Genetica oso pardo cantabrico

LAS SORPREDENTES DINÁMICAS DE MIGRACIÓN Y TAMAÑO
EN LA POBLACIÓN DEL VIEJO OSO PARDO IBÉRICO
Cristina Valdiosera, José Luis García-Garitagoitia, Nuria García, Ignacio Doadrio;
Mark G. Thomas, Catherine Hänni, Juan-Luis Arsuaga, Ian Barnes, Michael Hofreiter,
Ludovic Orlando, and Anders Götherstöm
Las poblaciones en peligro de extinción en la Península Ibérica estaban consideradas
como los últimos fragmentos de las poblaciones de Oso Pardo que recolonizaron
amplias zonas de Europa durante el Pleistoceno. Los esfuerzos de conservación son
intensos y los resultados se siguen de cerca. Sin embargo, el esfuerzo se basa en la
asunción de que el Oso Ibérico es una especie única que evoluciono localmente
durante largo tiempo. Hemos obtenido la secuencia mitocondrial del DNA de los restos
de un viejo Oso Ibérico y lo hemos analizado como una serie de datos, siguiendo los
cambios en la diversidad y existencia de los grupos genéticos europeos a lo largo del
tiempo. Usando estos datos, se consigue demostrar que la población ibérica de oso ha
experimentado una historia dinámica evolutiva reciente. La población no solo ha
sufrido el flujo genético mitocondrial de otros osos europeos, sino que también su
tamaño efectivo ha fluctuado sustancialmente. Sacamos como conclusión que la
población ibérica de oso pardo ha sido una unidad evolutiva, desarrollada a partir de
evolución genética de otras poblaciones y cuellos de botella en las poblaciones, lejos
de tener un equilibrio genético o estar aisladas de otras poblaciones de oso pardo. Así,
la situación actual es altamente inusual y la población puede ser que está aislada por
primera vez en su historia.
El oso pardo está incluido en la lista de la Unión Internacional para la Conservación
de la Naturaleza y Recursos Naturales como una especie en peligro de extinción. La
especie ahora mismo se distribuye a lo largo de tres continentes distintos: Asia,
Europa y Norteamérica. Las áreas de distribución se han reducido drásticamente en la
historia reciente. Por ejemplo, en los Estados Unidos, la población se ha reducido en
un 75% en solo un siglo, debido en su mayoría a la reducción de su hábitat. Aunque
está presente de forma abundante en Alaska y Canadá y en otro tiempo ocupando
mucho de lo que es hoy Estados Unidos y norte de México, quedan pocos osos en
algunas áreas del Norte de Estados Unidos y la especie esta extinguida en México.
Como en América, el oso pardo es abundante en las zonas del norte de Europa, pero
ha sido reducida a pequeñas y fragmentadas poblaciones en el sur de Europa. La
mayoría de las poblaciones del sur de Europa están en peligro de extinción. Italia
alberga dos poblaciones aisladas en alto riesgo de extinción y la situación es similar en
Grecia, los Pirineos y España. La población Pirenaica se redujo a cinco o seis
ejemplares según las estimaciones de los años ochenta. Se han hecho dos
reintroducciones desde el 1993, llevando ejemplares de la reserva de Kocevje en
Eslovenia. Las montañas Cantábricas en el norte de España, donde quedan dos
poblaciones, representan el límite sur-occidental de la presencia del oso en Europa.
Estas dos pequeñas poblaciones están geográficamente aisladas, la del este con solo
25-30 ejemplares y la occidental con unos 120. Algunas de estas poblaciones
fragmentadas han sido definidas como simples unidades de conservación. Las
poblaciones cantábricas están en alto riesgo de extinción y la situación de los osos
pirenaicos es aun peor.
