UNIVERISDA AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
Identificación de segundas señales inducidas por la unión de
Agonistas Solubles a CD40, en queratinocitos humanos
Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título
profesional de Químico Farmacéutico.
Profesor Patrocinante: Sr. Miguel Concha Murray – Instituto de Histología y
Patología – Facultad de Medicina.
Mauricio Andrés Gutiérrez Cabrera
Valdivia Chile 2004
Agradecimientos
A través de estas líneas quisiera agradecer a todos quienes hicieron posible, directa o
indirectamente, el desarrollo de este trabajo.
Agradecer en especial a mi profesor patrocinante el Dr. Miguel Concha por la oportunidad que
me brindó para hacer ciencia y realizar mi trabajo de la mejor manera. También por el tiempo y
dedicación invertidos, por sus consejos y sugerencias.
A todas las personas del Instituto de Histología y Patología de la Universidad Austral de Chile,
que de una u otra manera me ayudaron, en especial a la Dra. Alejandra Vidal y al Dr. Carlos
Figueroa. Además al Sr. Angel Astroza, Licenciado en Ciencias Biológicas, al Sr. Fernando Vera,
Tecnólogo Médico, por su contribución en la obtención de algunos resultados y a los
2
Bioquímicos Sra. Francisca Pavicic y Srta. Carola Matus por su amistad, tiempo, opiniones y
aportes.
Finalmente quiero agradecer a Dios, por haberme dado la vida y la oportunidad de conseguir mis
metas, y muy especialmente a mis padres, a mi hermana, a mi novia Ximena y a mi hijito que
viene en camino, por darme las fuerzas y el apoyo incondicional para salir adelante.
Esta tesis fue financiada por el proyecto S-2003-33 DID UACH.
3
1. RESUMEN
El receptor de membrana CD40 ha sido identificado en varios tipos celulares, entre ellos, los
queratinocitos de la epidermis. Su activación con agonistas solubles como por ej. el anticuerpo
monoclonal M89, produce en los queratinocitos cambios morfológicos y también en la expresión
de proteínas, estos cambios han sido asociados con la inducción de la diferenciación terminal.
Para ahondar en este problema, en esta tesis estudiamos la expresión de (pro)filagrina utilizando
inmunohistoquímica y la fosforilación de polipéptidos tirosina- y treonina/prolina-dependiente y
de MAPK (ERK1/2), así como la expresión de las segundas señales TANK, TRAF6 y TRAF3,
mediante Western blotting. Con este objetivo se emplearon queratinocitos de cinco donantes
diferentes sometidos a cirugía abdominal reparativa y de antecedentes clínicos conocidos. Las
células fueron cultivadas en bajos niveles de Ca+2 y estimuladas con los anticuerpos M89, EA-5,
G261.1, la proteína recombinante hCD40L o con IgG1, en presencia o ausencia de IFN-γ. En
nuestros ensayos se pudo observar que CD40 indujo en los queratinocitos estudiados un aumento
estadísticamente significativo en la expresión de (pro)filagrina, TANK y TRAF3, así como de la
fosforilación de proteínas tirosina y treonina/prolina-dependiente. Sin embargo, la estimulación
de CD40 inhibió la fosforilación de MAPK y no produjo efectos significativos en la expresión de
TRAF6. Estos resultados fueron independientes del empleo de IFN-γ exógeno y en conjunto
demuestran que la conjugación de CD40 con agonistas solubles induce, en los queratinocitos
humanos, cambios en la fosforilación de proteínas y en la expresión de segundas señales. Estas
podrían formar parte de las vías de señalización dependientes de CD40 implicadas en la
inducción de la diferenciación de los queratinocitos humanos.
SUMMARY
The cell surface molecule CD40 has been identified in several cellular types, including human
epidermal keratinocytes. CD40-triggering with soluble agonists e.g. M89 antibody, induces
morphological changes and protein expression of keratinocytes that have been related with
induction of terminal differentiation. Using immunohisto-chemistry, here we evaluated the
4
expression of (pro)filaggrin (a marker of keratinocyte terminal diffrentiation), and using Western
blotting tyrosine- and threonine/proline-dependent phosphorylation of polypeptides. Also MAPK
(ERK1/2) phosphorylation and TANK, TRAF6 and TRAF3 expression were analyzed. The cells
were obtained from five different donors with well-known clinical history and submitted to
reparative abdominal surgery. The cells were cultured in low Ca+2 levels and stimulated with the
M89, EA-5, G261.1 or IgG1 antibodies and recombinant protein hCD40L in the presence or
absence of IFN-γ. Results shown that CD40 triggering induce a statistically significant increase
on the expression of (pro)filaggrin, TANK and TRAF3 as well as tyrosine and threonine/prolinedependent phosphorylation. In addition, MAPK ERK1/2 phosphorylation was inhibited and
TRAF6 expression remained unchanged. Effects on (pro)filaggrin and second signals were
independent of exogenous IFN-γ.
As a whole our results demonstrated that in human keratinocytes CD40 triggering with soluble
agonists affect protein phosphorylation and second signaling activation. Whereas involvement
others than second signals studied here cannot be discarded, CD40-dependent signaling
activation could be involved in human keratinocytes differentiation.
5
2. INTRODUCCION
2.1. La piel
La piel es el órgano más grande del cuerpo humano, su superficie alcanza los 2m2 en un adulto y
su peso, alrededor del 30% de la masa corporal. Ocupa una posición de frontera o interfase y
limita a nuestro organismo del medio externo actuando como una barrera. De esta manera evita la
pérdida de agua y proteínas, mantiene la homeostasis del medio interno, regula la temperatura
corporal, evita la penetración de rayos UV, es un órgano de percepción sensorial y participa en la
producción de la vitamina D y en la vigilancia inmunológica.
Histológicamente, la piel está constituida por i) la epidermis, que es un epitelio de revestimiento
estratificado queratinizado; y ii) la dermis, que es vascularizada y rica en anexos cutáneos y
estructuras nerviosas. Los queratinocitos constituyen el principal tipo celular con capacidad de
proliferación de la epidermis, organizándose en los estratos basal, espinoso, granuloso y córneo
(Fig. 1). Estos cuatro compartimentos corresponden, respectivamente, a células progenitoras, en
proliferación, diferenciación y a aquellas que han alcanzado la diferenciación terminal. in vitro,
los queratinocitos conservan la capacidad de formar un epitelio estratificado que recuerda a la
epidermis in situ. En efecto, mediante el uso combinado de hidrocortisona, del factor de
crecimiento epidérmico (EGF, epidermal growth factor), insulina, trasferrina, tri-yodotironina,
toxina colérica y fibroblastos murinos 3T3 irradiados, es posible inducir la proliferación y
crecimiento in vitro de los queratinocitos hasta el estadío de formación de un epitelio
estratificado (Rheinwald y Green, 1975). Si se emplean medios definidos de cultivo de
queratinocitos que contienen bajos niveles de calcio (0,1 mM) y que no requieren sueros animales
y fibroblastos, los queratinocitos crecen en monocapa y funcionalmente recuerdan a los
queratinocitos del estrato basal. En cambio, si se emplean medios de cultivo con niveles
fisiológicos de calcio (2 mM) y suero fetal de bovino se obtiene el crecimiento pluriestratificado
de las células. En síntesis, el cultivo in vitro de los queratinocitos es una herramienta útil para el
6
estudio de los procesos de proliferación y diferenciación epidérmicos que ocurren in vivo,
permitiendo manipular el crecimiento celular para su mejor estudio.
