Bioquímica II - 2007

Bioquímica II - 2007
SEMINARIO 5: FOTOSINTESIS
Temario.
Clase 1:
Ecuación general de la fotosíntesis. Estructura del cloroplasto. Membrana tilacoide.
Fase clara: estructura de las clorofilas y carotenoides. Espectro de absorción de la clorofilas a y b. Interacción de
la luz con los pigmentos. Transferencia de la energía. Reacción de transferencia de electrones. Centro de
reacción. Unidad fotosintética. Reacción de Hill. Fotosistema I y fotosistema II: interacción. Constitución y rol del
fotosistema II. Centro partidor del agua. Potenciales redox. Bomba Q (flujo de protones). Citocromo bf. Flujo de
electrones del fotosistema II al I. Reacción neta entre el fotosistema II, cit bf y fotosistema I. Esquema Z. Ciclo de
fotofosforilación. Flujo de electrones. Producción de ATP sin producción de NADPH. Síntesis de ATP. ATP
sintasa de cloroplastos. Distribución del fot. I, fot. II, cit bf y ATP sintasa en la membrana tilacoide.
Generalidades de algas (eucariotes) y cianobacterias (procariotes).
Clase 2:
Fase oscura: Ciclo de Calvin-Benson. Regulación del ciclo y principalmente de la RUBISCO. Plantas C3 y C4.
Anatomía de ambos tipos de hojas. Regulación de la PEPCasa. Determinación de plantas C3 y C4, relación de
actividades enzimáticas. Plantas CAM.
Bibliografía
- Voet, D y Voet, JG (2004). Biochemistry, Tercera Edición.
- Zubay, GL (1998). Biochemistry, Cuarta Edición.
- Nelson, DL y Cox, M.M. (2005) Lehninger Principles of Biochemistry, Cuarta Edición.
Preguntas guía
Clase 1
1) Escriba la reacción general de fotosíntesis para:
a) una bacteria fotosintética aerobia.
b) una bacteria anaerobia que consume H2S.
2) Qué es un Centro de Reacción? Las organelas fotosintéticas contienen muchas más moléculas de clorofila que Centros de Reacción.
Qué función cumplen?
3) Haga un esquema del sistema de transporte de electrones de una bacteria fotosintética púrpura. Cómo se forma el gradiente de
protones? Que semejanzas encuentra con el sistema de transporte de electrones mitocondrial?
4) Haga un esquema del sistema fotosintético empleado por plantas y cianobacterias. Qué efecto tendría el agregado de una sustancia
que bloquee el transporte de electrones de PSII a citocromo f?
5) Cuáles son las fuentes de generación del gradiente de protones a través de la membrana tilacoide. Esquematice el orden de los
componentes de la cadena de transporte de electrones e indique donde y como se generan los protones. Para que se utilizan estos
protones?
6) Qué es el centro partidor de agua y como funciona?
7) Escriba la ecuación global de fotofosforilación no ciclica
8) En que difiere el transporte de electrones cíclico del no cíclico inducido por luz empleado por las plantas, con que finalidad se utiliza?
Cuántas moléculas de ATP se producen por fotón absorbido en cada tipo de transporte?
Clase 2
1) Que es el ciclo de Calvin. Haga un esquema indicando los intermediarios y productos marcados generados en una vuelta del ciclo al
administrar 14CO2. Qué función cumple la ribulosa bisfosfato carboxilasa?
2) Explique los mecanismos de control del Ciclo de Calvin.
1
3) En que consiste la fotorespiración? Qué función cumple la ribulosa bisfosfato carboxilasa-oxigenasa? Relacione fotorespiración con
fotosíntesis? Que función cumple la fotorespiración?
4) Qué tipo de plantas emplean la via C4, con qué finalidad? Haga un esquema de la via indicando su localización. Compare el consumo
energético de las plantas C4 en relación a las C3.
5) En que difieren las plantas CAM de las C4. Qué ventaja presentan? Por qué se producen elevadas fluctuaciones de los niveles de
almidón entre el día y la noche?
Problemas
Transmtancia a 420 nm
Clase 1
1) La más contundente y temprana evidencia del
esquema Z de la fotosíntesis surgió de la medida
del estado de oxidación de los citocromos en
algas, bajo diferentes regímenes de oxidación.
Como se muestra en la figura, la iluminación con
una luz de 680 nm causa la oxidación de los
citocromos (indicado por los trazos superiores);
iluminación adicional con luz de 562 nm causó
reducción de los citocromos (indicado por los
trazos inferiores); y ambos efectos pueden ser
revertidos eliminando la iluminación con la luz
correspondiente (figura A). En presencia del
herbicida DCMU, el cual bloquea el transporte de
electrones a través de los citocromos y frena la
producción de O2, el estado de reducción con la luz de 562
nm desapareció y fué reemplazado por una pequeña oxidación adicional (figura B).
a. En estas algas, cuál de las longitudes de onda estimula el Fotosistema I y cuál el Fotosistema II?
b. Cómo podrían estos resultados apoyar el esquema Z de la fotosíntesis?
c. El DCMU bloquea el transporte de electrones a través de los citocromos, sobre el lado adyacente al
fotosistema I o sobre el adyacente al fotosistema II?
