fcz.95c - Tesis Electrónicas UACh

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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Bioquímica
Cambios en la eficiencia fotoquímica primaria del PS II en
“Deschampsia Antarctica Desv.” Bajo condiciones de estrés
frío y lumínico
Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de
Licenciado en Bioquímica y al Título profesional de Bioquímico.
Profesor Patrocinante : Sra. Miren Alberdi L. - Instituto De Botánica - Facultad De
Ciencias.
Rafael Enrique Zúñiga Hormazábal
Valdivia Chile 2003
Profesor Co-Patrocinante
Sra. Susan Hess - Instituto De Química - Facultad De Ciencias
Dedicatoria
A mis Padres, hermanos, hijo y familia.
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Agradecimientos
En forma muy especial quiero agradecer a mi profesora patrocinante Dra. Miren Alberdi Lag,
quien me permitió desarrollar este trabajo en el laboratorio que ella dirige y de quien siempre
recibí constante ayuda tanto teórica como práctica. Quien con su constante apoyo y dedicación
contribuyó al desarrollo de esta tesis como también a la formación de un potencial hombre de
ciencia. A las profesoras integrantes de mi comisión de tesis Dra. Susan Hess F. que con sus
consejos y enseñanzas aportó a este trabajo y con ello permitió que éste llegara a buen término y
Dra. Ilona Concha Grabinger por aceptar formar parte de esta comisión.
A Nancy Ulloa (Magíster en Ciencias, mención Botánica), quien formaba parte del grupo de
trabajo y de quien aprendí mucho, con respecto a la forma de trabajar en el laboratorio y abordar
los diferentes problemas.
También merecen un reconocimiento importante, los profesores Magdalena Romero del Instituto
de Botánica, Juan Carlos Paredes y Joel Pardo del Instituto de Química de esta Universidad, de
quienes recibí tanto críticas constructivas como voces de apoyo.
Este trabajo fue realizado en el laboratorio de Ecofisiología Vegetal del Instituto de Botánica e
Instituto de Química de la Universidad Austral de Chile y fue financiado por los proyectos: DIDUACH S-20002-88 y FONDECYT No 1000610.
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1. RESUMEN
La energía solar es potencialmente dañina para plantas cuando excede su capacidad fotosintética.
Las plantas pueden protegerse de este daño, mediante mecanismos de disipación del exceso de
energía, en el que participan pigmentos del grupo de las xantofilas (carotenoides oxígenados).
Deschampsia antarctica Desv., es la única Gramínea que ha colonizado en forma natural la
Antártida Marítima, ambiente de condiciones muy desfavorables (alta luminosidad y bajas
temperaturas), para el crecimiento de plantas superiores.
Se estudió el efecto de altas intensidades lumínicas (PFDs), y baja temperatura sobre la eficiencia
fotoquímica del fotosistema II (PSII) en plantas aclimatadas (A) y no aclimatadas (NA) al frío de
D. antarctica, y su relación con el ciclo de las xantofilas, evaluándose si la previa aclimatación a
4ºC, modifica el comportamiento del PSII y pigmentos investigados. La eficiencia fotoquímica
máxima (Fv/Fm) y efectiva (ФPSII) del PSII de plantas A y NA, no mostraron diferencias
significativas, a una misma PFD, advirtiéndose un descenso más marcado en plantas NA a la
mayor PFD y al final del tratamiento, lo que sugiriere un indicio de fotoinhibición. Plantas A
sometidas al efecto combinado de frío y alta PFD mostraron un mayor quenching no fotoquímico
(qNP) y tasa relativa de transporte de electrones (rETR), menor quenching fotoquímico (qP),
concomitante con mayores contenidos de zeaxantina, nivel de de-epoxidación y menores
contenidos de violaxantina, lo que indicaría la puesta en marcha de un mecanismo fotoprotector.
En conclusión, el análisis de los resultados nos permite inferir que esta especie presenta una
eficiente disipación de energía vía ciclo de las xantofilas sólo ante el efecto combinado del frío y
alta intensidad lumínica. Además, la aclimatación al frío sería favorable para evitar daños
fotoinhibitorios a la mayor intensidad lumínica utilizada. Estos mecanismos, podrían capacitar a
esta especie para la colonización y sobrevivencia en el desfavorable ambiente antártico.
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SUMMARY
The sun energy can be potentially harmful when exceeds the photosynthetic capacity of plants.
There are photoprotective mechanisms that permit the dissipation of the excess of energy
absorbed by plants, being one of this mechanism associated with pigments of the xanthophyll
(oxygenated carotenoids) cycle.
The effect of cold and high light intensities (PFDs) on the photochemical efficiency of
photosystem II (PSII) of cold acclimated (A) and non-acclimated (NA) plants of Deschampsia
antarctica Desv., in association with the xanthophyll cycle pigments, were studied. The
maximum (Fv/Fm) and effective (ФPSII) photochemical efficiency of the PSII did not
significantly changed in cold acclimated (A) and non-acclimated (NA) plants when exposed to
the same light level. At the highest light intensity a greater decrease of both parameters were
found, being this decrease greater in the NA than in A plants. That suggest an initial
photoinhibition in NA plants specially at the end of treatment. Cold A plants subjected to cold at
the highest PFD, showed a higher coefficient of non photochemical quenching (qNP) and relative
rate electron transport (rETR), lower coefficient of photochemical quenching (qP), higher content
of zeaxanthin and levels of de-epoxidation and a decrease of violaxanthin, suggesting a
photoprotector role of zeaxanthin.
From these results can be concluded that D. antarctica have an efficient mechanism of energy
dissipation via the xanthophyll cycle only when a high light level is combined with cold. A
previous cold acclimation seems to be favourable to avoid the photoinbitory damage under high
light and cold in this plant species. These mechanisms, can permit to this plant species to
colonize the harsh Antarctic environment.
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2. INTRODUCCION
La luz, como fuente de energía para la fotosíntesis, es el prerrequisito esencial para la vida de las
plantas. Sin embargo, el exceso de luz, puede disminuir la fotosíntesis (fotoinhibición) y llevar a
la destrucción fotooxidativa de los aparatos fotosintéticos (Long & Humphries, 1994), además de
causar efectos inhibitorios en la asimilación de CO2 (Krause, 1988). La fotoinhibición puede ser
definida como la inhibición de la fotosíntesis cuando el flujo de fotones que llega a la planta
excede el requerimiento fotónico de ésta (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986; Krause, 1988;
Öquist & Huner, 1991; Heber & Walker, 1992; Gray et al., 1994; Long et al., 1994; Adams III et
al., 1995a; Huner et al., 1996). La fotoinhibición de la fotosíntesis se presenta como una
disminución del rendimiento cuántico para el intercambio de CO2 y O2, un aumento en la
fluorescencia de la clorofila a (Chl a), y una disminución de las tasas de fotosíntesis a saturación
lumínica, bajo exposición prolongada a luz excesiva (Demmig & Björkman, 1987; Demmig et
al., 1987; Krause, 1988; Ögren, 1988; Somersalo & Krause, 1989, 1990a; Gray et al., 1994; Long
et al., 1994). El proceso fotoinhibitorio se basa principalmente en una inactivación del sistema
transportador de electrones en los tilacoides, cuyo efecto dominante es la alteración de los centros
de reacción del fotosistema II (PSII), lo que conduce a un descenso de la eficiencia fotoquímica
primaria de la fotosíntesis (Krause, 1988).
La energía lumínica, capturada por las clorofilas y carotenoides del complejo antena tilacoidal, es
transferida al centro de reacción del PSII, donde la separación de cargas inducida por fotones
tiene lugar entre el aceptor y dador primario de electrones. El complejo PSII es uno de las multisubunidades de los tilacoides, y está compuesto por más de 30 proteínas codificadas por genes
nucleares y del cloroplasto (Barber, 1998; Yamamoto, 2001). De entre las proteínas intrínsecas
codificadas por el cloroplasto, las D1 y D2 con una masa molecular de 32 kDa, son de particular
importancia. En ellas se localizan los componentes redox requeridos para la reacción
fotoquímica, como ser, el dador primario de electrones P680, el aceptor primario de electrones
feofitina (Pheo), el dador secundario de electrones Tyr Z (tirosina con actividad redox de la
proteína D1) y los aceptores secundarios de electrones quinona A (QA) y quinona B (QB) (Fig. 1).
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Bajo iluminación excesiva de luz visible, la proteína D1 se convierte en blanco de fotodaño, el
cual inhibe el transporte de electrones en el fotositema II (Yamamoto, 2001). Este daño se
traduce en la degradación de esta proteína por acción del oxígeno singlete (1O2), especies
oxidativas como P680+ y Tyr Z+, las cuales producen cortes en loops de la proteína (De las Rivas
et al., 1992) y cambios conformacionales en el sitio de unión a QB (Nakajima et al., 1996).
También se forman aductores covalentes o agregaciones de la proteína con los polipéptidos que
la rodean, debido a la oxidación de amino ácidos de la proteína D1. Estas agregaciones son
digeridas por putativas proteasas estromales (Yamamoto, 2001). La disfunción y degradación de
la proteína D1 (proteína de unión al centro de reacción del PSII), ha sido sugerida como el sitio
inicial causante de fotoinhibición (Krause, 1988).
Además del exceso de luz, otros factores de estrés ambiental tales como temperaturas bajas y de
congelación, calor, sequía y la deficiencia de nitrógeno pueden conducir e intensificar la
fotoinhibición aún con luz moderada (Larcher & Neuner, 1989; Somersalo & Krause, 1989,
1990b; Greer et al., 1991; Brestic et al., 1995; Dannehl et al., 1995; Fryer et al., 1995; Giardi et
al., 1996; Havaux & Tardy, 1996; Maury et al., 1996). Sin embargo, en algunas plantas, la
aclimatación al frío contribuye a disminuir la sensibilidad a la fotoinhibición ante un estrés de
enfriamiento (Somersalo & Krause, 1989, 1990a, 1990b).
FIGURA 1. Diagrama esquemático de la estructura del fotosistema II. Se muestra la localización
relativa de las proteínas D1 y D2 (proteínas de unión al centro de reacción del PSII, de masa
molecular 32 kDa), CP43 y CP47 (proteínas de unión a clorofila antena de masa molecular
relativa de 43 y 47 kDa) y OEC33, OEC24 y OEC18 (subunidades del complejo liberador de
oxígeno de 33, 24 y 18 kDa), QA y QB (plastoquinona aceptora de electrones primaria y
secundaria del PSII), TyrZ (tirosina con actividad redox de la proteína D1), Pheo (feofitina),
cluster de Mn (4Mn) y P680 (dador primario de electrones), además del complejo captador de luz
II (LHCII) y citocromo b559 (Cyt b559). Basado en las referencias de Mori et al., (1995);
Yamamoto & Akasaka, (1995); Yamamoto et al., (1998), citadas por Yamamoto, (2001).
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2.1.
Fotosíntesis y fotoinhibición a bajas temperaturas y alta
luminosidad
La fotosíntesis es uno de los procesos fisiológicos más sensibles a la temperatura (Berry &
Björkman, 1980; Huner et al., 1993). La fotosíntesis se inhibiría a baja temperatura, por la
reducción en la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente, por una disminución en
el transporte de electrones del PSII, causada por daños en el centro de reacción del mismo
fotosistema y por un incremento de la velocidad de disipación no radiativa (emisión de calor) de
la energía de excitación (Demmig et al. 1987; Krause, 1988; Baker, 1991; Brüggemann &
Dauborn, 1993; Huner et al., 1993; Rintamäki et al., 1995). El transporte de electrones mediado
por el fotosistema I (PSI) no es significativamente fotoinhibido (Moll & Steinback, 1986; Huner
et al., 1993; Hurry et al., 1994).
La fotoinhibición a bajas temperaturas ha generado un alto interés en los últimos años y ha sido
extensivamente investigada bajo condiciones de terreno (Ögren, 1988; Ögren & Sjöstrom, 1990;
Somersalo & Krause, 1990b; Groom et al., 1991; Karpinski et al., 1994; Adams III et al., 1995b;
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Steffen et al., 1995; Lütz, 1996) y de laboratorio (Somersalo & Krause, 1990a; Falk & Palmquist,
1992; Krause et al., 1995). Aunque muchos investigadores han expresado la fotoinhibición de la
fotosíntesis como daño del PSII, las investigaciones actuales demuestran que no siempre se
produce daño del aparato fotosintético cuando éste se fotoinhibe, y que la caída en el rendimiento
cuántico del PSII estaría asociado a fenómenos de fotoprotección (Krause, 1988; Huner et al.,
1993; Öquist et al., 1993; Horton et al., 1996).
La extensión de la fotoinhibición varía con el estado fisiológico de la planta y las condiciones
ambientales, tales como densidad del flujo fotónico (PFD) y duración de la exposición a la luz
(Powles, 1984; Krause, 1988; Demmig-Adams & Adams, 1992). A baja temperatura las plantas
son más sensibles a la luz, produciéndose fotoinhibición a intensidades de luz menores que a
mayor temperatura (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986; Somersalo & Krause, 1989, 1990a;
Schöner & Krause, 1990; Mishra et al., 1993). En algunas plantas, el daño producido puede
mantenerse aún cuando la temperatura óptima de crecimiento se restablezca (Park et al., 1995).
