Trabajo Práctico 2

Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata
Bioquímica III- 2009
Trabajo Práctico Nro 2
Preparación de ADN plasmídico y su caracterización mediante mapeo de restricción
INTRODUCCIÓN
El término plásmido define un elemento extracromosomal de replicación autónoma. Sus tamaños pueden variar
de 1 a más de 200 kb. Aunque su replicación no esté sincronizada con la del cromosoma, depende de factores
del hospedador para llevarse a cabo. Los plásmidos no son esenciales para la supervivencia de la bacteria, pero
suelen codificar para una amplia variedad de determinantes genéticos que le permiten sobrevivir en condiciones
adversas del medio o competir con otros microorganismos que ocupan el mismo nicho ecológico. En la figura se
esquematizan los plásmidos que se utilizarán el TP. En la misma se señalan los sitios únicos de restricción y los
segmentos de funcionalidad relevante.
OBJETIVOS DEL TP
La finalidad de este TP es purificar plásmidos de cultivos de tres cepas de E.coli, identificadas como 1, 2 y 3
(que llevan el plásmidos 1, 2 y 3, respectivamente) y caracterizarlas estableciendo un mapa de restricción a fin
de que identifique a cual de los mapas (A, B o C) corresponde cada plásmido.
Se realizará en primer lugar la purificación de los plásmidos (miniprep). Cada ADN así purificado será sometido a
la acción de diversas endonucleasas de restricción (que Ud. proponga) con el fin de identificar los distintos
plásmidos.
CONSIDERACIONES GENERALES
Los seminarios y los trabajos experimentales no son entidades independientes del curso. Es importante que
antes, durante y después del trabajo experimental trate de afirmar los conceptos teóricos sobre los que están
apoyados las hipótesis de trabajo y los métodos utilizados. Los métodos que utilizará en el trabajo práctico son
los de uso corriente en los laboratorios de investigación en Biología Molecular. El detalle de los procedimientos
se encuentra al final de la guía. En la primera parte de la guía sólo se explican los fundamentos y objetivos del
TP. Es de suma importancia el comprender que un aspecto relevante de la experimentación es lograr la
reproducibilidad de los datos. Es decir que además de la importancia obvia de obtener un resultado, es
imprescindible que se pueda reproducir (o en el peor de los casos, no volver a cometer los mismos errores). Para
lograr esto es clave contar con un correcto registro de lo realizado, por lo tanto durante el desarrollo de la clase
experimental se deberán realizar anotaciones de las observaciones y/o posibles modificaciones que se realicen
al procedimiento escrito además del registro de los datos cuantitativos y/o documentos gráficos (fotos). En
definitiva lo que se pretende es que cualquier persona que repita el procedimiento tal como lo describe llegue a
los mismos resultados obtenidos por Ud (sean buenos o no!).
Técnicas Experimentales
PARTE A (Día 1)
I) Preparación de DNA Plasmídico (“Miniprep”)
1) A un tubo de microcentrífuga transferir 1,5 ml de cultivo de E. coli y centrifugar a máxima velocidad durante 1
minuto.
2) Retirar el tubo de la microcentrífuga, descartar el sobrenadante invirtiendo el tubo. Volver a transferir 1,5 ml de
cultivo de E. coli y centrifugar en las mismas condiciones. Descartar el sobrenadante y eliminar los restos de
medio de cultivo tomándolos con una pipeta P-200.
1
3) Resuspender el pellet en 200 l de Solución P1. (opcional: Lisozima 0.5mg/ml de P1)
4) Agregar 300 l de Solución P2 (preparada en el momento) y mezclar el contenido del tubo
cuidadosamente por inversión suave varias veces para permitir una lisis celular suave (no superar los 5
minutos). En este paso es clave que los movimientos sean lentos para evitar romper excesivamente las
membranas y el cromosoma. Observe la lisis bacteriana por desaparición de la turbidez.
5) Agregar 300 l de solución P3 y mezclar por inversión suave.
6) Centrifugar a máxima velocidad durante 10 minutos.
7) Retirar cuidadosamente el tubo de manera de no perturbar el precipitado. Con una pipeta P-1000 tomar unos
600 l del sobrenadante teniendo mucho cuidado de no tomar restos celulares precipitados y pasarlos a un
tubo nuevo. (opcional: Agregar 1ul de RNasa 1mg/ml, luego incubar 5 min a RT).
8) Agregar 2 volúmenes de etanol o un volumen de Isopropanol y mezclar por inversión.
9) Centrifugar a máxima velocidad durante 10 minutos.
10) Retirar cuidadosamente el tubo de la centrífuga de manera de no desprender un pequeño precipitado blanco
presente en el fondo del tubo y descartar el sobrenadante invirtiendo cuidadosamente el tubo.