2.2. Factores reguladores de la proliferación y diferenciación de los
queratinocitos
La proliferación y la diferenciación de los queratinocitos se encuentran bajo el control de una
variedad de factores biológicos solubles y de membrana, entre los que se encuentran factores de
crecimiento y citoquinas, que actúan de manera autocrina o paracrina. Los primeros son
producidos por la misma célula que posee los receptores para éste; los factores paracrinos, actúan
sobre células localizadas en el microambiente contiguo a la célula que los produce. Entre los
factores de crecimiento de los queratinocitos, el más conocido es EGF. Otros factores
corresponden al factor de transformación del crecimiento (TGF, transforming growth factor)-β y
el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, keratinocyte growth factor); mientras que EGF
y KGF tienen un efecto mitogénico en queratinocitos, TGF-β inhibe la síntesis de DNA y la
mitosis y promueve la diferenciación celular (Burbach y col, 2001). Los queratinocitos producen
una variedad de citoquinas que participan en la inflamación y la reparación cutánea. Entre éstas
se incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF, Tumor necrosis factor)-α, interleuquina (IL)-1β,
IL-8, IL-10, IL-18, el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF, vascular
endothelial growth factor), el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF, fibroblast growth
factor), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, platelet-derived growth factor) y
el factor estimulador de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF, granulocytemacrophage colony-stimulating factor) (Burbach y col, 2001). Otros importantes factores
reguladores de la proliferación y diferenciación celular de los queratinocitos corresponden al Ca+2
y la vitamina D3 (Mitev y Miteva 1999).
No obstante, el conocimiento de los factores que impactan a los queratinocitos o emanan de ellos
no está completo y muchas otras moléculas aún poco conocidas podrían estar implicadas en el
crecimiento y diferenciación epidérmica.
7
2.3. Participación de CD40 en la diferenciación de los queratinocitos
El receptor CD40 es una glicoproteína de membrana de 50 kDa perteneciente a la familia del
receptor de TNF (TNFR) (Noelle y col, 1992), descrita originalmente en linfocitos B humanos.
Se ha comprobado que CD40 es esencial en la generación de la respuesta de los linfocitos B a los
antígenos T-dependientes (Banchereau y col, 1994) y en el rescate de la muerte por apoptosis de
las células B activadas en ausencia de antígeno y citoquinas (van Kooten y Banchereau, 1997).
El ligando endógeno de CD40 es una glicoproteína de 39 kDa también conocida como CD40L o
gp39 y es expresado por linfocitos T activados.
La expresión de esta potente molécula co-activadora de la respuesta inmune no está restringida a
las células de origen hematopoyético sino que su expresión también ha sido detectada en células
de origen mesénquimal y células epiteliales. Denfeld y col (1996) y Gaspari y col (1996)
demostraron su expresión en los queratinocitos humanos en cultivo y que el tratamiento de estas
células con interferón gamma (IFN-γ) producía la sobre-expresión de CD40. La estimulación de
los queratinocitos con agonistas solubles, tales como anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD40
o con la proteína de fusión gp39 soluble, induce la producción de IL-6 y co-estimula la respuesta
proliferativa T (Gaspari y col, 1996; Denfeld y col, 1996). Basados en dichos hallazgos, estos
autores postularon que CD40 participaría en la patogénesis de ciertas dermatosis como psoriasis.
Péguet-Navarro y col (1997) describieron la expresión de CD40 en las células del estrato basal de
la epidermis humana normal y comprobaron que la estimulación de queratinocitos humanos con
fibroblastos transfectados con CD40L (CD40Lc) inhibe en éstos la proliferación e induce la
producción de (pro)filagrina. Esta última es una proteína que es sintetizada y almacenada en
gránulos citoplasmáticos en el estrato granuloso y su forma activa, filagrina, es generada por
proteólisis en el estrato córneo (Sarret y col, 1989; Reano y col, 1991). Por esta razón
(pro)filagrina es considerado un marcador bioquímico de la diferenciación terminal del
queratinocito.
De acuerdo a los resultados obtenidos en líneas celulares B, es claro que CD40 se comporta como
un receptor de membrana cuya conjugación específica a su ligando expresado en los linfocitos T
co-estimula la proliferación celular y la adquisición de funciones específicas, notablemente la
producción de inmunoglobulinas (Stout y col, 1996; Gaspari y col, 1996). Sin embargo, en los
8
queratinocitos no es conocido el ligando ni las señales de transducción generadas por CD40.
Según nuestros antecedentes, la única observación existente en la literatura sugiere que la
activación
de
CD40
induce
fosforilación
tirosina-dependiente
de
una
proteína
de
aproximadamente 50 kD de actividad biológica indeterminada (Gaspari y col, 1996).
2.4.
Segundas señales
involucradas
en la activacion del
queratinocito
La proliferación, diferenciación y muerte celular están reguladas mediante la comunicación
molecular entre células y en cada una de éstas, por la comunicación entre la membrana celular y
los compartimentos intracelulares, incluyendo el núcleo. Las señales que afectan a las células hormonas, neurotransmisores o factores de crecimiento- actúan mediante su conjugación a
receptores específicos, en su mayoría localizados en la membrana celular. Es así como los
receptores son un componente esencial en la comunicación entre las moléculas extracelulares y el
compartimiento intracelular, permitiendo que una señal se transmita hacia el interior de la célula
y que la interacción ligando/receptor sea productiva.
2.4.1. Proteínas tirosina quinasa y serina/treonina quinasa en la epidermis.
La fosforilación covalente de proteínas en residuos de tirosina, serina, y treonina es el mecanismo
más frecuente de respuesta a las señales extracelulares (Mitev y Miteva, 1999). La fosforilación
de proteínas es responsable de la respuesta a los factores de crecimiento y la regulación de las
proteínas que intervienen en las distintas etapas del ciclo celular. Esto es, que sincronizan la
síntesis de DNA, la mitosis, y el control de la diferenciación celular. Las quinasas, que catalizan
la fosforilación de proteínas, y las fosfatasas, que revierten la fosforilación, cumplen una
importante función reguladora de la respuesta celular.
En los queratinocitos varios receptores presentan actividad quinasa (PTK). Entre estos, los
receptores para EGF, IGF (factor de crecimiento semejante a insulina)-1, y quinasas de adhesión
intercelular focal (FAK; Mitev y Miteva,1999). Se ha observado que la fosforilación de proteínas
en residuos de tirosina es importante en procesos de proliferación, como la actividad tirosina
quinasa aumentada que revela la epidermis psoriática (Gentleman y col, 1984). El control de la
9
diferenciación de los queratinocitos también se asocia a actividad tirosina quinasa. Por ejemplo,
Ca2+ y TPA (12-0 tetradecanoylphorbol-13-acetate) inducen la diferenciación de queratinocitos
en asociación con actividad tirosina quinasa (Mitev y Miteva, 1999).
La fosforilación de proteínas en residuos de serina y treonina es una de las formas más frecuentes
de modificación post-traduccional. Estas quinasas pueden ser clasificadas en dos categorías
principales: i) proteínas quinasas dependientes de un mensajero, como las proteínas quinasas
dependientes del nucleótido cíclico adenosina monofosfato (cAMP), PKA, y de guanosina
monofosfato (cGMP) o como proteína quinasa C (PKC) dependiente de Ca2+; y ii) proteínas
quinasas independientes de un mensajero, como las proteínas quinasas activadas por mitógeno
(MAPK). Las proteínas serina/treonina quinasas participan en la regulación de la proliferación y
crecimiento celular (Mitev y Miteva, 1999).
2.4.2. MAPK.
Las proteínas quinasa activadas por mitógenos (MAPKs) son enzimas importantes en la
traducción de señales en células eucarióticas y están involucradas en fenómenos de regulación
celular. Estudios recientes indican que la cascada de señales citoplasmáticas mediada por MAPKs
participa en el control de la transcripción, regulando la proliferación celular y la apoptosis.
Las MAPK son enzimas que conectan a los receptores de superficie celular con blancos
reguladores críticos de la respuesta al estrés celular. En consecuencia, controlan la sobrevivencia
y adaptación celular. La actividad de las MAPKs es regulada por tres cascadas interrelacionadas,
compuestas por una MAPK, una MAPK quinasa (MAPKK, MKK o MEK) y una MAPKK
quinasa o MEK quinasa (MAPKKK o MEKK). Muchas quinasas son activadas por quinasas
efectoras específicas y son inactivadas por fosfatasas de MAPKs (Chang y Karin, 2001). Las
MAPKs son activadas por estímulos tales como factores de crecimiento, citoquinas, ésteres de
forbol, radiación UV, etc. (Mitev y Miteva, 1999). En células de mamíferos la familia de las
MAPKs incluye a quinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2 (Erk1 y Erk2 o p42mapk y
p44mapk), las quinasas c-Jun NH2-terminal (JNK o SAPK, proteínas quinasas activadas por estrés)
y p38mapk (Cobb y col, 1995). Las MAPKs activadas traslocan al núcleo, en donde, se cree,
10
regulan la expresión de factores de transcripción tales como c-fos a través de la fosforilación del
factor de transcripción p62TCF (Gille y col, 1992).