Como se indicó anteriormente, el sitio primario de daño fotoinhibitorio del PSII sería la proteína
D1 de 32 kDa, la cual se denatura y separa de la membrana tilacoidal (Krause, 1988; DemmigAdams & Adams, 1992; Horton et al., 1996; Nishida & Murata, 1996). Con ello se inactiva la
transferencia electrónica y la proteína se hace susceptible a la acción de proteasas o especies de
oxígeno activo (Powles, 1984; Krause, 1988; Somersalo & Krause, 1989; Schöner & Krause,
1990; Wang et al., 1992; McKersie et al., 1993; Long et al., 1994; Zhang et al., 1995; Hakam &
Simon, 1996; Hippeli & Elstner, 1996; Kocsy et al., 1997; Yamamoto, 2001). Sin embargo, no
existe aún consenso que éste sea el único sitio de daño, ya que se ha encontrado fotoinhibición
del transporte de electrones sin pérdida de D1 (Krause, 1988; Long et al., 1994). En hojas
aclimatadas al frío la fotoinhibición y su recuperación tampoco involucran a esta proteína
(Critchley & Russell, 1994). Plantas sensibles a las bajas temperaturas, fotoinhibidas por estrés
frío, muestran una alta reducción del “pool” de plastoquinonas y en especial de la quinona A, con
incremento en el cierre de los centros de reacción (CR) y una marcada disminución y degradación
en los complejos proteína-pigmentos del PSII (Klosson & Krause, 1981; Wise & Naylor, 1987;
Koroleva et al., 1994; Hodges et al., 1996; Fadzillah et al., 1996).
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Se ha reportado que, mientras la respuesta fotoinhibitoria es muy marcada en plantas susceptibles
al frío, plantas resistentes a este factor, poseen mecanismos que las capacitan para evitar o reducir
el bloqueo fotosintético, y por ende, mantener la integridad funcional de los cloroplastos (Steffen
et al., 1989).
Somersalo y Krause (1989, 1990) fueron los primeros en informar que hojas de espinaca
(Spinacia oleracea) aclimatadas al frío exhiben una alta capacidad de tolerar la fotoinhibición
(Huner et al., 1993; Gray et al., 1994). Aunque plantas de espinaca no aclimatadas se
fotoinhiben, este fenómeno es potencialmente reversible en el tiempo (Somersalo & Krause,
1989, 1990a; Schöner & Krause, 1990), como también se ha reportado para otros vegetales (Ting
et al., 1991). Cereales de primavera, con baja resistencia al frío, no son capaces de resistir la
fotoinhibición durante crecimiento prolongado a bajas temperaturas (temperaturas no
congelantes), como ocurre en plantas resistentes al frío, como trigo o centeno de invierno (Öquist
& Huner, 1991; Huner et al., 1993; Öquist et al., 1993; Huner et al., 1996; Szalai et al., 1996).
El incremento en la resistencia a la fotoinhibición en los cereales de invierno es el reflejo de la
capacidad de mantener las QA oxidadas, bajo condiciones de alta irradiancia y baja temperatura
(Öquist & Huner, 1991; Huner et al., 1996; Savitch et al., 1997). Esta capacidad ha sido
relacionada con el aumento en la tolerancia al congelamiento en estas plantas (Öquist et al.,
1993). Sin embargo, estos autores también reportan, que la alta resistencia al frío exhibida por
plantas de pino aclimatadas a bajas temperaturas, no está relacionada con esta capacidad, ya que
estas especies vegetales se fotoinhiben en condiciones de frío y luz moderada. Todo lo anterior,
muestra que la respuesta de las plantas a factores ambientales capaces de provocar fotoinhibición
es variable.
No sólo plantas vasculares, sino plantas no vasculares como musgos y líquenes antárticos
expuestos a bajas temperaturas y alta luminosidad, son capaces de mantener su capacidad
fotosintética gracias a la mantención de una mayor actividad del PSII ante el efecto de estos
factores ambientales (Huner et al., 1993; Davey & Rothery, 1996; Edwards & Smith, 1988;
Casanova, 1997).
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Se considera que la posibilidad de recuperación en el tiempo, de plantas que han sufrido eventos
fotoinhibitorios bajo frío y que son devueltas a condiciones óptimas, está íntimamente
relacionada con la capacidad del PSII de disipar la energía no radiativa como calor (a través del
ciclo de las xantofilas), con o sin intervención de la proteína D1. Esta capacidad de recuperación
sería reflejo de que están operando procesos de fotoprotección (Demmig et al., 1987; Greer et al.,
1991; Demmig-Adams & Adams, 1992; Heber & Walker, 1992; Long et al., 1994; Brestic et al.,
1995; Fryer et al., 1995; Adams et al., 1996; Demmig-Adams & Adams, 1996; Flanigan &
Critchley, 1996). Cambios bioquímicos en el contenido y composición de los complejos proteínapigmentos del centro de reacción y/o de las antenas, permiten minimizar el daño fotoinhibitorio,
manteniendo la eficiencia de los eventos primarios de la fotosíntesis, proceso conocido como
“down-regulation” (Huner et al., 1984; Sicher et al., 1988; Demmig-Adams & Adams, 1992; van
Wijk & van Hasselt, 1993; Maxwell et al., 1995; Haldimann, 1996; Horton et al., 1996; Jahns &
Miehe, 1996; Park et al., 1996; Gilmore, 1997). Todos estos mecanismos de desexcitación del
sistema tilacoidal, pueden afectar la emisión de fluorescencia de la Chl a, cuyos parámetros son
utilizados como indicadores del efecto fotoinhibitorio de diversos tipos de estrés sobre plantas. El
significado de la emisión de diferentes señales de fluorescencia y su importancia en la predicción
de fotoinhibición será tratado más adelante (punto 2.3).
2.2. Carotenoides y su rol fotoprotector
Aunque los carotenoides cumplen un importante papel en la captación de energía lumínica, su
papel como pigmentos fotoprotectores es crucial en la mantención de la función fotosintética en
hábitats expuestos a altas intensidades lumínicas (Rau, 1988). Esta protección se atribuye a la
capacidad de los carotenoides de apagar (“quench”) directamente el estado de triplete oxidado de
la clorofila (3Chl), previniendo con esto la producción de singletes de oxígeno (1O2) o bien
apagándolos (Thayer & Björkman, 1990; Asada, 1999; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001) y
evitando así que el 1O2 estimule la formación de otras especies reactivas de oxígeno (ROS) tales
como peróxido de hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2·-) y los radicales hidroxilo (HO·) y
perhidroxilo (O2H·). Estas moléculas reactivas, especialmente OH·, son altamente destructoras de
lípidos de membrana, ácidos nucleicos, y proteínas. Sin embargo, las especies de oxígeno
reactivas como O2·- y H2O2 son requeridas para algunos procesos vegetales como la lignificación
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y funcionan como señales en la respuesta defensiva contra la infección de patógenos (Buchanan
et al., 2000).
Se ha sugerido un rol específico de la zeaxantina, un carotenoide formado en el ciclo de las
xantofilas, en la protección de los aparatos fotosintéticos contra los efectos adversos del exceso
de luz (Demmig et al., 1987; Demmig-Adams & Adams, 1992; Bugos et al., 1998). Este ciclo
(Fig. 2 y 3) convierte las tres xantofilas (carotenoides oxigenados), mediante secuencias de deepoxidación por acción de la enzima violaxantina de-epoxidasa, desde el diepóxido violaxantina
vía monoepóxido anteraxantina, a la forma de epóxido libre, zeaxantina, cuando la absorción de
luz excede la utilización fotoquímica de ella. Esta interconversión ocurre en presencia de
ascorbato y cuando la concentración de protones [H+] en el lumen tilacoidal alcanza un umbral
crítico (lumen ácido), determinado por la bomba de protones inducida por luz (Gilmore &
Yamamoto, 1992; Bugos et al., 1998; Niyogi et al., 1998; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001;
Elrad et al., 2002). La zeaxantina actuaría como “varilla de alumbrado” (lightning rod)
recibiendo la energía de la misma forma que la clorofila y disipándola como calor, pudiendo esta
energía ser medida por la emisión de fluorescencia (Demmig et al., 1987). En la oscuridad o
cuando la luz no está en exceso se produce epoxidación (por acción de la enzima zeaxantina
epoxidasa) de la zeaxantina a violaxantina vía el intermediario anteraxantina (Long &
Humphries, 1994; Bugos et al., 1998; Niyogi et al., 1998; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001). La
reacción es óptima a un pH cercano a 7,5 y la enzima utiliza oxígeno, ferrodoxina y FAD como
co-substratos (Bouvier et al., 1996; Bugos et al., 1998; Müller et al., 2001).
Existen evidencias que apoyan la participación de los carotenoides en la mantención de una
fotosíntesis adecuada ante condiciones de frío y alta intensidad lumínica, como ocurre en lugares
ubicados en altura (Wildi & Lütz, 1996; Lütz, 1996). Especies de Lycopersicum provenientes de
mayor altitud, sometidas a un tratamiento de enfriamiento responden con un incremento de
carotenoides y un ajuste de su “pool” de xantofilas, conducente a presentar niveles mayores de
zeaxantina que las de menor altitud (Venema et al., 1999). Mayores antecedentes sobre la
capacidad de apagamiento de los carotenoides y su significado fisiológico se entregan mas
adelante (punto 2.5).
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2.3. Fluorescencia in vivo de la clorofila a en la medición del estado
fisiológico del aparato fotosintético
Cuando la energía lumínica es absorbida por una molécula de clorofila, se altera temporalmente
su configuración electrónica (estado excitado) emitiendo fluorescencia. Este estado es inestable y
de corta duración (<10-8 segundos), pues muchos procesos compiten para disipar la energía. Por
lo tanto, in vivo, la clorofila presenta cambios en el rendimiento fluorescente durante la
exposición a la luz (Kautsky & Hirsch, 1931). Estos cambios se deben a que la clorofila forma
parte de complejos proteínas-pigmentos los cuales están embebidos en la membrana tilacoidal, y
transmiten la excitación energética a los centros de reacción de los fotosistemas II (P680) y
fotosistema I (P700) donde se produce la conversión energética por separación de cargas.
FIGURA 2. Vía biosintética de carotenoides en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii y
plantas. Tomado de Niyogi et al., (1997).
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FIGURA 3. Vía biosintética del ciclo de las xantofilas a partir de β-caroteno en plantas
superiores, con mención de las enzimas principales involucradas en la interconversión de estos
pigmentos, extraído de Niyogi et al., (1998). Violaxantina de-epoxidasa es estimulada por un
exceso de luz y pH ácido, mientras que zeaxantina epoxidasa se estimula con luz baja y pH
neutro.
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A temperatura ambiente la fluorescencia variable (Fv) se origina casi exclusivamente del PSII,
por lo que los cambios en fluorescencia reflejan primariamente el estado del PSII (Krause &
Weise 1991). Esto no ocurre a temperaturas de -196ºC (77°K) donde se observa fluorescencia
tanto del PSII (max em = 690 nm) como del PSI (max em = 730 nm) (Govindjee, 2002).
Además, las variaciones en la distribución de la energía entre los dos fotosistemas también
influyen en el rendimiento fluorescente. Como el PSI esencialmente no fluoresce, cualquier
incremento en la transferencia de energía del PSII al PSI podría ser considerado como
equivalente a la disipación no radiante (Björkman & Demmig, 1987).
El estudio de la fluorescencia in vivo de la Chl a aporta información valiosa sobre el efecto que
producen los diferentes tipos de estrés en la fotosíntesis. En los últimos años las técnicas de
fluorescencia han sido aplicadas a estudios sobre la eficiencia fotoquímica o rendimiento
cuántico máximo del PSII (ФPSII) (Demmig & Björkman, 1987; Krause, 1988; Planchon et al.,
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1989; Adams et al., 1990; Horton et al., 1994; Peterson & Aylor, 1995; Strasser et al., 1995,
Strasser, 1997; Agati et al., 1996; Fracheboud et al., 1999; Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et
al., 2001). Estas técnicas se basan en inducir la emisión de fluorescencia de la Chl a en plantas
adaptadas a la oscuridad y posteriormente iluminadas. Esta fluorescencia depende del estado de
reducción de los aceptores primarios de electrones del PSII. La emisión de fluorescencia presenta
una curva característica, denominada curva o efecto de Kautsky en honor a su descubridor
(Kautsky, 1931), cuyos parámetros son utilizados en la interpretación del rendimiento cuántico
del PSII (Krause & Weis, 1984; Krause, 1988; Strasser et al., 1995; Fracheboud et al., 1999;
Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et al., 2001). Para mejor comprensión de esta curva ver la (Fig.