2) Se desea estudiar el mecanismo fotosintético en un mutante de cianobacterias. La bacteria mutante realiza
fotosíntesis, con producción de O2 y NADPH aún en presencia de DCMU (inhibidor de transporte electrónico a
nivel de la plastoquinona) Cuando se analizan los resultados de un experimento clásico de Emerson y Arnold
realizado con el mutante en presencia de DCMU, se obtienen los siguientes resultados.
molec O2/flash
Cuando este mismo experimento (mutante en presencia o
2
ausencia de DCMU) se realiza con luz de 700 nm no se
registra producción de O2..
1,5
Además, por medida de potencial de membrana (para el
1
mutante) se observó la traslocación de 4 protones hacia el
0,5
medio exterior cuando se libera una molécula de O2
En otro experimento se midió la actividad de la
fosfofructoquinasa (PFK) tanto en la bacteria salvaje como en
la mutante, durante el día y la noche. Los
resultados se muestran en la siguiente tabla:
0
0
2
4
6
8
10
Intensidad del flash hv 2(a 680nm)
eje y: Moles de O2/m x
seg
eje x: Moles de fotones/m 2 x seg
2
Act. PFK salvaje
Dia
2
Noche
53
a) En base a todos los resultado que Ud. tiene, cuál cree que es
el mecanismo de la fase clara en la bacteria mutante?
b) Explique si en la bacteria mutante los ATP producidos en la
fase clara son suficientes para realizar la fase oscura.
c) Cree Ud que el mecanismo de regulación de la tiorredoxina
mutante
54
50
está funcionando?
Potenciales de reducción:
E0 (FII+/FII)= +1.1V
E0 (FI+/FI)= +0.5V
E0 (FII*+/FII*)= -0.7V
E0 (FI*+/FI*)= -1.3V
E0 (NADP+/NADPH)= -0.3V
E0 (O2/H2O)=+0.8V
3) El fotosistema II (FII) acepta electrones del agua, generando O2, y los cede al fotosistema I (FI) vía la cadena
de transporte de electrones. Cada fotón absorbido por el FII puede efectuar la transferencia de un único electrón,
y se necesitan 4 electrones, removidos del H2O para generar una molécula de O2.
Ud se pregunta: Cómo cooperan los 4 fotones en la producción del O2?
a) Que hipótesis podría plantear para explicar la remoción de los 4 electrones del agua y la consecuente
formación de una molécula de oxígeno a través del FII?
b) Para investigar este problema Ud. expone cloroplastos de espinaca adaptados a la oscuridad a una serie de
flashes cortos de luz (2 seg) separados por breves períodos de oscuridad y mide la producción de O2 resultante
de cada flash. Bajo este régimen lumínico, la gran mayoría de los fotosistemas captan un fotón durante cada
flash. Los resultados muestran que el O2 es producido con una determinada periodicidad: la primer explosión en
la producción de O2 ocurre con el tercer flash, mientras que las explosiones subsiguientes ocurren cada cuatro
flashes después del primer pico y los picos se hacen cada vez más anchos y cortos. Además no se pudo detectar
la presencia de radicales libres mediante EPR (resonancia paramagnética electrónica)
Si, en cambio, Ud. primero inhibe el 90% de los centros de reacción del FII con DCMU y entonces repite el
experimento, observa la misma periodicidad de producción de O2 pero la altura de los picos corresponde al 10%
de la correspondiente al experimento sin inhibidor.
Explique en la forma más completa posible los resultados obtenidos.
Clase 2
Tamaño relat ivo pool
metabólico
1) Se prepara un extracto de hojas de una planta de poroto (una planta C3) que han sido expuestas a diferentes
condiciones para comenzar el estudio de la regulacion de la Rubisco. En los extractos utilizados y todos los
ensayos de actividad de Rubisco que se realizaron, se hicieron en presencia de CO 2 y de Mg +2. Los resultados
de cada ensayo se irán mostrando a lo largo del problema.
a) Explique con detalle la reacción que cataliza y la regulación de la Rubisco en todos los niveles de regulación
que Ud. conozca. No olvide señalar porque cree Ud.
que necesita del Mg+2 en el tubo de reacción.
2,5
b) La presión parcial de CO2 en el ensayo se mantuvo
Luz
Oscuridad
en el 1%, sin embargo se conoce que la presión
2
parcial in vivo es mucho menor que la utilizada in
1,5
vitro, como puede explicar eso.
