Diagnóstico de Laboratorio de las infecciones
periodontales
A travez de varias decadas pasadas, la microbiologia oral se ha enfocado
en un problema que ha sido sin precedentes en su campo. Investigadores de
estados unidos y a travez del mundo se han enfocado en enumerar y
caracterizar las bacterias que habitan la cavidad oral humana y que juegan un
rol en la etiologia y patogenesis de las diferentes formas de enfermedades
periodontales. Las mejores estimaciones sugieren que alrededor de 300
especies distintas de bacterias habitan en el crevice gingival humano. Este
gran numero de especies y las numerosas actuales y potenciales interacciones
entre estas especies a hecho que la microbiologia de la enfermedad
periodontal una de las mas complejas areas de estudio de todas las de la
microbiologia clinica.
En vista de los vacios en el conocimiento del total de la microflora
periodontal , se ha progresado en el asociamiento de ciertas especies
bacterianas con la etiologia y patogenesis de la enfermedad periodontal
humana.
Primordial dentro de esta es la asociacion entre la Actinobacillus
actinomycetemcomitants y la periodontitis localizada juvenil, donde tanto
volumen de evidencia se ha acumulado que este microorganismo es considerado
como estiologico en la mayoria de los casos de esta enfermedad.
Ademas de la A. actinomycetemcomitants , una docena de otras especies han
sido asociadas con diferentes formas de enfermedad periodontal humana. ,
incluyendo Bacteroides forsythus, Campilobacter rectus, especies de
Eubacterium, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum,
Peptoestreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,
especies de Selenomonas y spirochetes. Como uno puede ver en la lista, el
potencial periodontopatogenico de ciertas especies esta bien definido. El
potencial patogenico de otros grupos bacterianos , como las espiroquetas , se
piensa que es importante pero hasta el momento no ha sido completamente
descrito. Sin enbargo, basado en la informacion acumulada implicando ciertas
especies como patogenos periodontales, un numero de pruebas ha sido
desarrollado para la deteccion y cuantificacion realtiva en mustras de placa de
pacientes.
Las pruebas actuales para la deteccion de patogenos periodontales tiene
diversos origenes . Un grupo fue desarrollado de pruebas microbiologicas , que
fueron de utilidad en estudios clinicos de enfermedad periodontal y los cuales
demostraron una correlacion con mediciones clinicas , en particular, con
cambios en el nivel de union clinica. Ejemplos de estos ensayos incluyen
cultivos bacterianos en medios selectivos y no selectivos , microscopia de
inmunofluorecencia y pruebas inmunoabsorbentes unidas a enzimas. Otra
categoria de pruebas fue originalmente desarrollada para la deteccion de
patogenos medicos y luego fue modificada para la deteccion de patogenos
periodontales. Ejemplos de estas pruebas incluyen ensayos de sondeo de acidos
nucleicos y mas recientemente, la reaccion en cadena de la polimerasa. Una
tercera catergoria de ensayos incluyen pruebas que fueron desarrolladas
especificamente para patogenos periodontales basados en sus propiedades
peculiares. Hidrolisis BANA, que detecta un selecto grupo de patogenos
periodontales es un ejemplo de este tipo de pruebas.
Una pregunta importante en consideracion de las pruebas de laboratorio
para patogenos periodontales es "¿que se esta midiendo?". Los clinicos
necesitan una prueba que facilite la deteccion de patogenos periodontales y
monitorear la eficacia del tratamiento de la enfermedad periodontal,
principalmente las formas de enfermedad periodontal que resultan en
accesorios y perdida de hueso alveolar. Pero las pruebas que miden los
patogenos periodontales no necesariamente miden la enfermedad periodontal.
Patogenos bacterianos pueden estar presentes incluso en altas cantidades en
los bolsillos periodontales sin perdida de tejido conectivo o hueso alveolar. Por
lo tanto , las pruebas para patogenos periodontales no son por ellas mismas
diagnosticas para la enfermeda periodontal. Hay, sin embargo, una evidencia
creciente que la infeccion subgingival con ciertos patogenos periodontales
pueden incrementar el riesgo del individuo de perdida subsecuente de union
periodontal. La infeccion subgingival con P. gingivalis y con B.fosythus aumentan
el riego relativo de perdida de union periodontal por factores 1.59 y 2.45
respectivamente.
La figura 1 resume el paradigma actual para la patogenesis de las formas
infecciosas de enfermedad periodontal. Este paradigma sirve de base para el
uso de ensayos microbiologicos en periodoncia. El evento inicial de la
enfermedad periodontal es la transmision de patogenos periodontales ,
usualmente de otros miembros de la familia, a la cavidad oral del individuo,
donde estos microorganismos clonizan la gingiva . Ellos persisten en sitios
gingivales evadiendo los mecanismos de defensa del huesped y, a travez del
tiempo y gatillados por mecanismos desconocidos, produce factores
destructores de tejido y engendran factores destructivos del huesped que
causan la perdida de union del tejido conectivo y hueso alveolar. En este punto ,
la enfermedad periodontal puede ser clinicamente diagnosticada, y el
tratamiento periodontal puede eliminar la bacteria patogena y restaurar
partes del periodonto perdidas como resultado de la infeccion. Estas
infecciones , sin embargo, tiene una predisposicion a recurrir debido a una
eliminacion incompleta durante la terapia y una subsecuente recrudecencia o
reinfeccion. La re-emergencia de los patogenos periodontales inicia el ciclo
nuevamente. Un paso clave en el diagnostico de enfermedades infecciosas que
no ha sido utilizado a ningun grado significativo de infeccion periodontal es el
de identificar los microorganismos infectantes. Esto permite al clinico lograr
el diagnostico basado en la etiologia microbiana de la enfermedad y llevarlo a
una apropiada terapia antimicrobiana como la administracion de antibioticos
para remover el agente infeccioso.
