Fenología y variabilidad genética en mutantes de manzano cv

Fenología y variabilidad genética en mutantes de manzano cv. Golden
delicious en la Sierra de Arteaga, Coahuila
Phenology and genetic variability in mutants of apple cv. Golden Delicious in
the Sierra of Arteaga, Coahuila
Alfonso Reyes López1, Justo Pastor Luna Solano2, Victor Zamora Villa3,
Rosalinda Mendoza Villarreal4, Alberto Flores Olivas5, Evangelina Rodríguez Solis6
Resumen
Se evaluó fenológica y genéticamente a tres variedades de manzano, para
conocer en cada una de ellas, aspectos relacionados a: fechas de floración y
finalmente la determinación de las características genéticas en cada variedad para
detectar parentesco entre ellas, a través del uso de la técnica del RAPDs. Para el
análisis de la huella genética se realizó el aislamiento del ADN; se amplificó en el
termociclador, para efectuar la reacción del PCR con los iniciadores para RAPDs:
C01, C02, C11, C13, C15, C19, C20. Los patrones electroforéticos fueron
codificados en matrices de 0 y 1, para realizar un análisis de conglomerados. Los
tratamientos evaluados fueron: ‘Golden delicious’ o normal y los mutantes; ‘Vigas’
y ‘Brotador’, plantados en diversas localidades de la Sierra de Arteaga. Los datos
obtenidos en cada tratamiento por localidad, fueron analizados mediante un
diseño completamente al azar, los análisis de varianza (ANVA) demostraron
diferencias significativas en cada una de las variables analizadas, los mutantes
demostraron mas precocidad en la floración, el mutante ‘Vigas’ con 15 y el
mutante ‘Brotador’ con 25 días antes que la ‘Golden delicious’ o normal, en el
análisis de las huellas de ADN usando el tipo de marcador RAPDs, se demuestra
que existe diversidad genética entre las variedades mutantes comparadas entre sí
y estas con la ‘Golden delicious’ o normal.
Palabras clave: Manzana, fenología, variabilidad genética, mutantes.
Abstract
Three apple tree varieties were phenologically and genetically evaluated in
order to know in each of them, aspects related to: flowering date and finally the
determination of the genetic characteristic in each variety to detect relationship
among them using the RAPDs technic. For the analysis of genetic diversity the
DNA isolation was made, the termociclator was used for amplification, to see the
reaction of PCR with primers of RAPDs: C01, C02, C11, C13, C15, C19, and C20.
The electrophoretic patterns were codified in numbers of 0 and 1, to realize
conglomerate analysis. The evaluated treatments were, ‘Golden delicious’ or
normal, mutants ‘Vigas’ and ‘Brotador’ planted in several locations of the forest of
Arteaga. The data obtained in each sample was analyzed with a Randomly
1. 2, 6
3
4
5
Departamento de Horticultura. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro
Departamento de Fitomejoramiento. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro
Departamento de Ciencias Básicas. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro
Departamento de Parasitología. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro
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Complete Design to see which was the best. The variance analysis (ANVA)
showed significant differences in each of the variables, the mutants showed more
precocity in blooming in the mutant ‘Vigas’ 15 and the mutant ‘Brotador’ 25 days
before the ‘Golden delicious’ or normal, in the analysis of DNA using RAPDs
markers, it showed that there is genetic diversity among the mutant varieties, also
in comparison with ‘Golden delicious’ or normal.
Key words: Apple, phenology, genetic variability, mutants.
Introducción
En el estado de Coahuila, específicamente en la Sierra de Arteaga, se han
presentado algunas mutaciones en el manzano de materiales medianamente
adaptados, que han dado buenos resultados en cuanto a producción y calidad de
frutos, teniendo como principal característica sus bajos requerimientos de frío.
Dichos materiales se pueden explotar comercialmente, por que ofrecen ventajas
comerciales, como cosecha precoz de frutos en cantidad y calidad disponibles
para el mercado. Estos mutantes presentan la ventaja que son producidos y
manejados por los productores, razón por la que se pueden implementar mayores
áreas del cultivo, con el material disponible de estas variedades precoces. El uso
de los mutantes ‘Vigas’ y ‘Brotador’ resuelve en gran parte el problema de la
deficiencia de horas frío; como también el problema de las altas temperaturas que
se presentan en la Sierra de Arteaga al momento de la floración y que ha afectado
significativamente a las floraciones tardías. En años anteriores, ambos problemas
han provocado baja brotación de flores y altos índices de aborto de frutos por lo
que se ha perdido desde un 70 a un 80% de la producción potencial.