4). De acuerdo a Kautsky, cuando una hoja es iluminada con una intensidad de luz constante, la
emisión de fluorescencia también será constante. Sin embargo, si la hoja es mantenida en la
oscuridad donde todos los componentes de la cadena transportadora de electrones se encuentran
completamente oxidados, y es posteriormente irradiada con luz continua, la fluorescencia
aumenta rápidamente a un nivel inicial bajo (Fo) fluorescencia inicial, característico de la
apertura de los centros del PSII y la total oxidación del aceptor primario de electrones de este
fotosistema QA. Posteriormente, la fluorescencia pasa por un nivel intermedio, a medida que la
luz es absorbida y la separación de cargas tiene lugar, produciéndose el cierre de los centros y la
reducción de QA, aumentando la fluorescencia hasta un nivel máximo (fluorescencia máxima,
Fm), lo cual indica que QA se encuentra totalmente reducida. Al mantenerse la luz, los procesos
fotosintéticos se activan, funcionando la cadena transportadora de electrones y la energía es usada
en la reducción del CO2. Esto produce que la emisión de fluorescencia disminuya paulatinamente
pasando por un segundo máximo (M), asociado con el inicio de la reducción del CO2 en el ciclo
de Calvin (Ireland et al., 1984), hasta llegar a un nivel (T) cercano a Fo (Kautsky & Hirsch,
1931). La disminución de la fluorescencia más allá de su valor máximo hasta llegar a T responde
a la activación de los procesos, relacionados con la transformación de la energía en el PSII y la
cadena transportadora de electrones, coeficiente de “quenching” fotoquímico (qP) y el coeficiente
de “quenching” no fotoquímico (qNP). Este último representa los procesos que disipan la energía
como calor o como energía de transferencia.
La fotoinhibición está relacionada con una disminución del rendimiento de la fluorescencia
variable de la Chl a del PSII, lo que se manifiesta en una disminución del cuociente de
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fluorescencia variable y fluorescencia máxima, Fv/Fm (Ireland et al., 1984; Krause, 1988; Krause
& Weis, 1984, 1991; Ögren & Sjöström, 1990; Raggi, 1995; Raveh et al., 1995; Verhoeven et al.,
1996, 1999; Fracheboud et al., 1999; Maxwell & Johnson, 2000). En condiciones normales, la
mayoría de las plantas superiores poseen un Fv/Fm óptimo cercano a 0,83 típico de plantas sanas,
oscilando entre 0,7 a 0,85 (Krause, 1988; Krause & Weis, 1984, 1991; Björkman & Demmig,
1987; Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et al., 2001). Un descenso de Fv/Fm ha sido relacionado
con una caída en el rendimiento fotónico óptimo de la fotosíntesis, mientras que la recuperación
de este estado se asocia con un reestablecimiento de Fv/Fm (Adams et al., 1990).
En plantas de cereales y pino sometidas a tratamiento frío, la fotoinhibición ocurre gradualmente
alcanzando un estado de equilibrio cerca de las 20 y 60 horas de tratamiento frío,
respectivamente, decreciendo Fv/Fm en un 20% en los cereales y un 60% en pino (Öquist &
Huner, 1991). En plantas de espinaca no aclimatadas al frío, el Fv/Fm desciende en un 50%
(desde 0,8 a 0,4) bajo un tratamiento frío (4°C) y alta luminosidad, mientras que plantas
aclimatadas al frío presentaron un valor de 0,7. La caída fotoinhibitoria de Fv/Fm se caracteriza
por un incremento en Fo y disminución de Fv (Somersalo & Krause, 1989). En plantas de cebada
fotoinhibidas, este proceso puede ser rápidamente revertido y disminuir al cambiar las plantas a
temperaturas óptimas de crecimiento, lo que se expresa en un aumento de Fv/Fm (Greer et al.,
1991).
El descenso de la tasa fotoquímica del PSII, se expresa como un incremento en Fo (probable
alteración del centro de reacción) y un aumento de la tasa de disipación no radiativa de la energía
de excitación, como un decrecimiento en Fo y Fm (Demmig et al., 1987; Demmig & Adams,
1992). Cabe señalar que ambos procesos son observados como una disminución en Fv/Fm, aún
cuando las características en la intensidad de la fluorescencia en los centros de reacción abiertos y
cerrados puedan ser diferentes (Long et al., 1994).
La función indicadora de la actividad fotosintética que se atribuye a la fluorescencia de la
clorofila a proviene del hecho que la emisión de fluorescencia es complementaria al resto de las
vías de desexcitación (traslado de la energía fotónica) del PSII, fundamentalmente en la forma
fotoquímica y la de disipación de calor. Así, la eficiencia en la emisión de fluorescencia es mayor
cuanto menor es la eficiencia de los mecanismos de disipación fotoquímicos y en forma de calor.
17
Teniendo en cuenta que la fluorescencia de la clorofila se origina principalmente en el PSII, y que
más del 90% de la emisión de fluorescencia se origina en la clorofila a de este fotosistema, la
transferencia de la energía de excitación al PSI debe ser considerada como una vía adicional y
competitiva de desexcitación.
Por lo tanto, la fluorescencia de la clorofila a del PSII podría funcionar como indicador de todos
los niveles funcionales de la fotosíntesis y reacciones fotosintéticas de las plantas verdes. Un gran
número de estudios así lo han demostrado desde que Kautsky & Hirsch (1931) descubrieron que
esta emisión presenta cambios característicos cuando una planta es sometida a iluminación luego
de estar en la oscuridad (Krause & Weis, 1984).
2.4. Mecanismos de desexitación de la clorofila a del PSII
Desde el punto de vista de la emisión de fluorescencia existen fundamentalmente dos
mecanismos que compiten durante los procesos de desexcitación. Estos son la conversión
fotoquímica de energía en los centros de reacción del PSII y los mecanismos no fotoquímicos al
nivel de antena y centros de reacción (Horton, et al., 1996) (Fig. 5). Debido a la intervención de
ambos mecanismos la eficiencia potencial de emisión de fluorescencia resulta disminuida
definiéndose dos mecanismos de amortiguamiento o apagamiento “quenching” fotoquímico
(utilización de electrones en la cadena fotosintética) y no fotoquímico (disipación de la energía en
forma de calor). La correcta interpretación de los cambios en la emisión de fluorescencia requiere
conocer la contribución relativa de estos mecanismos de amortiguamiento.
Recientemente se ha desarrollado una técnica no intrusiva (Fig. 5) para determinar in vivo la
fluorescencia de la clorofila a del PSII, que utilizando luz actínica modulada de baja intensidad y
pulsos de luz de mayor intensidad permite evaluar a través de la obtención de fluorescencias
máximas y variables, no sólo los rendimientos cuánticos óptimos (en plantas adaptadas a la
oscuridad) sino también las fluorescencias efectivas, Fm’ y Fv’ (Fm’- Fo’) (en plantas adaptadas
a la luz), y la distribución de la energía, es decir cuanta energía se transfiere a la cadena
transportadora de electrones fotosintética (quenching o apagamiento fotoquímico: qP) y aquella
18
disipada en forma de calor (quenching o apagamiento no fotoquímico: qNP) (Schreiber et
al.,1986).
2.5.
Bases moleculares de los mecanismos de apagamiento
(quenchings) y su asociación con los carotenoides del ciclo de las
xantofilas
Aunque las bases moleculares de los mecanismos de apagamiento aun se desconocen, se pueden
hacer algunas consideraciones (Büchel & Wilhelm, 1993): El qP depende estrictamente del
estado de oxidación del primer aceptor del PSII la QA, e indica la eficiencia fotoquímica de los
fotones capturados por los centros de reacción. Sin embargo, el qP es presumiblemente mayor
que el porcentaje de QA oxidados, debido a la migración de energía de centros cerrados a
abiertos. Adicionalmente, QA oxidado puede actuar de “apagador” o “quencher”. Por ende, el
verdadero valor de Fm se alcanza sólo cuando todo el “pool” de plastoquinonas (PQ) está
reducido.
FIGURA 4. Efecto Kautsky. Curvas de emisión de fluorescencia de hojas previamente adaptadas
a la oscuridad. Estas muestran que la emisión de fluorescencia varía en función del tiempo de
manera bastante compleja. En el momento de la iluminación, la fluorescencia aumenta casi
instantáneamente hasta un nivel inicial (Fo) luego aumenta rápidamente hasta un nivel máximo
(Fm). Finalmente la emisión de fluorescencia disminuye lentamente hasta un estado estacionario
(T), después de haber pasado por un segundo máximo (M). Los cambios de la intensidad de la
fluorescencia observados durante la transición obscuridad/luz son función de la activación de los
procesos fotosintéticos
19
FIGURA 5. Cinética de emisión de fluorescencia obtenida con el fluorímetro de pulso de
amplitud modulada FMS 1 (Hansatech, Reino Unido). Las flechas negras indican el encendido de
la luz de medida. Las flechas negras quebradas indican los pulsos de saturación. Con las flechas
rojas se indica el encendido y apagado de la luz actínica, y la flecha de color lila un pulso de rojo
lejano, modificado de Ulloa (2002).
20
El significado de los parámetros de fluorescencia (símbolos) se indican en las páginas 28 y 29.
El qNP puede estar compuesto de varios mecanismos de apagamiento independientes, siendo
importante el apagamiento o “quenching” energético (qE), que contribuye a la mayor parte del
qNP. El qE está determinado por la acumulación de protones en el lumen tilacoidal, movilizados
por el flujo fotónico, de modo que el qNP se asocia con el incremento del pH intratilacoidal y con
la presencia de zeaxantina, cuando hay un exceso de luz (Bilger & Björkman, 1990; Müller et al.,
20001; Elrad et al., 2002). La zeaxantina actúa como apagador. Se asume que esta acción se
produciría por: (1) apagamiento directo del singlete excitado de la clorofila, por transferencia de
energía desde la clorofila a la zeaxantina, lo que requiere proximidad física entre ambas
moléculas (Ruban et al., 1993) y (2) por alteración de las propiedades de la membrana tilacoidal,
por parte de este pigmento, al promover la agregación de los principales complejos recolectores
de luz o por cambio en la fluidez de la membrana tilacoidal, disminuyendo la fluidez,
incrementando la termoestabilidad y reduciendo la susceptibilidad a la peroxidación lipídica, al
21
interaccionar las xantofilas y los lípidos de membrana (Havaux, 1998; Havaux & Niyogi, 1999).
En este caso la zeaxantina actuaría como amplificador del apagamiento más que como apagador
directo (Thiele & Krause, 1994; Thiele et al., 1998).
Deschampsia antarctica y Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl., son las únicas plantas vasculares
que han colonizado en forma natural la Antártida (Alberdi et al., 2002). Pueden mantener un 30 a
40% de sus tasas fotosintéticas máximas a 0°C, siendo la temperatura óptima para este proceso de
13 y 19°C, respectivamente (Edwards & Smith, 1988). Estos autores señalan, que en la mayoría
de las especies de gramíneas septentrionales o australes (subpolares), una fotosíntesis neta
significativa, se produce en un rango de temperaturas entre 0 y -5°C. En ambientes de bajas
temperaturas, otro factor que puede también contribuir a limitar la fotosíntesis es la intensidad
lumínica, lo que puede conducir a fotoinhibición (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986;
Schöner & Krause, 1990; Mishra et al., 1993).
La temperatura óptima para la fotosíntesis exhibida por una especie vegetal refleja el rango de
temperaturas ambientales en las cuales las especies crecen en su ambiente natural (Berry &
Björkman, 1980; Sakai & Larcher, 1987; Larcher, 1995). La mayoría de los estudios en relación
con el efecto de las bajas temperaturas sobre la fotosíntesis se refieren a plantas de altura o
cultivadas. Pocos estudios referentes a este tema se han realizado en plantas vasculares capaces
de colonizar la región Antártica (Edwards & Smith,1988; Xiong et al., 1999). Mayores
antecedentes bibliográficos al respecto en Alberdi et al. (2002).
En el presente estudio, y mediante el uso de diferentes parámetros de fluorescencia, se pretende
evaluar los cambios en la eficiencia fotoquímica primaria del PSII, que pudieran dar cuenta de
daños fotoinhibitorios en D. antartica, sometida al efecto simultáneo de frío e intensidad
lumínica y su posible asociación con el ciclo de las xantofilas. Adicionalmente, se pretende
estudiar el efecto que posee una aclimatación previa al frío sobre los parámetros anteriores.
22
2.6. Hipotesis
Teniendo en cuenta las condiciones climáticas (alta luminosidad y bajas temperaturas) bajo las
cuales D. antarctica crece y fotosintetiza durante el verano antártico, y a las cuales debería estar
adaptada, se formula la hipótesis siguiente:
D. antarctica debiera mantener una alta eficiencia fotoquímica (no fotoinhibirse) del PSII, aún
cuando interactúen simultáneamente bajas temperaturas y altas intensidades de flujo fotónico. El
aumento de carotenoides, disipadores de energía, específicamente zeaxantina, en respuesta a
condiciones de alto flujo fotónico y baja temperatura, sería el mecanismo que evita el daño
fotoinhibitorio en esta especie.
2.7. Objetivos generales
Estudiar los cambios en la eficiencia fotoquímica del PSII en plantas no aclimatadas y
aclimatadas al frío de D. antarctica, sometidas al efecto simultáneo del frío y altas intensidades
lumínicas, por tiempo variable y establecer los cambios de concentración de pigmentos
fotoprotectores (carotenoides), que pudiesen asociarse a estas condiciones.
