s3-bca07 estudio de la diversidad genética de aguacate criollo en el

ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE AGUACATE CRIOLLO EN EL
ESTADO DE NUEVO LEON
A. Gutiérrez-Díeza, J. Martínez-de la Cerdaa, E.A. García-Zambranoa, J. Aranda-Ruiza,
G.E. Salinas-Garcíaa
a
Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Nuevo León. Carr. Zuazua-Marín km.
17.5, Marín, N.L., [email protected]
RESUMEN
Nuevo León se considera uno de los estados centros de origen del aguacate criollo, municipios como Sabinas
Hidalgo, Aramberri, Zaragoza y Rayones cultivan este frutal tanto de forma intensiva como en huertos
familiares. En cada una de las regiones en donde se cultiva el aguacate criollo existen diferentes variedades
cuyos nombres han sido otorgados por los productores resultando que en algunos casos la variedad es la
misma pero con diferente nombre. En la actualidad aún es posible encontrar poblaciones de aguacate criollo
formando parte de las huertas o de la vegetación natural en el estado, es necesario como un esfuerzo de
conservación, identificar y clasificar esta variabilidad genética que puede servir de base para los programas de
mejoramiento de Persea. La identificación tradicional de las plantas se realiza por caracterización fenotípica,
procedimiento que es lento; la biología molecular ofrece metodologías que permiten la identificación,
clasificación y aprovechamiento de la diversidad genética existente en los genomas de las plantas ya que se
puede observar en forma directa y precisa las diferencias o similitudes a nivel del ADN entre individuos. Los
marcadores de ADN se han utilizado para caracterizar la diversidad genética de diferentes especies vegetales
incluyendo aguacate. En esta investigación se pretende estimar la diversidad genética del aguacate criollo en
Nuevo León mediante descriptores fenotípicos y moleculares (AFLP, RAPD), misma que servirá para la
generación del inventario de la misma.
1. INTRODUCCION
Nuevo León se considera uno de los estados centro de origen del aguacate criollo (Persea americana Mill.) en
México. En el estado, el aguacate criollo es cultivado en diferentes sistemas agrícolas y de forma intensiva
tanto en huertas familiares como de traspatio, estas formas de producción son importantes centros de
experimentación, introducción de plantas y mejoramiento de cultivos así como refugios de diversidad
genética única. En aguacate criollo, las razas locales o variedades consisten de selecciones locales de especies
que se han cultivado en muchas regiones y que tienen una fuerte tendencia a ser sustituidas por variedades
modernas, aunque aún es posible encontrar poblaciones de aguacate criollo formando parte de las huertas o de
la vegetación natural.
El germoplasma de México ha sido la base de los programas de mejoramiento genético en otros países por lo
que es necesario poner atención a los trabajos de exploración, clasificación y conservación del germoplasma
del género Persea e implementar programas de mejoramiento genético y dejar de ser exportadores de
germoplasma e importadores de genotipos. La generación de variedades mejoradas implica la búsqueda de
genes que pueden existir en algunas variedades cultivadas criollas o plantas silvestres, si estas fuentes de
genes no existen se perderá para siempre la posibilidad de transferir sus características. La clasificación y
conservación del germoplasma vegetal debe verse como una actividad que permita preservar nuestro
patrimonio de biodiversidad y se requiere de un esfuerzo importante para conservar los genotipos de plantas
cultivadas que actualmente se ven amenazadas al dejarse de utilizar por haber sido sustituidas por variedades
mejoradas.
La identificación tradicional de las plantas se realiza por caracterización fenotípica procedimiento que es
lento. La biología molecular ofrece metodologías que permiten la identificación, clasificación y
aprovechamiento de la diversidad genética existente en los genomas de las plantas; con estas técnicas se
pueden observar en forma directa y precisa las diferencias o similitudes a nivel del ADN entre individuos. Los
marcadores de ADN se han utilizado para caracterizar la diversidad genética de diferentes especies vegetales
incluyendo aguacate (Mhameed et al., 1997; Ashworth y Clegg, 2003; Schnell et al., 2003; Ashworth et al.,
2004).
