¼ .04) expression in resected
NSCLC were negative prognostic factors. There was no protein with prognostic value in epidermoid tumours.
Conclusions: We found three proteins with long-term prognostic value in the long-term in the general
population and five adenocarcinoma prognostic proteins in our study of resected non-small cell lung cancer
(NSCLC). In the future, genetic-molecular factors should be included along with anatomical (TNM staging) and
clinical factors in a multidimensional lung cancer staging.
& 2008 Elsevier España, S.L. All rights reserved.
Autor para correspondencia.
Correo electrónico: [email protected] (R. Garcı́a Luján).
0025-7753/$ - see front matter & 2008 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.medcli.2008.10.060
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R. Garcı́a Luján et al / Med Clin (Barc). 2009;132(14):529–536
Introducción
El carcinoma broncogénico (CB) es el tumor más frecuente y
que da lugar a la mayor mortalidad por cáncer, tanto en el ámbito
mundial como en España1. En los últimos años, se ha producido un
gran avance en los conocimientos acerca de la identificación de las
diversas alteraciones genéticas relacionadas con el cáncer y, en
especial, con el desarrollo del CB2–6. Generalmente, los genes
cuyas mutaciones se encuentran relacionadas con el cáncer se
dividen en 2 grupos, según sus caracterı́sticas mutacionales y su
función biológica: los oncogenes (genes cuya función biológica
conlleva la activación de vı́as que promueven el crecimiento y la
división celular, y cuyas alteraciones genéticas dan lugar a un
aumento de la función de la proteı́na para la que codifican) y los
genes supresores tumorales (genes que regulan de forma negativa
los procesos que conllevan un crecimiento y división celular y
cuya alteración genética da lugar a un aumento de la función de la
proteı́na a la que inhiben).
Gracias a las mutaciones en estos genes, la célula adquiere
actividades que permiten el crecimiento y desarrollo del tumor
(oncogenésis). Hasta la actualidad, se han descrito algunos genes y
proteı́nas claramente relacionados con la carcinogénesis de los
tumores pulmonares.
Dentro de los oncogenes relacionados con el CB habrı́a que
destacar los siguientes: oncogenes de la familia RAS, que se
encuentran predominantemente en el CB no microcı́tico (CBNM),
especialmente adenocarcinomas7, y que están relacionados con
los carcinógenos del tabaco; receptor del factor de crecimiento
epidérmico (EGFR), que pertenece a la familia erbB e influye en la
activación de la proteı́na RAS y, por tanto, en la división celular y
apoptosis, es más frecuente en carcinomas epidermoides y
carcinomas bronquioloalveolares y se presenta casi exclusivamente en no fumadores8; oncogenes de la familia MYC, que son
mucho más frecuentes en el CB microcı́tico (CBM)9; oncogén
BCL-2, que se encuentra más frecuentemente en el CBNM (95%) y
está aumentado en las células basales del epitelio peritumoral10.
Dentro de los genes supresores tumorales relacionados con el
CB destacan los citados a continuación. Gen supresor p53, gen más
frecuentemente mutado en todos los cánceres y también en el
CB11,12, que es más frecuente en el CBM que en el CBNM, y dentro
de estos últimos, más frecuentemente en la estirpe epidermoide13–15. Su inactivación está claramente relacionada con el
tabaco16,17 y regula la expresión de genes relacionados con el
ciclo celular, la apoptosis y la reparación celular; entre ellos
destacan el p21, p27 y el MDM2. Genes supresores p16 y
retinoblastoma, implicados en el ciclo celular18 y que se inactivan
por mutaciones puntuales o hipermetilación del ADN. El gen p16
es un inhibidor de proteincinasas dependientes de ciclinas (CDK2ciclina E, CDK4-ciclina D) que permiten la progresión del ciclo
celular. Su alteración permite el paso de la célula de fase de reposo
a replicación de ADN. Genes supresores LKB1 y PTEN, que suelen
alterarse por mutaciones puntuales y son casi exclusivos de
adenocarcinomas19. Son capaces de inhibir directamente la
proteı́na mTORp, que está directamente implicada en el crecimiento celular y la inhibición de la apoptosis.
En los últimos años se está realizando un gran esfuerzo para
analizar el papel que podrı́an desempeñar los factores moleculares
en el pronóstico del CB, de forma que se pudieran añadir a factores
pronósticos anatómicos (TNM) y a variables clı́nicas con significado pronóstico. Sin embargo, a pesar de que existen muchos
artı́culos que han estudiado la expresión de diferentes marcadores
y su significado pronóstico en CBNM (según algunas revisiones,
aproximadamente 1.400 artı́culos entre 1960 y 2005)20, hasta la
fecha los resultados obtenidos son poco concluyentes e incluso
contradictorios21,22. Para poder efectuar este análisis del sentido
pronóstico de diferentes marcadores moleculares en el CB es
fundamental una buena interrelación entre las bases de datos
clı́nicas, que incluyen la supervivencia a largo plazo de pacientes
no seleccionados y las técnicas de análisis masivos de genes o
proteı́nas (matrices).