2.8. Objetivos especificos
En plantas de D. antarctica no aclimatadas y aclimatadas al frío y sometidas al efecto simultáneo
del frío y diferentes niveles de intensidad lumínica, por tiempo variable, se determinarán los
siguientes objetivos específicos:
a) Evidenciar los cambios que experimentan los diversos parámetros de fluorescencia de la
clorofila a del PSII.
b) Establecer los cambios en contenido hídrico foliar.
c) Determinar la concentración de pigmentos (clorofila a, b).
d) Determinar los cambios en los contenidos de carotenoides totales y de los pigmentos del ciclo
de las xantofilas (zeaxantina, anteraxantina, violaxantina).
23
3. MATERIAL Y METODOS
3.1. Condiciones de crecimiento
Se trabajó con plantas de D. antarctica colectadas en la Isla Robert (Antártida Marítima) y
cultivadas en el laboratorio de Ecofisiología Vegetal del Instituto de Botánica de la Facultad de
Ciencias de la Universidad Austral de Chile. El cultivo se realizó en una cámara climática (Sigma
Scientific) a 13±1,5°C (óptimo fotosintético de esta especie Smith, 1994), 65-70% de humedad
relativa, fotoperíodo de 21/3 h luz/oscuridad y a una intensidad lumínica o densidad de flujo
fotónico (PFD) de aproximadamente 180 µmol m-2s-1. La iluminación fue proporcionada por
lámparas de luz fría (cool-white lamps), (Sylvania/GTE, Danvers MA, USA), cuyos PFD se
controlaron con fotómetro (Li-Cor modelo LI-189). El sustrato estuvo constituido por una mezcla
de suelo orgánico y turba (3:1 p/p). Las plantas se regaron cada tres días a 80% de la capacidad
de campo del suelo, alternadamente, con agua y solución nutritiva (Phostrogen®).
3.2. Condiciones de aclimatación al frío
Un grupo de plantas (45) crecidas a 13±1,5°C y a las condiciones anteriores fue transferido a otra
cámara de crecimiento, para ser aclimatadas a 4±1,5°C por 21 días (plantas aclimatadas = A),
mientras que otro grupo con la misma cantidad de plantas permaneció a 13±1,5°C (plantas no
aclimatadas = NA). Las otras condiciones de la cámara fueron las mismas que las descritas en el
párrafo anterior. Después de los 21 días ambos grupos de plantas se transfirieron a otras cámaras
para iniciar el tratamiento fotoinhibitorio. Previo a esto, se determinaron los parámetros de
fluorescencia, contenidos hídricos y peso seco, además de los contenidos de pigmentos en las
plantas provenientes de cada tratamiento.
24
3.3. Tratamiento fotoinhibitorio
Para probar si esta especie se fotoinhibe bajo el efecto combinado del frío y alta intensidad
lumínica, plantas NA y A (Fig. 6), provenientes de los tratamientos anteriores fueron trasladadas
independientemente a dos cámaras. En una de ellas las plantas fueron sometidas a 4±1,5°C y a
diferentes densidades de flujo fotónico (PFDs; 200, 600 y 1000 µmol m-2s-1) a diferentes tiempos
(0, 6, 12, 18 y 24 horas de irradiación), mientras que en otra cámara, las plantas fueron sometidas
a las mismas PFDs, pero a 13±1,5°C. La determinación de los parámetros de fluorescencia,
pigmentos, contenidos hídricos y peso seco, se realizó después de finalizado cada tratamiento. La
fuente de luz fue proporcionada por una lámpara de vapor de sodio de alta presión ubicada sobre
una capa de circulación de agua fría, para favorecer la mantención de las temperaturas, evitando
un sobrecalentamiento. En este trabajo se utilizarán indistintamente los términos de intensidad
lumínica y densidad de flujo fotónico (PFD), para referirse a la intensidad de luz aplicada.
3.4. Medición in vivo de la fluorescencia de la clorofila a
La emisión de fluorescencia de la clorofila a del PSII, se determinó utilizando un fluorímetro de
pulso de amplitud modulada “Fluorescence Monitoring Systems” (FMS 1, Hansatech Instruments
Ltd., Reino Unido). Los parámetros cinéticos de inducción de fluorescencia registrados con este
equipo se muestran en la (Fig. 5) y se explican más adelante.
Para las mediciones de fluorescencia, hojas bien desarrolladas de D. antarctica, unidas a la
planta, provenientes de los diferentes tratamientos, se oscurecieron con pinzas (provistas de una
abertura cubierta por una placa central móvil, sobre la que se adapta la fibra óptica a
aproximadamente 10 mm de distancia), por 30 minutos, para lograr que todos los componentes
de la cadena transportadora de electrones (QA) se encuentren completamente oxidados (abiertos).
Luego, se aplicó sobre la pinza el cabezal con la fibra óptica, y se deslizó la lámina oscurecedora
de la pinza, para permitir el paso de los diferentes pulsos de luz.
La clorofila a es excitada por medio de una luz modulada de débil intensidad (<0,1 µmol m-2s-1).
Con esta activación la fluorescencia emitida corresponde a Fo, que es definida como la
fluorescencia de hojas adaptadas a la oscuridad, cuando todos los centros de reacción del PSII y
25
las moléculas aceptoras de electrones (QA) están totalmente oxidados. Mediante la aplicación de
un pulso corto de luz saturante de alta intensidad (9000 µmol m-2s-1) por 0,7 segundos se obtiene
la fluorescencia máxima o potencial (Fm), que corresponde al punto en que todos los aceptores
de electrones del PSII se reducen. La diferencia entre Fm y Fo es la máxima capacidad de energía
fotoquímica de la muestra y es definida como fluorescencia variable (Fv). Cuando las muestras
han estado previamente oscurecidas, el parámetro Fv/Fm corresponde al rendimiento cuántico
óptimo, máximo o potencial del PSII, el cual es un buen indicador de la eficiencia fotosintética.
Luego, las hojas se iluminan continuamente con luz actínica a una intensidad de luz
aproximadamente de 180 µmol m-2s-1 (hojas fotosintetizando) y la fluorescencia evoluciona
desde un máximo hasta llegar a una condición de equilibrio o “steady state” (Fs). Posteriormente,
el equipo emite un nuevo pulso de luz saturante (9000 µmol m-2s-1), con el cual se obtiene la
fluorescencia máxima de hojas adaptadas a la luz (Fm’). En seguida, por apagamiento de la luz
actínica y encendido de un pulso de rojo lejano de 3 segundos se obtiene la fluorescencia mínima
de las hojas adaptadas a la luz (Fo’).
Cuando las muestras se encuentran adaptadas a la luz se obtiene el rendimiento cuántico efectivo
del PSII (ФPSII), coeficiente de “quenching” fotoquímico (qP), coeficiente de “quenching” no
fotoquímico (qNP) y la tasa relativa de transporte de electrones (rETR).
FIGURA 6. Aspecto de plantas cultivadas en laboratorio a partir de reproducción vegetativa
(clones) de Deschampsia antarctica Desv., provenientes de Isla Robert (Antártida Marítima), en
diferentes condiciones. El cultivo se realizó, en cámara climática (Sigma Scientific) con 65-70%
de humedad relativa, fotoperíodo de 21/3 h luz/oscuridad, y a una intensidad lumínica ≈180 µmol
m-2s-1. Plantas aclimatadas al frío fueron mantenidas a 4±1,5°C, durante 21 días y no aclimatadas
a 13±1,5°C por el mismo tiempo. Ambos grupos fueron sometidos a tratamiento fotoinhibitorio.
Las plantas aclimatadas presentan menor crecimiento, sus hojas poseen menor superficie, son
más densas y plegadas por sus bordes que las no aclimatadas.
26
El equipo registra las señales de los diferentes tipos de fluorescencia y calcula en forma
automática los parámetros de fluorescencia. Los parámetros y las fórmulas entregadas por el
software FMS 1,05 (Hansatech, Reino Unido) se indican a continuación (Schreiber et al., 1986):
Fo = fluorescencia inicial.
Fm = fluorescencia máxima o potencial.
Fv = fluorescencia variable = Fm – Fo.
Fv/Fm = eficiencia fotoquímica máxima o potencial, del PSII de plantas previamente
oscurecidas. Indica el rendimiento cuántico máximo del PSII, que se obtiene cuando todos los
centros del PSII se encuentran abiertos (oxidados).
Fm’ = fluorescencia máxima real.
27
Fv’ = fluorescencia variable efectiva bajo condiciones de iluminación = Fm’ – Fo’.
Fs = fluorescencia en el estado estacionario.
Fo’ = fluorescencia mínima de hojas adaptadas a la luz.
Fv’/Fm’ = eficiencia fotoquímica efectiva del PSII, de plantas iluminadas. Señala la eficiencia en
la captura de energía de exitación, por los centros abiertos del PSII.
ФPSII = rendimiento cuántico efectivo del PSII de plantas previamente iluminadas, que fue
determinado por Genty et al. (1989) de acuerdo a la siguiente fórmula:
Este parámetro proporciona información sobre el rendimiento cuántico del transporte de
electrones en el PSII.
qP = coeficiente de “quenching” fotoquímico o “quenching” fotoquímico =
qNP = coeficiente de “quenching” no foquímico o “quenching” no fotoquímico =
rETR = tasa relativa de transporte de electrones =
28
3.5. Determinación del contenido hídrico
El contenido hídrico de las muestras foliares se determinó por el método gravimétrico,
estableciéndose las diferencias entre el peso fresco (PF) y el peso seco (PS) de ellas, siguiendo las
indicaciones de Steubing et al. (2002). Para la obtención del peso seco, el material vegetal,
previamente pesado, se colocó 10 minutos en una estufa a 105°C (para inactivar enzimas), y
posteriormente a 80°C hasta peso constante. La diferencia entre los pesos proporcionó el
contenido de agua de los tejidos, el que fue expresado en porcentaje y calculado de la siguiente
forma:
3.6. Determinación de clorofilas y carotenoides totales
Para extraer y cuantificar clorofilas a, b (Chl a y b) y carotenoides totales (Car) se utilizó el
protocolo propuesto por Lichtenthaler y Willburn (1983). Se homogeneizó 0,15 g de material
foliar fresco con 20 mL de metanol, en un mortero enfriado sobre hielo. El extracto fue filtrado
(papel filtro ADVANTEC MFS Nº1) y recolectado en un matraz aforado de 20 mL. Se trabajó en
oscuridad y con los matraces recubiertos con papel aluminio para evitar descomposición de los
pigmentos por efecto de la luz. La medición de la absorbancia de los extractos se realizó
inmediatamente en un espectrofotómetro (Metertek SP-850) a longitudes de onda de 666, 653 y
470 nm, utilizando metanol como blanco.
Para el cálculo de las concentraciones de clorofilas y carotenoides se utilizaron las siguientes
fórmulas:
29
3.7. Extracción de pigmentos y separación de xantofilas
Los pigmentos fotosintéticos y protectores (carotenoides oxigenados) fueron extraídos a partir de
un macerado en baño de hielo de 0,15 g de tejido foliar (material no dañado y fresco) después del
tratamiento fotoinhibitorio. Las extracciones se realizaron lo más rápidamente posible después de
la obtención del material, para evitar la degradación oxidativa o la rápida destrucción enzimática
de carotenoides que ocurre inmediatamente cuando las hojas son cortadas (Law & Rilling, 1985).
Cuando los tejidos no pudieron ser extraídos inmediatamente, éstos se almacenaron con nitrógeno
líquido en un congelador a -30°C.
Por la presencia de agua en los tejidos y la insolubilidad de los carotenoides en ella, éstos fueron
extraídos tres veces con 3 mL de metanol 100% grado HPLC, solvente orgánico polar miscible
en agua. La primera extracción con 3 mL de metanol, si bien removió muy poco pigmento, secó
el tejido y permitió la eficiente remoción durante las siguientes extracciones.
Debido a su alto grado de insaturación, los carotenoides son muy inestables al oxígeno, luz, calor,
ácidos y álcalis, lo que puede formar artefactos oxidados. Para evitar ésto el macerado del
material vegetal se realizó en un baño de hielo, con metanol frío bajo luz roja y usando un flujo
suave de N2, para minimizar la oxidación e isomerización (Law & Rilling, 1985). El
sobrenadante obtenido de las tres extracciones se recolectó en Eppendorf ámbar de 2,0 mL y fue
centrifugado a 5000 x g por 3 minutos.
Para la obtención de pigmentos del ciclo de las xantofilas más puros y libres de clorofilas se
realizó una separación de fases, que involucró la partición del extracto en metanol 100%
centrifugado, entre dos fases de solventes inmiscibles de diferente polaridad, 9 mL de éter de
petróleo y 9 mL de metanol acuoso 40%. Los compuestos no polares, carotenos, epóxidos de
caroteno, ésteres de xantofilas y clorofilas, quedaron en la epifase con éter de petróleo y las
xantofilas polares fueron recuperadas desde la inferior o hipofase (Law & Rilling, 1985). La
separación, identificación y determinación de los pigmentos del ciclo de las xantofilas se realizó
30
inmediatamente después de la separación de fases, por HPLC de fase reversa de la hipofase o
fracción en metanol.