A pesar de que la bacteria en la placa dental la cascada patogenica
resultando en perdida de union de tejido conectivo y hueso alveolar en la
periodontitis, ellos representan solamente la mitad de la ecuacion.
Enfermedades infecciosas como las enfermedades periodontales son en ultima
instancia el resultado de un desbalance entre la inmunidad del huesped y los
microorganismos. Los pacientes permaneces saludables mientras la virulencia
microbiana no sobrepase las defensas del huesped. Si, de todas formas, la
virulencia microbiana es alta en el caso de los microorganismos patogenos ,
entonces puede exceder las defensas del huesped y resultar en una
enfermedad periodontal. Si, por otro lado las defensas del huesped estan
desiquilibradas , como en enfermedades como el sindrome de inmunodeficiencia
adquirida , entonces incluso una bacteria no-patogenica normal (patogenos
oportunistas) pueden sobrepasar las defensas del huesped , resultando en una
enfermedad periodontal.
Socransky y Haffajee han descrito el criterio para la implicancia de
especies de bacterias por ser importantes en la causa de las enfermedades
periodontales. Esto incluye : la asociacion entre la presencia de organismos en
grandes cantidades en las lesiones periodontales....con la ausencia de las
especies... en un numero relativamente pequeño en sitios con.... las especies
implicadas pueden generar una respuesta inmune , usualmente un incremento en
el fluido salivar o crevicular de anticuerpos serosos hacia los organismos; las
especies involucradas deben tener una virulencia demostrada in vitro, como la
produccion de enzimas hidroliticas o toxinas , que puedan explicar la
destruccion histologica vista en las lesiones periodontales ; la terapia
periodontal que elimina las bacterias de la lesion debe ser correlacionada con
un mejoramiento clinico , y deberia haber evidencia de modelos animales de la
patogenicidad del organismo, como en el modelo de absceso, o en la habilidad
del organismo de causar daño periodontal y perdida de hueso alveolar.
Basado en este paradigma para la patogenesis de las enfermedades
periodontales infecciosas , esta revision describe metodos actuales para la
deteccion de patogenos periodontales , nuevos metodods de seguimiento de la
transmision de infecciones periodontales y la aplicacion clinica de estos
metodos.
METODOS PARA LA DETECCION DE PATOGENOS PERIODONTALES.
Microscopia de fases contrastadas y de campo oscuro
La microscopia , especialmente la de fases contrastadas y de campo
oscuro, ha sido usada como ................ha sido promovida como el componente de
monitoreo de la terapia periodontal no quirurgica conocida como la
aproximacion de Keyes. La microscopia puede proveer informacion muy util. Las
muestras de placa del paciente son ubicadas en el microscopio y examinadas
por el tamaño, forma, y motilidad de la bacteria en forma individual en la
muestra. La placa asociada a la salud periodontal esta caracterizada por
pequeñas cantidades de cocci no motiles principalmente. La placa asociada a la
enfermedad periodontal esta caracterizada por grandes cantidades de
pequeñas, medianas, y grandes espiroquetas barras curvas y moviles.
Comparando muestras de placas , la microscopia puede detectar cambios en la
morfologia y motilidad de la flora de la placa observada en la periodontitis. La
habilidad de detectar estos cambios tiene una importancia clinica. Hay, por
ejemplo, correlaciones positivas entre la deteccion microscopica de barras
(rods) moviles y niveles clinicos de inflamacion gingival asi como entre
recuentos microscopicos de espiroquetas y la profundidad del surco. Por lo
tanto, la eficacia clinica puede ser demostrada por cambios de una flora
asociada a enfermedad a una flora asociada a la salud. Asimismo, la microscopia
de campo oscuro ha sido usada para demostrar las diferencias en la
distribucion de morfotipos bacterianos que ocurren en la plca subgingival en
una direccion de coronal a apical. Estos ensayos mustran una buena
reproductibilidad , como se informo en los estudios de repetidas muestras de
placas de pacientes con periodontitis y pacientes edentulos con implantes.
La mayor desventaja de la microscopia de campo oscuro o la de fases
contrastadas para detectar patogenos periodontales es que el metodo no
puede discriminar entre especies bacterianas individuales. Estas tecnicas no
pueden determinar si la barra pequeña microscopicamente visible en la muestra
de placa de un paciente es un A.actinomycetemcomitants, o un P.gingivalis o
cualquiera otra bacteria con forma de barra que se puede encontrar en la placa
dental. Por lo tanto, aun cuando es until en demostrar cambios en la totalidad
de la plca bacteriana que ocurre siguiendo una terapia periodontal y en
pacientes motivados en lograr una mejor higiene oral, queda corta como
metodo microbiologico para identificar especies particulares de patogenos
periodontales.