En este sentido, nuestro estudio va dirigido al análisis de
proteı́nas con potencial significado pronóstico en una población
de CBNM resecado mediante el empleo de matrices de tejido
(tissue arrays), para conocer el valor pronóstico a largo plazo de un
conjunto de marcadores moleculares (proteı́nas) implicados en la
carcinogénesis del CB en una población general de CBNM
resecado, en estadios iniciales, tanto globalmente como por
estirpe histológica.
Material y método
Se trata de un estudio observacional, de cohorte, concurrente y
con muestreo desde el diagnóstico de la enfermedad.
Todos los pacientes incluidos en el estudio tenı́an un CBNM en
estadios iniciales, cumplı́an criterios de resecabilidad y operabilidad, y en todos ellos se realizó una toracotomı́a con intención
curativa. Se incluyó a todos los pacientes que fueron tratados
quirúrgicamente en el Hospital Universitario 12 de Octubre de
Madrid, entre el 1 de octubre de 1993 y el 30 de septiembre de
1997.
Los criterios de exclusión fueron los siguientes: terapia de
inducción, cirugı́a incompleta, toracotomı́a exploradora o casos de
mortalidad operatoria, definida como todas las muertes directamente relacionadas con el acto quirúrgico, independientemente
del momento y lugar en que se produjera.
Los criterios de operabilidad funcional del paciente y de
operabilidad oncológica del tumor son los descritos por el Grupo
Cooperativo de Carcinoma Broncogénico de la Sociedad Española
de Neumologı́a y Cirugı́a Torácica (GCCB-S)23.
Como método de estadificación quirúrgica ganglionar (Np) se
ha utilizado el muestreo ganglionar sistemático que, en un estudio
aleatorizado, tiene resultados similares a la disección ganglionar
sistemática24.
Para el estudio histológico posterior, todas las muestras (piezas
de neumonectomı́as, lobectomı́as o resecciones segmentarias
pulmonares) fueron fijadas con formol al 10% e incluidas en
parafina. La selección de las proteı́nas a estudio se realizó
basándose en una revisión exhaustiva de la literatura cientı́fica,
en la disponibilidad de los anticuerpos especı́ficos y en su
indicación para uso en material parafinado.
Con estas premisas, se han estudiado los valores de distintas
proteı́nas que tienen un papel clave en diferentes funciones
biológicas de la carcinogénesis en CB y entre las que se encuentran
las siguientes: capacidad de generar sus propias señales mitogénicas (PTEN, EGFR25, KRAS26, c-erbB2, y LKB119, AKTp, mTORp,
proteı́na S6, LKB1, c-erbB2); resistencia a la influencia exógena de
las señales inhibidoras del crecimiento, entre los que se
encontrarı́an los marcadores del ciclo celular (ciclinas, proteı́na
del retinoblastoma (RB), p1618 y Cdc6); evasión de la apoptosis o
muerte celular programada (p53, p21, MDM227 BCL2, caspasa 3,
ligando FAS, NFKB, survivina); proliferación ilimitada y capacidad
para invadir otros tejidos (betacatenina y E-cadherina).
Sobre la base de todas las informaciones descritas, incluimos
finalmente 32 marcadores en nuestro estudio (ciclina A1, ciclina
B1, ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK6, p16, p21, p27, RB, Ki 67, Cdc6,
p53, MDM2, bcl-2, caspasa 3, survivina, NFKB, FAS, B catenina,
E-cadherina, AKTp, mTORp, EGFR, Herceptest, ACC, proteı́na S6,
LKB1, COX2, TTF1, p63 y alpha CP4). De cada uno de los casos se
evaluaron todas las preparaciones histológicas de la pieza
quirúrgica contenidas en el archivo de patologı́a de nuestro
hospital, y se seleccionaron sólo aquellas que contuviesen una
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cantidad óptima de tumor, representativa de toda la lesión. Se
excluyeron para el estudio las áreas de tumor que tuvieran
necrosis, inflamación o con extensa queratinización. Se seleccionó
de cada uno de los casos y los controles el bloque que presentaba
la mejor relación grosor-representatividad tumoral.
Posteriormente, se diseñaron las matrices de tejido que
incluyen un número total de casos de 189; para su realización se
empleó un arrayer de la marca Beecham Instruments (Hackensack,
EE.UU.), dotado de medición digital micrométrica. Una vez
realizada la matriz, se procedió a su corte mediante microtomı́a
y los cortes se almacenaron en parafina lı́quida. Se excluyeron
43 casos porque no existı́a material suficiente o el que existı́a
no era de suficiente calidad por su elevado componente necrótico;
el número final de pacientes fue de 146. Por tanto, sólo se
realizó el estudio con las muestras de tejido parafinado con la
suficiente calidad para la realización del análisis inmunohistoquı́mico.