Aunque hoy día amenazado en el sur de Europa y extinguido de amplias áreas de
Centroeuropa, el oso pardo ha sido una parte integral de la fauna europea durante al
menos el ultimo medio millón de años. Estudios de ADN mitocondrial de las
poblaciones que quedan los dividen en dos linajes, el oriental y el occidental, con la
rama occidental subdividida a su vez en dos ramas, una que comprende los osos
desde los Pirineos, el sur de Suecia y España y la otra los de Italia y los Balcanes. Las
poblaciones Cantábricas son las únicas en las cuales la diversidad genética no ha sido
alterada por el hombre mediante reintroducciones de osos provenientes de otras
poblaciones. Los dos grupos occidentales se cree que se originaron desde dos
reductos ancestrales de las glaciaciones. El linaje oriental se cree que se expandió
desde otro reducto ubicado en los Cárpatos.
El oso pardo ibérico se cree que quedo aislado durante extensos periodos de
tiempo y supuestamente fue el origen de recolonizaciones en Europa después de
múltiples glaciaciones, incluyendo los últimos máximos en las glaciaciones (LGM),
hace entre 23 y 18 mil años. El caudal genético en la península ibérica se considero de
menor importancia porque el supuesto tamaño de las ancestrales poblaciones, en
combinación con la extinción del oso en las poblaciones de las regiones limítrofes a la
Península Ibérica, excluiría contribuciones externas. Así que, el oso pardo ibérico
parece haber ocupado de forma continua la península y posiblemente haberse
adaptado a las condiciones locales al menos desde el Pleistoceno. Si este es el caso,
la conservación del oso ibérico es importante, no solo para la península, sino para
Europa entera, para la cual ha servido como reducto de recolonización pos-glacial. Sin
embargo, algunos recientes estudios sugieren que la amplitud del caudal genético,
suponiendo que proviene de material contemporáneo, puede haber sido subestimado
y hay evidencias de que esto es también verdad para los verdaderos osos ibéricos. De
hecho, el oso ibérico puede haber sido parte de una continua población europea,
aunque aislada en distancia, incluso durante el LGM. Para investigar este extremo
más profundamente, analizamos secuencias de ADN de osos viejos y modernos.
Usamos estas series de datos para identificar cambios potenciales en el tamaño de las
poblaciones, estimar el caudal genético e investigar la diversidad genética de la
población ibérica desde el Pleistoceno hasta su actual, aunque reducido, tamaño.
RESULTADOS
Afinidades genéticas de la población española. Amplificamos y secuenciamos
exitosamente ADN mitocondrial de un total de 14 osos usando 20 muestras fósiles y
subfósiles. La serie de datos contenía secuencias de viejos osos pardos ibéricos, de
las cuales algunas eran de lugares que habían previamente almacenado ADN. Una
muestra fue identificada como de ‘Ursus spelaeus’. De las 13 restantes, 4 formaban
una secuencia de 115 bp, mientras que 9 formaban una secuencia de 177 bp (en las
posiciones 16589–16650, 16728–16792, and 16800–16849 de genoma de ADN
mitocondrial del oso pardo, entrada nº AF303110). Además, 24 muestras de osos
pardos modernos (de 177 bp largo, entradas numero EU400184-EU400206) se
obtuvieron de muestras de pelo mudado de la población actual de la Cordillera
Cantábrica en el norte de España. No se detecto contaminación en ninguno de los
controles negativos que se usaron durante el proceso de extracción y amplificación,
Para incluir todo el conjunto de los datos generados en el proceso, creamos dos
grupos de datos, que se extendían 177 bp y 115 bp de la zona de control mitocondrial
(a los que nos referiremos más abajo como el grupo largo y el corto, respectivamente).
En nuestros análisis, también incluimos halotipos de Oso Pardo Europeo disponibles
en bancos genéticos. En conjunto, los grupos largo y corto comprendían 67 y 71
secuencias de oso pardo respectivamente. Todos los análisis se hicieron usando los
dos grupos de datos independientemente y ofrecieron similares resultados. Obtuvimos
un árbol filogenético de la serie larga (Figura 1ª), para maximizar la resolución y
construimos una mínima red expandida usando la serie corta, para visualizar los datos.