CULTIVO BACTERIANO
El cultivo bacteriano, por otra parte, es el estandar dorado de los
ensayos microbiologicos contra otros tests a los que se le son comparados y
validados. En el cultivo bacteriano, las muestras de placa del paciente son
dispersas por sonication o mezcla de vortex, distribuidos en varios tipos de
medios de agar y cultivas en condiciones aerobicas y anaerobicas. Las placas
son examinadas despues de una incubacion apropiada y las colonias individuales
son subcultivadas . Estas cadenas bacterianas son identificadas utilizando
multiples pruebas incluyendo morfologia de colonia y celular, tincion gramm,
modelos de fermentacion de azucar , pruebas bioquimicas y analisis
cromatografico de productos metabolicos de acidos. El informe clinico de
laboratorio describe el tipo de especie bacteriana presente en la muestra de
placa del paciente y su relativa proporcion o su cantidad absoluta.
Sin embargo, no existe ni un solo metodo microbiologico que pueda identificar
todas las bacterias en en una muestra clinica , el cultivo bacteriano es capaz de
detectar el mas amplio espectro de bacterias periodontales patogenas. El
rango de microorganismos cultivables puede ser extendido por el uso de
medios selectivos orientados a una suceptibilidad especifica de un antibiotico y
la resistencia de ciertas especies asi como el uso de condiciones de
crecimiento apropiadas y nutrientes del medio tambien apropiados. Las
muestras de placa subgingival cultivadas en un medio de agar triptico de soya
conteniendo suero de caballo , bacitracina y vancomicina (TSBV) a 37º C a un
5% de CO2 , por ejemplo, favorece la recuperacion del A.
actinomycetemcomitants . Ademas del TSBV , un numero de otros medios
selectivos han sido desarrolladas para la recuperacion de patogenos
periodontales y microorganismos orales. Generalmente, la sensibilidad del
cultivo es de aproximadamente 10 elevado a 4 a 10 elevado a 5 para las
especies blanco usando un medio no selectivo y aproximadamente 10 elevado a
3 para especies blanco usando un medio selectivo. Aunque se ha refinado con el
uso de un disco espiral ( una forma semiautomatica de distribuir la placa
dispersa en un medio de agar) , un medio selectivo, camaras anaerobicas
mejoradas y mas definidos y expeditos metodos para la identificacion de
especies cultivables como esquemas enzimaticos y sondas de DNA, el cultivo
bacteriano es aun incomodo, consumidor de tiempo y costoso.
No solo el cultivo de bacterias permite la recoleccion de un amplio rango
de especies bacterianas , pero es el metodo de eleccion para determinar
suceptibilidad y resistencia a antibioticos - informacion que es altamente
importante en el plan de tratamiento de para las infecciones periodontales. En
el futuro, tecnicas de biologia molecular como la reaccion en cadena de la
polimerasa podran facilitar la identificacion de plasmidios y otrtas moleculas
que sirven de base para la resistencia a antibioticos, pero por ahora, la prueba
de suceptibilidad antimicrobiana es el metodo estandard.
El cultivo bacteriano posee varios problemas cuando es usado como el
estandard dorado frente a otros metodos para ser comprobados y validados.
Un gran problema en la comparacion es que la bacteria en el surco periodontal
puede ser no cultivable. Las celulas bacterianas pueden estar ya muertas o
pueden estar inicialmente viables pero incapaces de sobrevivir el stress
acumulado de muestreo , dispersion de la muestra, ...... de oxigeno y la falta de
nutrientes adecuados en el medio de cultivo. La incapacidad de cultivo de una
bacteria presente en la muestra de un paciente puede resultar en una prueba
negativa falsa.
Otros tipos de ensayos microbiologicos para patogenos periodontales bo
requieren bacterias cultivables o viables para poder detectar estas especies.
Comparasiones entre el cultivo y otros tipos de ensayos microbiologicos son
actualmente comparaciones entre naranjas y manzanas. Los ensayos de cultivos
miden celulas bacterianas y unidades formadoras de colonias. Los
inmunoensayos y las sondas de acidos nucleicos miden antigenos y secuencias
de acidos nucleicos respectivamente. Loesche es al. examino el asunto de la
comparacion de diferentes ensayos microbiologicos testeando 204 muestras
de placa para 4 especies de patogenos periodontales por cultivo, inmunoensayo,
ensayo de sondeo de DNA, y prueba del benzoilo-DL-arginina-2-naftilamida
(BANA). El cultivo de bacterias fue el metodo menos acertado, con valores
entre 61- 79%, mientras que el sondeo de DNA fue el mas acertado con
valores de 88-96%.
INMUNOENSAYOS Y ENSAYO DE SONDEO DE ACIDOS NUCLEICOS.
