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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
FISIOLOGÍA DE LA NUTRICIÓN
PRÁCTICA NÚM. 3
DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS INDISPENSABLES
(METODO ESPECTROFOTOMETRICO PARA LA DETERMINACIÓN DE
TRIPTÓFANO SEGÚN BEAVEN Y HOLLIDAY)
1. OBJETIVOS
1.1.
Evaluar la importancia de conocer el contenido
indispensables en los alimentos naturales y procesados.
de
aminoácidos
1.2.
Determinar el contenido de triptófano en algunos alimentos naturales y
procesados.
2. INTRODUCCIÓN
La mayoría de los aminoácidos constituyentes de proteínas son prácticamente
transparentes en la región 250-320 nm del espectro ultravioleta, y es sabido que
fenil alanina, tirosina y triptofano son los responsables de la absorción de la luz
ultravioleta en soluciones de proteínas. La fenil alanina presenta una absorción
muy débil en este intervalo de longitud de onda y en soluciones acuosas de NaOH
0.1M presenta un máximo de absorción a 258.5 nm, teniendo un coeficiente de
extinción molar de valor bajo.
La absorción de la luz ultravioleta ejercida por tirosina (Tyr) y triptofano (Try) es
mucho mayor que la absorción presentada por fenil alanina en la misma región del
ultravioleta, por lo que puede despreciarse el valor de ésta última, y por tanto, se
puede considerar a la solución de proteína como un sistema de 2 componentes
para el análisis espectrofotométrico. Las soluciones equimoleculares de Tyr y Try
presentan la misma absorción a 294 nm se encuentran en solución alcalina 0.1M.
El método está basado en dos observaciones hechas sobre el espectro de
absorción ultravioleta en la región de 250 a 320 nm, de la mezcla de Tyr y Try
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
puros a concentraciones equimoleculares conocidas en solución 0.1M de NaOH.
El máximo de absorción de Try se observa a 280 nm y a 294 nm para Tyr. Figura
(3)
Este método de mezclas es estrictamente aplicable cuando se mantiene la ley de
Lambert-Beer. En los casos de aminoácidos aromáticos, la ley de Lambert-Beer es
válida sólo para ciertos intervalos. Las mediciones de absorbancia de una solución
de proteínas en álcali N/10, determinadas para las longitudes de onda de 280 a
294 nm, a la vez referidas a los valores del contenido de nitrógeno, se utilizan para
calcular la cantidad de Triptófano presente, por sustituciones desarrolladas por
Beaven y Holliday (1).
M Try = (0.263 A280 – 0.170 A294) x 10-3
M Tyr = (0.592 A294 – 0.263 A280) x 10-3
3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR.
3.1. Explicar los fundamentos en los que se basa la técnica para la determinación
de triptófano.
3.2. Investigar el contenido de triptófano en los alimentos que se analizarán en la
práctica.
3.3. Investigar sobre la importancia de conocer el contenido de aminoácidos
indispensables en los alimentos.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
4.1. El profesor responsable de la práctica indicará los alimentos que se
analizarán.
4.2. Llevar a cabo la determinación que se indica a continuación:
Espectro de absorción de la mezcla de las soluciones de triptofano y tirosina
REACTIVOS
Solución de NaOH 0.1 M
Práctica Núm. 3
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
PROCEDIMIENTO
A una mezcla equimolecular de los aminoácidos Try y Tyr (0.1 mM) se le
determina el valor de absorción en la región ultravioleta del espectro de la luz
entre 270 y 315 nm y para las regiones de máxima absorción se determina la
absorbancia a intervalos entre 5 a 1 nm de longitud de onda. Se construye una
figura con los valores de absorbancia obtenidos para longitud de onda. El valor
máximo de absorción para tirosina se obtuvo a una longitud de onda de 294 nm y
para triptofano a 280 nm.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Las muestras de los diferentes alimentos fueron puestas en los matraces, a los
cuales se les agregaron 20 mL de NaOH 0.1M, las suspensiones fueron
calentadas a reflujo por 30 min.
Transcurrido este tiempo, se enfrían los matraces y su contenido se filtra o
centrífuga según el caso, el sobrenadante obtenido se vacía cuantitativamente en
un matraz aforado de 25 mL, con la solución de NaOH se lleva a un volumen final
de 25mL. De cada una de estas disoluciones se toma una alícuota en las celdas
de cuarzo de 1cm de paso de luz y se leen en el espectrofotómero a ambas
longitudes de onda.
Los valores obtenidos a esas longitudes de onda se substituyen directamente en
la ecuación derivada por Beaven y Holliday (1), con lo cual se obtiene el contenido
de Try de las muestras de los alimentos.
Duración del método:
35 minutos
5. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.
5.1. Presentar la curva tipo de triptofano obtenida, así como las determinaciones
de los alimentos problema.
5.2. Presentar en forma de tabla, con unidades, los resultados de las
determinaciones hechas a los alimentos, incluyendo en esta tabla los valores
establecidos en la bibliografía consultada.
5.3. Discutir, de manera integral, los resultados obtenidos, tomando en cuenta los
siguientes aspectos:
Práctica Núm. 3
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN

El contenido de triptófano en los diferentes alimentos con respecto a lo
reportado para estos alimentos en la bibliografía.

Puntos críticos en las determinaciones.

Posibles fuentes de error en las determinaciones.

Importancia de conocer el contenido de aminoácidos indispensables, como
el triptofano, en los alimentos.
6. CONCLUSIONES.
Elaborar sus conclusiones de la práctica en base al análisis y discusión de
resultados y a los objetivos planteados.
7. BIBLIOGRAFÍA.
1. Beaven G.H. and Holliday E.R. Análisis of the Absortion of Proteins in Term
of Tyrosine and Tryptophan Content. Adv. Protein Chem. 7, (1952), 369.
2. Bencze W.L. and Schimd Karl. Determination of Tyrosine and Tryptophan in
Protein. Anal. Chem. 29, (1957), 1193 – 1196.
3. Bender E. Arnold: Processing Damage to Protein Food. Pag. Bulletin 13,
Winter 1971, Vol. 2, No. 1, (1972), pág.10.
4. Black S. – Burn. Aminoacids Determination, Method an Techniques, 1968,
20, 190-193.
5. Clarence E. May and Rose E.R. The Tryptophan Content some Proteins. L.
Biol. Chem. August 7, (1922), 213 – 216.
6. Dahl O. The inverse Relationship between Tryptophan and Hidroxiproline in
Animal Tissues. Acta Chem. Scad. 14, (1960), 227.
7. Dahl O. Zur Analytik der Eiweissqualität von Fleisch-Waren, Dic
Fleischwirtschaft 48, (1968), 444.
Práctica Núm. 3
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
8. Fischl Joseph. Quantitative Colorimetric Determination of Tryptophan. J.
Biol. Chem. Vol. 235, (1960), 999 – 1001.
9. Goodwin T.W. and Morton R.A. The Spectrophotometric Determination of
Tyrosine and Tryptophan in Proteins. Biochem Journal 40, (1946), 628.
10. Graham C.E., Smith E.P., Hier S.W. and Klein D.J. Biol. Chem. 168 (1947),
711.
11. Harper A. Harold. Manual de Química Fisiológica 3ª. Ed. (1971), 392 – 397.
12. Howe Jean M., Yamura Y. And Clark E. Helen. American Asociation of
Cereal Chemist. Inc. Sept.-October (1972), 566 – 570.
13. Spies J.R. and Chambers anal. Chem. 21 (1949), 1249.
Práctica Núm. 3
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
PRÁCTICA NÚM. 3
DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS INDISPENSABLES
( TRIPTÓFANO )
1. OBJETIVOS
1.3.
Evaluar la importancia de conocer el contenido
indispensables en los alimentos naturales y procesados.
de
aminoácidos
1.4.
Determinar el contenido de triptófano en algunos alimentos naturales y
procesados.
2. INTRODUCCIÓN
Estrictamente hablando, todos los aminoácidos son unidades esenciales para la
síntesis de la molécula de proteína. Sin embargo, el cuerpo puede fabricar algunos
aminoácidos si tiene una fuente adecuada de nitrógeno, pero no es capaz de
formar otros en cantidades suficientes para satisfacer sus necesidades.
Estos aminoácidos que el cuerpo no puede sintetizar en cantidades adecuadas
son llamados indispensables o esenciales, por que deben ser suministrados
mediante la dieta ( los alimentos que ingerimos ) en proporciones adecuadas para
cubrir los requerimientos para el mantenimiento y crecimiento de los tejidos.
Un individuo está en equilibrio o balance nitrogenado cuando la ingesta de
nitrógeno proveniente de las proteínas es casi igual a la perdida de nitrógeno en
las heces y la orina. Un adulto que consume una dieta que contiene cantidades
suficientes de aminoácidos indispensables estará en balance o equilibrio de
nitrógeno. Si un aminoácido indispensable es eliminado de la dieta el resultado es
un balance de nitrógeno negativo. Esto significa que más nitrógeno esta siendo
perdido que él que es consumido, por que los tejidos que requieren los
aminoácidos indispensables no pueden ser mantenidos y por lo tanto son
agotados y su nitrógeno excretado. El equilibrio de nitrógeno puede lograrse otra
vez cuando los aminoácidos indispensables faltantes son suministrados en