2.4.3. Moléculas adaptadoras de receptores pertenecientes a la familia de TNFR.
a) TRAFs
Los factores asociados al receptor de TNF, (TRAFs, tumor necrosis factor receptor associated
factors), constituyen una familia de proteínas genéticamente conservadas presentes tanto en
células de mamíferos, como en otros organismos multicelulares como Drosophila,
Caenorhabditis elegans y Dictyostelium discoideum (Chung y col, 2002). Los TRAFs expresados
por células de mamíferos corresponden a las principales señales de transducción de la familia de
TNFR y del receptor de IL-1/receptor semejante a Toll (IL-1R/TLR), mediando una amplia
variedad de funciones biológicas como inmunidad innata y adquirida, desarrollo embriológico,
respuesta a estrés y desarrollo óseo, a través de la inducción de la sobrevivencia, proliferación,
diferenciación y muerte celular (Chung y col, 2002). Muchos de los efectos biológicos de los
TRAFs parecen ser producto de la activación de factores de transcripción de la familia de NFκB
y AP-1 (Inoue y col, 2000).
La familia de proteínas TRAF está constituida al menos por TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4,
TRAF5 y TRAF6 que se caracterizan por la presencia de un dominio TRAF en el extremo Cterminal (Inoue y col, 2000). Este consiste en un dominio en helicoide seguido por un dominio
conservado TRAF-C (Chung y col, 2002). Este último sería necesario para la interacción de las
moléculas TRAF con sus receptores asociados (Arch y col,1998). Las características estructurales
de las proteínas TRAF sugieren una función como adaptadores citoplasmáticos, los cuales pueden
promover la transducción de señales intracelulares mediante su habilidad para unirse a receptores
y potenciar así la incorporación de proteínas, formándose preferentemente complejos
citoplasmáticos de señalización (Arch y col, 1998). TRAF1 ha sido involucrado en la protección
contra la apoptosis; TRAF2 en la activación de NFκB, señalización anti-apoptótica, activación de
JNK y sobrevivencia perinatal; TRAF3 -una proteína de 65 kDa- ha sido relacionado con la
respuesta a antígenos dependiente de células T y con la supervivencia perinatal; TRAF4 está
involucrado en la formación traqueal; TRAF5 en la activación de NFκB y en la señalización por
11
CD27 y CD40; y la proteína de 60 kDa TRAF6, está presente en el metabolismo óseo,
sobrevivencia perinatal y señalización de CD40, IL-1 y LPS, (Chung y col, 2002).
b) TANK
Es una proteína de peso molecular cercano a 48 kDa que unida a TRAF posee efectos
estimuladores e inhibitorios. La actividad estimuladora de TANK se manifiesta más claramente
en la capacidad de activar NFκB, existiendo un sinergismo con bajos niveles de TRAF2
expresados en células tisulares en cultivo (Cheng y Baltimore, 1996). Esta actividad requiere del
dominio N-terminal de TANK así como una región central, necesaria para la interacción con
TRAF2. TANK fue primeramente conocido por su actividad inhibidora de este factor de
transcripción. El dominio C-terminal de TANK inhibe la activación de NFκB mediada por CD40
(Chin y col, 1999). Estas observaciones indican que TANK participa en las vías dependientes de
TRAF que activan NFκB, como son las cascadas de señales iniciadas por CD40L y TNF-α.
2.5. Objetivos generales
Estudiar mecanismos moleculares evocados por la activación de la molécula CD40 con agonistas
solubles, en queratinocitos humanos.
2.6. Objetivos específicos
1. Estudiar si el aumento de expresión de (pro)filagrina inducido por la unión de anticuerpos
específicos a CD40 en queratinocitos humanos, pre-tratados o no con IFN-γ exógeno, es un
fenómeno extendido en la población humana.
2. Determinar si la activación de CD40 con agonistas solubles, en ausencia o presencia de IFN-γ
exógeno, induce en queratinocitos humanos la fosforilación de proteínas, tirosina- y
treonina/prolina-dependiente.
3. Identificar segundas señales activadas secundariamente por la unión de anticuerpos a CD40, en
queratinocitos humanos pre-tratados o no con IFN-γ .
12
Figura 1. Imagen micrográfica de piel normal (hematoxilina y eosina). La figura muestra las
dos principales capas de la piel, epidermis y dermis. En la epidermis se observan los estratos
basal (B), espinoso (E), granuloso (G) y córneo (C). Los queratinocitos que crecen en monocapa
en medio bajo en calcio corresponden a células similares a las células del estrato basal. La
expresión de (pro)filagrina ocurre en el estrato granuloso donde se acumula en los gránulos de
queratohialina.
13
3. MATERIALES Y METODO
3.1. Equipos
Balanza analítica electrónica Precisa 120 A; fuente de poder Apparatus EC-1000-90; cámara de
electroforesis EC-Apparatus Corporation EC120; cámara de electrotransferencia EC-Apparatus
Corporation EC140; ultracentrífuga Heraeus Biofuge 15; estufa de cultivo con atmósfera de CO 2
Forma Scientific; cámara de flujo laminar vertical Factomet; baño termoregulado VWR Scientific
Products, Modelo 1202; homogenizador ultrasónico serie 4710; microscopio invertido de
contraste de fase Nikon Diaphot TMD; espectrofotómetro Shimadzu (UV 150-0.2); Vortex Genie
2; Microscopio Leitz 020-507.010; centrífuga Sigma 5-15; agitador Heidolph Reax 3; tambores
con nitrógeno líquido; congelador -80ºC Revco Scientific.
3.2. Medios de cultivo y enzimas
Para los cultivos primarios de queratinocitos humanos se utilizó medio DMEM 1,8 mM Ca2+
(Dulbeco’s Modified Eagle Médium, Gibco BRL, Life Technologies) mezclado con HAM F12
(Gibco BRL) en una proporción 3:1 y suplementado con suero fetal de bovino al 10% (SFB,
Hyclone, Logan, UTA, USA), hidrocortisona 0,4 μg/ml (Sigma Chemical Co.), toxina del cólera
10-10 M (Sigma Chemical Co.), insulina 5 μg/ml (Sigma Chemical Co.) y factor de crecimiento
epidérmico 10 μg/ml (EGF, Sigma Chemical Co). Además se empleó penicilina-estreptomicina al
1% (10.000 UI/ml de penicilina y 10.000 μg/ml de estreptomicina, Gibco BRL, Life
Technologies), Fungizone® al 1% (250 μg/ml anfotericina B y 205 μg/ml desoxicolato sódico;
Gibco BRL). Previo a la estimulación celular los queratinocitos fueron cultivados en Defined
Keratinocyte-serum free medium con < 0,1 mM de Ca2+ (DK-SFM; Gibco BRL).
Además se usó tripsina 0,05%-EDTA 1 mM (Gibco BRL) y tripsina 0,25%-EDTA 1mM (Gibco
BRL).
14
3.3. Anticuerpos y otros agonistas
Se emplearon los anticuerpos monoclonales específicos anti-CD40, M89 (Immunotech), G261.1
(Upstate) y EA-5 (Biosource), ~TRAF 3, ~TRAF6, ~c-jun, ~p-JNK, ~TANK, ~p-p38 (Santa
Cruz Biotechnology, Inc), ~p-tirosina, ~p-treonina/prolina, ~p-MAPK (Cell Signaling
Technology),
hCD40L
(Immunex
Corporation,
WA),
anti-(pro)filagrina
(Biomedical
Technologies Inc, Stoughton MA, USA) y como control se utilizó el anticuerpo monoclonal
~IgG1 de especificidad no relacionada (DAKO, USA).