Opuesto al cultivo de bacterias, que detecta un amplio espectro de
bacterias periodontales patogenas, otros metodos como el inmunoensayo y
ensayos de sondeo de acidos nucleicos son generlamente orientados a detectar
ciertas especies bacterianas o grupos de especies relacionadas . Ambos
metodos usan reactivos especificos para las especies. El Inmunoensayo usa
anticuerpos -tanto un antisuero policlonal especifico para la especie o un
anticuerpo monoclonal- para formar complejos antigeno-anticuerpo donde el
antigeno bacteriano y de esta forma de detectar el organismo blanco. El
ensayo de sondeo de acidos nucleicos usa una pieza de DNA o RNA- tanto un
sondeo genomico completo, un sondeo clonado, o un sondeo de oligonucleotido
sintetico- para hibidar a secuencias de acidos nucleicos complementarias en el
microorganismo blanco.
Tanto los inmunoensayos como los ensayos de sondeo de acidos nucleicos
pueden mostrar problemas de reaccion cruzada. Los sondeos genomicos
completos para el A. actinomycetemcomitants, por ejemplo, pueden reaccionar
en forma cruzada con un haemophili relacionado taxonomicamente. En el
desarrollo de estos ensayos , la especifidad esta usulamente determinada en
contra una gran cantidad de especies orales y no orales , pero los reactantes
pueden reaccionar en forma cruzada con especies no incluidas en el conjunto o
con una de las muchas baterias hasta el momento no cultivables que se
encuentran el en surco periodontal. Una ventaja de la microscopia de
inmunofluorecencia para chequear los problemas de reaccion cruzada es su
habilidad de confirmar un test positivo mediante un examen visual de las
celulas reactivas por una morfologia consistente de las especies blanco.
Los reactivos inmunologicos o los sondeos de acidos nucleicos pueden ser
usados en una variedad de configuraciones de prueba. Los inmunoensayos
incluyen microscopia de inmunofluorecencia , inmunoensayo de membrana y
ensayos de aglutinacion de latex. Los dos ultimos ensayos son particularmente
aplicables a la practica clinica ya que no requieren instrumentacion y pueden
ser completados en la oficina en 30 minutos. Los reactivos pueden ser usados
tambien para detectar bacterias patogenicas en otros sitios orales como en
canales radiculares infectados y para localizar espacialmente a patogenos
periodontales en una masa de placa bacteriana , para poder estudiar la
distribucion de estas especies en la placa y en las superficies radiculares.
Varias otras configuraciones son usadas para la deteccion inmunologica de
patogenos periodontales en muestras clinicas . Un tipo de configuracion es el
inmunoensayo de fluorecencia de concentracion de particulas el cual usa
cuentas de poliestireno como sustrato . Estas cuentas son cubiertas con los
anticuerpos especificos para la especie y de ahi reaccionados con una muestra
clinica preparada. La señal fluorecente y por consecuencia , el numero relativo
de de bacterias blanco son determinados usondo un fluorimetro. Wolff et al.
desarrollo una modificacion de este metodo usando celulas baterianas en vez
de poliestireno como la fase solida junto con diferentes anticuerpos
monoclonales , cada uno especifico para lipopolisacaridos de diferentes
especies de patogenos periodontales. El ensayo resultante mostro una
sensibilidad del 97-100% y una especificidad del 57-92% dependiendo de la
especie blanco y posee un limite de deteccion de 10 elevado a 4 celulas blanco
en un cultivo mixto.
Un inmunoensayo comercialmente conocido como "Evalusite" ha sido
receientemente comercializado en europa y canada para la deteccion de 3
patogenos periodontales. Este ensayo tiene una configuracion sandwich. La
muestra de placa del paciente es preparada mediante la adicion de detergente
, mezclado y luego exprimido a travez de un filtro hacia un pozo reactivo. El
anticuerpo unido a la membrana en el pozo especiefico para el A.
actinomycetemcomitants, P. gingivalis y P. intermedia racciona con la muestra
procesada del paciente. Los complejos antigeno y anticuerpo formados en la
membrana son luego detectados por la adicion de un segundo anticuerpo
enzimaticamente marcado junto con un sustrato enzimatico coloreado. Puntos
separados indican la presencia de tres tipos diferntes de especies , y la
intensidad del color de la reaccion indica el numero relativo de bacterias . El
sistema fue hecho en controles positivos y negativos- un "OK" aparece en el
pozo de control- y puede ser realizada en alrededor de 10 minutos. El limite de
deteccion para las 3 especies va desde aproximadamente 5 por 10 elevado a 4,
a 10 elevado a 5 celulas bacterianas. Los ensayos basados en acidos nucleicos
incluyen hibridacion de acidos nucleiocos realizadas en levantamientos de la
colonia o en ensayos de punto o en ensayos de ranura -mancha. El sondeo de
acidos nucleicos, usualmente DNA, esta hibridado bajo una temperatura critica
y condiciones ionicas resistentes con DNA extraido de placa bacteriana de la
muestra del paciente y unido a un sustrato adecuado como membrana
nitrocelulosa. El sondeo de DNA , que hibrida a el DNA bacteriano, puede ser
detectado por marcacion radial o por una reaccion de color. Para los patogenos
periodontales , sondeos pareados y comparaciones de cultivo sugieren que los
sondeos de DNA son a veces superiores a el cultivo bacteriano para la
deteccion de estas especies.