Cuando las muestras de carotenoides o extractos con carotenoides, (≈12 mL) contenidos en viales
ámbar (para evitar la isomerización trans-cis por la luz directa o radiación UV), no se alcanzaron
a analizar inmediatamente, se almacenaron en un congelador a -30°C, en una atmósfera
completamente inerte (las soluciones fueron burbujeadas con N2 a través de un tubo capilar por
unos minutos). Trazas de oxígeno son suficientes para causar descomposición aún a temperaturas
congelantes.
3.7.1. Separación y determinación de pigmentos del ciclo de las xantofilas por la técnica de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Las separaciones de carotenoides han sido realizadas por HPLC fase normal y HPLC fase
reversa. El HPLC-fase normal incluye fases adsorptivas (como sílice y alúmina) y fases polares
enlazadas (alquilamina, alquilnitrilo, y alquilglicol) conjuntamente con fases móviles no polares,
donde los sitios polares de las moléculas de carotenoides, compiten con solventes por los sitios
adsorptivos en la fase estacionaria. Durante esta forma de cromatografía, los carotenoides menos
polares (hidrocarbonos o carotenos) eluyen primero, mientras los carotenoides oxigenados
(xantofilas) son retenidos más tiempo (Packer, 1992). El HPLC-fase reversa incorpora fases no
polares enlazadas (tal como octyl C8 y octyldecil C18) y fases poliméricas (polistireno-divinil
benceno y polimetacrilato), conjuntamente con fases móviles polares. Los carotenoides se
reparten entre la fase estacionaria no polar y la fase móvil polar. Durante el HPLC-fase reversa,
las xantofilas se reparten más efectivamente en la fase móvil y, por lo tanto, eluyen primero
mientras que los carotenos se reparten preferencialmente en la fase estacionaria y eluyen después
(Packer, 1992). Ambas, HPLC-fase normal y HPLC-fase reversa, pueden ser corridas con el
mismo solvente todo el tiempo (elución isocrática), lo que implica una separación que utiliza un
solo disolvente de composición constante, o con composición cambiante de solvente durante la
corrida (elución en gradiente), que utiliza dos o más disolventes con una polaridad
significativamente distinta, variando la relación de los disolventes en forma programada, ya sea
continuamente o mediante una serie de etapas escalonadas.
31
La columna envasada más comúnmente usada para la separación de carotenoides es
octildecilsilano (ODS o C18). Las razones para la popularidad de empaques C18 incluye
compatibilidad con la mayoría de los solventes, utilidad para el rango total de polaridad de los
carotenoides, y amplia disponibilidad comercial.
Aunque la gran mayoría de métodos de HPLC-fase reversa usan columnas C18, no todos los
empaques C18 son los mismos. Factores tales como tamaño y forma de la partícula, diámetro del
poro, superficie protegida (carbón cargado), “end capping”, y síntesis monomérica vs. polimérica
influencian la separación resultante (Packer, 1992).
Basándonos en lo anteriormente planteado, la separación y determinación de las muestras de
carotenoides (zeaxantina, anteraxantina y violaxantina), fueron realizadas por cromatografía
HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) de fase reversa en una columna Phenomenex Luna 5
μ C18 (250 x 4,60 mm, tamaño de partícula 5 µm) provista de precolumna C18 5 μ para eliminar
materia en suspensión y contaminantes de los disolventes. 50 µL de las muestras (extractos en
metanol) previamente filtradas (filtro de teflón ADVANTEC MFS 0,2 µm), para eliminar
partículas sólidas suspendidas, fueron inyectadas a un flujo de 2,5 mL min-1, controlado por una
bomba peristáltica cuaternaria, a temperatura ambiente y con una longitud de onda de detección a
446 nm utilizando detector UV-visible. La longitud de onda fue elegida de acuerdo a los
espectros de absorción de las muestras y estándares (Fig. 7), medidas en un espectrofotómetro
UV-visible de doble haz (UNICAM UV500) y a la comparación de las alturas, separaciones y
resoluciones de los picos que permitieran una buena identificación y cuantificación de cada una
de las xantofilas en las corridas cromatográficas. Todo esto se realizó teniendo presente las
longitudes de onda señaladas por los fabricantes en el caso de los estándares y de los rangos de
longitudes de onda citadas en referencias bibliográficas, esto es, entre 440-460 nm. Una
separación eficiente, acortando el tiempo de separación, sin sacrificar la resolución de los
primeros picos, se logró usando una gradiente modificada de solventes: acetonitrilo-metanolbuffer Tris HCl 0,1 M pH 8,0 (72:8:3) y metanol-acetato de etilo (68:32) (Thayer & Björkman,
1990; Almela et al., 1990; Gilmore & Yamamoto, 1991; Huck et al., 2000; Polle, et al., 2001).
La mezcla de solventes acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCl 0,1 M pH 8,0, fue corrida
isocráticamente de 0 a 6 min, seguidos por 10 min de un gradiente lineal a 100% de la mezcla de
32
solventes metanol-acetato de etilo y 4 min de corrida isocrática con la última mezcla de
solventes. Entre cada inyección de muestras la columna fue re-equilibrada, con la primera mezcla
de solventes, por un mínimo de 5 min, para eliminar los efectos residuales de la mezcla de
solventes metanol-acetato de etilo.
3.7.2. Identificación de carotenoides del ciclo de las xantofilas
La identificación de los carotenoides del ciclo de las xantofilas se realizó mediante la
comparación de los tiempos de retención de los picos obtenidos para los extractos con los de
estándares puros de zeaxantina, anteraxantina y violaxantina (DHI Water & Environment,
Hørsholm, Dinamarca) en etanol 100% con coeficientes de extinción de 254 L g-1cm-1 a 450 nm,
para zeaxantina, de 235 L g-1cm-1 a 446 nm, para anteraxantina y 255 L g-1cm-1 a 443 nm, en el
caso de violaxantina. Los cromatogramas de los estándares y las muestras fueron obtenidos bajo
exactamente las mismas condiciones de temperatura, gradiente y flujo (Fig. 8).
3.7.3. Cuantificación de los carotenoides del ciclo de las xantofilas
Para cuantificar los picos de los carotenoides identificados se realizó una curva de calibración
con cada uno de los estándares a concentraciones conocidas: zeaxantina 0,09, 0,18, 0,27, 0,36 y
0,45 mg L-1; anteraxantina 0,09, 0,19, 0,28, 0,37 y 0,47 mg L-1; violaxantina 0,22, 0,44, 0,66,
0,88 y 1,10 mg L-1 (Fig. 9) y se obtuvieron las siguientes ecuaciones de las rectas para
FIGURA 7. Espectro de absorción de muestras (extractos en metanol) de tejido foliar de D.
antarctica (A) y estándares etanólicos de xantofilas (violaxantina, anteraxantina y zeaxantina)
(B), empleados en la elección de la longitud de onda, para la detección y cuantificación de las
xantofilas en las muestras por HPLC.
33
calcular las concentraciones de cada pigmento:
Donde A corresponde al área de los picos identificados y C a la concentración.
3.8. Diseño experimental
El diseño experimental fue realizado completamente al azar, utilizando grupos de plantas (45
plantas) NA y A al frío, las que se sometieron a diferentes tiempos de tratamiento e intensidades
lumínicas. Se realizaron dos o tres experimentos con tres réplicas cada uno.
34
Con los resultados obtenidos se realizaron análisis estadísticos con el programa computacional
Sigma Stat 3,0. Con el fin de determinar si las diferencias entre los resultados eran significativas
se realizaron análisis de varianza (ANOVA) de tres y dos factores, considerando el tratamiento,
tiempo de tratamiento e intensidad de flujo fotónico. Con el Test de Tukey se establecieron si las
diferencias entre los promedios eran significativas o no.
FIGURA 8. Cromatograma de carotenoides del ciclo de las xantofilas en extractos de D.
antarctica resueltos por HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa, columna
Phenomenex Luna 5 μ C18 (250 x 4,60 mm, tamaño de partícula 5 µm) provista de precolumna
C18 5 μ, inyectando 50 µL de muestra a un flujo de 2,5 mL min-1, controlado por bomba
peristáltica cuaternaria, longitud de onda 446 nm con detector UV-visible, a temperatura
ambiente, con gradiente de CH3OH: CH3CN: buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 y CH3OH:
CH3COOC2H5. Tiempos de retención: Violaxantina (11,8 min), Anteraxantina (13,3 min),
Zeaxantina (14,3 min).
FIGURA 9. Curvas de calibración de estándares puros de zeaxantina, anteraxantina y
violaxantina, corridos en HPLC fase reversa, de acuerdo a las indicaciones señaladas en el
capitulo de materiales y métodos.
35
36
4. RESULTADOS
4.1. Parámetros de fluorescencia del PSII
Salvo algunas excepciones, no se presentaron diferencias significativas (P<0,05) entre las
variaciones de fluorescencia inicial (Fo), la fluorescencia máxima (Fm) y fluorescencia variable
(Fv) de las plantas NA y A a las diferentes intensidades lumínicas y tiempos (Fig. 10). En las
plantas NA se encontraron diferencias entre el Fo del inicio y del final del experimento, sólo a los
200 y 600 µmol m-2s-1, y a las 24 horas entre los Fo medidos a 1000 y 600 µmol m-2s-1. En las
plantas A a 200 y 600 µmol m-2s-1, la Fm aumentó significativamente (P<0,05) al final del
tratamiento, siendo mayor el aumento a la menor intensidad lumínica. A la mayor intensidad
lumínica, se advirtió un curso bastante fluctuante de las Fm, que alcanzó valores mínimos a las
12 y 24 horas de tratamiento. Tendencias similares a Fm presentaron las Fv de las plantas A,
siendo por lo general mayores a 200 µmol m-2s-1 y menores a 1000 µmol m-2s-1. Cabe destacar
que los valores de Fv fueron más altos en las A que en las NA.
La eficiencia fotoquímica máxima (Fv/Fm) (Fig. 11) no presentó diferencias significativas entre
plantas NA y A (P>0,05). Los valores se ubicaron entre los rangos de 0,83-0,71 en plantas NA y
0,83-0,75 en plantas A. Plantas A y NA presentaron un mayor descenso de los Fv/Fm a mayor
intensidad lumínica a los diferentes tiempos de tratamiento, en comparación con plantas
sometidas a las menores intensidades, siendo este descenso más marcado, pero no
estadísticamente significativo, en las plantas NA que en las A.
El coeficiente de apagamiento fotoquímico (qP), -que da cuenta de la transformación de la
energía en el PSII y la cadena transportadora de electrones en el proceso fotoquímico-, de las
plantas NA a diferentes PFDs presentaron un curso irregular durante el tratamiento, alcanzándose
al término de éste, valores muy similares entre ellos (Fig. 11). Estos valores no fueron
estadísticamente significativos con respecto al valor inicial. Plantas A presentaron qP menores
que los de las plantas NA al principio (0 y 6 horas) del tratamiento, a las tres intensidades de luz
37
utilizadas (P<0,05), aumentando a partir de las 12 horas, pero sin manifestar diferencias
significativas (P>0,05) entre los diferentes rangos lumínicos. En plantas A a la mayor PFD, un
ascenso de los qP se correlacionó significativamente con un descenso de los Fv/Fm (r = -0,89;
P<0,05).
El coeficiente de apagamiento no fotoquímico (qNP), -que indica la disipación de energía como
calor o energía de transferencia-, presentó valores considerablemente más altos en las plantas A
al frío, con relación a las NA (Fig. 11). El rendimiento cuántico efectivo del PSII (ФPSII), fue
más estable y en general más bajo en las plantas A al frío que en las plantas NA (Fig. 12). En
ambos grupos de plantas el mayor ФPSII se obtuvo a la menor PFD utilizada. Tanto en plantas A
como NA, el ФPSII se correlacionó positivamente con los Fv/Fm, en cada una de las PFDs
empleadas.
La velocidad relativa de transporte de electrones (rETR) fue generalmente más alta en las plantas
A al frío, en comparación con las plantas NA aclimatadas a todos los niveles de luz empleados
(Fig. 12), siendo en ambos casos muy fluctuante.
4.2. Contenido hídrico
El contenido hídrico de las plantas NA a 200 µmol m-2s-1, sólo presentó diferencias
estadísticamente significativas (P<0,05), entre los valores obtenidos a las 6 y 12 horas (valores
más altos) del tratamiento con respecto al de 0 horas (Tabla 1). A una PFD de 1000 µmol m -2s-1,
los contenidos hídricos mayores se presentaron a las 18 y 12 horas respectivamente, los que se
diferenciaron significativamente (P<0,05) de los menores contenidos hídricos obtenidos en los
otros tiempos. Plantas A a la menor PFD, presentaron por lo general mayores contenidos hídricos
que las plantas A a intensidades mayores, habiéndose encontrado diferencias estadísticamente
significativas entre los 200 y 600 µmol m-2s-1, al tiempo de 12 horas y entre los 200 y 1000 µmol
m-2s-1 a las 12 horas. Contenidos hídricos de plantas A y NA fueron diferentes entre sí (P<0,05) a
las 6, 12 y 24 horas, del tratamiento de iluminación a 200 µmol m-2s-1; a las 6 horas con la
intensidad lumínica de 600 µmol m-2s-1; y a las 6, 12, 18 y 24 horas a 1000 µmol m-2s-1 de
intensidad de luz (Tabla 1).