3.4. Preparación de fibroblastos mitomizados
1x106 fibroblastos 3T3 de ratón fueron cultivados en botellas de 25 cm2 (NUNC, Brand Products)
por 2-3 días en medio DMEM suplementado con SFB 10%; penicilina-estreptomicina y
Fungizone, hasta subconfluencia. Posteriormente los cultivos celulares fueron tratados con
mitomicina C (Sigma) 5 μg/mL en DMEM sin SFB por 3-4 horas. Los fibroblastos mitomizados
fueron desprendidos de las botellas con tripsina 0,25%-EDTA, lavados en medio Hank-10% SFB,
resuspendidos en medio DMEM-F12 para co-cultivar con queratinocitos.
3.5. Aislamiento y cultivo de queratinocitos humanos
Se obtuvieron biopsias de piel de 5 pacientes sometidos a cirugía abdominal reparadora (cirugía
reductiva) en el Hospital Clínico Regional de Valdivia. Los 5 pacientes eran de sexo femenino,
obesos pero de condiciones generales de salud normales. Sus edades fluctuaban entre los 35 y 50
años (Tabla 1). Las biopsias de piel fueron obtenidas de acuerdo a las normas de los Comités de
Etica de la Facultad de Medicina de la Universidad Austral de Chile y del Hospital Regional
Valdivia.
Las biopsias se procesaron con un querátomo, obteniéndose láminas de aproximadamente 1 mm
de espesor que contenían epidermis y dermis. Las láminas fueron tratadas con tripsina 0,05% en
medio Hank sin calcio ni magnesio por 1 h, a 37ºC y la epidermis fue separada de la dermis
mediante pinzas finas y disgregada en pequeños fragmentos con tijeras y re-pipeteo hasta la
obtención de una suspensión celular homogénea. Esta suspensión se filtró a través de una gasa
15
estéril y las células epidérmicas se lavaron en solución de Hank-10% SFB. Se efectuó recuento
celular y determinación de viabilidad por exclusión con Azul Tripano 0,5% (Sigma Chemical
Co). Las células obtenidas fueron cultivadas con fibroblastos 3T3 mitomizados en proporción 1:1
(1X106/células de cada tipo) en botellas de 25 cm2 en medio DMEM-F12 suplementado. Luego
que los queratinocitos alcanzaron entre un 70% y un 80% de confluencia, fueron desprendidos
con tripsina 0,25%-EDTA, y congelados en nitrógeno liquido hasta su utilización posterior.
3.6. Congelación y descongelación de células
Una vez cultivadas a subconfluencia, las células fueron tratadas con tripsina 0,25%-EDTA y
lavadas dos veces en solución Hank-10% SFB. Luego fueron resuspendidas en Cell Culture
Freezing Medium-DMSO (Gibco BRL) a una concentración 10x105/ml y almacenadas en viales
a –80ºC en un congelador celular (Freezing Container, Nalgene). Después de 24 horas fueron
trasladadas a nitrógeno líquido hasta su utilización. Para descongelar las células, los viales fueron
rápidamente retirados del nitrógeno líquido y sumergidas en un baño a 37ºC agregándoles 500 μL
de SFB. Posteriormente se lavaron dos veces con Hank-10% SFB y realizó recuento y sembrado
en el medio de cultivo correspondiente.
3.7. Activación de queratinocitos in vitro
Los queratinocitos fueron descongelados, lavados y contados según método antes descrito, luego
sembrados en placas de cultivo a razón de 6X105 células por placa y cultivadas a subconfluencia
en medio DK-SFM a 37ºC. Antes de realizar el ensayo de activación celular, las células
permanecieron entre 18-24 horas en medio DK-SFM sin factores de crecimiento (medio base).
Posteriormente, las células fueron lavadas en medio base fresco e incubadas con agonistas
solubles de CD40. Como control se usaron queratinocitos incubados con IgG1 en concentración y
períodos iguales. La reacción se detuvo mediante la aspiración del medio de cultivo y la adición
de 100 μl de buffer de lisis, que contiene buffer RIPA (Tris ph 7,4, 0,6 grs; NaCl 0,9 grs; NP40, 1
mL; EGTA 0,038 grs; EDTA 0,04) más inhibidores de proteasas: PMSF 100 mM, pepstatin 1
mg/ml, aprotinin 1 mg/ml y leupeptin 1 mg/ml. A continuación, y mediante la utilización de una
espátula de teflón, las células fueron desprendidas de las placas y recolectadas en tubos de
16
ultracentrífuga para ser sonicadas por 10 segundos y realizar determinación de proteínas totales.
Las muestras fueron almacenadas a -80ºC en buffer de muestra 2X (SDS 4,6%, β-mercaptoetanol
5%, Tris 0,06%, glicerol 10% y azul de bromofenol; todos Sigma).
3.8. Determinación de proteínas por el método de Bradford
Para esta determinación se utilizó reactivo de Bradford que contiene azul de Coomasie G
0,01%, etanol 4,75%, ácido fosfórico 8,5%. La lectura se llevó a cabo en un espectrofotómetro a
una longitud de onda de 595 nm. Para determinar la concentración de proteínas del extracto
celular se tomó una alícuota de 10 μl de la muestra y se le adicionó 1 ml de reactivo de Bradford.
La absorbancia leída a esa longitud de onda fue interpolada en una curva de calibración elaborada
previamente.
3.9. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
Para el ensayo de fosforilación de proteínas tirosina y treonina/prolina-dependiente se emplearon
geles de poliacrilamida en gradiente 5-10%, sobre los cuales se cargaron 50 μg de proteínas
totales. Para los ensayos de expresión de segundas señales fueron utilizados geles de
poliacrilamida al 12,5% , en los que se cargaron 25 μg de proteínas totales. La electroforesis se
realizó a 170 Volts de corriente constante y 70 mA iniciales por 90 minutos aproximadamente a
4ºC, en buffer de corrida 1X (Tris 3%, Glicina 14,4%, SDS 1%).
3.10. Electrotransferencia
Una vez realizada la separación de las proteínas por electroforesis, éstas fueron transferidas a
membranas de Nitrocelulosa tamaño de poro 0,22 μm (Millipore, USA). La transferencia se
realizó a 70 volts constantes y 120 mA iniciales de corriente, por 110 min utilizando un buffer
que contenía 24 ml de buffer de transferencia 10X (Tris 3,03% y Glicina 14,4%), 60 ml de
metanol y 216 ml de agua destilada. Posteriormente las membranas fueron lavadas y bloqueadas
con TTBS-leche 5% antes de realizar la inmunotinción.
17
3.11. Inmunotinción de membranas de nitrocelulosa
Las membranas provenientes de la electrotransferencia fueron bloqueadas durante 90 minutos
con solución TTBS-leche 5% (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, Tween 20 0,05%, NaCl 500 mM, leche
en polvo descremada 5%) a temperatura ambiente y agitación constante. Luego de repetidos
lavados con TTBS por 30 minutos fueron incubadas toda la noche a temperatura ambiente y con
agitación constante con el anticuerpo estudiado. Las membranas fueron lavadas con TTBS
durante dos horas, para luego ser incubadas con el segundo anticuerpo conjugado a peroxidasa
(Pierce, Illinois, USA) diluido en TTBS-leche. Luego de nuevos lavados con TTBS por dos
horas, se incubaron con Super Signal West Dura Extended durante 20 minutos. Finalmente, las
membranas fueron expuestas en cámara oscura a una placa Kodak Biomax para
quimioluminiscencia.