Un laboratorio comercial, Omnigene (Cambridge MA), ofrece varias
referencias de pruebas de laboratorio de sondeo de DNA para la deteccion
semicuantitativa de hasta 6 diferentes patogenos periodontales de sitios
individuales o de muestras de placa subgingival reunida de varios sitios. Mas
recientemente, Microprobe Corporation desarrollo un Ensayo de sondeo de
acidos nucleicos de oficina para la deteccion semicuantitativa de patogenos
periodontales. Las celulas bacterianas en las muestras de placa del paciente
son (Lysed)-no se esa palabra- por calor en presencia de detergente. El DNA
extraido es ubicado en un primer pozo de un rack de multiples pozos y luego
ubicado en una maquina con un brazo robotico programable.
La clave para el ensayo es una pequeña cuenta en donde esta incluida
oligonucleotidos sinteticos. Estos oligonucleotidos sinteticos son unicos ya que
se hibridan con las secuencias especificas de 16S RNA ribosomicos de la
especie que estan presentes en copias multiples en la celula bacteriana. La
presencia de multiples copias incrementa la sensibilidad del ensayo . Un sondeo
de oligonucleotido sintetico desarrollado para la B. forsythus, por ejemplo,
demostro 100% de sensibilidad y 100% de especificidad comparado con los
cultivos de bacterias para la deteccion de este mocrooorganismo directamente
de las muestras de placa subgingival del paciente. El RNA ribosomal 16S
tambien contiene secuencias que son conservadas asi como en las regiones
hipervariables. La amplificacion de estas regiones hipervariables pueden
diferenciar cadenas bacterianas individuales dentro de la misma especie.
Las cuentas cubiertas de oligonucleotidos sinteticos con diferencias
especificidades , como para el A. actinomytemcomitants, P.gingivalis o el P.
intermedia, son montados en un transportador plastico con forma de tarjeta
de credito que , en su momento, es unido a elm brazo robotico. El operador
enciende la maquina y el brazo mueve el transportador con las cuentas hacia
arriba y abajo a travez de una serie de soluciones en el conjunto. Este proceso
de 1 hora escencialmente replica en la oficina todos los pasos de la hibridacion
de acidos nucleicos .... que ocurren en el ensayo de laboratorio. Al completarse
el ensayo , la cuenta va de blanca a azul si las secuencias blanco son detectadas
y asi indicando la presencia de la bacteria en la muestra del paciente.
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
La reaccion en cadena de la polimerasa es un ensayo basado en acidos
nucleicos relativamente nuevo, y recientemente gano su creador , Kary Mullis ,
el premio nobel.Puede detectar un solo microoragnismo y tiene , por lo tanto, la
mas alta sensibilidad comparada con cualquier otro metodo microbiologico. La
clave para la deteccion de segmentos de DNA de la reaccion en cadena de la
polimerasa es la seleccion de dos primers de DNA - usualmente
oligonucleotidos sinteticos de 18 a 28 bases de longitud. Estos primers son
seleccionados basados en la region de DNA que sera amplificada. Los primers
son adicionados a la solucion conteniendo DNA de doble hebra de la muestra de
placa del paciente . Cuando la mezcla es calentada a 90-95ºC , el DNA de doble
hebra es desnaturalizado a una mezcla de DNA de hebra simple. Se enfria a
temperaturas de 40-60ºC permite a los primers de DNA a hibridar a regiones
especificas del DNA de hebra simple. Subiendo la temperatura a 70-75ºC
permite la extension o llenado del DNA entre la union de los 2 primers a la
plantilla del DNA de hebra simple. Subiendo la temperatura a 90-95ºC , se
desnaturaliza la nueva hebra de DNA de la plantilla de DNA. Ciclos repetidos
de desnaturalizacion ,templadura y extension produce numerosas copias del
segmento de DNA y la amplificacion de la original secuencia unica de DNA en
varias cantidades de la misma secuencia que puede ser detectada por otros
metodos menos sensibles que expedita el sondeo de DNA. Dentro de ciertos
limites, el monto de amplificacion es dependiente del numero de repeticion del
ciclo . La reaccion en cadena de la polimerasa puede detectar , por ejemplo, una
unica Treponema pallidum subsp. pallidum en muestras clinicas o en muestras
de tejido embebido en parafina. Grieffen et al. ha aplicado la reaccion en
cadena de la polimerasa a la deteccion de el A. actinomycetecomitants usando
primers dentro de regiones conservadoras entre los genes ribosomales 16S y
23S. No solo este metodo detecta numeros bajos de A.
actinomycetemcomitants , pero la restriccion del analisis de la region
amplificada puede diferenciar cadenas para estudios epidemiologicos .
Una variacion a la reaccion en cadena de la polimerasa usa segmentos de DNA
en forma arbitraria en vez de una secuencia definida como primers. Este
metodo , conocido como la reaccion en cadena de la polimerasa de primer
arbitrario , ha sido usada para identificar bacterias dentro de la misma
especie para seguir el origen de las infecciones bacterianas. Los primers
arbitrarios hibridan a DNA bacteriano en lugares especificos dependiendo de
las condiciones del ensayo y las regiones de amplificacion correspondientes.
