ESTUDIO DE LA RED DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN PARA

ESTUDIO DE LA RED DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN PARA LA FORMACIÓN DE
BIOFILM EN Escherichia coli
Pérez Alfaro R. S1.; Martínez-Antonio A2.; Hernández Morales A2.
1 Lic. Biotecnología /Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
2Departamento de Ingeniería Genética, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados,
Instituto Politécnico Nacional, Campus Guanajuato, Irapuato
RESUMEN
La compilación y análisis teóricos de los estudios experimentales nos han mostrado que las actividades
de la bacteria son controladas por una red de interacciones entre proteínas reguladoras de la
transcripción. El trabajo aquí reportado forma parte de un proyecto que tiene como finalidad entender
la dinámica de la actividad de los factores de transcripción que forman una cascada de regulación para
la formación de biofilm en esta bacteria. Los resultados aquí reportados, como producto del trabajo
durante esta estancia de verano, puso las condiciones para poder continuar con este proyecto. Se trabajo
en eliminar resistencias a antibióticos de 12 cepas que deben ser receptoras de las fusiones
transcripcionales, mismas que se construyeron en su mayoría.
INTRODUCCIÓN
Escherichia coli K-12 es la bacteria mejor caracterizada molecularmente, la disponibilidad de la
secuencia completa de su genoma ha impulsado su utilización en diversos estudios, entre ellos,
entender la organización funcional de su red de regulación transcripcional (Martínez-Antonio y Col,
2008). Los factores de transcripción (FT) son proteínas reguladoras de la transcripción que pueden
actuar uniéndose a sitios específicos del DNA, a otros FT o directamente a la RNA polimerasa, su
activación o inactivación depende de señales o metabolitos que pueden ser producidas por la célula o
percibidas del ambiente. En datos actúales se ha publicado que hay mas de 3000 interacciones
regulatorias entre FT y los genes regulados en E. coli (Martínez-Antonio y Col, 2008), en este trabajo
se esta interesado en estudiar únicamente aquellas interacciones entre FT y dentro de estas redes se
pueden identificar módulos o grupos de factores de FT que regulan: el uso de fuentes alternativas de
carbono, integridad del DNA y replicación cromosomal, biosíntesis de aminoácidos, fijación
molecular de nitrógeno y sulfuro, respuesta a solventes y ácidos orgánicos débiles, motilidad y
quimiotaxis, respiración aeróbica/anaeróbica y destoxificación de bioproductos, respuesta a choque frío
y la formación de biofilm, esta última, será la parte en la que se enfoque este trabajo.
El biofilm es una comunidad de microorganismos agregados en una superficie por polisacáridos,
proteínas y ácidos nucleicos (Wood 2009), el proceso de desarrollo del biofilm se da en cinco pasos:
agregación reversible de las células a una superficie, aglomeración irreversible, desarrollo temprano de
la arquitectura del biofilm, desarrollo de microcolonias dentro del biofilm maduro y dispersión de las
células, estos procesos se encuentran coordinados por largas cascadas de FT regulándose entre sí
(figura 1). CsgD es el regulador maestro para la formación de biofilm, YoaD regula de manera
especifica la producción de las fibras de polisacáridos para adhesión en el biofilm; además de estos FT
directamente relacionados con la formación de biofilm, existen otros FT arriba en la cascada, entre
ellos, la proteína receptora de AMPc (CRP), “factor for inversion stimulation” (FIS), “integration host
factor” (IHFAB), proteína histona (HNS), proteína asociada al nucleoide (HUAB) y el regulador de la
biosíntesis para la capsula (RcsAB). Los primeros 4, son considerados reguladores globales (de amplio
efecto) y los restantes, locales (de acción restringida). Todos estos FT son el objetivo de estudio
principal en este proyecto.
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Figura 1. Red regulatoria para formación de biofilm en E. coli. Los factores de transcripción se encuentran representados
por círculos en color azul, las flechas en color verde representan una interacción de activación, mientras que el color rojo
representa la inactivación y los números después del nombre están representando el número de genes que son regulados por
ese factor de transcripción.
OBJETIVO GENERAL
Aprender las metodologías de biología molecular que nos permita tener los elementos y construcciones
genéticas para estudiar la dinámica de la actividad de los factores de transcripción que forman una
cascada de regulación para la formación del biofilm en Escherichia coli.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Eliminar la resistencia a kanamicina de las células mutadas en cada uno de los reguladores aquí
estudiados de E. coli, (obtenidas de la colección Keio).