3.12. Inmunohistoquímica para (PRO)filagrina
Aproximadamente 3x104 queratinocitos fueron cultivados hasta subconfluencia en porta objetos
tipo Chamber Slide (Nalge Nunc International, USA) y estimulados como se mencionó
anteriormente. Una vez concluida la estimulación celular se desechó el medio de cultivo, se
retiraron los pocillos del portaobjetos y el preparado fue secado a temperatura ambiente por 12
horas. Posteriormente éste fue re-hidratado realizando dos lavados de 5 min cada uno con buffer
fosfato salino (PBS). La inmunohistoquímica fue realizada incubando de manera secuencial con
anticuerpo monoclonal anti-(pro)filagrina (Biomedical Technologies Inc, Stoughton MA, USA;
1/400); lavado en PBS; Ig anti-IgG de ratón biotinilada (Kit Lsab2, Dako Corp, USA); lavado en
PBS; streptavidina-peroxidasa (Kit Lsab2, Dako Corp, USA), lavado en PBS; revelado con 3amino-9-etilcarbazol (AEC substrate system, Dako, USA). Los preparados fueron contrastados
con hematoxilina y montados en Moviol (Hoechst, Frankfurt, Germany).
3.13. Análisis semicuantitativo de micrografías y geles
Con el objeto de cuantificar la inmunoreactividad a (pro)filagrina de las células en cultivo y la
intensidad de las bandas inmunoreactivas en Western blotting, se realizó un análisis
densitométrico con el programa Un-Scan-It Gel Automated Digitized System, versión 4.1 para
18
Windows. Para construir los diferentes gráficos con los datos obtenidos desde el análisis de
imagen, se utilizó el programa Sigma Plot 3.0 y Microsoft Excel 2000. Se efectuó análisis
estadístico utilizando el test t de Student, un valor de p < 0,05 fue considerado significativo.
TABLA I. Resumen de los antecedentes clínicos de los cinco pacientes cuyos queratinocitos
fueron empleados en este estudio.
Donante
P1(1)
P2
P3
P4
P5
(1)
Sexo
Femenino
Femenino
Femenino
Femenino
Femenino
Paciente Nº1
Edad
35
37
50
41
38
Enfermedades pre-existentes
No
colitis ulcerosa
s/a
hipotiroidismo
cáncer mamario
Cirugía
Abdominoplastía
Abdominoplastía
Abdominoplastía
Abdominoplastía
Reconstrucción mamaria
19
4. RESULTADOS
La estimulación con el anticuerpo anti-CD40 M89 induce la expresión de (pro)filagrina en
queratinocitos provenientes de diferentes individuos.
Para facilitar la estimulación celular con agonistas solubles, se empleó medio de cultivo para
queratinocitos con bajos niveles de calcio (0,1 mM), sin uso de SFB, obteniéndose el crecimiento
de las células en monocapa y separadas unas de otras. En estas condiciones la estimulación con
los agonistas solubles de CD40, M89 y EA-5, produjo en los queratinocitos cambios
morfológicos compatibles con la inducción de la diferenciación celular. En efecto, los
queratinocitos tratados por 48 hrs con IFN-γ y luego por 24 hrs con estos agonistas, sufrieron un
aumento de tamaño y el cambio de su apariencia redondeada a una forma hexagonal y aplanada.
Simultáneamente en las células ocurrió un aumento en la expresión de (pro)filagrina. El
tratamiento de las células con IFN-γ e IgG1 no sólo no provocó cambios en la morfología celular,
sino que tampoco indujo la expresión de (pro)filagrina (Fig. 2a).
La cuantificación de la inmunoreactividad para (pro)filagrina en los queratinocitos obtenidos de
tres individuos diferentes (p1, p3 y p5), cultivados en ausencia o presencia de IFN-γ y
estimulados con el anticuerpo M89, reveló que este último induce la producción de (pro)filagrina
independientemente del tratamiento previo de las células con IFN-γ (Fig. 2b). Nuestros resultados
también mostraron que el efecto de M89 sobre la expresión de (pro)filagrina no fue dependiente
de las concentraciones de agonista utilizadas (Fig. 2b).
La estimulación de queratinocitos humanos con agonistas solubles de CD40 produce
fosforilación tirosina- y treonina/prolina-dependiente de polipéptidos de distinta masa
molecular.
La estimulación de queratinocitos humanos (donante p3) con los anticuerpos anti-CD40 M89,
G261.1 o la proteína quimérica hCD40L produjo la fosforilación de residuos de tirosina de varios
polipéptidos de una masa molecular aproximada entre 50 y 178 kDa (Fig. 3), no observados en
20
las células controles tratadas con IgG1. La fosforilación de residuos de tirosina ocurrió
especialmente con el pre-tratamiento de los queratinocitos con IFN-γ por 48 hrs. y en menor
medida en ausencia de IFN-γ exógeno (Fig. 3a y b). La fosforilación de un polipéptido de
aproximadamente 175 kDa, parcialmente bloqueada por AG1478 sugirió que éste podría
corresponder a EGFr (Fig. 3c).
Paralelamente, la activación de las células de este mismo individuo reveló la fosforilación en
residuos treonina/prolina de polipéptidos de masa molecular aproximada entre 34 y 148 kDa y la
fosforilación de novo de un polipéptido de aproximadamente 54 kDa (Fig. 4a). Diferentes
concentraciones de IFN-γ no influyeron en un aumento de la fosforilación treonina/prolinadependiente, sino que incluso 1000 UI/mL de IFN-γ bloquearon dicho efecto (Fig. 4a). Debido a
que este último efecto ocurrió cuando las células fueron estimuladas con M89 en ausencia de
IFN-γ (Fig. 4b), se concluyó que la fosforilación de polipéptidos de novo fue dependiente de M89
y no de IFN-γ. Como era de esperarse, la utilización del antagonista AG1478 no bloqueó la
fosforilación de proteínas treonina/prolina-dependiente.
Efecto del anticuerpo M89 sobre segundas señales en queratinocitos humanos
Considerando que el anticuerpo anti-CD40 M89 indujo la fosforilación tirosina- y
treonina/prolina-dependiente de diversos polipéptidos en queratinocitos del donante p3, se
investigó el efecto de la estimulación de CD40 sobre la expresión y/o fosforilación de las
moléculas MAPK, TANK, TRAF6 y TRAF3 que en otros sistemas celulares han sido
relacionadas con la activación de CD40 (Chung y col, 2002). Debido a que en las poblaciones
humanas las muestras de tejidos presentan una elevada variabilidad en la expresión de proteínas,
comparamos el efecto de M89 sobre queratinocitos aislados de cuatro pacientes sometidos a
cirugía reparadora (p1, p2, p3 y p4).
El análisis mediante Western blotting demostró que el tratamiento de los queratinocitos con M89
inhibió de manera significativa la fosforilación de MAPK en el conjunto de las muestras
estudiadas (Fig. 5). Sin embargo, este efecto no fue observado en los queratinocitos del individuo
p3 en los cuales no ocurrió una modificación notoria de la expresión de MAPK fosforiladas. El
21
pre-tratamiento de las células con IFN-γ revirtió el efecto inhibitorio de M89 sobre la
fosforilación de MAPK (Fig. 5).
Cuando las células fueron estimuladas con M89 ocurrió un aumento significativo de la expresión
de TANK que no fue observado en los queratinocitos tratados con IgG1 o IgG1 más IFN-tratamiento de las células con
IFN-
M89 sobre TANK, éste no fue evidente en el
individuo p4 (Fig. 6).
Respecto a la detección de la molécula TRAF6, en queratinocitos de cuatro pacientes estimulados
con M89, se observó que pese a producir un leve aumento en su expresión, éste no fue
significativo (Fig. 7). A pesar de ello, en el donante p2 la expresión de TRAF6 fue especialmente
notoria (Fig. 7). Respecto a la expresión de TRAF3, M89 indujo el aumento significativo de su
expresión respecto a las células estimuladas con IgG1 control o con IgG1 e IFN-γ (Fig. 8).
Se debe subrayar que el efecto estimulador sobre segundas señales ejercido por M89 fue
observado en ausencia o presencia de IFN-γ y que el pre-tratamiento de los queratinocitos con
dicha citoquina tuvo una acción que en general se puede recalcar como de tipo inhibitorio sobre
la respuesta a M89.