Los segmentos amplificados de DNA de la reaccion en cadena de la polimerasa
son resueltos en electroforesis de gel , y el patron de union o ampliotipo es
comparado entre lineas. La reaccion en cadena de la polimerasa de primer
arbitrario ha sido usada para examinar la transmision de patogenos medicos ,
como el Staphylococcus pyogenes, Staphylococcus aureus como varios
patogenos periodontales , incluyendo el A. actinomycetemcomitants.
En suma a los metodos inmunologicos de sondeo de acidos nucleicos para la
rapida deteccion de patogenos periodontales, varios ensayos enzimaticos estan
accesibles. En general, estas pruebas no detectan especies bacterianas
especificas . En vez, estas pruebas indican la presencia de enzimas
destructoras de tejido periodontal producidas por un grupo principal pero no
exclusivo de patogenos periodontales. Las enzimas usadas inclyen colagenasa,
peptidasas, enzimas parecidas a la tripsina, proteasas neutrales y elastasa. La
colagenasa, por ejemplo, es producida por una variedad de cacterias asi como
por celulas del huesped. En aplicaciones periodontales , la colagenasa
bacteriana puede ser diferenciada de la colagenasa del huesped por
electroforesis de gel, pero esta tiene una aplicacion limitada como ensayo
clinico. Un ensayo clinico de colagenasa ha sido desarrollado que incluye
incubacion de una muestra del paciente junto con un sustrato apropiado y la
cual es detectada por una reaccion de color.
Las enzimas parecidas a la tripsina han encontrado una aplicacion
comercial en el (chairside)-no se esa- ensayo. Perioscan (laboratorios Oral B,
Edwood city, CA), la cual puede ser realizada en 15 minutos. Un grupo de
patogenos periodontales incluyendo el B. forsythus, P. gingivalis, y el
Treponema denticola producen esta enzima asi como ciertas Capnocytophaga
que no se encuentran usualmente en las periodontopatias . Esta enzima es
detectada por la degradacion de un sustrato sintetico, BANA, en un ensayo
colorimetrico- un color negro azulado en la carta reactiva indica una prueba
positiva- Este ensayo muestra de un 55-73% de concordancia con las medidas
clinicas de la enfermedad periodontal incluyendo sangramiento al sondeo,
profundidad del surco y juicio clinico.
ESTRATEGIAS PARA EL MUESTREO MICROBIOLOGICO
Ensayos para bacteria en muestras de placa dental miden directamente
la presencia y numero de organismos blanco , pero esta aproximacion tiene una
gran desventaja. Estos metodos pueden detectar especies blanco solamente
cuando estan presentes en las muestras del paciente. Como pueden haber mas
de 100 muestras de sitios subgingivales diferentes en una denticion completa ,
obtener una muestra representativa constituye un reto. La ausencia de un
patogeno blanco de la cara mesialbucal del diente numero 30 no significa que el
patogeno no este presente en la cara distobucal del mismo diente o en otra
superficie de otro diente en la misma boca.
Para sobrellevar este problema de obtener muestras representativas ,
varios estudios han examinado la interrogante de cuantas muestras deben ser
examinadas para decir con una seguridad rasonable que un paciente no esta
infectado con un cierto patogeno periodontal. Los descubrimientos sugieren
que las diferentes especies de patogenos periodontales necesitan diferentes
esquemas de muestreo. Para determinar con un 95% de seguridad que el sujeto
no esta infectado con A. actinomycetemcomitants , 25 o mas muestras
subgingivales deben resultar negativas. Para el P.gingivalis y el B. forsythus , 6
o mas sitios al azar , o 3 o mas sitios con un surco clinico con una profundidad
mayor a 5 mm deben resultar negativas. Estos valores estan basados en rangos
de prevalencia del 11% para el A. actinomycetemcomitants , 44% para el
P.gingivalis, 48% para el B. forsythus y 54% para el P. intermedia en
poblaciones adultas. La prevalencia de estos patogenos y el numero de
muestras necesarias en otras poblaciones de pacientes como en la periodontitis
refractaria o en las periodontitis de adultos de progreso rapido no han sido
determinados.
ENSAYOS DE ANTICUERPOS PARA PATOGENOS PERIODONTALES
Otra aproximacion a el problema de el numero de muestras es el
examinar respuestas de anticuerpos de suero para patogenos periodontales en
vez de prubas para los organismos en si. Las respuestas de anticuerpos del
suero , en vez de reflejar una infeccion en un sitio unico , indican infeccion a
travez del cuerpo . Desde que el patogeno periodontal por definicion engendra
una respuesta inmune, ensayos para anticuerpos del suero para estas bacterias
son utiles para implicar ciertas especies como patogenos periodontales y
determinar clinicamente el status de infeccion . Niveles elevados de
anticuerpos de suero pueden , por ejmplo, implicar a el A.
actinomycetemcomitants y bacteroides como patogenos periodontales.
Refinaciones en el monitoreo longitudinal de las respuestas de anticuerpos del
suero a patogenos periodontales han revelado fluctuaciones en los niveles de
anticuerpos en respuesta a terapias periodontales mecanicas y
quimioterapeuticas.