La filogenia se estimo con la serie larga usando un grupo muy relacionado (la del
Ursus spelaeus). Aunque sin resolver parcialmente, tiene una topología similar a
aquella publicada previamente usando series de ADN mitocondrial tanto de osos
existentes como extinguidos. En nuestro árbol, identificamos 3 ramas principales
estadísticamente. Una rama comprende secuencias modernas orientales (Rusia) junto
con los osos ibéricos del Pleistoceno, los osos austriacos y un oso alemán del
Holoceno. Otra rama comprende un grupo de halotipos extinguidos, antes descrito
como una colonia del Holoceno en el sur de Francia. La tercera rama se pensaba
previamente que representaba dos grupos monofilicos (ibéricos e italianos/balcánicos).
Aunque nuestro árbol nos hace suponer estas dos ramas como grupos monofilicos, no
encontramos argumentos para demostrarlo. Esta última rama comprende secuencias
modernas y antiguas. Advertimos que las poblaciones ibéricas no entran todas en esta
última rama, lo que sugiere diferenciación genética entre los halotipos del Pleistoceno
y del LGM.
La red de menor extensión se construyó usando un total de 29 halotipos (Figura
1B). Las muestras de los lugares de Arlanpe y Valdegoba muestras halotipos muy
divergentes, junto con los datos publicados previamente de Atapuerca, la Gruta
Beatrice Cinci (Italia) y Muhlberg (Alemania).
Fig. 1. Diversidad genética antigua y actual. (A), Filogenia Bayesiana generada usando secuencias
de oso pardo europeo antiguo y actual (serie larga) y tres osos de cuevas. Los valores de muestreo se
indican encima del nudo y las probabilidades posteriores se muestran debajo del nudo. El color de cada
cuadro representa el origen, el número en itálica indica en halotipo y la ‘n’ es la frecuencia del halotipo.
(B), Red mínima de expansión indicando la distribución del halotipo de las secuencias de oso antiguo y
moderno (serie corta). Los números en los círculos indican el halotipo asignado de un total de 29 halotipos
obtenidos.
Se hicieron análisis de la varianza molecular (AMOVAs) sobre las series larga y
corta para probar las evidencias del aislamiento de las poblaciones española y las del
resto de Europa. A destacar que encontramos niveles significativos de subestructuras
geográficas en las poblaciones actuales y del Holoceno (serie larga: FSTcurrent _
0.5169, P _ 10_5; FSTHolocene _ 0.3391, P _ 10_4; serie corta: FSTcurrent _ 0.4540,
P _ 10_5; FSTHolocene _ 0.3345, P _ 10_5), pero no en el Pleistoceno (serie larga:
FSTPleistocene _0.17691, P _ 0.1723; serie corta: FSTPleistocene _ 0.1505, P =
0.1885). Los resultados hacen imaginar que el flujo genético entre Europa y España
fue mayor durante el Pleistoceno que en periodos más recientes (tanto en tiempos
recientes como en el Holoceno). Estas observaciones se tienen que considerar como
preliminares, debido a que el número de halotipos disponibles de periodos antiguos es
limitado y a que la población Ibérica parte claramente del supuesto de que su tamaño
es constante, lo que es un prerrequisito para cálculos exactos de FST (ver debajo).
Tabla 1. Sumario de estadísticas y test de neutralidad para las diferentes poblaciones de oso
pardo
L, nt Population
N
N Haplo.
Npoly.