22
23
24
25
26
27
28
29
30
5. DISCUSION
Las evidencias acumuladas indican que la activación del receptor de membrana CD40 mediante
agonistas solubles provoca, en queratinocitos humanos, cambios morfológicos y de expresión de
proteínas compatibles con la diferenciación terminal. Sin embargo, los mecanismos mediante los
cuales CD40 podría inducir dichos cambios no han sido dilucidados. En este trabajo se investigó
primeramente si el efecto de la activación de la molécula de membrana CD40 con agonistas
solubles, sobre la expresión del marcador de la diferenciación (pro)filagrina, en queratinocitos
humanos, ocurría indistintamente del origen de los queratinocitos en una población humana. Con
este objetivo se estudiaron con inmunohistoquímica, muestras de queratinocitos obtenidas de tres
donantes seleccionados al azar, sujetos a cirugía reparativa abdominal. A continuación, se analizó
con técnicas de electroforesis y Western blotting si la activación de CD40 inducía la fosforilación
tirosina- y treonina/prolina-dependiente de proteínas. Finalmente, empleando dicha técnica,
estudiamos señales secundarias a la estimulación de CD40, específicamente la fosforilación de
MAPK y la expresión de TANK, TRAF6 y TRAF3 que, aunque no han sido investigadas en
queratinocitos, es conocido que se asocian a la activación de CD40 en células linfoides. Un
problema importante a resolver fue determinar si las variaciones detectadas en la expresión de
proteínas dependían o no del pre-tratamiento de las células con IFN-γ exógeno.
La activación de CD40 induce la expresión de (pro)filagrina en queratinocitos humanos de
diferentes individuos, independientemente de la presencia de IFN-Γ exógeno.
Los ensayos realizados en queratinocitos humanos obtenidos de individuos diferentes y tratados
con el anticuerpo anti-CD40 M89, mostraron que la estimulación de este receptor produce un
aumento en la expresión de la proteína (pro)filagrina, que no se observa en los controles tratados
con IgG1 (Fig. 2a). Anteriormente se había demostrado que CD40 induce cambios morfológicos
compatibles con la diferenciación de queratinocitos humanos (Péguet-Navarro y col, 1997;
Concha y col, 2003). En éstos y otros trabajos (Splawski y col, 1994; Stout y col, 1996; Grousson
y col, 2000) se ha empleado regularmente IFN-γ para estimular la expresión de CD40 y
31
consecuentemente facilitar la determinación de efectos funcionales dependientes de CD40. Sin
embargo, es conocido que IFN-γ es un potente activador de las funciones pro-inflamatorias en
queratinocitos (Federici y col, 2002). En efecto, IFN-γ es una citoquina producida por linfocitos
T que tiene la capacidad de inducir en los queratinocitos la expresión de moléculas de adhesión
intercelular como ICAM-1, la expresión de moléculas HLA-DR y la producción de quimioquinas
(Chu y Morris, 1997). El cambio fenotípico producido facilita que el queratinocito se comporte
como una célula accesoria de la respuesta inmune capaz de estimular la respuesta T específica a
superantígenos (Chu y Morris, 1997). Este efecto de IFN-γ tiene importancia en enfermedades
tales como psoriasis, dermatitis atópica y dermatitis por contacto en cuya patología han sido
implicados superantígenos (Howie y col, 1996). Nuestros resultados indican que la producción de
(pro)filagrina inducida por la activación de CD40 es independiente de IFN-γ exógeno y que,
además, este efecto puede ser reproducido en queratinocitos humanos indistintamente de su
condición individual. El hecho que la producción de (pro)filagrina secundaria a la estimulación
de CD40 no dependa de IFN-γ exógeno, indica que es bastante probable que CD40 participe en la
homeostasis cutánea controlando la diferenciación de los queratinocitos en condiciones
fisiológicas. La demostración de que en los cultivos primarios de queratinocitos estimulados con
CD40 no existe IFNLa estimulación de queratinocitos humanos con agonistas solubles de CD40 induce la
fosforilación tirosina y treonina/prolina-dependiente de polipéptidos de distinta masa
molecular.
En nuestros ensayos, la activación de CD40 se efectuó utilizando los anticuerpos M89, G261.1 y
la proteína quimérica hCD40L. Los resultados obtenidos con dichos agonistas solubles revelaron
un aumento en la fosforilación tirosina-dependiente de diversos polipéptidos de masas
moleculares de aproximadamente 50 a 178 kDa (Fig 3a-b). Hasta donde conocemos, sólo existe
una publicación en la literatura que ha presentado evidencias respecto a que la activación de
CD40 en queratinocitos induce fosforilación de proteínas tirosina-dependiente (Gaspari y col,
1996). En dicho trabajo, los autores demostraron que el pre-tratamiento de los queratinocitos con
IFN-γ induce la sobre-expresión de CD40, y que la activación de este receptor con el anticuerpo
monoclonal G28.5 resulta en la generación de un polipéptido de masa molecular aproximada a 50
32
kDa fosforilado en tirosina. Sin embargo, nuestros resultados muestran que no solamente el
anticuerpo G28.5 sino también M89, G261.1 y CD40L fueron capaces de inducir fosforilación de
polipéptidos de 50 kDa fosforilados en tirosina (Fig 3a). Adicionalmente, nuestros resultados
demostraron que la activación de CD40 en presencia de IFN-γ produce la fosforilación tirosinadependiente de otros polipéptidos de aproximadamente 69, 89 y 178 kDa. Asimismo se evidenció
la inducción de la fosforilación tirosina-dependiente de polipéptidos de 177, 119 y 42 kDa en
ausencia de IFN-γ. Estos resultados sugieren que el efecto de los agonistas solubles sobre la
fosforilación de residuos de tirosina CD40-dependiente, corresponde a una respuesta propia de
CD40 y no particular a uno de los agonistas empleados y constituyen un argumento adicional de
que los efectos analizados de CD40 no dependen de IFN-γ.
El empleo del antagonista AG1478 produjo un bloqueo parcial de la fosforilación tirosinadependiente de un polipéptido de aproximadamente 175 kDa. Este podría corresponder a EGFR,
porque los inhibidores de proteínas con actividad tirosina quinasa de la familia de las tirfostinas,
a la cual pertenece AG1478, bloquean la actividad quinasa de EGFR y detienen el crecimiento de
queratinocitos psoriáticos in vitro (Mitev y col, 1999).
Los ensayos de activación de CD40 con el anticuerpo M89, en ausencia o presencia de 100
UI/mL de IFN-γ exógeno, también mostraron un aumento en la fosforilación de residuos de
treonina/prolina en polipéptidos de masa molecular aproximada de 34, 54 y 148 kDa; y la
fosforilación de novo de un polipéptido de masa molecular cercana a los 54 kDa (Fig 4a-b).
Aunque no existe en la literatura información acerca del efecto en queratinocitos de los
anticuerpos anti-CD40 sobre la fosforilación treonina/prolina-dependiente, es conocido que éstos
inducen en linfocitos B, un incremento de la fosforilación serina/treonina (Faris y col, 1994).
Nuestras evidencias muestran por primera vez que la activación de CD40 por agonistas solubles
está ligada a la fosforilación treonina/prolina de varios polipéptidos. De acuerdo a la
especificidad del anticuerpo utilizado para el revelado de residuos fosforilados de
treonina/prolina, existe la posibilidad que alguno de los polipéptidos identificados corresponda a
proteínas quinasas de las familias MAPK y cdk/cdc (cyclin dependent kinases/cell división
control; Nº Cat 2321S Cell Signaling Technology, 2002).
Efecto del anticuerpo M89 sobre segundas señales en queratinocitos humanos.
33
La diferenciación de la epidermis corresponde a un programa complejo en el cual los
queratinocitos se equilibran entre procesos de i) proliferación celular, ii) diferenciación y iii)
apoptosis. Las MAPK probablemente poseen una activa participación en estas tres vías (Eckert y
col, 2002). Diferentes agentes, cuyos efectos son mediados por MAPK ERK1/2, promueven la
supervivencia del queratinocito mediante la activación de receptores de EGF (Eckert y col, 2002).
