Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Instituto de Ciencias

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Instituto de Ciencias
Centro de Investigación en Ciencias Microbiológicas
Posgrado en Microbiología
BÚSQUEDA DE UN LOCUS DE PATOGENICIDAD EN Pantoea ananatis
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS (MICROBIOLOGÍA)
CON OPCIÓN EN: BIOQUÍMICA Y GENÉTICA MICROBIANA
PRESENTA:
Q.F.B. NANACY MARTÍNEZ MONTIEL
ASESOR DE TESIS:
DR. LUIS ERNESTO FUENTES RAMÍREZ
PUEBLA, PUE.
FEBRERO, 2011
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN…1
El género Pantoea…1
Características…3
Ecología…3
Pantoea ananatis…4
P. ananatis como patógeno…5
Interacciones microbianas con plantas…7
Microorganismos patógenos…8
Efecto de los patógenos sobre la translocación del agua y los nutrientes de la planta
hospedante…10
Exopolisacárido…12
Relación entre la producción de EPS y la virulencia…12
Identificación de genes relacionados con la patogenicidad…15
El maíz (Zea mays)…16
JUSTIFICACIÓN…20
HIPÓTESIS…20
OBJETIVOS…21
MATERIALES Y MÉTODOS…22
Microorganismos y Condiciones de Crecimiento…22
Cepas Bacterianas y Plásmidos…22
Medios de Cultivo…22
Antibióticos…24
Técnicas Generales de Biología Molecular…24
Extracción de ADN Genómico (Kit Wizard Genomic DNA Purification)…24
Extracción de ADN Plasmídico mediante Lisis Alcalina…25
Extracción de ARN…25
Extracción de ARN con TRIZOL LS…25
Extracción de ARN mediante el kit ZR RNA MicroPrep…26
Cuantificación de ADN y ARN…27
Retrotranscripción…27
Amplificación de Fragmentos de ADN o ADNc mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR)…27
Restricción de ADN…28
Reparación de Fragmentos de ADN…28
Ligación de Moléculas de ADN…29
Electroforesis de ADN y ARN en Geles de Agarosa…29
Purificación y Concentración de ADN en Solución o a Partir de Geles de Agarosa…29
Secuenciación…30
Análisis Bioinformático…30Técnicas de Trasferencia Genética…31
Preparación de Células Competentes…31
Obtención de Células Quimiocompetentes de E. coli DH5α…31
Obtención de Células Quimiocompetentes de P. ananatis…31
Obtención de Células Electrocompetentes de P. ananatis…31
Transformación…32
Electroporación…32
Técnicas de Mutagénesis Bacteriana…33
Inactivación de Genes Cromosómicos Utilizando Fragmentos de PCR…33
Transformación del Plásmido Pkd119…33
Generación del Fragmento de PCR…33
Inactivación del Gen en el Cromosoma…34
Mutagénesis Sitio Específica Utilizando un Método de Intercambio Alético…35
Construcción de la Interrupción del gen en Puc19…35
Inactivación del Gen en el Cromosoma…35
Técnicas Experimentales con ARN…36
Curva de Crecimiento…36
Expresión Constitutiva de un Gen…36
Obtención de la Construcción del Gen en un Vector de Sobreexpresión…36
RESULTADOS Y DISCUSIÓN…38
Amplificación por PCR del fragmento cpsD-E en Pantoea ananatis…38
Análisis de las secuencias de cpsD-E…39
Mutación en cpsE por el método de intercambio alélico…40
Clonación de cpsD-E en pUC19…41
Interrupción del gen cpsE en Puc19…42
Inactivación del gen cpsE en el cromosoma de P. ananatis LMG2665 y UAPS07100…42
Bioinformática de un genoma secuenciado de P. ananatis…43
Amplificación de amsB por PCR…46
Amplificación del MAL de amsB por RT-PCR…47
Expresión constitutiva del gen amsB en P. ananatis LMG2665 y AUPS07100…48
Inactivación de amsB en el cromosoma de P. ananatis LMG2665 y UAP07100…51
Generación del fragmento del cassette de Km por PCR…52
Inactivación del gen amsB en el cromosoma de P. ananatis LMG2665 y UAPS07100…52
Construcción de la proteína recombinante AmsB…53
CONCLUSIONES…57
PERSPECTIVAS…58
BIBLIOGRAFÍA…59
INTRODUCCIÓN
El género Pantoea.
Este género fue creado en 1989 por Gavini y colaboradores a partir de especies que se
encontraban ubicadas en los taxones Enterobacter y Erwinia, especies que se encuentran
estrechamente relacionadas y que anteriormente habían pertenecido a géneros distintos (Janda,
2006). Inicialmente se describieron las especies Pantoea agglomerans y Pantoea dispersa. A su
vez, P. agglomerans surgió a partir de una reclasificación de las especies Enterobecter
agglomerans (ATCC 27155), Erwinia herbicola (NCPPB 2971) Erwinia milletiae (NCPPB 2519) y P.
dispersa a partir de aislamientos no clasificados previamente. Después de incluyó la especie
Pantoea stewartii, anteriormente Erwinia stewartii, con las subespecies P. stewartii indologenes y
P. stewartii stewartii, así como la especie Pantoea ananatis surgida a partir del reagrupamiento de
los aislamientos previamente clasificados como Erwinia ananas y Erwinia uredovora (Mergaert et
al., 1993).