En la Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León, se está realizando el proyecto de
“Estimación fenotípica y molecular de la diversidad genética del aguacate criollo (Persea americana Mill.) en
el estado de Nuevo León”, con lo que se pretende entre otras cosas generar descriptores genético moleculares
tipo AFLP y RAPD para aguacate criollo, agrupar los variedades criollos en base a los descriptores genético
moleculares generados y fenotípicos e identificar las duplicaciones de las mismas. En México, a la fecha los
trabajos relacionados con la caracterización molecular de los recursos genéticos de aguacate de variedades
mejoradas y criollas son escasos, la aplicación de estas técnicas en aguacate criollo permitirá estimar el grado
y distribución de la diversidad genética intra e interpoblacional del germoplasma haciendo posible el
levantamiento del inventario de diversidad genética así como la generación de una base de datos de Persea
americana Mill. del estado de Nuevo León.
2. MATERIALES Y METODOS
Exploración de campo y colecta de germoplasma. Se están realizando recorridos en las áreas de los
municipios de Nuevo León donde se cultiva aguacate criollo y en donde se localizan plantas en poblaciones o
aisladas formando parte de la vegetación natural. Las plantas seleccionadas se identifican y se realiza su
geoposicionamiento. Asimismo se realiza un registro de datos de cada material.
Caracterización fenotípica. Cada una de las plantas seleccionadas se caracteriza de acuerdo a los
descriptores morfológicos para aguacate propuestos por el International Plant Genetic Resources Institute
(IPGRI, 1995). En fruto se mide el peso y diámetros polar y ecuatorial, peso y diámetros polar y ecuatorial de
hueso, espesor de pulpa y color de cáscara. En hojas se determina el largo y ancho, relación largo-ancho,
color y forma de bordes. En caso de que sea posible, se determina la forma de crecimiento y densidad de copa
del árbol. De los frutos se obtendrán los porcentajes de aceite y humedad (Gómez-López , 1998 y 2002) y su
valor calórico (Pearson, 1975). De los caracteres evaluados se determinarán los estadísticos descriptivos, los
datos se analizarán por componentes principales. Se realizará el análisis de conglomerados, el dendograma se
construirá con base en el algoritmo UPGMA (agrupamiento de pares no ponderados con medias aritméticas,
Unweighted Paired Grouping Method with Arithmetic Averages) (Hair et al., 1992). El análisis estadístico se
realizará con el programa Statistica 5.0 (StatSoft, 1997; Tulsa, Oklahoma, USA).
Caracterización molecular. Para la caracterización molecular se colecta tejido foliar de las plantas: para
definir el método de extracción de ADN, se probaron varios métodos. La calidad y cantidad de ADN de las
extracciones se determina por gel de agarosa al 1% y fluorimetría. En la generación de AFLP se está
utilizando el kit IRDyeTM Fluorescent AFLP Kit for Large Plant Genome Analysis de LI-COR® Biosciencies,
Lincoln, NE, USA. La separación y análisis de productos amplificados se realizará mediante el secuenciador
LI-COR R2 4200 y el programa SAGAMX (LI-COR, Lincoln, NE, USA). Para la generación de RAPD se
utilizarán los juegos A y B de primers de MWG Biotech. En el análisis molecular se asumirá que bandas con
el mismo peso molecular en individuos diferentes son idénticas, para cada individuo se designará “1” a la
banda presente y “0” a la ausencia de la misma. La distancia genética entre individuos se estimará con base al
coeficiente de apareamiento simple (Skroch et al., 1992). La matriz de distancias genéticas se utilizará para la
construcción del dendograma por el método UPGMA y para la realización del análisis jerárquico de la
varianza molecular (AMOVA) con el programa Arlequín 1.0. El análisis estadístico se realizará con el
programa Statistica 5.0.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En una primera etapa de exploración de campo y colecta de germoplasma, se logró el contacto y cooperación
de los productores del municipio de Aramberri, N.L. Se han estado visitando las huertas de las que se han
colectado y evaluado 34 muestras que engloban 15 variedades (Cuadro 1) con nombre local diferente,
aparentemente las 19 muestras restantes pertenecen a la variedad denominada “plátano tardío o plátano
grande”. De estas muestras solamente en algunas (Cuadro 1) se han estimado los descriptores del fruto debido
a que el periodo de cosecha había pasado al momento de la colecta o todavía no ocurre.