Sin embargo estos mismos autores han postulado que en particular en los queratinocitos, ERK1/2
no está asociado a la diferenciación o a la apoptosis, sino que en dichos procesos actuarían otros
miembros de la familia de las MAPK. En este sentido Vidal y col (2004) han demostrado
recientemente que Lis-bradicinina, una molécula pro-inflamatoria, induce una rápida y sostenida
fosforilación de MAPK 42/44 (ERK1/2) y sólo una moderada inducción de la síntesis de
(pro)filagrina. Estos autores estimaron que el moderado proceso de diferenciación inducido por
esta vía de segundas señales, podría ser relevante para la supervivencia del queratinocito en
procesos inflamatorios cutáneos. Nuestros resultados precisamente indican que la activación de
CD40 actúa como una señal negativa sobre la fosforilación de ERK1/2, sugiriendo que esta
última no participa activamente en la diferenciación del queratinocito dependiente de CD40. Esta
idea es apoyada por la observación hecha por Efimova y Eckert (citado por Eckert y col, 2002)
quienes consideran que las señales positivas para la diferenciación del queratinocito están
asociadas con pobre actividad de ERK1/2.
Una proteína adicionalmente estudiada en este trabajo correspondió a TANK. Esta forma parte
del complejo de proteínas accesorias de CD40 en la membrana plasmática y, con excepción de
TRAF4, se encuentra asociada a todos los miembros de la familia TRAF (TRAF1-TRAF6; Inoue
y col, 2000). Chin y col (1999) han señalado que la habilidad de TANK para modular la
activación de NF-κB podría reflejar un potencial efecto activador o inhibidor de este factor de
transcripción. De hecho, la sobre-expresión de TANK en la línea de células embrionarias de
riñón 293 impide la asociación de TRAF2 con TNFR2 e inhibe la activación de NFκB inducida
por TNFR2 y CD40 (Rothe y col, 1996). Desde este punto de vista, TANK parece corresponder a
una molécula reguladora de la actividad de los factores de transcripción nuclear que son
inducidos como respuesta a la conjugación de los receptores de la familia de TNFR (como
CD40). En nuestro estudio, la activación de CD40 con M89 indujo un aumento en la expresión de
TANK tanto en ausencia como en presencia de IFN-γ. Considerando que TANK se asocia
34
molecularmente a prácticamente todos los miembros de la familia TRAF y que simultáneamente,
regularía la activación de NF-κB, el aumento de expresión de TANK observada en nuestros
experimentos puede ser interpretado como un indicio de la translocación nuclear de dicho factor.
La activación de CD40 en los queratinocitos con el anticuerpo M89 efectivamente induce la
translocación nuclear de p65, una proteína del complejo NF-κB (Concha y col, resultados no
publicados). Más recientemente se ha observado que durante la regeneración epidérmica, p50,
otro miembro de este complejo, es tempranamente translocado al núcleo de los queratinocitos de
los estratos espinoso- y granuloso-símil (Arias y col, tesis en progreso). Para ahondar en este
problema, se debería investigar si como consecuencia de la activación de CD40, la translocación
al núcleo de p50 y p65 están asociadas o no con expresión aumentada de TANK.
Los TRAFs constituyen una familia de adaptadores proteicos altamente conservados en la escala
evolutiva y corresponden a los principales traductores de señales de la superfamilia de receptores
de TNF y de receptores de IL-1/Toll-like. Mediante la inducción de la proliferación,
diferenciación y muerte celular las moléculas TRAF participan en la regulación de un amplio
rango de funciones biológicas tales como el desarrollo embrionario, el metabolismo óseo, la
inmunidad innata y adaptativa y la respuesta al estrés (Arch y col, 1998; Chung y col 2002).
Nuestros resultados revelaron que en los queratinocitos de cuatro individuos diferentes la
estimulación de CD40 induce, en presencia o ausencia de IFN-γ, un aumento significativo en la
expresión de TRAF3 pero no de TRAF6. Probablemente la función más importante mediada
corriente abajo por los TRAFs es la activación de los factores de transcripción nuclear NF-B y
AP-1, hecho bien conocido para TRAF6 (Chung y col 2002). Precisamente, estudios realizados
en la línea de células humanas 293 demostraron que la sobre-expresión de TRAF6 provoca la
activación del factor de transcripción NFκB (Cao y col, 1996). Respecto a TRAF3, la
información existente en la literatura sugiere una función inhibitoria sobre la activación de NFB (Chung y col 2002). Sin embargo, los animales transgénicos TRAF3 -/- muestran, entre otras
alteraciones, severas deficiencias en el número de linfocitos totales con respecto a los animales
controles, por lo que se supone que esta proteína está implicada en la supervivencia celular (Xu y
col, 1996). Tampoco debe olvidarse que una de las características de las moléculas TRAF,
incluidas TRAF-3 y TRAF6, es que tienden a ser redundantes en su función. Considerando en
conjunto estas evidencias, los resultados obtenidos en esta tesis respecto a TRAF3 pueden
35
interpretarse como su probable contribución al menos a la supervivencia celular, en la cual la
activación de factores transcripcionales podría ser importante.
Nuestros resultados respecto a TANK y a las moléculas TRAF revelaron el aumento de la
expresión de estas proteínas rápidamente después de la estimulación de CD40 (30 min). En
células en reposo las proteínas TRAF se encuentran localizadas en organelas citoplasmáticas pero
al ocurrir la estimulación de un receptor de la familia de receptores de TNF, los TRAF se
redistribuyen a la membrana plasmática (Chung y col 2002). Esta redistribución facilitaría la
transmisión de señales desde el receptor y permitiría, además, explicar el aumento en la expresión
de proteínas observado en nuestros experimentos a un tiempo tan breve de respuesta. Apoyando
esta idea, se ha demostrado que luego de quince minutos de la adición de una forma multimérica
soluble de CD40L a células humanas DND39 (línea de células de linfoma), TRAF2 Y TRAF3
co-inmunoprecipitan junto a CD40 (Kuhné y col, 1997). Aunque no es conocido que ocurra un
cambio conformacional de TANK o TRAFs durante su redistribución celular, un cambio de los
epítopes expuestos también ayudaría a explicar el aumento de su expresión.
Diferentes autores han estudiado la participación de p-JNK, c-jun y p38 en los procesos de
proliferación y diferenciación celular en queratinocitos. En este trabajo nosotros analizamos
mediante Western blotting y quimioluminiscencia si la activación de CD40 con agonistas
solubles inducía cambios en la expresión de dichas señales. Sin embargo, debido a limitaciones
técnicas no se obtuvieron resultados satisfactorios. Antes de descartar que la activación de CD40
en los queratinocitos humanos no afecta la expresión de p-JNK, c-jun y p38 se deberían probar
nuevos anticuerpos dirigidos contra dichas moléculas. Se debe advertir que en el modelo de
regeneración epidérmica empleado en nuestro laboratorio (Arias y col, tesis en progreso) se
detectó la translocación nuclear de c-jun en los estratos espinoso- y granuloso-símil.
Los cambios más significativos en segundas señales observados en este estudio ocurrieron en el
donante p2 que tenía antecedentes clínicos de colitis ulcerativa y, en cambio, la menor
reactividad fue observada en el donante p4 con diagnóstico de hipotiroidismo. Aunque parece
muy interesante analizar una posible asociación entre estas patologías y el nivel de cambios en las
segundas señales estudiadas, se requiere investigar un mayor número de individuos con dichas
patologías para determinar si los cambios son relevantes o no.