El estudio inmunohistoquı́mico se realizó sobre el material
fijado en formol e incluido en parafina, sobre las secciones de los
tissue arrays (TMA) de 3 micras. Los 32 anticuerpos empleados, sus
clones, casas comerciales, diluciones y protocolo de desenmascaramiento se reflejan en la tabla 1.
Todas las preparaciones de inmunohistoquı́mica fueron evaluadas independientemente por 2 patólogos, quienes valoraron en
cada cilindro, de forma semicuantitativa, la intensidad de la
expresión proteica y el porcentaje de células positivas, basándose
en criterios establecidos en la literatura cientı́fica para 29 de los
32 anticuerpos utilizados, o en criterios basados en la correlación
entre la expresión proteica y el estado genético en los restantes 3
marcadores (LKB1, ACC y PS6).
La valoración se hizo sin tener conocimiento de ningún dato
clı́nico, ası́ como tampoco se conocı́a la distribución de los
cilindros del mismo caso dentro de la matriz tisular. Finalmente,
531
se realizó un primer análisis interobservador entre los resultados
de los 2 patólogos.
Para nuestro estudio pronóstico, se consideraron 2 categorı́as
posibles según los resultados inmunohistoquı́micos: positivo,
cuando se consideraba que la proteı́na se expresaba en la muestra
de tumor resecado, y negativo, cuando se consideraba que la
proteı́na no se expresaba en la muestra de tumor resecado.
Por diseño, se estableció la existencia de 2 bases de datos
independientes, la clı́nica y la patológico-molecular. Durante todo
el proceso, las bases de datos clı́nicas (datos TNM, caracterı́sticas
del paciente, tipo de terapia y supervivencia) y las de estirpe con
los datos moleculares se rellenaron de forma independiente, con
desconocimiento por los investigadores de los resultados de la
base de datos de la que no disponı́an ni de los datos conjuntos
hasta el final.
Finalmente, se realizó un análisis del significado pronóstico de
cada proteı́na en relación con la supervivencia a 5 años tras la
resección. La supervivencia global considera el evento defunción
como mortalidad por todas las causas a 5 años tras la resección.
Para el análisis del perfil pronóstico empleamos como métodos
estadı́sticos la prueba de Wilcoxon-Gehan y la prueba de log rank.
Consideramos que los marcadores tienen un significado pronóstico cuando presentan una diferencia significativa en la supervivencia a 5 años, por cualquiera de los dos métodos de análisis
efectuados, con un nivel de po0,05 entre los casos con expresión
del marcador en tumor resecado y los casos sin expresión.
El significado pronóstico de cada marcador ofrece 3 posibles
resultados: positivo (mayor supervivencia a 5 años en los casos
con expresión del marcador en la muestra de tumor resecado),
negativo (menor supervivencia a 5 años en los casos con expresión
del marcador en tumor resecado) y no significativo (cuando no
hay diferencias de supervivencia entre los casos con/sin expresión
del marcador en tumor resecado).
Tabla 1
Caracterı́sticas de los marcadores moleculares
Anticuerpo
Clon
Casa comercial
Dilución
Desenmascaramiento
Ciclina A
Ciclina B1
Ciclina D1
Ciclina E
CDK2 Ab-2
CDK6
p16 (F-12)
p21 (WAF1)
p27
Rb
Ki-67
cdc6
p53
MDM2
bcl-2
Caspasa-3 act
Survivina
NF-kB
FAS (CD95)
Betacatenina
E-cadherina
AKTp
m-TORp
EGFR
Herceptest
ACC
p-S6
LKB1
COX-2
TTF-1
p63
Alpha-CP4
6 E6
7A9
Sp4
13A3
8D4
Poli-rabbit
F-12
EA10
57
G3-245
MIB-1
180.2
DO-7
IF2
124
C92-605
Poli-rabbit
F-6
GM30
14
4A2C7
Poli-rabbit
Poli-rabbit
EGFR.113
Policlonal
Policlonal (rabbit)
Poli-rabbit
LEY37
SP21
8G7G3/1
4A4
Novocastra
Novocastra
Neomarkers
Novocastra
NeoMarkers
BD PharMingen
Santa Cruz
Oncogén
BD Transduction Lab
BD PharMingen
DAKO
Santa Cruz
Novocastra
Oncogén
DAKO
BD PharMingen
RD System
Santa Cruz
Novocastra
BD Transduction Lab
Zymed
Cell Signaling
Cell Signaling
Novocastra
DAKO
Cell Signaling
Cell Signaling
1:50
1:25
1:10
1:10
1:200
1:350
1:25
1:25
1:1000
1:100
1:50
1:25
1:50
1:25
1:25
1:25
1:1000
1:350
1:25
1:500
1:50
1:25
1:10
1:10
Prediluido
1:25
1:50
1:10
1:25
1:25
1:50
1:1000
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Sin calor
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
EDTA 1 mM pH
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
AR: Trilogy
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
Tampón citrato
NeoMarkers
DAKO
DAKO
Zymed
10 mM
10 mM
10 mM
10 mM
pH
pH
pH
pH
6,5
6,5
6,5+PK
6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
8
10 mM pH 6,5
10mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5, 16 h, 4 1C
10 mM pH 6
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5+PK
10mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
10 mM pH 6,5
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Resultados
El estudio inicial incluyó a 189 pacientes, que son todos los
casos con CBNM en los que se realizó una toracotomı́a con
intención curativa en estadios iniciales (IAp, IBp, IIAp y IIBp) en el
Hospital Universitario 12 de Octubre de Madrid, entre octubre de
1993 y septiembre de 1997. De estos 189 casos, se excluyeron del
estudio 43 por ausencia de bloque parafinado de material tumoral
en el archivo de patologı́a o porque el tejido era de mala calidad
por su elevado componente necrótico, con un número final de
pacientes de 146.