38
4.3. Pigmentos foliares
Los contenidos en Chl a de las plantas A a una misma PFD fueron muy similares en cada uno de
los tiempos, mientras que los contenidos Chl b presentaron diferencias estadísticamente
significativas (P<0,05) sólo entre las 18 horas y las 0, 12 y 24 horas a la mayor intensidad
lumínica empleada (1000 µmol m-2s-1). En las plantas NA existieron diferencias entre los
contenidos en Chl a medidos en los tiempos (0 y 12 horas) a la intensidad lumínica de 200 µmol
m-2s-1. Con respecto a Chl b hubo diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las 12
horas y el control, y entre las 24 horas con el control a 200 y 600 µmol m-2s-1 respectivamente
(Tabla 2). No hubo diferencias significativas en las concentraciones de Chl a de plantas NA y A a
diferentes PFDs, a excepción de las plantas sometidas a 200 µmol m-2s-1 durante 6-12 horas, y
600 µmol m-2s-1 a las 24 horas de tratamiento (P<0,05) (Tabla 2).
Las concentraciones de clorofilas totales de plantas NA con respecto al control, no presentaron
por lo general, diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) entre las intensidades de luz y
tiempos empleados en el tratamiento, salvo a las 12 horas a una intensidad lumínica de 200 µmol
m-2s-1 (Fig. 13).
FIGURA 10. Parámetros de fluorescencia de la clorofila a del PSII (Fo, Fm y Fv) de plantas de
D. antarctica, crecidas durante 21 días a 13±1,5ºC (NA) y a 4±1,5ºC (A) con una intensidad
lumínica de ≈180 µmol m-2s-1 y sometidas a la acción simultánea de estrés frío y lumínico (a
intensidades de flujo fotónico de 200, 600 y 1000 µmol m-2s-1).
39
FIGURA 11. Parámetros de fluorescencia de la clorofila a del PSII (Fv/Fm, qP y qNP) de
plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío. Sometidas a condiciones
de estrés frío e intensidades de flujo fotónico de 200, 600 y 1000 µmol m-2s-1.
40
FIGURA 12. Parámetros de fluorescencia de la clorofila a del PSII (ФPSII, rETR) de plantas de
D. antarctica no aclimatadas (NA) y aclimatadas al frío (A). Sometidas a condiciones de estrés
frío e intensidades de flujo fotónico de 200, 600 y 1000 µmol m-2s-1.
41
TABLA 1.
Contenido hídrico (%) en plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y
aclimatadas (A) al frío. Las letras mayúsculas distintas indican diferencias estadísticamente
significativas (P<0,05) entre las intensidades lumínicas del tratamiento, a un mismo tiempo; las
letras minúsculas diferentes señalan diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos
del tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas
entre plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios
de dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar.
Intensidad de luz
(µmol m-2s-1)
200
Tiempo
(h)
0
6
12
18
Contenido hídrico
(%)
NA
69,83±0,93 a
73,50±0,50 b*
73,21±0,60 Ab*
71,50±0,50 Aab
A
68,94±1,16 a
70,00±1,00 a
71,00±0,00 Aa
70,50±1,50 a
42
600
1000
24
0
6
12
18
24
0
6
12
18
24
70,50±0,50 ab*
69,83±0,93 a
70,50±0,50 a*
68,75±0,00 Ba
69,00±2,00 Ba
70,71±0,71 a
69,83±0,93 a
72,00±0,00 ba*
74,00±0,00 Abc*
74,50±0,50 Cc*
70,50±0,50 a*
68,18±0,65 a
68,94±1,16 a
67,00±0,00 a
67,50±0,50 Ba
68,50±0,50 a
68,50±0,50 a
68,94±1,16 ab
69,50±0,50 bc
67,00±0,00 Bad
71,50±0,50 c
66,28±1,16 d
Los contenidos en clorofila total de plantas A al frío y sometidos a la mayor intensidad lumínica,
presentaron un curso fluctuante especialmente a los 1000 µmol m-2s-1, sin presentar diferencias
significativas (P>0,05) a las 12, 18 y 24 horas respectivamente, evidenciando los valores más
bajos al final del tratamiento (Fig. 13). Diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) en los
contenidos de clorofilas totales entre las plantas NA y A, fueron observados a las 6 y 12 horas a
la intensidad de luz de 600 µmol m-2s-1, y a 24 horas del tratamiento fotoinhibitorio a 600 µmol
m-2s-1. En la misma figura se observa, que los contenidos en carotenoides totales de las plantas A
y NA fueron prácticamente iguales a las tres intensidades de flujo fotónico utilizadas.
El cuociente Chl a/Chl b no presentó diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) en las
plantas NA, a ninguna intensidad lumínica (Tabla 3). En las plantas A esta razón solamente tuvo
diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las 6 y 18 horas; 6 y 24 horas a 600
µmol m-2s-1 de intensidad lumínica. Chl a/Chl b sólo presentó cambios estadísticamente
significativos (P<0,05) entre los dos grupos de plantas (A y NA) a las 24 horas a 200 µmol m-2s-1
y transcurridas 12 horas del tratamiento fotoinhibitorio a la máxima intensidad lumínica de 1000
µmol m-2s-1 (Tabla 3).
La relación (Chl a+Chl b)/Car de las plantas NA fue significativamente mayor (P<0,05) que la de
las A, las tres PFDs utilizadas, exceptuándose las 18 horas a 1000 µmol m -2s-1 (Tabla 3). Plantas
NA a las diferentes intensidades lumínicas no mostraron en general, diferencias estadísticamente
significativas en los diferentes tiempos empleados, a excepción de la mayor intensidad lumínica
utilizada en que hubo diferencias entre las 6 y 24 horas (P<0,05). En cambio, las plantas A
43
mostraron diferencias significativas a 200 µmol m-2s-1 entre las 0 y 12 y entre 12 y 24 h. A la
intensidad lumínica intermedia se detectaron diferencias entre 0, 12 y 18 horas y a la máxima
intensidad las diferencias significativas (P<0,05) se obtuvieron entre los dos primeros tiempos (0
y 6) y los tiempos restantes. También fueron significativamente diferentes los cuocientes
obtenidos a las 12 y 24 horas con respecto a las 18 horas.
4.4. Ciclo de las xantofilas
En las plantas NA a la intensidad de luz intermedia (600 µmol m-2s-1), el nivel de zeaxantina
aumentó, con respecto al control, desde las 6 hasta las 24 horas, mientras que a la mayor
intensidad lumínica (1000 µmol m-2s-1), este aumento se estabilizó a las 12 horas de iluminación
(Fig. 14). A 200 µmol m-2s-1 y a las 12 horas de iluminación se detectó un aumento de los niveles
de zeaxantina, con respecto al control, el que fue seguido de un posterior descenso. Hubo
diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) en los contenidos en zeaxantina obtenidos a
las 24 y 12 horas, con respecto al control, a PFDs de 1000 y 600 µmol m-2s-1. Durante el
tratamiento fotoinhibitorio, las concentraciones de violaxantina de las plantas NA, fueron en
general, las mayores de los tres carotenoides investigados, en especial a las últimas horas de
tratamiento.
Plantas A presentaron casi siempre niveles más altos de zeaxantina las NA (Fig. 14). Altos
valores de zeaxantina, con respecto a los controles, se obtuvieron en la plantas A a la mayor
intensidad lumínica, ya en las primeras 6 horas de impuesto el estrés, en que los valores del
pigmento prácticamente se duplicaron, manteniéndose hasta las 12 horas, para descender
paulatinamente hasta las 24 horas (P<0,05), en que se obtuvieron concentraciones similares al
control. También se detectó un aumento significativo (P<0,05) en las concentraciones de
zeaxantina en las horas finales del tratamiento (18 y 24 horas) a una intensidad lumínica de 200
µmol m-2s-1, en relación al inicio del tratamiento.
TABLA 2. Concentración de clorofila a (Chl a) y clorofila b (Chl b) en muestras no aclimatadas
(NA) y aclimatadas (A) al frío de D. antarctica. Las letras minúsculas diferentes señalan
44
diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos del tratamiento a una misma
intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas entre plantas NA y A a un
determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios de dos experimentos
individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar.
Intensidad de luz
(µmol m-2s-1)
Tiempo
(h)
200
0
6
12
18
24
0
6
12
18
24
0
6
12
18
24
600
1000
Chl a
(mg g PS)
(mg g-1PS)
NA
A
5,80±0,86 a
5,61±0,47 a
7,86±1,12 ab*
5,74±0,43 a
8,70±0,14 b*
6,64±0,34 a
6,95±0,57 ab
6,12±0,34 a
7,46±0,19 ab
5,97±0,48 a
5,80±0,86 a
5,61±0,47 a
5,99±0,75 a
4,28±0,12 a
5,94±0,97 a
4,87±0,35 a
7,18±1,14 a
5,53±0,47 a
8,31±0,11 a*
5,06±0,67 a
5,80±0,86 a
5,61±0,47 a
6,79±1,77 a
6,39±0,30 a
7,73±1,12 a
4,74±0,24 a
6,99±1,29 a
8,99±0,92 a
7,27±0,48 a
4,31±0,50 a
-1
Chl b
(mg g PS)
(mg g-1PS)
NA
A
2,24±0,34 a
2,27±0,14 a
3,12±0,41 ab*
2,40±0,12 a
3,49±0,06 b*
2,83±0,13 a
2,83±0,26 ab
2,62±0,13 a
2,96±0,11 ab
2,55±0,17 a
2,24±0,34 a
2,27±0,14 a
2,53±0,29 ab
1,93±0,09 a
2,37±0,42 ab
1,97±0,14 a
2,78±0,42 ab
2,07±0,19 a
3,38±0,05 b*
1,95±0,25 a
2,24±0,34 a
2,27±0,14 a
2,53±0,59 a
2,55±0,17 ba
2,87±0,38 a
1,91±0,06 a
2,79±0,51 a
3,73±0,34 b
2,81±0,18 a*
1,63±0,18 a
-1
FIGURA 13. Concentración de clorofilas y carotenoides totales de muestras obtenidas a partir de
tejido foliar de plantas no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío de D. antarctica a
diferentes PFDs. Los valores son promedios de dos experimentos con tres replicas cada uno ± su
error medio estándar.
45
TABLA 3. Relación clorofila a clorofila b Chl a/Chl b y relación clorofilas totales carotenoides
totales Chl a+Chl b/Car en muestras no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío de D.
antarctica. Las letras mayúsculas distintas indican diferencias estadísticamente significativas
(P<0,05) entre las intensidades lumínicas del tratamiento, a un mismo tiempo; las letras
minúsculas diferentes señalan diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos del
tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas entre
plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios de
dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar.
Intensidad de luz
(µmol m-2s-1)
Tiempo
(h)
NA
Chl a/Chl b
A
200
0
6
12
2,60±0,01 a
2,52±0,04 a
2,49±0,02 a
2,45±0,09 a
2,39±0,08 a
2,34±0,04 a
Chl a+Chl b/Car
NA
A
4,92±0,07 a*
5,21±0,06 a*
5,18±0,13 a*
4,43±0,07 a
4,60±0,06 ab
4,79±0,03 Ab
46
600
1000
18
24
0
6
12
18
24
0
6
12
18
24
2,46±0,02 a
2,52±0,08 a*
2,60±0,01 a
2,36±0,10 a
2,53±0,05 a
2,58±0,03 a
2,46±0,01 a
2,60±0,01 a
2,64±0,11 a
2,68±0,05 a*
2,51±0,02 a
2,59±0,02 a
2,33±0,06 a
2,34±0,04 a
2,45±0,09 ab
2,23±0,04 b
2,48±0,16 ab
2,67±0,02 a
2,59±0,05 a
2,45±0,09 a
2,52±0,05 a
2,47±0,05 a
2,41±0,03 a
2,63±0,04 a
4,88±0,14 a*
4,89±0,04 a*
4,92±0,07 a*
4,91±0,08 a*
4,84±0,17 a*
4,74±0,02 a*
4,99±0,04 a*
4,92±0,07 ab*
5,02±0,03 a*
4,94±0,05 ab*
4,88±0,12 ab
4,60±0,04 b*
4,48±0,03 Aab
4,45±0,07 Aa
4,43±0,07 a
4,20±0,22 ab
3,87±0,04 Bb
3,87±0,14 Bb
4,05±0,21 Bab
4,43±0,07 a
4,38±0,08 a
3,98±0,05 Bb
5,05±0,17 Cc
3,83±0,07 Bb
Cabe destacar que los mayores contenidos de zeaxantina encontrados en las plantas A a la mayor
intensidad lumínica, en casi todos los tiempos de tratamiento, se correspondieron con un
descenso significativo en los niveles de violaxantina (r = -0,6; P<0,05) a diferencia de lo ocurrido
en las plantas NA en que la correlación entre estos compuestos fue significativamente positiva (r
= 0,7; P<0,05). Los niveles del intermediario anteraxantina, en general, fueron muy similares en
los grupos de plantas A y NA (Fig. 14). La comparación entre los grupos de plantas
experimentales permite establecer que sólo en plantas NA y a 200 µmol m-2s-1, anteraxantina
presentó un aumento de sus concentraciones al final del tratamiento (24 horas).