11) Lavar el precipitado agregando unos 700 l de etanol al 70%, mezclando un par de veces por inversión
tratando de no desprender el precipitado.
12) Retirar la mayoría del alcohol con ayuda de una P-1000.
13) Dar un pulso de centrífuga para bajar los restos de etanol adheridos a la superficie del tubo y retirar el etanol
del fondo del tubo con ayuda de una P-200.
14) Dejar secar sobre papel durante 5 minutos o 1 minuto a 50ºC.
15) Resuspender en 10 l de agua bidestilada estéril.
Soluciones empleadas:
Solución P1: glucosa 50 mM, solución de Tris 25 mM y EDTA 10 mM, pH 8.
Solución P2: Solución 0,2 N de NaOH y 1% de SDS preparada en el momento mediante la mezcla de
cantidades iguales de solución 0,4 N de NaOH y 2 % de SDS.
Solución P3: Solución de Acético/Acetato de Potasio 3M. (Conc. Final 5M Ac-/ 3M K+).
II) Digestión con Enzimas de Restricción.
1) Prepare una mezcla de reacción que incluya:
a) Plásmido purificado
b) 1 l de la enzima correspondiente. Nunca la retire del hielo.
c) Cantidad adecuada de buffer 10X (un décimo del volumen final de la mezcla de reacción)
d) cantidad adecuada de agua bidestilada estéril para llevar al volumen final
2) Incube a 37 ºC 1 hora.
2
PARTE B (Día 2)
III) Electroforesis en Gel de Agarosa.
1) Pese la cantidad adecuada de agarosa en relación con el volumen final a preparar y la concentración deseada
(se recomienda 1,5 % p/v para fragmentos de entre 0,2 a 3,0 kpb, p.ej. fragmentos de PCR; 1 % p/v para
fragmentos de 0,5 a 7,0 kpb, p.ej. plásmidos o digestiones; 0,8 p/v para fragmentos de 0,8 a 10,0 kpb, p.ej.
digestiones de DNA total).
2) Agregue TBE hasta el volumen deseado
3) Funda en microondas o a baño maría hasta que la agarosa fundida se vea transparente y sin grumos.
4) Deje enfriar hasta que pueda tomar la botella sin quemarse y agregue bromuro de etidio hasta una
concentración final de 0,5 g/ml. Esta cantidad se agrega desde un stock 10 mg/ml en agua. CUIDADO CON EL
BROMURO DE ETIDIO: ES CANCERIGENO. PARA MANIPULARLO SIEMPRE USE GUANTES
DESCARTABLES. NO TOQUE OTRA COSA LUEGO DE HABER TOCADO ALGO QUE CONTUVIERA
BROMURO DE ETIDIO. SI NECESITA TOCAR OTRA COSA, QUITESE EL GUANTE Y REEMPLACELO.
5) Prepare la cama para el gel sellando el soporte de acrílico con cinta de papel o con tacos de goma.
6) Coloque el peine cuidando que quede un espacio de al menos 2 mm entre los dientes y la cama.
7) Vierta la agarosa fundida y tibia dentro de la cama con el peine colocado. Llene hasta que la agarosa adquiera
un espesor de 0,5 cm aproximadamente.
8) Espere hasta que se enfríe la agarosa y solidifique. En ese momento, el gel adquiere una opalescencia blanca.
NO TOQUE EL GEL.
9) Retire el peine cuidadosamente para no romper los pocillos.
10) Retire las cintas de papel o los tacos de goma utilizados para sellar la cama.
11) Sumerja la cama con el gel en la cuba de electroforesis, que debe contener TBE. La cantidad de buffer debe
cubrir totalmente el gel.
12) Mezcle las muestras con buffer de siembra 4X en una proporción de 3 partes de muestra por cada parte de
buffer. Volúmenes mayores a 24 l no cabrán en el pocillo de siembra. Incluya en una calle algún marcador de
peso molecular (p.ej. fago  cortado con HindIII o EcoRI).
13) Conecte los electrodos adecuadamente (hacia donde migran los ácidos nucleicos?) e inicie la corrida (se
recomienda 100-120 volts). NO TOQUE EL BUFFER NI EL GEL MIENTRAS LA CUBA ESTA CONECTADA.
14) El colorante incluido en el buffer de siembra le indicará el frente de corrida. Cuando se haya desplazado lo
suficiente, desconecte el equipo de electroforesis, y retire el gel utilizando guantes.