EL PROBLEMA DE LAS BACTERIAS NO CULTIVABLES
Estudios de cultivo de bacterias de placa dental han implicado a un
numero de especies como patogenos periodontales putativos. Sin embargo, esta
informacion a derivado de la examinacion de solo una fraccion del numero total
de especies bacterianas presentes en la placa dental. Ningun medio, ningun
conjunto de medio selectivo y no selectivo y ninguna combinacion de medios ni
de metodos de cultivo pueden cubrir todas las especies bacterianas presentes
en la placa dental. , mucho menos los virus y protozoos que tambien estan
presentes. Excluyendo avances tecnologicos que estan por verse , el cultivo
bacteriano , para la mayor parte , es lider en avances de conocimiento para la
gran mayoria de las aun placas bacterianas no cultivables. La microbiologia oral
no esta por ningun motivo sola en estos problemas. Es aun dificil despues de
investigaciones que atraviezan mas de medio siglo cultivar el oragnismo causal
de la sifilis, Treponema palidum subsp pallidum.
El novel se aproxima engañando el bloqueo tecnologico de los metodos de
cultivo que han sido desarrollados. Los inmunoensayos han apuntado a una
nueva espiroqueta oral como patogeno periodontal. Riviere et al. encontro que
los anticuerpos monoclonales especificos para patogenos determinantes
antigenicos para el T. pallidum subsp pallidum reacciona con una espiroqueta
encontrada en la gingivitis ulcerosa y periodontitis cronica. Este organismo
esta referido como la espiroqueta oral patogeno relacionada.
Tecnicas en biologia molecular han obiado tambien la necesidad de
cultivo para las muestras de placa dental. En particular , la reaccion en cadena
de la polimerasa junto con la secuencia ribosomal 16S pueden identificar
caterias previamente no cultivables. Esta aproximacion funciona de la siguiente
forma: primers universales han sido identificados para el RNA procariotico
ribosomal 16S. Estos primers son seleccionados de secuencias de acidos
nucleicos conservadas encontradas en todos los procariontes. La secuencia
participante entre los primers universales es amplificada en la reaccion en
cadena de la polimerasa. La secuencia de acidos nucleicos del fragmento
amplificado puede ser determinado y comparado con la base de datos
conteniendo secuencias 16S de RNA ribosomal de numerosas especies. Las
secuencias que no calzen las secuencias ya definidas pueden inducir a pensar de
que no son cultivables o que son de especies aun no cultivables. Los sondeos de
acidos nucleicos especificos para estos organismos pueden entonces ser
desarrollados , y la distribucion y relativa importancia del organismo en las
varias formas de enfermedad periodontal puede ser establecida. Usando esta
aproximacion, las especies no cultivables en la placa dental pueden ser
definidas y su rol en la enfermedad periodontal puede er establecido.
INDICACIONES CLINICAS PARA LAS PRUBAS MICROBIOLOGICAS
Hay un acuerdo general de que los tests microbiologicos para los
patogenos periodontales no deben ser usados en todos los pacientes, pero
ciertas indicaciones han sido propuestas incluyendo pacientes refractarios y
pacientes a punto de iniciar una terapia prostetica extensiva o de implante.
PACIENTES REFRACTARIOS
Como se definio por la academia americana de periodontologia, los
pacientes con periodontitis refractaria son los que estan reciviendo una
terapia periodontal apropiada que continua experimentando perdida de union
del tejido conectivo y de hueso alveolar. Determinando la composicion de la
placa dental y, mas importante, los antibioticos que podrian ser utiles en el
tratameinto de la infeccion periodontal es crucial para el manejo exitoso de
estos pacientes. Desde que estos pacientes tienen a veces terapias previas
empiricas de antibioticos resultando en una resistencia antimicrobiana y el
resurgimiento de nuvos patogenos periodontales como especies entericas o
levaduras, el cultivo de bacterias es el ensayo de eleccion.
SELECCION DE PACIENTES PREVIO A TERAPIAS PROSTETICAS
EXTENSIVAS E IMPLANTES
El costo involucrado en las pruebas microbiologicas para patogenos
periodontales al parecer limita su utilidad a situaciones donde la informacion
resultante es particularmente util. Pruebas microbiologicas han sido
propuestas para el planeamiento del tratameinto de nuevos pacientes,
seleccionando un intervalo apropiado de refuerzo y monitoreando la terapia
periodontal, pero este uso en rutina de la periodontitis de adulto cronica ,
tambien importante, puede tener menor impacto economico que enfocar estos
ensayos en pacientes que contemplan una terapia extensiva. Mediante el
examen de la flora subgingival de pacientes con plan de tratamiento para
restauraciones extensas o para implantes dentales , es posible limitar el riesgo
de secuelas adversas de infeccion con patogenos periodontales y reforzar un
futuro clinico favorable. Este riesgo incrementado ha sido demostrado en
varios estudios. Beck et al. reporto que el p. gingivalis subgingival esta asociado
con un rango de probabilidad de 2.5 para una perdida severa de union, y el P.
intermedia subgingival fue asociado con un rango de probabilidad de 1.9.