2. Diseñar oligonucleótidos para amplificar las regiones promotoras y regulatorias de estos genes
reguladores.
3. Hacer las fusiones de las zonas promotoras y regulatorias de los genes reguladores con el gen
reportero gfp en los plásmidos pUA66 y 139.
4. Insertar las fusiones transcripcionales en cada una de las cepas mutadas de los reguladores
estudiados.
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Se cuenta con una copia de la colección Keio (Baba y Col, 2006), la cual consiste en cepas mutantes de
E. coli K12 MG1655 en cada uno de los genes no esenciales mediante una deleción y sustitución por
un cassette que confiere resistencia a kanamicina (KmR). Por otro lado, se cuenta con un banco de
fusiones transcripcionales de E. coli que incluye algunos de las regiones promotoras de este organismo
fusionadas al gen reportero gfp –sin promotor- (Zaslaver y Col, 2006), a partir de estos recursos
disponibles se busca insertar las diferentes fusiones en las cepas de E. coli mutantes, creando así
diversas combinaciones de fusiones en fondos mutantes para determinar la influencia regulatoria entre
los genes que codifican para la cascada de factores de transcripción que regulan la formación de
biofilm (por medio de un análisis de fluorometria).
Los materiales biológicos y los métodos de biología molecular empleados en este proyecto los puede
encontrar en la siguiente dirección: http://www.biologiasintetica.org/biosistemas/protocolos.
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RESULTADOS
Para poder llevar a cabo la estrategia experimental aquí propuesta se resolvieron tres detalles técnicos,
i) algunas de las fusiones transcripcionales de la biblioteca de fusiones de gfp en E. coli, no contenían
las regiones promotoras completas de los genes de interés, por lo que se decidió construirlas de nuevo,
la construcción se hizo mediante un PCR usando oligos para 50pb antes y después de la zona
promotora, estos productos de PCR fueron ligados a los vectores de clonación pUA66 para los
promotores en la cadena sentido y pUA139 para los promotores en la cadena antisentido; ii) las
mutantes de la colección Keio tienen un cassette de resistencia a km lo que impediría seleccionar las
células transformadas con las fusiones transcripcionales, ya que el vector de clonación utilizado
(pUA66 y pUA139 Figura 2a) tiene como elemento de selección el gen que codifica para resistencia a
km; por esta razón se procedió primero a eliminar el cassette de resistencia a km de el DNA genómico
de las mutantes, este procedimiento se llevo a cabo con ayuda de él plásmido pCP20 (fig. 2b) el cual
contiene un gen que se activa por calor y que codifica para una recombinasa de levadura (FLP), la
recombinasa actúa reconociendo y recombinando sitios blanco al inicio y fin del gen que da resistencia
a km, eliminándolo; iii) el tercer obstáculo, se presento una vez que se utilizo el plásmido pCP20 para
eliminar la resistencia a km, ya que los vectores de clonación pUA66 y 139 tienen el mismo origen de
replicación (Ori sc101), por lo que es necesario que la bacteria elimine el plásmido pCP20 para que
pueda ser transformado de manera estable con las fusiones transcripcionales construidas en los vectores
pUA66 y 139, esto se logro sembrando las células sensibles a km en un medio sin carbenicilina,
eliminando así la presión por el antibiótico y dando lugar a que la bacteria deje de replicar el plásmido,
seleccionando nuevas generaciones de mutantes sensibles a kanamicina y también a carbenicilina.
A)
B)
Figura 2. Mapa de plásmidos utilizados. A) Mapa del plásmido pUA66, usado para la creación de las fusiones
transcripcionales. Este plásmido contiene, entre otros, dos sitios de restricción que utilizamos, uno para XhoI y otro para
BamHI, entre los que se inserta la zona promotora y reguladora de los genes regulatorios a clonar. Tiene también, un gen
reportero que codifica para la proteína verde fluorescente; y un gen que le confiere resistencia a km, como elemento de
selección. Se utilizo también otro plásmido pUA139, que es muy parecido al anterior, diferenciándose únicamente por que
los sitios de restricción para multiclonación se encuentran invertidos. B) Mapa del plásmido pCP20, usado para eliminar la
resistencia a km. Este plásmido contiene, entre otros, el gen FLP que codifica para la recombinasa de levadura y el gen Bla
que le confiere resistencia a carbenicilina.