3-PGl
c) Se prepararon a distintos tiempos extractos de
1
hojas que fueron iluminadas y posteriormente
0,5
RuBP
sometidas a un período de oscuridad. En esos
0
0
200
400
tiempo (seg)
600
800
3
extractos se determinó el contenido del pool de 3-P-glicerato y de ribulosa bi fosfato (RuBP) como se muestran en
la gráfica (allí se muestran los valores relativos de estos metabolitos).
i) Explique el comportamiento de la curva del pool de 3-P-glicerato y de RuBP entre los 400 y 500 seg.
ii) Ahora Ud. realiza una modificación: vuelve a medir el pool de 3-P-glicerato y de RuBP con el tiempo. Las hojas
se mantienen en 1% de CO2 y luego, se baja el contenido de CO2 al 0.003%. Dibuje las curvas que espera
encontrar, marcando el pasaje de 1% a 0.003% de CO2, explicando su comportamiento. La iluminación siempre
es intensa.
iii) Ahora suponga que realiza el mismo experimento de que en el inciso anterior, pero aplicado a una planta C4.
Diga cual seria el comportamiento de las curvas en las mismas condiciones de presion parcial de CO2 que se
aplicaron a la C3.
d) En otro experimento un extracto de hojas fueron mantenidas en oscuridad, luego se le agrega DTT (1-4,
ditiotreitol, C4H10O2S2) y se las expone a la luz potente al mismo tiempo. A otro extracto de hojas que también
fueron mantenidas en oscuridad, siguen en oscuridad y además se le agrega DTT. Realice un análisis para
predecir cuáles serán los resultados esperados en el pool de 3-P-glicerato, la actividad de la Rubisco, y de la
fructosa 1,6 bifosfatasa
CO2 fijado (umole s/m2seg)
2,5
1300umoles quanta/m2.seg
2
2) a) Se han realizado experimentos de fijación de CO2 en plantas C3
130umoles quanta/m2seg
variando la intensidad de luz.
1,5
En la figura se muestra el comportamiento de la fijación de CO2 en el
tiempo variando la intensidad de luz, desde 1300 a 130 umoles
1
quanta/m2.seg. a los 3 min.
Explique con reacciones enzimática (indicando su regulación para este
0,5
caso en especial) por qué al disminuir el flujo de luz, la absorción de
CO2 cae notablemente.
0
Exp. realizado a 15 C.
0
2
4
6
Nota: CO2 fijado debe entenderse: CO2 fijado como 3-P-glicerato
Tiempo (min)
b) Si el experimento hubiera sido realizado a 40C, en lugar de 15C, la
curva se dibujaria igual? Explique detalladamente.
c) Ahora dibuje una curva de fijación de CO2 en el tiempo, pero no en una planta C3, sino en una planta CAM.
Explique detalladamente con reacciones, el comportamiento de la curva que haya dibujado y la regulación de las
reacciones involucradas.
d) Cuales son todos los tipos de plantas C4 que conoce? Describa las reacciones que las diferencian.
Si el experimento del inciso a) fuera realizado con una planta C4, cual sería el resultado esperado a 15 y a 40 C?
3) La siguiente ecuación representa la fase clara de la fotosíntesis:
2 NADP+ + 2 H2O + 8 h + X ADP + X Pi
2 NADPH + 2 H+ + O2 + X ATP
A) Reemplace los X con los coeficientes estequiométricos que correspondan y explique la razón.
B) Utilizando los potenciales redox del esquema Z así como otros datos necesarios, calcule el G de esta
reacción y la eficiencia de la fase clara.
C) Escriba las hemireacciones y la ecuación total de la fase oscura. Para esta última incluya los ATP
involucrados.
D) Sume la fase clara más la fase oscura y a partir de esta ecuación calcule el rendimiento total de la
fotosíntesis (use el G de la combustión "in vitro" de la glucosa)
E) Si hizo bien los cálculos, el rendimiento total de la fotosíntesis es algo menor que el rendimiento de la fase
clara. Explique la razón.
4
8
4) La medida de la actividad de Ribulosa-1,5-bifosfato Carboxilasa se determinó mediante la fijación de
NaH14CO3 en productos ácido-estables dependiente de ribulosa 1,5-bifosfato. El ensayo se realizó en tubos
eppendorf. La mezcla de reacción (0.5 ml) contuvo:
buffer, NaH14CO3 (15 mM, 0.04 MBq) y extracto celular (0.5-mg de proteínas). Después de una preincubación de
5 min la reacción se comenzó por el agregado de ribulosa-1,5-bifosfato (1.0 mM). La reacción se detuvo luego de
5, 10 o 15 min por el agregado de 100 l de ac. fórmico 12 M. el 14C fijado durante el período de incubación se
determinó a partir de las muestras secadas a 80 oC y contadas con líquido de centelleo.
El extracto contenía Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa con una actividad específica de 33 nmol min-1 / mg
proteína. Cuántas cpm se midieron luego de 10 min de incubación?
5