H
Nucleotide diversity
Tajima D
D(P value) FS
FS(P value)
Long
176
Spain, present
27
5
6
0.2792 _ 0.1118
0.276% _0.273%
-2.099
0.001*
-2.154
0.029*
177
Spain, Holocene
10
5
9
0.6667 _ 0.1633
1.339% _ 0.899%
-1.473
0.070
-0.479
0.319
177
Spain, Pleistocene 5
4
20
0.9000 _ 0.1610 8.921% _ 5.631%
-0.616
0.365
1.395
0.708
177
Spain, ancient
15
9
30
0.8476 _ 0.0878
6.746% _ 3.627%
-0.681
0.274
0.168
0.556
177
Europe, present
11
8
22
0.9273 _ 0.0665
8.273% _ 4.532%
0.870
0.849
-0.005
0.464
177
Europe, Holocene 11
8
26
0.9273 _ 0.0665
6.190% _ 3.442%
-0.718
0.244
-0.431
0.382
177
Europe, Pleistoc
4
4
17
1.0000 _ 0.1768
7.664% _ 5.237%
-0.117
0.609
0.232
0.321
177
Europe, ancient
15
12
27
0.9619 _ 0.0399
6.599% _ 3.552%
-0.211
0.477
-2.828
0.098
114
Spain, present
27
5
5
0.2792 _ 0.1118
0.355% _ 0.377%
-2.010
0.003*
-2.530
0.013*
115
Spain, Holocene
14
6
8
0.7473 _ 0.1114
1.625% _ 1.109%
-1.284
0.108
-1.474
0.137
115
Spain, Pleistoc
5
4
13
0.9000 _ 0.1610 8.358% _ 5.408%
-0.279
0.484
0.780
0.560
115
Spain, ancient
19
10
19
0.8596 _ 0.0696
4.917% _ 2.757%
-0.962
0.145
-1.774
0.186
115
Europe, present
11
8
15
0.9273 _ 0.0665
8.002% _ 4.499%
0.698
0.803
-1.014
0.263
115
Europe, Holocene 11
8
18
0.9273 _ 0.0665
6.177% _ 3.543%
-0.825
0.233
-1.452
0.189
115
Europe, Pleistoc
4
4
11
1.0000 _ 0.1768
7.563% _ 5.293%
0.000
0.661
0.255
0.553
115
Europe, ancient
15
12
19
0.9619 _ 0.0399
6.598% _ 3.658%
-0.396
0.360
-4.531
0.009
Short
Diversidad genética de la población española. Usando secuencias de ADN de
24 osos ibéricos modernos y 13 antiguos, en combinación con las secuencias
publicadas de siete osos ibéricos antiguos y uno moderno (ver SI en la figura 3),
somos capaces de determinar el grado de diversidad genética en la península a través
de los tiempos, desde el Pleistoceno hasta aquí. Para probar si los cambios en la
diversidad muestran desarrollos paralelos en el resto de Europa, hicimos análisis
similares para las muestras de poblaciones no ibéricas, aprovechando los halotipos
expuestos con anterioridad (4, 18-20, 23). Merece la pena indicar que la diversidad
genética de la población de oso pardo español decrece continuamente desde el
Pleistoceno hasta los tiempos recientes (tablas 1). El modelo se observa para las
diferentes estadísticas que usamos como estimación de la diversidad genética (S, H y
diversidad nucleótido). Tal modelo no se observa en el mismo grado en la población
europea, lo que sugiere que la reducción de la diversidad genética entre el Pleistoceno
y hoy en día es especifica de la población española. Tal situación puede haber sido el
resultado del reciente cuello de botella demográfico, seguido de una expansión en la
población, como se sugiere del significativo valor estadístico negativo Tajima D y Li en
la población existente (Tablas 1).
Continuamos estimando el parámetro de mutación de la población, θ, y usado esto
en combinación con las estimaciones de la tasa de mutación para deducir el tamaño
efectivo (ver Materiales y métodos) de la población actual de oso pardo español y la
del Holoceno y Pleistoceno (SI tabla 2; hay que recordar que tales valores han sido
probablemente sobreestimados porque no todas las muestras del Holoceno y del
Pleistoceno son de la misma edad). Primero, calculamos dos estimadores θ (θs y θπ).