Basados en la problemática existente en las huertas de los productores y
para obtener información mas confiable, se procedió a identificar genéticamente a
las variedades, por lo que se empleo la técnica de marcadores moleculares, y
específicamente los RAPDs, (polimorfismos de ADN amplificados al azar) con el
fin de obtener las disimilitudes genéticas existentes, entre las variedades mutantes
(Vigas y Brotador) y el posible progenitor como lo es el ‘Golden delicious’ (normal)
que se produce comúnmente en las huertas manzaneras de la Sierra de Arteaga,
Coahuila.
Metodología experimental
Para efectos de la investigación se consideraron tres variedades de
manzana ubicadas en tres localidades (San Antonio de las Alazanas, Jamé y El
Tunal) de la Sierra de Arteaga, Saltillo, Coahuila, México. La edad de las plantas
de las variedades evaluadas oscilan entre 8 y 30 años para el testigo o ‘Golden
delicious’ (normal), los mutantes ‘Vigas’ y ‘Brotador’ con 5 años de plantados. La
selección y etiquetado de los árboles se llevó a cabo en Octubre del año 2002,
cuando las plantas se preparaban para la entrada al reposo.
Los mutantes se evaluaron en dos etapas: a) Determinación de los
requerimientos de frío para la salida del reposo y evaluación fenológica de las
variedades, que comprendió desde la manifestación de la yema floral (botonación
en punta plateada) hasta la cosecha. b) y la determinación de la variabilidad
122
genética por medio de marcadores moleculares del tipo RAPDs (amplificación al
azar de ADN polimorfico).
Cuadro 1. Descripción de los tratamientos por localidad.
Trat Variedad
1
2
3
4
5
6
7
8
‘Brotador’ 1
‘Golden delicious’ 1
‘Vigas’ 3
‘Golden delicious’ 2
‘Vigas’ 1
‘Golden delicious’ 3
‘Vigas’ 2
‘Golden delicious’ 4
# localidad
Nombre de la Localidad
1
1
2
2
3
3
4
4
San Antonio de las Alazanas
San Antonio de las Alazanas
San Antonio de las Alazanas
San Antonio de las Alazanas
Jamé
Jamé
El Tunal
El Tunal
Edad
(año)
5
8
5
8
5
30
25
8
Trat = Tratamiento
Las variables evaluadas fueron:
Evaluación fenológica de campo
Se efectuó, la observación y toma de datos de la aparición de las diversas
etapas fenológicas, en campo, y se consideraron los tres estadios importantes de
la floración.
Punta plateada: Las yemas florales presentan color plata, el tejido foliar comienza
a emerger en la punta de la yema.
Punta verde: el tejido foliar verde es visible cerca de la punta de la yema.
Punta rosada: Las puntas rojas de los pétalos son visibles. La toma de
datos comenzó el día 6 de Marzo 2003, cuando las yemas presentaban el primer
estadio de floración.
Determinación de la variabilidad genética
Extracción del ADN
Se utilizaron 4 hojas medianas (renuevos) por variedad, se llevaron al
ultracongelador (REVCO) a –80ºC, para evitar la degradación del ADN. Para la
extracción del DNA, se utilizó el método descrito por (Dellaporta, et al., 1983). En
éste, un gramo de tejido fresco se molió en nitrógeno líquido con un mortero y
pistilo, hasta obtener un polvo fino; el polvo se agregó directamente a un tubo
Sorvall conteniendo 10 ml de solución amortiguadora de extracción (Tris-HCl
100mM pH 8.0, EDTA 50mM, NaCl 500mM, 2-mercaptoetanol 10mM y SDS al
20%) y se colocó en un baño a 65ºC por 10 min. Posteriormente se agregaron 3.3
ml de acetato de potasio 5M, se mezcló suavemente por inversión y se incubó en
hielo durante 40 min. Se centrífugo por 20 min a 18,000 rpm a 4ºC en una
centrífuga Beckman J2-21 (Instruments, Inc. CA, USA) y el sobrenadante se vació
en 10 ml de isopropanol preenfriado a través de un embudo con tela magitel. El
tubo conteniendo el sobrenadante se dejó a –20ºC durante 30 a 60 min. La
madeja de ADN se colectó con un gancho de vidrio y se colocó en 70 l de
solución para diluir (Tris-HCl 50 mM a pH 8.0, EDTA 10mM).
