Guía Seminario 3: Maniatis y col 1978 Bibliotecas genómicas
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MATERIA GENÉTICA TEORÍA CÓDIGO 1451 Profesora Palmira Guevara, Semestre I 2012 Guía Seminario No 3 , discusión en el tema 4 Maniatis, T., Hardison, R.C., Lacy, E., Lauer, J., O´Connell, C., y Quon, D. (1978) The isolation of structural genes from libraries of eukaryotic DNA. Cell 16:687-701. A continuación se presentan una serie de preguntas con el objetivo de orientar el análisis de las referencia escogida. La lectura detenida y crítica del diseño experimental, detalles de la metodología empleada para el objetivo planteado, los resultados reportados y discutidos, así como de los razonamientos que sustentan las conclusiones, son claves para integrar los conocimientos tratados en los temas 1 al 4. 1. 2. 3. 4. 5. ¿Cuál es el problema planteado? ¿Cual es la hipótesis de trabajo?. ¿Cual es el inconveniente técnico que plantean resolver? ¿Cual es el sistema biológico que manipulan para desarrollar la técnica? ¿Cuáles avances técnicos han hecho posible la construcción y búsqueda de genomas complejos? 6. ¿Cuál es la estrategia de clonamiento empleada por los investigadores? 7. ¿Cuáles metodologías se plantean como alternativas para cortar al ADN? 8. ¿Qué metodologías se utiliza para obtener fragmentos de tamaño promedio 20 Kb? 9. ¿Por qué se trata al ADN con metilasa Eco RI? 10. ¿Qué procedimiento se emplea para llevar a cabo la infección con los fagos recombinantes? 11. ¿Qué significado tienen las clasificaciones EK1 y EK2 para los vectores? 12. ¿Por qué se escogen fragmentos de ADN de tamaño promedio 20 Kb? 13. ¿Por qué se prefirió fraccionar al ADN con dos enzimas de restricción? 14. ¿Cómo se establecieron las condiciones de restricción? Explique la figura 2. 15. ¿Qué utilizan como control en las experiencias de mutilación de las figura 3? 16. ¿Cuál es la función de los “linkers” en la estrategia de clonamiento? 17. ¿Por qué se purifica al ADN metilado y ligado a los “linkers”? 18. Con los datos proporcionados el la publicación haga un mapa aproximado de los sitios de corte con Eco RI en Lambda Charon 4. 19. ¿Por qué se digieres Lambda Charon 4 con Eco RI y se utiliza un gradiente de sacarosa en la preparación del ADN del vector? 20. ¿Qué consideraciones se tomaron en cuanta durante la ligación de Charon 4 al ADN eucariótico y por qué? 21. ¿Cuál había sido hasta ese momento uno de los obstáculos en la construcción de librerías genómicas de eucariotas complejos en vectores derivados del fago Lambda? 22. ¿Cuál era la estrategia en la preparación de las mezclas de empaquetamiento? 23. ¿Qué mutaciones fueron incluidas en las cepas y fagos lisógenos utilizados por Stemberg y col, 1977, y por qué? 24. ¿Cuál es la finalidad de tratar las preparaciones con luz u.v.? 25. ¿Cuál era el objetivo de amplificar la genoteca? 26. Analice y comente los datos presentados en la tabla 1 en términos de los factores que determinan la eficiencia del clonamiento. ¿Cuál demostré ser el mejor método para fraccionar al ADN y por qué? 27. ¿Cómo analizaron el número de clones que contenía ADN eucariótico? 28. ¿Cómo determinaron el número de fagos de fondo? 29. ¿Qué muestran en la figura 4? Analícela críticamente. 30. Analice la figura 5. ¿Con qué finalidad se determinó el tamaño promedio del inserto de ADN en cada una de las genotecas? 31. ¿Cómo se comparan los valores teóricos de los títulos de cada genoteca y los obtenidos por los autores? 32. ¿Qué significa el término representatividad de una secuencia? 33. ¿Cómo demuestran que en la genoteca de Drosophila está presente un complemento completo de secuencias copia única? 34. En cuanto estiman los autores se ubica la probabilidad de encontrar una secuencia copia única en la genoteca de conejo? 35. ¿Qué variables examinaron los autores para optimizar las condiciones de búsqueda y por qué? 36. ¿Cómo determinan la densidad de placas óptima para la búsqueda en la genoteca de conejo? 37. Identifique cómo se demostró, para cada una de las genotecas, la representatividad de secuencias (genes) copia única. 38. ¿Qué aproximaciones metodologías utilizan para la caracterización inicial de los fagos recombinantes de los genes de globina de conejo? 39. ¿Qué conclusiones se obtienen de esta caracterización en cuanto a la organización genómica de los genes de globian?