Merece la pena hacer notar que aunque estos dos valores permanecen constantes
para la población europea a lo largo de los tres periodos de tiempo distintos, decrecen
sobre el 60-85% post LGM (transición Pleistoceno/Holoceno) y en un 48-80% más de
reducción en tiempos recientes (del Holoceno a tiempos actuales). Estos resultados
sugieren dos cuellos de botella sucesivos que afectaron a la población de oso pardo
en España en la transición Holoceno-Pleistoceno (hace unos 10.000 años) y durante
los últimos 350 años (ya que el halotipo mas reciente considerado como un miembro
de la población del Holoceno es de unos 350 años más antiguo en nuestras series de
datos, ver Materiales y Métodos). Un patrón similar se obtiene si el parámetro θ es
estima usando una cadena combinada de muestreo genético de Markov-Montecarlo
(MAMARC 2.0) en un máximo de probabilidad en el marco Bayesiano, excepto que
notamos una reducción positiva de la población de oso europeo al final del Holoceno
(SI Tabla 3). Por consiguiente, lo más probable es que cambios en θ son indicativos de
una reducción del 54-69% en el tamaño efectivo del oso pardo en España post-LGM y
del 20-31% de reducción en tiempos recientes.
Se hicieron simulaciones de series combinadas para probar si los cambios en las
diversidades genéticas en ambas transiciones se pueden observar bajo un modelo de
tamaño constante de la población. (Figura 2, SI, fig 4 y SI tablas 4-9). Es interesante
observar que no fue posible detectar un cambio igual o mayor que el que se observa
del Holoceno a hoy en día en más de un 5% de nuestras simulaciones de series
combinadas, en tanto que el tamaño efectivo era mayor en unos 500-1000 ejemplares
(SI tablas 4 y 5). Por otra parte, un cambio similar a lo que se observa post-LGM
(transición Pleistoceno-Holoceno) aparece en más del 5% de nuestras simulaciones
de series combinadas solo para tamaños efectivos por debajo de 5000-10000
individuos o 10000-15000 individuos, dependiendo de la tasa de mutación que
consideremos (rápida y lenta, respectivamente; SI tablas 4 y 5).
Discusión
Presentamos una serie de datos de secuencias de ADN mitocondrial del 177bp y
115bp, respectivamente, que varían en edad desde el Pleistoceno hasta la actualidad.
Aunque son pequeños fragmentos, nos aportan datos suficientes para tener una una
idea de la importancia estadística en un abanico de análisis. Los resultados indican un
posible cambio en el tamaño de la población desde el Pleistoceno y la presencia de
halotipos del linaje oriental en Iberia durante la Prehistoria.
Bajo las hipótesis tradicionales de refugio glacial (4, 17), la estructura filogeografica
del oso pardo actual deriva del refugio glacial ancestral: el linaje occidental que se
origina desde Iberia, Italia y los Balcanes y el linaje oriental posiblemente derivado de
un refugio en los Cárpatos (14, 16). En contraste con ese estricto modelo de refugio,
pero en concordancia con una población prehistórica europea continua de oso pardo
ibérico desde Arlanpe (País Vasco) que pertenece a la estirpe oriental. En nuestros
análisis, tales asignaciones filogeograficas se basan en probabilidades posteriores
máximas (Fig 1, A). Este patrón se basa después en tres secuencias de oso pardo del
Pleistoceno de Valdegoba (norte de España) cuyo grupo con una secuencia publicada
previamente de Atapuerca (norte de España) y con varias secuencias de osos
modernos italianos y de los Balcanes.
Fig. 2. Cambios en la diversidad genética entre diferentes períodos, asumiendo un tamaño
constante de la población. Tasa de mutación: 29,8% reemplazo por lugar por millón de años (A) y
10,0% de reemplazo por lugar por millçón de años (B). Los colores hacen referencia a la proporción de
simulaciones que llevan al correspondiente aumento en la diversidad genética. Trece posibles tamaños
efectivos se simularon (100, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000,
40,000, and 45,000 individuos). Las líneas rojas indican cambios observados en la diversidad genética
(serie larga)
Además, AMOVAs sugieren pequeñas subestructuras geográficas entre las
poblaciones de oso ibérico y las europeas del Pleistoceno. Estos nuevos datos
confirman la falta de discontinuidad filogenética en el oso europeo después de la LGM.