123
Purificación del ADN
Para determinar la variabilidad genética por medio de marcadores
moleculares del tipo RAPDs, se usó el siguiente protocolo: Se tomaron 1.0 μl del
ADN templado, 1 μl del oligonucleótido (Biomol, Monterrey, Mex), 5.0 μl de la
mezcla 5x Taq - & - Go (Biogene, EE UU) que incluye a la enzima Taq polimerasa, los dNTPs (dinucleótidos) y el MgCl2 (cloruro de magnesio) la mezcla
se diluyó al 1x. Se utilizó un gel de agarosa al 1.5%, en los corrimientos en la
cámara horizontal, se usó una concentración de ADN de 10 ng/μl. Se usó el
marcador de peso molecular, 100 BP LADDER, para 13 fragmentos desde 100 pb
hasta 3000 pb.
Los datos de cada localidad se analizaron mediante
un diseño
completamente al azar. Para el análisis conjunto de los datos se utilizó un análisis
combinado sobre las localidades, con anidamiento de las variedades en las
localidades. Las comparaciones de medias se realizaron con la metodología DMS.
A partir del patrón de bandeo obtenido, de las variedades (tratamientos), se realizó
un análisis multivariado de conglomerados, utilizando el índice de Jaccard, este
índice da al valor 1 mas importancia que al valor 0, la tabla de contingencia, con
ayuda, del algoritmo de Jaccard, es transformada en una matriz de distancias
genéticas entre pares de muestras. Obtenida la matriz de distancias genéticas,
con el índice de Jaccard, se construye un dendograma utilizando el análisis de
agrupamiento con el método AGNES (Agglomerative Nesting) que utiliza el
algoritmo aglomerativo llamado Método de promedios no ponderados de pares de
grupos (UPGMA), lo cual fue realizado utilizando el programa estadístico SPLUS.
Resultados y discusión
Resultados del análisis estadístico indicaron diferencias altamente
significativas. De manera general los 3 estadios de floración, en punta plateada,
en punta verde y en punta rosada, se sucedieron en las fechas comprendidas
entre el 6, 15, 21, 31 de Marzo, y 6 de Abril del año 2003, a diferencia del mutante
‘Brotador’ cuya botonación en punta plateada ocurrió a finales de Febrero. El
fenómeno de yema en punta plateada para los mutantes ‘Vigas’ ocurrió el 6 de
Marzo del 2003, en punta verde el 15, en punta rosada el 21 y el final de plena
floración el 30 del mismo mes.
Para el mutante ‘Brotador’ el fenómeno punta plateada ocurrió a finales de
febrero 2003, ya que esta variedad precoz mostró las yemas florales en punta
rosada el 6 de Marzo 2003 y el final de plena floración el día 15 del mismo mes.
Para la ‘Golden delicious’ o normal el 40% de yemas florales en punta
plateada se sucedieron para el 6 de Marzo 2003, en punta verde el 21 y en punta
rosada el 30 del mismo mes, para mostrar el final de plena floración el día 15 de
Abril 2003.
Es decir para las tres variedades, los rangos aproximados en las
ocurrencias de esos fenómenos, fue:15 días para el mutante ‘Brotador’, 25 días
para el mutante ‘Vigas’ y 35 días para el ‘Golden delicious’. El final de plena
floración se determinó, cuando el 75% de las flores presentes en las ramillas por
árbol, estuvieron abiertas.
124
Determinación de la variabilidad genética
La diversidad genética estimada mediante los patrones electroforéticos
(Figura 1), reportó que existen diferencias entre los materiales evaluados.
Figura 1. Gel de agarosa con fragmentos amplificados por PCR, utilizando como DNA
templado, variedades de manzano de cuatro localidades.
En la Figura 1, podemos notar polimorfismos de ADN entre los cultivares.