Cuadro 1. Nombres locales de las diferentes variedades criollas colectadas
Var. criollas con frutos colectados
Var. criollas sin frutos colectados
Criollito
Calabo
Mantequilla
Huevo de Paloma
Coco
Israel
Chino o Hass
Pagua
El verde
María Elena/Papo
Criollo
Campeón
Plátano tardío/grande
Leonor
Plátano temprano/delgado
Asimismo en la mayoría de las variedades se dificulta la estimación del hábito de crecimiento del árbol
debido a que las ramas están prácticamente definidas por los injertos, de tal forma que en algunos casos cada
rama corresponde a una variedad diferente (Figura 1).
Figura 1. Árbol de aguacate criollo injertado con variedad plátano tardío
La extracción de ADN de aguacate se dificulta debido a los altos contenidos de ácidos grasos de las hojas,
propios de la especie: por lo que se probaron los siguientes métodos y kits comerciales de extracción de ADN
con el fin de determinar el óptimo en cuanto a calidad y cantidad del mismo: método modificado de SaghaiMaroof (Hosington et al., 1994), kit MasterPureTM Plant Leaf DNA Purification (EPICENTRE), kit DNAzol
ES (Molecular Research Center, Inc), kit para ruptor celular FastDNA (Qbiogene, Inc., CA) asimismo se
realizaron modificaciones a los protocolos de los mismos con el fin de aumentar la cantidad y calidad del
DNA. Para la definición del método de extracción de ADN se seleccionaron tres muestras al azar de las
colectadas. Como se observa en el Cuadro 2, con la combinación del kit MasterPure TM Plant Leaf DNA
Purification con el ruptor celular como mecanismo de molido del tejido se obtuvo el mayor rendimiento de
ADN, sin embargo en el gel de agarosa se aprecia gran cantidad de ARN (Figura 2) por lo que el costo y
trabajo se incrementa debido a la utilización de RNAsa para la eliminación del mismo. Con el método del
ruptor celular con el kit FastDNA así como con el kit DNAzol ES modificado se obtiene el mismo
rendimiento de ADN sin embargo el costo por extracción de cada muestra es más bajo con el primero (Cuadro
2).
Cuadro 2. Rendimiento de ADN de Persea americana Mill., obtenido con diferentes métodos/kits de
extracción
Método/kit de extracción de ADN
Rendimiento de ADN
1. Modificado de Saghai-Maroof (Hosington et al., 1994),
35.85 ng/l
2. MasterPureTM Plant Leaf DNA Purification (EPICENTRE)
33.38 ng/l
3. DNAzol ES (Molecular Research Center, Inc)
191.33 ng/l
4. DNAzol ES (Molecular Research Center, Inc) modificado
232.33 ng/l
5. MasterPureTM Plant Leaf DNA Purification (EPICENTRE) con ruptor celular
332.66 ng/l
6. FastDNA (QBiogene)
232.33 ng/l
MM
3
4
5
3
4
5
3
4
5
Figura 2. Extracción de ADN con los diferentes métodos probados en tres muestras seleccionadas al azar, el
carril 1 corresponde al marcador de peso molecular (MM), el número de cada carril corresponde al
método de acuerdo a como se identifican en el Cuadro 2.