Aunque
las
poblaciones
españolas
y
europeas
del
Holoceno,
aparecen
geográficamente diferenciadas en nuestros AMOVAs, un estudio reciente ha sugerido
que el flujo genético pudo haber continuado desde el Pleistoceno al Holoceno. Un oso
pardo ibérico, datado de la época de la LGM en Atapuerca, Burgos, en el norte de
España, estaba más relacionado con los osos italianos y balcánicos que con los
propios ibéricos. Es más, durante el Holoceno, en el Mont Ventoux (sur de Francia) se
han encontrado tres grupos mitocondriales entre 1.570 y 6525 años: uno perteneciente
al grupo ibérico, otro al italiano/balcánico y un tercero no asociado a ninguno de los
tres refugios principales glaciares. Resalta, sin embargo, que el apoyo de las ramas
española e italo/balcánicas son bajas en nuestro árbol. En este estudio, hemos
encontrado tres individuos diferentes de Valdegoba, un lugar en Burgos del
Pleistoceno tardío, que casa con el grupo de la muestra de Atapuerca.
Nuestros datos también indican que el tamaño de la población ha variado
significativamente a lo largo del tiempo. La caída en la población en los últimos siglos
(XV-XX) está bien documentada y también es visible en nuestros análisis de
diversidad genética. Sin embargo, hay un posible aumento en el tamaño de la
población en la transición del Pleistoceno al Holoceno, como viene indicado por
cambios en el valor en el tiempo de las distintas estimaciones θ. Este aumento es
estadísticamente significativo, asumiendo rangos de población efectivas (de más de
entre 2 y 10 mil o mayor de 10 a 15 mil, considerando la rapidez o lentitud de las tasas
de mutación, respectivamente).
Consideramos que tal tamaño de población es probable por los siguientes motivos.
Usando una tasa de mutación rápida, estimamos que la población de oso español
habría llegado a una media de entre 7,3 y 12 mil ejemplares (dependiendo de las
muestras tomadas y del método de estimación: tabla 1 y SI tabla 2). Asumiendo tales
poblaciones efectivas (de unos 10 mil individuos), solo un porcentaje despreciable
(0,8% y 0,0% de las muestras largas y cortas, respectivamente) de las simulaciones
en serie pueden replicar el aumento observado en la diversidad genética en la
transición Pleistoceno/Holoceno sin cambio efectivo en los tamaños de las poblaciones
(SI tablas 4 y 5). Lo mismo es válido para el caso de la tasa de mutación lenta, ya que
entre el 0,6 y el 0,9% de las simulaciones en serie nos llevan al aumento observado en
la diversidad genética en la transición Pleistoceno/Holoceno, asumiendo volúmenes
efectivos constantes de entre 25 y 35 mil individuos (21.818 a 35.686; SI tablas 4 y 5).
Además, debe hacerse notar que el volumen de población efectivo en el Pleistoceno
no se refiere solamente a la población española, ya que hemos demostrado un flujo
genético significativo entre los osos españoles y los europeos tanto orientales como
occidentales durante el Pleistoceno. Añadir que las diferentes estimaciones θ para la
población española están en el rango de lo que se observa para la población europea
considerada en su conjunto (tabla 1 y SI tabla 2). Por lo tanto, la población efectiva es
probable que fuese grande y en torno a mas de 26 mil ejemplares (el mínimo del 95%
del rango de confianza, estimado en Saarno et al).
Fuentes históricas y paleontológicas nos dan mas información acerca de los
cambios en el rango del hábitat del oso y por lo tanto, podemos usarlas como
herramientas adicionales para deducir el tamaño de las poblaciones. Tan reciente
como en el siglo XIV, el oso habitaba la mayoría de las montañas y los bosques de la
península ibérica. Su hábitat variaba desde el macizo gallego-portugués, hasta los
bosques de Andalucía en el sur de España, donde ya no existen, y hasta las montañas
cantábricas y los Pirineos, donde aun hoy habitan. El uso de armas de fuego para la
caza desde el siglo XVI, entre otras actividades humanas, puede haber sido el motivo
de la reducción de la extensión de su hábitat, restringiendo al oso pardo a la franja
norte de España, sobre el siglo XVIII.