cantidades adecuadas para mantener los tejidos.
Práctica Núm. 3
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
El adulto humano requiere de ocho aminoácidos indispensables y los niños en
crecimiento necesitan nueve o quizá diez aminoácidos. Estos son:
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptófano
Valina
Histidina (niños)
3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR.
3.1. Explicar los fundamentos en los que se basa la técnica de Spies y Chamber
para la determinación de triptófano.
3.2. Investigar el contenido de triptófano en los alimentos que se analizarán en la
práctica.
3.3. Investigar sobre la importancia de conocer el contenido de aminoácidos
indispensables en los alimentos.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
4.1. El profesor responsable de la práctica indicará los alimentos que se
analizarán.
4.2. Llevar a cabo cada una de las determinaciones que se indican a continuación:
4.2.1. Determinación de triptófano (método de Spies y Chamber).
Práctica Núm. 3
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
MATERIAL
Tubos de ensaye de 16x150 mm
Matraces volumétricos de 50 Ml
Matraces volumétricos de 100 mL
Matraces Kjeldahl de 500 mL
EQUIPO
Balanza analítica
Espectrofotómetro
Celdas para espectrofotómetro
Equipo de digestión y destilación
Kjeldahl
Pipetas volumétricas de 1 mL
Pipetas volumétricas de 5 mL
Matraces Erlenmeyer de 250 o 500 mL
Probetas de diferentes capacidades
Bureta de 50 mL
REACTIVOS
Solución tipo de triptofano 0.01% en NaOH 1N
Solución de nitrito de sodio 0.05% en agua destilada
Solución de para-dimetilaminobenzaldehido 0.5% en HCl 1N
Ácido sulfúrico al 60% (v/v) tener en cuenta la puereza
Reactivos necesarios para la determinación de nitrógeno total (proteínas) por el
método de Kjeldahl.
PROCEDIMIENTO
1. Determinar el contenido de nitrógeno proteico de la muestra problema,
mediante el método Kjeldhal.
2. Preparar una curva tipo a partir de la solución patrón de triptofano que
incluya concentraciones de triptofano entre los limites de 10 g/mL. A cada
uno de los tubos que contienen la solución patrón se les agregan 2.5 mL de
la solución de para-dimetilaminobenzaldehido y se les adiciona la solución
de H2SO4 al 60% hasta completar el volumen final de 14.5 mL.
Preparar también un testigo que no contenga solución patrón de triptofano.
TUBO
Sol. de Triptofano
(mL)
PDAB
(mL)
Testigo
1
2
3
4
5
6
0.0
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
1.0
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
Práctica Núm. 3
H2SO4 al
60%
(mL)
12.0
11.9
11.7
11.5
11.3
11.1
11.0
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
3. Agitar los tubos y colocarlos en la oscuridad durante 17 hrs., una vez
transcurrido este tiempo agregarles 0.1 mL de nitrito de sodio al 0.05%,
dejarlos en reposo durante 30 min. y leer absorbancia a 590 nm. La curva
tipo obtenida deberá tener un coeficiente de correlación mayor o igual a 0.9
para que pueda utilizarse.
4. Para cuantificar el triptofano en la proteína problema, pesar 10 mg de
muestra y seguir el procedimiento descrito anteriormente.
5. Leer en la curva obtenida la cantidad de triptofano en la muestra (no olvidar
preparar un testigo para leer la muestra).
6. Informar los resultados en: g por 100g de proteína y mg/g de nitrógeno.
5. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.
5.1. Presentar la curva tipo de triptofano obtenida, así como las determinaciones
de los alimentos problema.
5.2. Presentar en forma de tabla, con unidades, los resultados de las
determinaciones hechas a los alimentos, incluyendo en esta tabla los valores
establecidos en la bibliografía consultada.
5.3. Discutir, de manera integral, los resultados obtenidos, tomando en cuenta los
siguientes aspectos:

El contenido de triptófano en los diferentes alimentos con respecto a lo
reportado para estos alimentos en la bibliografía.

Puntos críticos en las determinaciones.

Posibles fuentes de error en las determinaciones.

Importancia de conocer el contenido de aminoácidos indispensables, como
el triptofano, en los alimentos.
Práctica Núm. 3
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
6. CONCLUSIONES.
Elaborar sus conclusiones de la práctica en base al análisis y discusión de
resultados y a los objetivos planteados.
7. BIBLIOGRAFÍA.
1. Beaven G.H. and Holliday E.R. Análisis of the Absortion of Proteins in Term
of Tyrosine and Tryptophan Content. Adv. Protein Chem. 7, (1952), 369.
2. Bencze W.L. and Schimd Karl. Determination of Tyrosine and Tryptophan in
Protein. Anal. Chem. 29, (1957), 1193 – 1196.
3. Bender E. Arnold: Processing Damage to Protein Food. Pag. Bulletin 13,
Winter 1971, Vol. 2, No. 1, (1972), pág.10.
4. Black S. – Burn. Aminoacids Determination, Method an Techniques, 1968,
20, 190-193.
5. Clarence E. May and Rose E.R. The Tryptophan Content some Proteins. L.
Biol. Chem. August 7, (1922), 213 – 216.
6. Dahl O. The inverse Relationship between Tryptophan and Hidroxiproline in
Animal Tissues. Acta Chem. Scad. 14, (1960), 227.
7. Dahl O. Zur Analytik der Eiweissqualität von Fleisch-Waren, Dic
Fleischwirtschaft 48, (1968), 444.
8. Fischl Joseph. Quantitative Colorimetric Determination of Tryptophan. J.
Biol. Chem. Vol. 235, (1960), 999 – 1001.
9. Goodwin T.W. and Morton R.A. The Spectrophotometric Determination of
Tyrosine and Tryptophan in Proteins. Biochem Journal 40, (1946), 628.
10. Graham C.E., Smith E.P., Hier S.W. and Klein D.J. Biol. Chem. 168 (1947),
711.
11. Harper A. Harold. Manual de Química Fisiológica 3ª. Ed. (1971), 392 – 397.
12. Howe Jean M., Yamura Y. And Clark E. Helen. American Asociation of
Cereal Chemist. Inc. Sept.-October (1972), 566 – 570.
13. Spies J.R. and Chambers anal. Chem. 21 (1949), 1249.
Práctica Núm. 3
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