Los resultados de las caracterı́sticas generales de nuestra
población (relacionadas con el paciente, con el tumor y con la
cirugı́a) se expresan en la tabla 2. En nuestro estudio, más del 90%
de los casos eran varones, con un porcentaje de fumadores activos
elevado (58,8%) y con un 30% de pacientes con enfermedad
pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La mayor parte de los
tumores eran tumores epidermoides (68%) con estadio patológico
IA-IB (84%). La mayor parte de los tumores fueron resecados
mediante lobectomı́a y la supervivencia a 5 años fue del 37,7%.
Para el análisis del valor pronóstico de los marcadores se
comparó la supervivencia a 5 años tras la resección entre los casos
que expresan el marcador en muestra de tumor resecado y los que
no lo hacen. Se excluyeron para el estudio los casos considerados
Tabla 2
Caracterı́sticas generales de la población del estudio
N ¼ 146
Varones
Edad (años)
Índice de masa corporal
Fumador activo
Años/paquete
Años desde inicio
EPOC
Vasculopatı́a periférica
Hipertensión arterial
Diabetes
Transfusión
Enfermedad cardı́aca asociada
Hemoglobina (g/dl)
Albúmina (g/dl)
FEV1
Estado de supervivencia
Vivos
Muertos
Desconocido
Hallazgo casual
Estirpe
Epidermoide
Adenocarcinoma
Células grandes
Sarcomatoide
Tamaño clı́nico (cm) medido por TC
Tamaño tumoral patológico(cm)
Estadio patológico
IA
IB
IIA
IIB
Tipo de cirugı́a
Neumonectomı́a
Bilobectomı́a
Lobectomı́a
Segmentectomı́a
Resección en cuña
Otras
134 (91,8)
67; 61–73
25,5; 23,5–27,8
85 (58,2)
50; 33–80
40; 35–50
43 (29,5)
19 (13)
35 (24,3)
16 (11)
24 (16,6)
25 (17,1)
14,3; 13,2–15,5
4,2; 3,9–4,6
83,1; 71,4–97,7
55 (37,7)
90 (61,6)
1 (0,7)
51 (34,9)
99 (67,8)
33 (22,6)
10 (6,8)
4 (2,7)
4; 3–5
4; 3–5,8
28 (19,2)
94 (64,4)
6 (4,1)
18 (12,3)
47 (32,2)
11 (7,5)
85 (58,2)
1 (0,7)
1 (0,7)
1 (0,7)
EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica; FEV: volumen espiratorio
máximo en el primer segundo; TC: tomografı́a computarizada.
Las variables cualitativas se expresan en frecuencias absolutas y relativas (n y
%) y las cuantitativas en forma de mediana y rango intercuartı́lico.
como no valorables. La supervivencia global incluı́a el evento
muerte como mortalidad por todas las causas a los 5 años de la
resección. Los resultados del perfil pronóstico general de los
marcadores se resumen en la tabla 3. Para cada proteı́na se
ofrecen los resultados del análisis por los 2 métodos estadı́sticos
utilizados (Wilcoxon-Gehan y log rank) y el significado pronóstico
individual en relación con la supervivencia a 5 años.
En nuestro análisis hemos encontrado 3 marcadores con
significado pronóstico a 5 años, para un nivel de significación de
po0,05, uno cuya expresión se asocia a mejor pronóstico (RB) y
dos cuya expresión en tumor resecado se asocia a peor pronóstico
(p27 y Ki67).
Las gráficas del análisis de supervivencia según los 3
marcadores con significado pronóstico en la población general
se expresan en la figuras 1, 2 y 3.