En plantas NA, violaxantina presentó un aumento en su concentración a partir de las 6 horas de
tratamiento a 200 µmol m-2s-1 hasta las 18 horas, disminuyendo a las 24 horas. A 600 µmol m-2s1
, las plantas NA aumentaron sus concentraciones de violaxantina (P<0,05) desde las 12 horas
hasta las 24 horas de irradiación, en que se obtuvieron valores altos con relación al control. La
concentración de este carotenoide a la mayor intensidad lumínica del tratamiento, aumentó desde
las 12 a 18 horas, con una leve disminución a las 24 horas, en comparación con la concentración
obtenida a las 18 horas. Al comparar las concentraciones de violaxantina obtenidas a las tres
intensidades lumínicas en las plantas NA, se advierte una mayor concentración a las 18 horas a
las tres intensidades utilizadas y a las 24 horas a las intensidades de 600 y 1000 µmol m-2s-1.
Durante el tratamiento fotoinhibitorio con la intensidad de luz más alta, se observó un marcado
aumento en la concentración de violaxantina a las 18 horas, en que se obtuvo el valor más alto, el
que disminuyó posteriormente (24 horas). La concentración de este pigmento fue mayor en las
plantas NA que en las A entre las 6 a 24 horas de tratamiento lumínico. Al respecto, debe tenerse
47
en cuenta, lo señalado más arriba, respecto a la disminución significativa de violaxantina
concomitante con un aumento de zeaxantina.
Las xantofilas totales, zeaxantina + anteraxantina + violaxantina (Z+A+V) de las plantas NA no
presentaron diferencias significativas (P>0,05), entre las intensidades lumínicas usadas en el
tratamiento fotoinhibitorio a un mismo mismo tiempo, pero sí con respecto a diferentes tiempos.
Es así que en comparación al control, se detectaron aumentos a las 12, 18 y 24 horas, a 200 y
1000 µmol m-2s-1 y a las 18 y 24 horas a 600 µmol m-2s-1 (Tabla 4). Las plantas A presentaron
diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre los 200 µmol m-2s-1 y las otras
intensidades lumínicas empleadas a las 24 horas de tratamiento. A la menor intensidad lumínica,
las xantofilas totales de plantas A presentaron un leve aumento a las 18 horas, el que se mantuvo
estable hasta las 24 horas. A los 1000 µmol m-2s-1, se observó un aumento de este pigmento a las
12 horas, el cual evidenció una brusca caída a las 18 y 24 (Tabla 4). Diferencias significativas
entre las xantofilas totales de las plantas NA y A se encontraron sólo en el tiempo 0 a los tres
PFD empleados y a las 6 horas de iluminación a la intensidad de luz intermedia.
La razón de violaxantina a xantofilas totales V/(Z+A+V) de las plantas NA presentó un
transcurso diferente a la menor intensidad de luz con respecto a la intensidad intermedia y mayor.
Mientras que a 200 µmol m-2s-1, se presentó un aumento significativo con respecto al control, a
las 18 horas (P<0,05), a 600 y 1000 µmol m-2s-1 se detectó un descenso estadísticamente
significativo a las 6 horas (P<0,05) de tratamiento y luego un ascenso (Fig. 15). En las plantas A
esta razón presentó una disminución con respecto al control, a las tres intensidades de luz
empleadas, siendo estadísticamente significativas (P<0,05) a partir de las 12 horas a 200 µmol m2 -1
s ; desde las 6 horas a 600 y 1000 µmol m-2s-1, encontrándose los valores más bajos a la mayor
intensidad lumínica del tratamiento fotoinhibitorio. Esto es consistente con el aumento de
zeaxantina concomitante a la disminución de violaxantina encontrado a esta intesidad lumínica y
al que nos hemos referido anteriormente. Los menores valores V/(V+A+Z) se encontraron en
plantas A a la mayor intensidad lumínica utilizada.
El nivel o estado de de-epoxidación del ciclo de las xantofilas (Z+A)/(Z+A+V) indica la
eficiencia en la formación de zeaxantina, por la acción de la enzima violaxantina de-epoxidasa, a
partir de violaxantina, pasando por el intermediario anteraxantina. Presentó un curso fluctuante a
48
las tres intensidades lumínicas empleadas en las plantas NA, encontrándose un aumento
estadísticamente significativo (P<0,05) con respecto al control a las 6 horas, el cual disminuye y
se mantiene estable desde las 12 a 24 horas, a las intensidades de 600 y 1000 µmol m -2s-1. A 200
µmol m-2s-1 los valores experimentaron aumentos estadísticamente significativos (P<0,05) a las
12 y 24 horas, y una disminución a las 18 horas, con respecto al control (Fig. 15). Los cambios
más evidentes del nivel de de-epoxidación se obtuvieron en las plantas A a la máxima intensidad
lumínica, en que a partir de las 6 horas y hasta el final del experimento se produjo un aumento
significativo de este cuociente. Estos cambios coincidieron con descensos del cuociente
V/(V+A+Z) (P<0,05). A las intensidades de 200 y 600 µmol m-2s-1 el nivel de de-epoxidación se
mantuvo constante desde las 0 a 18 horas, aumentando a las 24 horas del tratamiento (Fig. 15).
Cabe destacar que al final del experimento el estado de de-epoxidación de las plantas NA fue
menor que el de las A (P<0,05) a las tres intensidades de luz aplicadas en la cinética de
fotoinhibición. Nótese que el alto nivel de de-epoxidación encontrado a partir de las 6 horas a la
máxima intensidad lumínica coincide con un incremento en zeaxantina y descenso de
violaxantina.
FIGURA 14. Concentración de zeaxantina, anteraxantina y violaxantina de plantas no
aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío de D. antarctica, sometidas a diferentes densidades de
flujo fotónico durante 24 horas. Las letras mayúsculas distintas indican diferencias
estadísticamente significativas (P<0,05) entre las intensidades lumínicas del tratamiento, a un
mismo tiempo; las letras minúsculas diferentes señalan diferencias estadísticamente significativas
entre los tiempos del tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias
estadísticamente significativas entre plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad
lumínica. Los valores son promedios de dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno
± su error medio estándar.
49
TABLA 4. Xantofilas totales (Z+A+V) en plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y
aclimatadas (A). Las letras mayúsculas distintas indican diferencias estadísticamente
significativas (P<0,05) entre las intensidades lumínicas del tratamiento, a un mismo tiempo; las
letras minúsculas diferentes señalan diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos
del tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas
entre plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios
de dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar.
50
Intensidad de luz
(µmol m-2s-1)
Tiempo
(h)
200
0
6
12
18
24
0
6
12
18
24
0
6
12
18
24
600
1000
Xantofilas totales
(µg g-1PS)
NA
70,59±1,76 a
80,61±0,39 ab
100,55±0,73 b
108,80±0,57 b
109,05±1,68 b
70,59±1,76 a
68,74±0,49 a
91,26±0,49 ab
117,49±0,73 b
118,04±0,57 b*
70,59±1,76 a
94,40±1,15 ab
104,75±1,52 b
122,26±0,35 b*
119,27±0,58 b*
A
107,34±1,11 ab*
89,17±1,05 b
108,42±1,02 ab
122,22±0,63 a
121,43±4,25 Aa
107,34±1,11 a*
93,77±0,55 a*
103,39±1,91 a
109,92±1,11 a
83,26±3,75 Ba
107,34±1,11 a*
106,25±1,92 a
113,31±0,89 a
94,99±0,11 ab
70,43±2,19 Bb
FIGURA 15. Nivel de de-epoxidación (Z+A)/(Z+A+V) y razón de violaxantina a xantófilas
totales: V/(Z+A+V) de plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío,
sometidas a condiciones de estrés frío y lumínico durante 24 horas.
51
52
5. DISCUSION
Con la presente tesis se pretendía establecer si el efecto combinado de una alta intensidad
lumínica y baja temperatura producía efectos fotoinhibitorios del aparato fotosintético, en plantas
de la Gramínea D. antarctica, evidenciados por cambios en la emisión de fluorescencia de la
clorofila a del PSII. Asimismo, se deseaba establecer si una aclimatación previa al frío mejoraba
la respuesta del PSII a estos factores y si había indicios de fotoprotección del PSII que estuviesen
mediados por el ciclo de las xantofilas.
La eficiencia fotoquímica máxima (Fv/Fm), indicadora del rendimiento cuántico máximo del
PSII, de plantas A y NA a los dos menores niveles de intensidad lumínica utilizados, presentó
valores indicadores de un óptimo estado fisiológico (≈0,83) (Björkman & Demmig, 1987;
Johnson et al., 1993; Maxwell & Johnson, 2000). Estos experimentaron un descenso, (≈0,71) a la
mayor intensidad lumínica y al mayor tiempo de exposición a la luz, el que fue más marcado en
las plantas NA (12,4% con respecto al control), que en las A (7% con respecto al control).
Dependiendo de los rangos de los valores de Fv/Fm que se acepten como normales, la
apreciación sobre la presencia o ausencia de fotoinhibición a la mayor intensidad lumínica es
variable. Si además del valor de alrededor 0,83, que los autores recién indicados consideran como
normal para plantas no fotoinhibidas ante algún estrés, nos remitimos al reporte de Somersalo &
Krause (1989), que considera valores de Fv/Fm por debajo de 0,7 como indicadores de
fotoinhibición, ninguna de las intensidades lumínicas utilizadas en nuestro estudio, podría ser
considerada como fotoinhibitoria. En un intento de compatibilizar estas dos opiniones, hemos
optado por considerar que sólo en las plantas NA a la mayor intensidad lumínica y al final del
tratamiento se podría asumir un comienzo de fotoinbición, ya que Fv/Fm se sitúo el límite (0,71),
a partir del cual se puede asumir este proceso. Este descenso sería más bien sugerente de una
desestabilización del fotosistema II, la que fue más marcada en las plantas NA que en las A. Por
lo tanto, el tratamiento frío, fue favorable para mantener una mayor estabilidad del PSII ante una
alta intensidad de luz. Estos resultados coinciden con los de (Somersalo & Krause, 1989, 1990a,
1990b; Huner et al., 1993; Gray et al., 1994), quienes han encontrado que hojas de espinaca
53
(Spinacia oleracea) aclimatadas al frío y expuestas a una alta luminosidad, exhiben una mayor
capacidad de tolerar una alta luminosidad, en relación con las no aclimatadas.
La resistencia a la fotoinhibición de D. antarctica ante el efecto combinado de frío y alta
luminosidad se corresponde con la capacidad de tolerancia a la congelación que posee esta
especie (Bravo et al., 2001). Este comportamiento es comparable al que exhiben los cereales de
invierno (trigo y centeno) altamente resistentes a la congelación (Öquist et al., 1993), lo que sería
un reflejo de la capacidad de mantener las QA oxidadas bajo alta irradiancia y baja temperatura
(Huner et al., 1996). Diferente es lo que ocurre con algunas plantas leñosas, como el pino
aclimatado al frío, en que a pesar de la alta resistencia a la congelación se presenta fotoinhibición
ante condiciones de alta luminosidad y frío.
Coincidente con la mayor disminución de la eficiencia fotosintética máxima a 1000 µmol m-2s-1,
en plantas NA y A, de D. antarctica, con respecto a sus controles, se presentaron casi siempre
mayores Fo que los obtenidos a las menores intensidades lumínicas, no habiendo diferencias
importantes entre los valores de ningún grupo de plantas, lo que indica que con respecto a este
factor, no es posible predecir un efecto negativo de la mayor intensidad lumínica sobre el aparato
fotosintético. Además, las diferencias de Fo en los distintos niveles lumínicos y tiempos
utilizados fueron casi siempre no significativas. Un ascenso de Fo, que refleja reducción de las
QA, ha sido relacionado con una disminución de la eficiencia fotosintética en muchas plantas
(Krause & Weiss, 1984). Comparativamente, la emisión de Fm fue mayor en plantas A que NA a
las tres densidades de flujo fotónico utilizadas, lo que estaría indicando una mayor resistencia a la
fotoinhibición de las plantas A, con respecto a las NA, bajo las condiciones de estrés empleadas,
lo que es coincidente con lo reportado por Gilmore et al., (1996); Müller et al., (2001).
La no existencia de una disminución significativa de Fv, en las plantas NA y A a la mayor
intensidad lumínica, durante el transcurso del experimento, con respecto al inicio, hace también
pensar que no habría daño del aparato fotosintético, a esta intensidad de radiación. Un
decrecimiento drástico de Fv puede estar asociado con daños en el sistema en el que ocurre la
fotólisis del agua (Brüggemann & Linger, 1994). Por lo tanto, ambos grupos de plantas bajo estas
condiciones no son fotoinhibidas. Sin embargo, la emisión de Fv algo mayor en el grupo de
54
plantas A al frío que en las NA, sugeriría la presencia de un mecanismo fotoprotector más
eficiente en el primer grupo de plantas.