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Cepas de E. coli y construcciones genéticas obtenidas en este trabajo
Las siguientes cepas y construcciones genéticas fueron obtenidas
A)
Mutantes
sensibles a km
IHFAFISHUAHUBHNSRcsARcsBCsgD-
B)
en
este
trabajo.
C)
Mutantes
sensibles a cb
IHFAFISHNSCsgDRcsARcsBHUAHUB-
Fusiones
transcripcionales
IHFA
IHFB
FIS
HNS
CRP
CsgD
Vector de
clonación
utilizado
pUA139
pUA66
pUA66
pUA139
pUA66
pUA139
A) de las mutantes transformadas se muestra las que perdieron la resistencia a kanamicina por inducción de la recombinasa
de levadura contenida en el plásmido pCP20, B) de las mutantes sensibles a kanamicina se muestra las que perdieron por
completo el plásmido pCP20, C) se muestra la lista de fusiones transcripcionales obtenidas en los plásmidos pUA66 y 139.
Comprobación de la eliminación del gen que confiere resistencia a Km en cepas de E. coli
Figura 3. En esta fotografía se muestra un ejemplo de la electroforesis
del PCR para comprobación de la eliminación del gen que confiere
resistencia a kanamicina en cepas de E. coli. Carriles: 1, marcador de
peso molecular; 2 y 3, controles negativos que consisten en mezcla de
reacción y cepa silvestre de E. coli respectivamente; 4, control
positivo cepa mutante Hns- resistente a kanamicina tomada de la
colección Keio; 5, 6 y 7, cepas mutantes Hns- sensibles a kanamicina.
DISCUSIÓN
En esta estancia de verano se lograron eliminar el gen que confiere resistencia al antibiótico
kanamicina así como del plásmido pCP20 de todas las cepas que se me fueron asignadas. El tener estas
cepas en estas condiciones es un requisito necesario para continuar el proyecto ya que estas cepas
mutadas en cada uno de los reguladores de la cascada se irán transformando con las distintas fusiones
transcripcionales (plásmidos) para medir la actividad de los promotores mediante la fluorescencia de la
proteína GFP. Así mismo en este trabajo logramos hacer 6 de las 12 fusiones transcripcionales
requeridas.
CONCLUSIÓN Y PERSPECTIVAS
El trabajo se desarrollo de manera adecuada pero debido, principalmente a la falta de tiempo no se
pudo avanzar mas en el. Los resultados fueron muy positivos y serán sumamente útiles para continuar
el proyecto. Desafortunadamente ya no se pudieron concluir los experimentos en donde se pueda
determinar la influencia regulatoria entre los genes que codifican para la cascada de factores de
transcripción que regulan la formación de biofilm, por medio de un análisis de fluorometria; a través de
4
estas estrategias se intenta conseguir la información para establecer las proporciones y la importancia
de cada uno de los factores de transcripción involucrados en la cascada regulatoria para la formación
del biofilm. Sin embargo con este trabajo se sentaron las bases para poder lograr esto.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Verano de la Ciencia Región Centro por brindarme la oportunidad de hacer esta estancia
académica. Al Laboratorio de BioSistemas del Dpto. de Ingeniería Genética del CINVESTAV Irapuato
por brindar la infraestructura y materiales requeridos, al Dr. Agustino Martínez-Antonio por permitirme
colaborar dentro de su proyecto y al MC. Alejandro Morales Hernández por guiarme con las técnicas y
metodologías aquí empleadas.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
B. Wanner, y H. Mori. 2006. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout
mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology.
Baba, T., T. Ara, M. Hasegawa, Y. Takai, Y. Okumura, M. Baba, K. Datsenko, M. Tomita,
Datsenko, Kirill A. y B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in
Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 6640-6645.
Martínez Antonio, A., S. Chandra y D. Thieffry. 2008. Functional organization de Escherichia coli
transcriptional regulatory network. J. Mol. Biol. 381, 238-247.
Pru¨ß, B. M.; C. Besemann, A. Denton, y A. J. Wolfe. 2006. A Complex Transcription Network
Controls the Early Stages of Biofilm Development by Escherichia coli. Journal of bacteriology. 11,
3731–3739.
Wood, T. K. 2009. Insights on Escherichia coli biofilm formation and inhibition from wholetranscriptome profiling. Environmental Microbiology.11, 1-15.
Zaslaver, A.; A. Bren; M. Ronen, S. Itzkovitz, I. Kkikoin, S. Shavit, W. Liebermeister, M.
Surette, y U. Alon. 2006. A comprehensive library de fluorescent transcriptional reporters for
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