La segunda parte del análisis consistió en evaluar el sentido
pronóstico para cada proteı́na en función de la histologı́a del CB.
Para ello, agrupamos los tumores en las dos grandes estirpes:
tumores de estirpe escamosa o epidermoide (incluidos en este
grupo los tumores sarcomatoides según la última clasificación
anatomopatológica de la Organización Mundial de la Salud [OMS]
actualizada en 200428) y adenocarcinomas.
Los resultados de la expresión de los marcadores con
significado pronóstico por estirpe se expresan en la tabla 4. En
este estudio no hemos encontrado ninguna proteı́na cuya
expresión tenga significado pronóstico en los tumores de estirpe
epidermoide (n ¼ 103) para un nivel de significación de po0,05.
En los adenocarcinomas (n ¼ 33) hemos encontrado 5 marcadores
con significado pronóstico; tres de ellos cuya expresión se asocia a
mejor pronóstico (FAS, ACC y Cdc6) y dos cuya expresión se asocia
a peor pronóstico (Ki 67 y E-cadherina). El marcador de
proliferación celular Ki67 es el único que también tiene significado
pronóstico en el análisis pronóstico general. Las gráficas del
análisis de supervivencia según las proteı́nas con significado
pronóstico en adenocarcinomas se reflejan en las figuras 4 y 5.
Discusión
En nuestra serie de pacientes con CBNM resecado en estadios
I-IIp la mayorı́a de los pacientes son varones (92%), lo que no
refleja el aumento de incidencia de CB en mujeres que se está
produciendo en los últimos años29. En los años posteriores a los
del estudio, este incremento se refleja también en nuestra serie
debido al incremento del hábito tabáquico en éstas, de modo que
en un futuro podremos comprobar si este aumento en la
incidencia en mujeres influye en los resultados de factores
pronósticos moleculares en CBNM. La edad media es avanzada
(67 años) y el porcentaje de fumadores activos es del 58%, similar
a lo descrito en otras series en los que oscila entre el 50–65%30,
con una historia prolongada de tabaquismo (mediana de 40 años
de consumo) y con un consumo importante (mediana de 50 años/
paquete). Nuestros casos tienen una comorbilidad asociada
importante; la más frecuente es la presencia de la EPOC (30%).
La estirpe histológica más frecuente en la pieza quirúrgica es la
epidermoide (68%), seguida del adenocarcinoma (23%). Estos
datos son similares a los descritos en las series nacionales, entre
los que los tumores epidermoides son, con diferencia, los más
frecuentes30, pero sin embargo diferente de la de otros paı́ses en
los que la histologı́a más prevalente es el adenocarcinoma31.
La mortalidad en nuestra serie es elevada, a pesar de tratarse
de estadios patológicos iniciales con resección completa, ya que
sólo el 37,7% de los casos siguen vivos a los 5 años desde la cirugı́a.
Sin embargo, esta tasa de mortalidad es similar a la descrita en
series recogidas en el ámbito nacional32.
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Tabla 3
Análisis del perfil pronóstico general de los marcadores moleculares
Mediana de supervivencia (meses)
Prueba estadı́stica
Proteı́na
Valor 0
Valor 1
Wilcoxon-Gehan
Log rank
Valor pronóstico
Ciclina A
Ciclina B1
Ciclina D1
Ciclina E
CDK2
CDK6
p16
p21
p27
RB
Ki-67
Cdc6
p53
MDM-2
BCL-2
Caspasa-3
Survivina-N
NF-kBc
FAS
B-catenina
E-cadherina
AKTp
mTORp
EGFR
Herceptest
ACC
PS6
LKB1
COX
TTF-1
P63
Alpha CP4
56
57,5
51,8
55,1
59
57,4
46,6
56,9
60
31,5
60
53,3
46,5
57,6
58
53
58,2
60
50,4
56
54,6
57,5
50,2
55,7
53,9
49,6
46,7
45,5
60
57
49,7
57,5
57,9
40,6
58,6
60
52,8
52,3
58,7
57,8
44
60
45,3
56,7
52
50,6
49,3
60
56
53,3
60
54
59,6
54
59,6
60
60
58,2
55
51
54
51
60
55,7
0,52
0,66
0,37
0,94
0,31
0,93
0,08
0,85
0,05
0,01
0,04
0,5
0,32
0,83
0,17
0,08
0,22
0,41
0,07
0,21
0,98
0,81
0,09
0,93
0,63
0,15
0,22
0,8
0,77
0,45
0,13
0,78
0,6
0,74
0,59
0,91
0,38
0,52
0,23
0,87
0,03
0,02
0,09
0,48
0,23
0,54
0,36
0,14
0,36
0,56
0,06
0,17
0,84
0,69
0,17
0,89
0,39
0,34
0,11
0,9
0,86
0,69
0,19
0,99
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Negativo
Positivo
Negativo
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Valor 0: casos sin expresión del marcador en tumor resecado, valor 1: casos con expresión del marcador en tumor resecado.