De acuerdo a los resultados de rendimiento y calidad (Cuadro 2 y Figura 3) obtenidos, se optó por seleccionar
el método del ruptor celular con el kit FastDNA (Figura 3).
MM 1 2
MM
15
3
4
16
5
6 7
17
18
8 9 11 12 13 14
19
20
21
Figura 3. Extracción de ADN con el método del ruptor celular con el kit FastDNA. El carril 1 de cada fila
corresponde al marcador de peso molecular (MM), la identificación de cada carril es de acuerdo al
número que se le asignó a la planta al momento de la colecta.
En lo que se refiere a los marcadores moleculares tipo RAPD, se están realizando las pruebas preliminares
para la optimización de las condiciones de reacción con los iniciadores del kit A y B de MWG Biotech Oligo
Lab. En la generación de AFLP se está utilizando el kit IRDyeTM Fluorescent AFLP Kit for Large Plant
Genome Analysis de LI-COR® Biosciencies, Lincoln, NE, USA. , y se están realizando las pruebas
preliminares de digestión, ligación y preamplificación. Actualmente se continúan realizando la exploración de
campo, colecta de germoplasma y caracterización fenotípica y en campo del mismo. Se cuenta con la
extracción de ADN de las 34 muestras colectadas realizadas con el kit para ruptor celular FastDNA (Figura
3), y se continúa con las pruebas preliminares para definir los protocolos de generación tanto de RAPD como
de AFLP.
BIBLIOGRAFIA
1. Ashworth, V.E.T.M. and M.T. Clegg. 2003. Microsatellite markers in avocado (Persea americana
Mill.): genealogical relationships among cultivated avocado genotypes. J. Hered. 94:407-415.
2. Ashworth, V.E.T.M., M.C. Kobayashi, M. de la Cruz and M.T. Clegg. 2004. Microsatellite markers
in avocado (Persea americana Mill.): development of dinucleotide and trinucleotide markers.
ScientiaHorti. 101:255-267.
3. Gómez-López, V.M. 1998. Characterization of avocado (Persea americana Mill.) varieties of very
low oil content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 46:3643-3647.
4. Gómez-López, V.M. 2002. Fruit characterization of high oil content avocado varieties. Scientia
Agricola. 59:403-406.
5. Hair, J.F., R.F. Anderson, R.L. Tatum and W.C. Black. 1992. Multivariate data analysis. Third
edition. McMillan Publishing Co., New York.
6. Hosington, D., Khairallah, M. and González-de-León, D. 1994. Laboratory Protocols: CIMMYT
Applied Molecular Genetics Laboratory. Second Edition. México, D.F. CIMMYT.
7. IPGRI. 1995. Descriptors for Avocado (Persea spp.). Internacional Plant Genetic Resources
Institute, Rome, Italy.
8. Mhameed, S.D., D. Sharon, D. Kaufman, E. Lahav, J. Hillel, C. Degani and U. Lavi. 1997. Genetic
relationships within avocado (Persea americana Mill.) cultivars and between Persea species. Theor.
Appl. Genet. 94:279-286.
9. Pearson, D. 1975. Seasonal English market variations in the composition of south African and Israeli
avocados. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 26, p. 207-213.
10. Schnell, R.J., J.S. Brown, C.T. Olano, E.J. Power, C.A. Krol, D.N. Kuhn and J.C. Motamayor. 2003.
Evaluation of avocado germplasm using microsatellite markers. J.Amer.Soc.Hort.Sci. 128:881-889.
11. Skroch, P., J. Tivag and J. Nienhaus. 1992. Analysis of genetic relationships using RAPD marker
data. In: The American Society for Horticultural Science and American Genetic Association (eds).
Applications of RAPD technology to plant bredding. Joint Plant Breeding Symposia Series. Crop
Science Society of America, Madison, WI, USA. pp. 32-40