Tambien , estas mismas especies de patogenos periodontales son importantes
en implantes dentales fallidos. Pruebas microbiologicas deberia entonces ser
usada en pacientes previo a una restauracion extensiva o una terapia de
implante y durante una terapia periodontal de apoyo.
El monitoreo microbiologico puede tambien reforzar el exito de la
regeneracion guiada de tejido . Estos procedimientos resultan en la adherencia
de numerosas bacterias predominantemente gramm negativas a las membranas
de polytetrafluoroetileno expandidas, incluyendo muchas especies de
patogenos periodontales como el A. actinomycetemcomitants , P.gingivalis y el
P.intermedia. La presencia en el sitio de sanamineto de de al menos una de
estas especies , A. actinomycetemcomitants, parece habitar regeneraciones
exitosas. Sin embargo, pruebas microbiologicas previas y durante el
sanamiento de una regeneracion guiada de tejido asociada con apropiados
regimenes anti.infecciosos pueden reforzar el exito de el procedimiento
clinico.
SEGUIMIENTO DE LA TRANSMISION DE PATOGENOS PERIODONTALES
Como se muestra en la fig. 1, las infecciones periodontales al parecer son
transmitidas de persona a persona. Ademas , se piensa que no todas las
cadenas de bacterias dentro de la misma especie tienen el mismo potencial de
virulencia o patogenicidad . De hecho, solo un pequeño numero de clones o
lineas geneticas de bacterias en una especie puede ser capaz de causar la
enfermedad. Esto podria explicarporque ciertos pacientes muestran infeccion
subgingival con grandes numeros de patogenos periodontales sin tener la
peridida de union periodontal correspondiente. Para estudiar la transmision
bacteriana y evaluar la clonalidad , es necesario diferenciar la bacteria dentro
de la misma especie . Las cadenas de bacterias de especies periodontopaticas
han sido diferenciadas usando biotipos o serotipos , pero estos metodos a
veces no proveen suficiente discriminacion . ...... electroforesis enzimatica y
antibiotipo han sido usados para estudiar las diferencias dentro de especies de
patogenos periodontales . En suma, varios metodos nuevos han sido aplicados a
los problemas de clonacion y variacion de cadenas. El analisis de restriccion de
endonucleasa ha sido utilizado para examinar la variacion de cadena en
patogenos no dentales incluyendo Candida , Campilobacter pyloridis,
Clostridium difficile , Staphylococci, Legionella pneumophila y Vibrio cholerae.
En esta tecnica , el DNA es aislado de la cadena bacteriana, digerido con una
paropiada enzima de restriccion y luego la marca de DNA se ve con
electroforesis de gel. Cuando dos diferentes cadenas son comparadas usando
el analisis de restriccion de endonucleasa , las diferencias en los patrones de
DNA son consistentes con las diferencias entre los aislados. Patrones
identicos , sin embargo, no necesariamente indican cadenas identicas . Otra
enzima de restriccion , o la combinacion de dos enzimas de restriccion
diferentes puede revelar diferencias que de otra forma no serian aparentes.
Usando el analisis de restriccion de endonucleasa , Zambon et al. pudo
solamente distinguir unos pocos grupos dentro de cadenas de A.
actinomycetemcomitants . Han et al. , por contraste , usando otras enzimas de
restriccion , distinguio 10 tipos genomicos clonales distintos entre 12 cadenas
de A. actinomycetemcomitants. El analisis de restriccion de endonucleasa ha
sido usado tambien para examinar otras bacterias orales incluyendo
Actinomyces, Eikenella corrodens y Streptococcus mutants. Como se describio
antes , la reaccion en cadena de polimerasa de primer arbitrario es otro medio
de ................. la reaccion en cadena de polimerasa de primer arbitrario fue
usada por Preus et al. para estudiar la distribucion y transmision del A.
actinomycetemcomitants en familias con periodontitis establecida. La reacion
en cadena de la polimerasa de primer arbitrario distingue varos patrones de
amplificacion en 20 cadenas de A. actinomycetemcomitants. y mostro que
esposos y esposas usulamente tienen diferentes tipos orales de A.
actinomycetemcomitants. Los niños en estas familias posee el mismo ampliotipo
de A. actinomycetemcomitants que uno de los padres, sugiriendo la
transimision entre padre e hijo.
CONCLUSION
La aplicacion del paradigma de las enfermedades infecciosas al estudio
de la enfermedad periodontal ha estimulado el progreso en identificar los
patogenos periodontales , es desarrollar ensayos microbiologicos rapidos para
normas clinicas y en el examen de transmision de patogenos periodontales.
Esta investigacion traslada directamente hacia una terapia periodontal
mejorada ofreciendole al clinico una medida de laboratorio de infeccion
periodontal como un adjunto al tradicional indice clinico de enfermedad
periodontal. El continuo progreso en el area de la microbiologia periodontal y
en el diagnostico de laboratorio de infecciones periodontales podra mas
adelante comprender la compleja ecologia microbiana que existe
subgingivalmente y ayudar a definir las interacciones entre huesped y parasito
asociadas con la enfermedad periodontal activa.
Traducido por Haroldo Magariños
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