NS: no significativo.
Significado pronóstico positivo: mayor supervivencia global a 5 años cuando hay expresión del marcador; significado pronóstico negativo: menor supervivencia global
a 5 años cuando hay expresión del marcador; no significativo: no hay diferencias en la supervivencia cuando hay expresión o no del marcador.
1,0
A: ausencia expresión RB
B: expresión RB)
C: no evaluados
0,8
C
0,6
B
0,4
A
0,8
C
0,6
A
0,4
B
0,2
0,0
0,2
20
A: ausencia expresión p27
B: expresión p27
C: no evaluados
p = 0,05 [W-G]
p = 0,03 [L-R]
p = 0,01 [W-G]
p = 0,02 [L-R]
0
Supervivencia acumulada
Supervivencia acumulada
1,0
40
60
80
Seguimiento (meses)
100
Figura 1. Análisis de supervivencia de la expresión de la proteı́na del retinoblastoma (RB).
En general, los factores pronósticos de supervivencia en CB
pueden englobarse en tres grandes grupos: anatómicos (TNM),
clı́nicos y moleculares. En cuanto a los factores anatómicos, la
clasificación TNM es una escala que recoge elementos individuales
del tumor y que, por tanto, es bastante reduccionista. Aunque esta
clasificación ofrece muchas ventajas, también plantea una serie de
limitaciones ya que la estadificación más exacta en cuanto al
0
20
40
60
80
Seguimiento (meses)
100
Figura 2. Análisis de supervivencia de la expresión de la proteı́na p27.
pronóstico es la quirúrgica, y existe el problema de que sólo se
consigue extirpar aproximadamente un 20% de los CB diagnosticados.
Por otra parte, la estadificación TNM clı́nica tiene una baja
certeza clasificatoria si se compara con la estadificación TNM
patológica33 y algunos parámetros, como el tamaño tumoral, tienen
baja capacidad discriminativa, ya que se consideran como variable
ARTICLE IN PRESS
534
R. Garcı́a Luján et al / Med Clin (Barc). 2009;132(14):529–536
dicotómica (menor o mayor de 3 cm), sin que en muchos casos ese
punto haya demostrado tener significado pronóstico real34.
Actualmente, está activa la última clasificación TNM, del año
1997, si bien se estima que habrá una nueva propuesta para el
2009, resultado de la evaluación de una base de datos de más de
80.000 pacientes.
En cuanto a los factores clı́nicos, hay revisiones sistemáticas
publicadas recientemente que estudian los factores pronósticos
dependientes del paciente35. Dentro de éstos se incluirı́an los datos
clı́nicos (pérdida de peso, performance status, edad, sexo, tabaco,
1,0
Supervivencia acumulada
C
0,8
0,6
A
0,4
p = 0,04 [W-G]
p = 0,09 [L-R]
0,2
B
A: ausencia expresión Ki67
B: expresión Ki67
C: no evaluados
00
0
20
40
60
80
Seguimiento (meses)
100
Figura 3. Análisis de supervivencia de la expresión de la proteı́na Ki67.
estado marital, comorbilidad, EPOC, tabaquismo, calidad de vida o
presencia de sı́ntomas36) y algunas determinaciones de laboratorio
(calcio, hemoglobina, lactato deshidrogenasa o albúmina). Existen
algunos trabajos en los que se elaboran )ı́ndices de comorbilidad*
en los que se incluyen diferentes enfermedades asociadas y que
constituyen un factor pronóstico independiente en CB37.
A pesar de todos estos factores, cuando se han elaborado
métodos multivariables con los factores de extensión TNM y los
factores clı́nicos, se ha demostrado que el área bajo la curva ROC
para predecir el pronóstico a 3 años no es mayor de 0,738, por lo
que existirı́a un margen para la mejora predictiva en el CB. Es en
este sentido donde los factores moleculares podrı́an incluirse, lo
que permitirı́a incrementar esa capacidad predictiva y mejorar el
área bajo la curva. Sin embargo, a pesar de que existen
muchı́simos artı́culos que han estudiado la expresión de diferentes marcadores y su significado pronóstico en CBNM (según
algunas revisiones aproximadamente 1.400 artı́culos entre 1960 y
2005)20, hasta la fecha los resultados obtenidos son poco
concluyentes e incluso, algunos de ellos, contradictorios21,22.
Probablemente, más que estudiar una sola alteración debe
considerarse un enfoque multidimensional. Los diferentes resultados que se obtienen entre los estudios podrı́an explicarse por
diferentes causas39, entre las que cabrı́a destacar que los estudios
suelen estar basados en series pequeñas, los seguimientos de la
supervivencia se realizan a corto plazo, existen problemas en la
selección de covariables en los estudios multivariantes y finalmente existen diferencias en la determinación de las variables
moleculares (técnicas y valores).