36
Nuestro estudio de segundas señales, realizado en queratinocitos obtenidos de una población
humana escogida al azar, demostró que la activación de CD40 inhibe significativamente la
fosforilación de MAPK 42/44 y que en cambio, incrementa la expresión de TANK y TRAF3,
mientras que la expresión de TRAF6 no se altera mayormente (Fig. 9). No es posible descartar
que los efectos de CD40 sobre (pro)filagrina y el cambio de morfología de los queratinocitos a
células diferenciadas estén mediados por segundas señales diferentes a las aquí analizadas, o que
en los cambios inducidos por CD40 participen múltiples moléculas. No obstante, los
queratinocitos de los donantes analizados son demostrativos de que la estimulación de CD40,
induce cambios en las moléculas estudiadas. Aún más, fue posible distinguir que la expresión de
TANK y TRAF3 se encuentra asociada entre sí y es independiente del estado de fosforilación de
MAPK 42/44. También, de acuerdo a nuestros resultados, existe la posibilidad de que en el efecto
diferenciador de CD40 intervengan polipéptidos fosforilados, de los cuales parece especialmente
interesante un polipéptido de masa molecular de aproximadamente 54 KDa fosforilado en
residuos de treonina/prolina.
BIBLIOGRAFIA
Arch, R., Gedrich, R., Thompson, C., (1998) Tumor necrosis factor-associated factors (TRAFs)a family of adapter proteins that regulates life and death. Genes & development, 12: 2821-2830.
Banchereau, J., Bazan, F., Blanchard, D., Briere, J., Galizzi, P., van Kooten, C., Liu, Y.J.,
Rousset F., Saeland, S., (1994) The CD40 antigen and its ligand. Annu. Rev. Immunol., 12: 881922.
Burbach, G., Ansel, J., Armstrong, C., (2001) Cytokines in the skin. En: Freinkel, R. K. and
Woodley, D. T. (ed) The biology of the skin: 299-364. The Parthenon Publishing Group, London.
Cao, Z., Xiong, J., Takeuchi, M., Kurama, T., Goeddel, D., (1996) TRAF6 is a signal transducer
for interleukin-1. Nature, 383: 443, 446.
Chang, L., Karin, M., (2001) Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature, 410: 37-40.
Cheng, G., Baltimore, D., (1996) TANK, a co-inducer with TRAF2 of TNF- and CD40-mediated
NF-κB activation. Genes & Dev., 10: 963-973.
Chin, A. I., Shu, J., Shi, C. S., Yao, Z., Kehrl, J., Cheng, G., (1999) TANK potentiates tumor
necrosis factor receptor-associated factor-mediated c-jun N-terminal kinase/stress-activated
37
protein kinase activation through the germinal center kinase pathway. Mol. Cell. Biol., 19: 66656672.
Chung, J., Chul Park, Y., Ye, H., Wu, H., (2002) All TRAFs are not created equal: common and
distinct molecular mechanism of TRAF-mediated signal transduction. J. cell Sc., 115: 679-688.
Cobb, M. H., Goldsmith, E. J. (1995) How MAPK Kinases Are Regulated. J. Biol. Chem., 27014843-14846.
Concha, M., Vidal, M. A., Moreno, I., Salem, C., Figueroa, C. D., Schmitt, D. and PeguetNavarro, J. (2003) Evidence for modulation of human epidermal differentiation and remodelling
by CD40. Br. J. Dermatol., 148, 1105-1114.
Denfeld, R., Hollenbaugh, D., Fehrebach, A., Weiss, J., von Leoprechting, A., Mai, B., Voith,
U., Schöpf, E., Aruffo, A., Simon, J., (1996) CD40 is functionally expressed on human
keratinocytes. Eur. J. Immunol., 26: 2329-2334.
Eckert, R., Efimova, T., Dashti, S., Balasubramanian, S., Deucher, A., Crish, J., Sturniolo, M.,
Bone, F., (2002) Keratinocyte survival, differentiation, and death: many roads lead to MitogenActivated protein kinase. J. Invest. Dermatol., 7: 36-40.
Faris, M., Gaskin, F., Parsons, T., Fu, S. M., (1994) CD40 signaling pathway: Anti-CD40
monoclonal antibody induces rapid dephosphorylation and phosphorylation of tirosinephosphorylated proteins including protein tyrosine kinase Lyn, Fyn, and Syk and the appearance
of a 28-kD tyrosine phosphorylated peotein. J. Exp. Med., 179: 1923-1931.
Federici, M., Giustizieri, M. L.., Scarponi, C., Girolomoni, G., Albanesi, C., (2002) Impaired
IFN-γ-dependent inflamatory responses in human keratinocytes overexpressing the suppressor of
citokine signalling 1. J. immunol., 168: 434-442.
Gaspari, A., Sempowski, G., Chess, P., Gish, J., Phipps, R., (1996) Human epidermal
keratinocytes are induced to secrete interleukin-6 and co-stimulate T lymphocyte proliferation by
a CD40-dependent mechanism. Eur. J. Immunol., 26: 1371-1377.
Gentleman, S., Martensen, T., Digiovanna, J., Chader, G. (1984) Protein tyrosine kinase and
protein phosphotyrosine phosphatase in normal and psoriatic skin. Biochim. Biophys. Acta,
798:53-59.
Gille, H., Sharrocks, A. D., Shaw, P. E. (1992) Phosphorylation of transcription factor p62TCF
by MAP kinase stimulates ternary complex formation at c-fos promoter. Nature., 358, 414-417.
38
Grousson, J., Ffrench, M., Concha, M., Schmitt, D., Péguet-Navarro, J., (2000) CD40 ligation
alters the cell cycle of differentiating keratinocytes. J. Invest. Dermatol., 114: 581-586.
Haxhinasto, S., Bishop, G., (2003) A novel interaction between protein kinase D and TNF
receptor-associated factor molecules regulates B cell receptor-CD40 synergy. J. immunol., 171:
4655-4662.
Howie, S., Aldridge, R., McVittie, E., Forsey, R., Sands, C., Hunter, J., (1996) Epidermal
keratinocyte production of IFN-γ immunoreactive protein and mRNA is an early event in allergic
contact dermatitis. J. Invest. Dermatol., 106: 1218-1223.
Inoue, J., Ishida, T., Tsukamoto, N., Kobayashi, N., Naito, A., Azuma, S., Yamamoto, T., (2000)
Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Factor (TRAF) Family: adapter proteins that
mediate cytoquine signalling. Exp. Cell Res., 254: 14-24.
Kuhné, M., Robbins, M., Hambor, J., Mackey, M., Kosaka, Y., Nishimura, T., Gigley, J., Noelle,
R., Calderhead, D., (1997) Assembly and regulation of the CD40 receptor complex in human B
cells. J. Exp. Med., 186: 337-342.
Mitev, V. and Miteva, L. (1999) Signal transduction in keratinocytes. Exp. Dermatol., 8, 96-108.
Noelle, R. J., Ledbetter, J. A. and Aruffo, A. (1992) CD40 and its ligand, an essential ligandreceptor pair for thymus-dependent B-cell activation. Immunol. Today, 13, 431-433.
Péguet-Navarro, J., Dalbiez-Gauthier, C., Moulon, C., Berthier, O., Réano, A., Gaucherand, M.,
Banchereau, J., Rousset, F. and Schmitt, D. (1997) CD40 Ligation of human keratinocytes
inhibits their proliferation and induces their differentiation. J. Immunol., 158, 144-152.
Rheinwald, J. G. and Green, H. (1975) Serial cultivation of strains of human epidermal
keratinocytes: the information of keratinizing from single cells. Cell., 6: 331-343.
Rothe, M., Xiong, J., Shu, H.B., Williamson, K.., Goddard, A.., Goeddel, D., (1996) I-TRAF is a
novel TRAF-interacting protein that regulates TRAF-mediated signal transduction. Proc. Natl.
Acad. Sci., 93:8241-8246.
Splawski, J. B., Lipsky, P.E., (1994) CD40-mediated regulation of human B-cell responses. Res.
Immunol. 145: 226-234.
Stout, R., Suttles, J., (1996) The many roles of CD40 in cell-mediated inflammatory responses.
Immunol. Today, 17: 487-492.
van Kooten, C., Banchereau, J., (1997) Immune regulation by CD40-CD40L interactions.
Frontiers in Biosc., 1: 1-11.
39
Xu, Y., Cheng, G., Baltimore, D., (1996) Targeted disruption of TRAF3 leads to postnatal
lethality and defective T-dependent immune responses. Immunity, 5: 407-415.
Descargar

fcg984i - Tesis Electrónicas UACh