T1 mutante ‘Brotador’, T2 ‘Golden delicious’ 1, T3 mutante ‘Vigas’ 3, T4 ‘Golden
delicious’ 2, T5 mutante‘Vigas’ 1, T6 ‘Golden delicious’ 3, T7 mutante ‘Vigas’ 2, T8
‘Golden delicious’ 4.
La huella de ADN del ‘Golden delicious’ y mutantes, representadas en la
Figura 1, muestra en la amplificación del ADN que existen bandas polimorficas con
el primer C 13. Es importante mencionar que los mutantes son híbridos, producto
de la cruza con patrones MM106 y MM111, ambos por yemas de árboles mutantes
o precoces de ‘Golden delicious’. Sin embargo la banda de 900 pares de bases
(pb), esta presente en los mutantes y en el tratamiento 6, lo que indica que son
descendientes de este último como progenitor común. Por otra parte la banda de
1200 pb esta presente en los tratamientos T1, T2, T3 Y T5, y ausente en los
tratamientos T6, T7 y T8, los primeros ubicados dentro de la misma localidad y
con las mismas condiciones de manejo, correspondiendo a los mutantes
‘Brotador’, ‘Vigas’ y ‘Golden delicious’ 2.
La disimilitud observada en el dendograma (Figura 2) fue 0.9. El tratamiento
6 o ‘Golden delicious’ (normal), ubicado en la localidad número tres, es el más
diferente y posiblemente sea el único tratamiento ‘Golden delicious’ (normal), es la
plantación con mayor edad con 30 años, y las dimensiones de los árboles superan
125
al resto de tratamientos, se le da poco manejo agronómico: como podas de
formación, floración y fructificación se encuentra bastante aislada del resto de
variedades cultivadas dentro de la localidad.
Figura 2. Dendograma obtenido de la tabla de contingencia, en base a las bandas
observadas en el gel electroforético de RAPDs.
Conclusiones
En todas las localidades evaluadas, se encontró que las variedades
presentan una fenología diferente. Genéticamente se determinó mediante el uso
del marcador de peso molecular RAPDs, que las muestras presentan
polimorfismos, lográndose observar en el dendrograma la disimilaridad al
establecer comparaciones entre ellas, lo que deja claro que pertenecen a
diferentes variedades dentro de una misma especie.
En cuanto a los fenómenos de floración los mutantes son más precoces
que la ‘Golden delicious’, sin embargo en amarre de frutos y rendimiento a
cosecha esta variedad fue superior.
Se considera en la presente investigación que los mutantes; ‘Vigas’ y
‘Brotador’ son las variedades potenciales, para las futuras plantaciones de la
manzana en Coahuila, así como en otros estados en donde se aclimaten.
Recomendaciones
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Los mutantes, son la alternativa de solución inmediata al problema de
todos los años, como es la brotación tardía, que afecta generalmente a la ‘Golden
delicious’ actualmente con mayores áreas plantadas y en etapas de producción.
Literatura citada
Aguilar, A. 2003. Evaluación de la diversidad genética en poblaciones de durazno Prunus persica
L. Batsch, establecidos en el centro del país en base a marcadores de tipo RAPDs.
Tesis de Licenciatura. Universidad Autónoma de Querétaro.Santiago de Querétaro.
México. Pág. 34-48.
Conner, J., Brown, K., and Weeden F. (1995). Examination of Apple (Malus x domestic). Fruit
Quality and Tree and Fruit Morphology using Molecular Markers. HortScience, Vol.
30(4), July 1995 ref. 448.
De la Loma, J. L. 1970. Historia, modalidades, importancia y utilización de las mutaciones. 1er.
Simposio Mexicano sobre Mutaciones. Agrociencia, Chapingo. México. Pág. 6-16.
Mendoza, V. R. 2003. Huella de ADN, Características Morfológicas y Viabilidad de Polen en Girasol
Cultivado y Poblaciones Silvestres de Helianthus annuus y Tithonia tubaeformis.
Tesis de Doctorado en Fitomejoramiento. Universidad Autónoma Agraria Antonio
Narro. Buenavista, Saltillo, Coahuila, México. Pág. 53-62
Williams, J. G. K., A. R. Kubelik, K. J. Livak and J. A. Rafalski. 1990. DNA
Polimorphisms amplified as arbitrary primers are useful genetic markers. Nucleic Acids
Res. 18: 6531 – 6535.
127