En nuestro grupo, ya hemos publicado algún caso de tumor en
estadios iniciales con un comportamiento clı́nico agresivo que
Tabla 4
Análisis del perfil pronóstico de los marcadores con significado pronóstico según histologı́a
Mediana de supervivencia (meses)
Prueba estadı́stica
Proteı́na
Estirpe
Valor 0
Valor 1
Wilcoxon-Gehan
Log rank
Valor pronóstico
Ki67
SCC
AC
SCC
AC
SCC
AC
SCC
AC
SCC
AC
59
59,5
60
30
59,2
45
60
55,2
60
42
60
39
56,7
59,5
57,6
60
58,6
21
59,2
60
0,42
0,05
0,62
0,04
0,64
0,04
0,35
0,05
0,78
0,05
0,7
0,04
0,61
0,07
0,5
0,04
0,28
0,04
0,68
0,04
NS
Negativo
NS
Positivo
NS
Positivo
NS
Negativo
NS
Positivo
Cdc6
FAS
E-cadherina
ACC
AdC6
A (valor 0)
B (valor 1)
C: no evaluados
0,8
C
0,6
B
0,4
A
0,2
0,0
p = 0,02 [W-G]
p = 0,007 [L-R]
-0,2
1,0
C
ACCp
A (valor 0)
B (valor 1)
C: no evaluados
0,8
B
0,6
0,4
A
p = 0,05 [W-G]
p = 0,04 [L-R]
20 40 60 80 100
Seguimiento (meses)
1,0
A (valor 0)
B (valor 1)
C: no evaluados
FAS
B
0,8
C
0,6
0,4
0,2
p = 0,04 [W-G]
p = 0,04 [L-R]
A
0,0
0,2
0
Supervivencia acumulada
1,0
Supervivencia acumulada
Supervivencia acumulada
Valor 0: casos sin expresión del marcador en tumor resecado; valor 1: casos con expresión del marcador en tumor resecado.
AD: adenocarcinomas; NS: no significativo; SCC: tumores escamosos o epidermoides.
*En la tabla no se reflejan los otros 29 marcadores ya que no tienen valor pronóstico para ninguna de las dos estirpes.
0
20 40 60 80 100
Seguimiento (meses)
0
20 40 60 80 100
Seguimiento (meses)
Figura 4. Análisis de supervivencia de los marcadores con significado pronóstico positivo en adenocarcinomas.
ARTICLE IN PRESS
1,0
Supervivencia acumulada
Supervivencia acumulada
R. Garcı́a Luján et al / Med Clin (Barc). 2009;132(14):529–536
C
Ki67
0,8
0,6
A
0,4
A (valor 0)
B (valor 1)
C: no evaluados
0,2
B
p = 0,05 [W-G]
p = 0,004 [L-R]
0,0
535
1,0
C
E-Cadherina
0,8
0,6
A
0,4
A (valor 0)
B (valor 1)
C: no evaluados
0,2
B
p = 0,05 [W-G]
p = 0,004 [L-R]
0,0
0
20
40
60
80
Seguimiento (meses)
100
0
20
40
60
80
Seguimiento (meses)
100
Figura 5. Análisis de supervivencia de los marcadores con significado pronóstico negativo en adenocarcinomas.
podrı́a explicarse por su expresión molecular40. En esta lı́nea, el
objetivo de nuestro trabajo era establecer el valor pronóstico de
proteı́nas relacionadas con la carcinogénesis del CB y confirmar si
nuestros resultados eran coincidentes con los que existı́an en la
literatura cientı́fica. De los 32 marcadores estudiados en nuestra
serie, 29 no han demostrado tener significado pronóstico en el
análisis univariante. Sólo tres proteı́nas han demostrado tener
valor pronóstico (po0,05 en la prueba de Wilcoxon-Gehan o log
rank) en nuestra serie, dos de ellas cuya expresión se asocia a peor
pronóstico (p27, Ki67) y una de ellas cuya expresión se relaciona
con mejor pronóstico a 5 años (RB). Las 3 proteı́nas pertenecen a la
vı́a biológica del ciclo celular.
En dos de las proteı́nas con significado pronóstico en nuestra
serie, los resultados coinciden con los existentes en la literatura
cientı́fica. Estos marcadores son el RB (la pérdida o inactivación de
este gen se asocia a peor pronóstico, tanto en carcinomas
epidermoides como en adenocarcinomas41, mientras que la
sobreexpresión parece relacionarse con un mejor pronóstico42,43)
y el marcador de proliferación celular Ki67 (metaanálisis efectuados recientemente afirman que la expresión de este marcador
predice peor pronóstico en CBNM44,45). Un dato diferencial es que
en el otro marcador nuestro resultado no coincide con lo
publicado hasta el momento, ya que la sobreexpresión del p27
en nuestra serie se asocia a peor pronóstico, mientras que en los
estudios publicados hasta el momento su expresión se asocia a
mejor pronóstico46,47.