15) Observe el gel en un transiluminador UV. UTILICE UNA MASCARA PROTECTORA YA QUE LA LUZ UV
PUEDE DAÑAR SU PIEL Y SOBRE TODO, SUS RETINAS. Si cree que la separación de las bandas aún no es
suficiente, puede volver a colocar el gel en la cuba y repetir los pasos 12-14 hasta obtener un resultado
satisfactorio.
16) Registre el resultado mediante una fotografía o un dibujo a escala.
3
Preguntas
Para el aprovechamiento del trabajo experimental es imprescindible saber exactamente qué se está haciendo en
cada momento y por qué. Recuerde que la experiencia de laboratorio es intransferible y no la encontrará en
ningún libro; por lo tanto las oportunidades desaprovechadas durante el trabajo experimental en el laboratorio
difícilmente puedan recuperarse con posterioridad en la carrera. Es por ello que sugerimos resolver el siguiente
cuestionario antes de venir al trabajo experimental.
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
12)
13)
14)
15)
16)
¿Son esenciales los plásmidos para la supervivencia de la bacteria?
¿Qué utilidad tienen las distintas partes contenidas en el plásmido graficado en la figura?
¿En qué se basa cada uno de los métodos de extracción plasmídica más habituales?
¿Qué métodos conoce para separar el ADN del ARN y las proteínas?
¿Qué ventaja tiene, para este TP utilizar una cepa conteniendo un plásmido de alto número de copias?
¿Qué función cumple cada una de las soluciones utilizadas en el TP?
¿Por qué generalmente se utiliza isopropanol y no etanol?
Si tiene 10l de una preparación de ADN plasmídico que se encuentra altamente contaminada con
proteínas: a) ¿Qué hace para aumentar la pureza de su preparación? y b) ¿y si además tiene un alto
contenido de sales?
¿Qué es un mapa de restricción?¿Cuál es el grado de precisión con el cual puede construirlo?. ¿De qué
depende?
¿Puede realizar mezclas de digestión con múltiples enzimas?
¿Qué son isoesquisómeros?
¿Por qué el procedimiento de purificación que empleará en la miniprep le permite obtener ADN
plasmídico y no ADN cromosomal?
¿Qué procedimientos puede emplear para cuantificar el ADN plasmídico?
¿Cómo se obtienen los tamaños (en kpb) en una corrida electroforética?
¿Qué precauciones deben tomarse para manipular material con bromuro de etidio?
¿Qué precauciones deben tomarse para mirar el resultado de una electroforesis en gel de agarosa?
4
BbeI,235
EheI,235
KasI,235
NarI,235
4548
AatII,
4432
SspI,
HindIII,399
4108
ScaI,
pBla
LacZ
35SpolyA
XbaI,633
BamHI,662
SalI,669
Amp
Cfr10
3710,
4000
Eam1105
3625,
ClaI,1002
1000
pRTLGFPKDELsmGKPKDEL
4621 bps
NcoI,1218
peptido'
3000
ColE1
TEVlider'
2000
LacI
pLac
2E-35Spr
KpnI,1391
NcoI,1442
EcoRI,1591
XhoI,1596
EcoRV,1691
2566
SapI,
HindIII
2331,
5
5529
SapI,
HindIII,236
PpuMI,376
AlwNI
4993,
M13
''LacZ
PshAI,693
XbaI,899
NheI,905
CaMV35S
pBla
4447
BsaI,
4429,
GsuI
5000
Amp
SpeI,1178
NdeI,1254
1000
pMonAmh
4000
Sgf I,1338
Sse8387,1403
5536 bps
4036
ScaI,
Amh11
2000
HindIII,1673
ColE1 ori
3000
AatII,
3596
LacI
LacZ' Nos3'
pLac
++
DraIII
3118,
BanII
3045,
NgoMI
3015,
NaeI,
3015
2816
NarI,
2816
KasI,
2816
EheI,
2816
BbeI,
Asp718,1791
KpnI,1791
BstXI,1800
SplI,2026
TthI,2034
NruI,2275
HindIII,2283
BalI,2335
Bsu36,2370
BamHI,2375
NsiI,2497
Ppu10I,2497
SmaI,2643
XmaI,2643
6
DraIII,225
BsaAI,228
NaeI,331
NgoMI,331
BsaHI
4037,
3979
ScaI,
BamHI,719
Ampicillin
''LacZ
4000
Eam1105
3496,
pSKA2B1a
653
KpnI
ApaI
XhoI
HincII
SalI
ClaI
HindIII
EcoRV
PstI
707
1000
4413 bps
3000
A2B1a'
ColE1 origin
2000
Av rII,1652
Sty I,1652
BbsI,1721
LacZ'
Af
2608
lIII,
2210
SacI,
BsgI,1974
2171
HindIII
BalI
NdeI
XbaI
NotI
SacII
2202
7