En cada nivel de luz empleado, la eficiencia fotoquímica máxima (Fv/Fm) de plantas NA y A se
asoció positivamente con el rendimiento cuántico efectivo del PSII (ФPSII) (r = 0,57-0,96), lo
que estaría también apoyando que esta especie no se fotoinhibiría a ninguna de las intensidades
lumínicas utilizadas y que por lo tanto, la vía fotoquímica estaría transcurriendo favorablemente,
ya que los electrones serían transportados para favorecer la reducción del CO2 y por ende la
fotosíntesis (Maxwell & Johnson, 2000).
El aumento del qNP de plantas A con respecto a las NA, podría asociarse a una disipación más
eficiente del exceso de energía lumínica absorbida como calor, proceso que se efectúa en el
ensamblaje de la antena del PSII (Demmig et al., 1988; Demmig-Adams et al., 1996; Ort, 2001;
Govindjee, 2002; Elrad et al., 2002). Debido a que las xantofilas juegan un rol muy importante en
el proceso de disipación de la energía térmica a nivel de la antena del PSII, se hicieron
mediciones del pool de pigmentos de las xantofilas, para evidenciar su interconversión y su
participación en la fotoprotección de la especie en estudio. El análisis global de los resultados,
permite establecer que sólo en plantas A al frío y bajo el efecto combinado de baja temperatura y
la más alta luminosidad, se pudo advertir un ascenso de zeaxantina a expensas de la disminución
de violaxantina (P<0,05), tal como ocurre en plantas que poseen una eficiente capacidad de
disipar energía por la vía del ciclo de las xantofilas (Govindjee, 2002). Habría sido esperable que
este grupo de plantas tuviesen a la máxima intensidad lumínica, los valores más altos de qNP. Sin
embargo, estos fuerom muy similares a los de las plantas sometidas a menores niveles de luz,
siendo todos ellos visiblemente mayores que los obtenidos en las plantas NA. En general, se
considera que la magnitud del qNP en plantas está estrechamente correlacionada con los niveles
de zeaxantina formados en el ciclo de xantofilas (Demmig-Adams & Adams, 1996), aún cuando
existen excepciones. Es así, que en mutantes de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (npq1),
incapaces de convertir violaxantina en zeaxantina, en presencia de un exceso de luz, por
mutación recesiva del gen que codifica para la enzima violaxantina de-epoxidasa, se ha
encontrado un qNP residual, que podría ser debido a niveles bajos, pero persistentes de
anteraxantina y zeaxantina (Niyogi et al., 1998; Niyogi, 1999). Estudios con tilacoides aislados
55
han sugerido que la zeaxantina amplifica el qNP en un cierto rango de pH, pero que la pH es
todo lo que se requiere para producir el qNP (Noctor et al., 1991). Sin embargo, no estamos en
condiciones de responder con este estudio esa interrogante. Por otro lado, en mutantes del alga
verde unicelular, Chlamydomonas reinhardtii (npq1), incapaces de de-epoxidar violaxantina a
zeaxantina, se ha demostrado que el “quenching” no fotoquímico es sólo parcialmente defectivo
en esta especie, lo que indicaría que no todo este “quenching” depende de la operatividad del
ciclo de las xantofilas, sugiriéndose un posible rol de la luteína, que es la xantofila más abundante
del tilacoide, en el qNP (Niyogi et al., 1997). La comparación de los resultados del alga
Chlamydomonas con los del mutante de Arabidopsis, (Arabidopsis npq1), y un mutante de esta
misma especie (npq2) que acumula zeaxantina constitutivamente, han demostrado que en este
último mutante no se altera la magnitud de qNP, mientras que en el mutante npq1 el qNP es bajo.
Esto demuestra que en Arabidopsis la de-epoxidación de la violaxantina es requerida para la
magnitud alcanzada por el qNP ante una alta intensidad lumínica (Niyogi et al., 1998). Estos
resultados junto a otros reportes (Johnson et al., 1994) proporcionan evidencias inequívocas
sobre la participación de la enzima violaxantina de-epoxidasa en el “quenching” no fotoquímico,
aunque diferentes eucariotes fotosintéticos utilicen el ciclo de las xantofilas en diferente grado,
para la disipación del exceso de energía lumínica absorvida.
En nuestro estudio, la acumulación de zeaxantina expresada como tal y en altos niveles de deepoxidación, sólo en las plantas A a la mayor intensidad de luz y en presencia de baja
temperatura (Figs. 14 y 15), podría interpretarse como una respuesta adaptativa al frío
(aclimatación), inducida por el efecto combinado de estos factores de estrés. Aún cuando se
conoce que la conversión de violaxantina a anteraxantina y zeaxantina ocurre lentamente a bajas
temperaturas en muchas plantas, como por ejemplo espinaca (AdamsIII et al., 1995b), no es
menos cierto que la previa aclimatación al frío favorece una rápida formación de zeaxantina a
temperaturas de enfriamiento (Demmig-Adams et al., 1989). Si tenemos en cuenta, que la deepoxidación de la violaxatina a zeaxantina ocurre sólo ante un “exceso” de luz, que no es el
mismo para cada planta (Fryer et al., 1995; Adams III et al., 1995), la máxima intensidad de luz
utilizada en nuestro estudio (1000 µmol m-2s-1), podría constituir el “exceso” de luz necesaria
para gatillar la reacción, pero sólo en plantas aclimatadas al frío y sometidas posteriormente al
efecto combinado de alta intensidad lumínica y baja temperatura. Las intensidades de luz
56
menores no serían capaces de provocar un aumento de zeaxantina, pues talvez no representan el
“exceso” de luz necesario para provocar fotoinhibición y por ende la puesta en marcha del
mecanismo de disipación del exceso de energía, via acumulación de zeaxantina. Todo esto parece
lógico si se tienen presente las condiciones ambientales (bajas temperaturas y alta intensidad
lumínica) a que está sometida esta planta en su ambiente natural (Antártida) durante el período de
crecimiento (Alberdi et al., 2002). A este punto nos referiremos más adelante.
La estabilidad del aparato fotosintético de D. antarctica ante el efecto combinado de una baja
temperatura y alta intensidad lumínica, evidenciada por nuestros resultados, es concordante con
mediciones de la fotosíntesis relizadas en esta especie in situ (Xiong et al., 1999; Xiong et al.,
2000). Estos investigadores han reportado que la fotosíntesis no es afectada por una alta
intensidad lumínica, pero sí por una alta temperatura. Ellos encontraron tasas de fotosíntesis neta
altas (2,6 µmol CO2 m-2s-1) en días de temperaturas inferiores a 10ºC en que las intensidades
lumínicas, radiación fotosintéticamente activa (PAR) fueron superiores a 500 µmol m-2s-1,
superando a veces 1500 µmol m-2s-1, mientras que en días con temperaturas >20ºC y PAR de
alrededor 1500 µmol m-2s-1 la fotosíntesis fue de 0,2 µmol CO2 m-2s-1. La mayor vulnerabilidad
de la fotosíntesis de plantas de regiones frías, a temperaturas moderadamente altas pareciera no
estar aún totalmente dilucidada, aunque se ha sugerido que por lo menos, en líquenes esto cursa
con un ascenso de la respiración (Kappen, 2000; Alberdi et al., 2002). También podría asumirse
una disminución de actividad de enzimas claves del ciclo de Calvin (Xiong et al., 1999). Sin
embargo, la mantención de una adecuada eficiencia fotosintética a temperaturas relativamente
bajas y altas intensidades lumínicas, podría residir, por lo menos en parte, en la alta estabilidad
del PSII (fase fotoquímica primaria de la fotosíntesis) ante estos factores como se demuestra en
este estudio para D. antarctica.
Especial interés para explicar la operatividad del proceso fotosintético, de esta especie en el
ambiente natural, ante condiciones de temperaturas moderadamente bajas y alta luminosidad,
proporcionan nuestros resultados, de acuerdo a los cuales, la posibilidad de poner en marcha el
ciclo de las xantofilas a una intensidad lumínica alta (1000 µmol m-2s-1) siempre que se esté en
presencia de una temperatura relativamente baja, podría contribuir a favorecer el disipamiento de
un exceso de energía vía zeaxantina. A las intensidades lumínicas menores en que se observan
57
qNP similares al observado a la mayor intensidad lumínica, podrían operar otros mecanismos
disipadores de energía diferentes del ciclo de xantofilas (Niyogi et al., 1997). Otro mecanismo
que podría explicar la no operacionalidad del ciclo de las xantofilas en D. antarctica, a las
intensidades de luz menores en presencia de frío o en el grupo de las plantas NA, sería la
acumulación constitutiva de algún otro tipo de pigmento fotoprotector, como ser la luteína, como
se ha reportado en la parásita Cuscuta reflexa (Bungard et al., 1999). Estos investigadores
propusieron, por primera vez, que en esta especie operan dos ciclos distintos de carotenoides,
ambos gatillados por la luz: el ciclo de las xantofilas y el ciclo de la luteína-5-epóxido. En C.
reflexa no se formaría neoxantina que deriva de la epoxidación de la zeaxantina, la cual a su vez
deriva del β-caroteno. Violaxantina está presente en la especie, de modo que sólo faltaría un paso
de la síntesis, desde la violaxantina a la neoxantina. Como dijéramos violaxantina es también el
sustrato primario de la de-epoxidación a zeaxantina, gatillada por la luz. Bajo exposición de C.
reflexa a alta radiación se encontraron bajos niveles de luteína-5-epóxido, los que desaparecieron
tan rápidamente como la violaxantina, por efecto de la luz, acumulándose luteína y los productos
de de-epoxidación de la violaxantina. Este mecanismo no estuvo presente en espinaca tratada a
alta intensidad lumínica. La luteína es un carotenoide que está presente en altas cantidades (hasta
un 60% del total de carotenoides) en el sistema captador de energía de la antena cloroplástica y
está implicado en la protección del fotodaño en algunas plantas y al que se le ha atribuido un
papel importante en la disipación de energía (Pogson et al., 1998 en Bungard et al., 1999).
Existen otros mecanismos disipadores de energía y de sus consecuencias nocivas (acumulación
de especies tóxicas de oxígeno), diferentes a los mencionados, que podrían sugerirse para D.
antarctica, como ser, una disipación de la energía por vía fotosintética (reducción del CO2) o
presencia de antioxidantes (Demmig-Adams & Adams, 1992). Efectivamente, como señaláramos
más arriba, esta especie presenta una fotosíntesis eficiente, aún a intensidades lumínicas altas,
siempre que la temperatura no sea superior a 20ºC. Las depresiones de la fotosíntesis encontradas
al mediodía en terreno (verano antártico), se deberían a la temperatura alta y no a la alta radiación
(Xiong et al., 1999; Alberdi et al., 2002). Si tenemos en cuenta que en nuestros experimentos los
niveles de intensidad lumínica se aplicaron a temperaturas inferiores a 20º (4ºC en las plantas A y
13ºC en la NA), es posible asumir que la fotosíntesis de estas plantas no fue bloqueada por las
mayores intensidades de luz utilizadas. Esto habría permitido un eficiente traslado de electrones
58
por la vía de la reducción del CO2, lo que habría evitado la acumulación de energía térmica, que
en otro caso debería disiparse por la vía del ciclo de las xantofilas u otra. Los elevados qP
encontrados dan cuenta de una eficiente utilización del poder reductor en la vía no fotoquímica.
Se sabe además, que hojas con altas tasas de fotosíntesis exhiben menores tasas de-epoxidación y
mayor epoxidación (Demmig-Adams & Adams, 1992). Por otro lado, de haber habido
acumulación de especies tóxicas (ROS), éstas podrían haber sido combatidas por la presencia de
antioxidantes. Efectivamente, recién se ha demostrado que esta especie posee un eficiente “pool”
de antioxidantes (Pérez et al., resultados sin publicar). Esta suposición se apoya en postulados de
Sommersalo y Krause (1990), quienes señalan, que en espinaca el endurecimiento previo al frío y
la exposición a alta intensidad de luz, induce efectivos mecanismos antioxidantes, los que hacen a
las hojas menos suceptibles a la fotoinhibición.
Existen evidencias de que en Rosmarinus officinalis sometida a sequía y a una alta energía de
exitación, se produce una pérdida de clorofila, la que ha sido considerado como una respuesta
adaptativa que reduce el daño de la maquinaria fotosintética ante el exceso de luz (Munné-Bosch
& Alegre, 2000). Los menores contenidos en clorofila reducen la absorción luz, y el daño
posterior por la formación de especies reactivas de oxígeno. Nuestros resultados no demostraron
disminución de clorofila ante el estrés frío, sino más bien una mantención de sus contenidos por
lo que podría suponerse que la disminución de este pigmento estaría asociada principalmente a un
déficit hídrico.
Los resultados en relación al buen funcionamiento del ciclo de las xantofilas ante la acción
combinada del frío y de la mayor intensidad lumínica en esta especie, representan un desafio para
estudiar a futuro la actividad de la enzima violaxantina de-epoxidasa en presencia de estos
factores, lo que lamentablemente escapó de nuestro propósito.
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