Este dato del perfil pronóstico de los marcadores moleculares
podrı́a ser de interés a la hora de elaborar )posibles diseños de
tratamientos dirigidos a dianas moleculares según las caracterı́sticas clı́nicas en CBNM inicial y en las polı́ticas de cribado
poblacional*. Sin embargo, hasta el momento no hemos encontrado ensayos clı́nicos publicados que tengan como diana los
marcadores identificados en nuestro estudio, a diferencia de lo
que sucede, por ejemplo, con anticuerpos frente al EGFR48,49 o
frente al VEGF50,51 o con el tratamiento con sulindac (un inhibidor
especı́fico de la vı́a Wnt, en la que interviene como molécula de
adhesión la B catenina), que parece ofrecer resultados a la hora de
reducir la masa tumoral, lo que podrı́a constituir una oportunidad
como factor inhibitorio en estadios iniciales de la tumorogenésis
en CB52. Por otra parte, también existen predictores moleculares
de la respuesta a diferentes tratamientos, en especial con
tratamientos frente a EGFR53.
Si desglosamos los resultados, en adenocarcinomas hay 3
marcadores cuya expresión tiene significado pronóstico positivo
(Cdc6, FAS y ACC) y dos con sentido pronóstico negativo (Ki67 y
E-cadherina). Un dato importante es que, aunque al igual que
hicimos en la población general del estudio, si comparamos con
los datos de la literatura cientı́fica, hay 3 marcadores cuyos datos
coinciden con lo publicado (Ki6742, FAS54,55 y E-cadherina56) pero
en los otros dos (CDC6c y ACC) no existı́an artı́culos relevantes
hasta el momento en relación con su valor pronóstico. En la
estirpe epidermoide, no hemos encontrado ningún marcador con
valor pronóstico a los 5 años tras la cirugı́a.
Nuestro estudio de análisis de sentido pronóstico de marcadores moleculares (proteı́nas) en CB tiene varias limitaciones,
entre las que cabrı́a destacar las siguientes:
El tamaño muestral es pequeño, lo que no permite realizar un
estudio multivariante de factores pronósticos múltiples y
simplemente hemos podido realizar un análisis univariante
entre la expresión de cada marcador y el estado vital a los 5
años. Sin embargo, actualmente estamos incrementando el
tamaño muestral aumentando el número de años para poder
llevar a cabo este análisis.
No se han considerado para este análisis todos los demás factores
pronósticos relacionados con CB ni los factores relacionados con
la extensión anatómica (TNM), los factores clı́nicos o los ı́ndices
de comorbilidad.
Conocemos los datos de mortalidad global a 5 años, pero no la
especı́fica por CB, lo que, aunque en casos de CBNM resecado
tiene menor relevancia, podrı́a constituir una potencial
limitación a la hora de aplicar los resultados.
Como conclusión, en este estudio prospectivo sobre una serie de
pacientes consecutivos con CB resecado en estadios iniciales
(estadios I–II), se ha determinado el sentido pronóstico de la
expresión de 32 proteı́nas implicadas en el proceso de carcinogénesis mediante matrices de tejidos. De los 32 marcadores
estudiados, en tres su expresión tenı́a significado pronóstico, era
positivo (mejor supervivencia) en un marcador (RB) y negativo
(peor supervivencia) en dos (p27 y Ki67). Esos resultados son, en
su mayor parte, coincidentes con la evidencia disponible en la
literatura cientı́fica hasta el momento. En el análisis del
pronóstico por estirpe histológica, en adenocarcinoma hay 3
marcadores cuya expresión tiene significado pronóstico positivo y
dos cuya expresión se asocia a peor pronóstico, mientras que en el
epidermoide no hay ningún marcador asociado con el pronóstico.
Finalmente, parece necesario incrementar la población del
estudio para poder realizar un análisis multivariante que incluya
los marcadores moleculares pronósticos junto con el resto de
factores pronósticos, tanto de extensión anatómica (TNM) como
variables clı́nicas. En este sentido, se están agrupando en un banco
de tumores muestras de tumores resecados procedentes de
nuestro centro y otros centros del GCCB-S para efectuar un
análisis posterior que permita confirmar la naturaleza pronóstica
de estos marcadores.
ARTICLE IN PRESS
536
R. Garcı́a Luján et al / Med Clin (Barc). 2009;132(14):529–536
Financiación
Financiado en parte por el Fondo de Investigaciones Sanitarias
PI-FIS -03/0046/49, CIBER-RESPIRATORIO-ISCIII-06 y por Beca
como Becario SEPAR 2004.
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