IA-MBA-PT-002 Determinación de Listeria monocytogenes

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Determinación de Listeria monocytogenes en productos
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1. Objetivo
Disponer de un método para detectar la presencia de Listeria monocytogenes.
2. Alcance
Para aplicar en muestras de productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie.
3. Responsabilidad y Autoridad
El Jefe de Sección debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento.
Los analistas de laboratorio deben realizar el ensayo según lo descrito en este procedimiento.
4. Definiciones
No aplica
5. Abreviaturas y siglas
IA: Inocuidad de Alimentos
MBA: Microbiología de Alimentos
6. Referencias y/o Bibliografía
IA-MBA-PE-009-RE-011 Hoja de trabajo: Análisis de Listeria monocytogenes
IA-MBA-PE-012-RE-005 Control Interno para análisis de Listeria monocytogenes
IA-MBA-PE-009 Manejo de la muestra
IA-MBA-PE-015 Control de Calidad de Reactivos
SEG-PE- 005
Control de medios de cultivo
USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook, MLG 8.06 Revisión 06
Instrucciones Prueba ARN Ribosomal GeneTrak®
Manual de Normas de Bioseguridad para Laboratorios del nivel NB-2 Potencial moderado
Instrucciones para la identificación bioquímica de Listeria con el sistema API® Listeria
Instrucciones para el almacenamiento cepas con crioperlas Microbank
7. Descripción del procedimiento
7.1 Fundamento teórico
El método consiste en el pre-enriquecimiento de la muestra en caldo UVM, este medio contiene
acriflavina y ácido nalidíxico, agentes selectivos que inhiben los microorganismos competidores.
Posteriormente se hace un enriquecimiento secundario selectivo en caldo Fraser o MOPS -BLB y un
aislamiento selectivo en agar Oxford modificado para luego hacer la confirmación de las colonias
sospechosas con pruebas bioquímicas, pruebas diferenciales (hemólisis, motilidad) y prueba ARN
Ribosomal.
7.2. Equipo, materiales, medios de cultivo y reactivos
7.2.1 Equipo
Balanza sensibilidad  0,1g
Homogenizador o Stomacher
Incubadora de 30 ºC ± 1ºC
Incubadora de 35 ºC  2ºC
Incubadora 23 ºC ± 2ºC
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Baño María a 65 °C± 1ºC
Baño María a 37 ºC ± 1ºC
Fotómetro GENE-TRAK 450 nm
Micropipetas de 50l -200 l
Microscopio contraste de fases
Mezclador para tubos de ensayo
7.2.2 Materiales
Bolsas plásticas para stomacher 7 pul x 12 pulg (ancho x largo) LABPLAS EPR 7012
LABPLAS Bolsas plásticas estériles con esponja KSS 21100
Pipetas de vidrio de 1 ml, 2 ml
Puntas micropipeta 50 l -200 ul
Asas bacteriológicas
Aplicador es con algodón estéril
Portaobjetos y cubreobjetos.
Materiales estériles para preparación de la muestra: cuchillos, cucharas, pinzas, bandejas, tijeras
Marcadores de tinta permanente
7.2.3 Medios de Cultivo
Caldo Modificado Universidad de Vermont (UVM)
Tubos con 10 ml de Caldo Fraser ( CF ) o Acido Morfolin propano sulfonico + Caldo Buferado
Enriquecimiento Listeria (MOPS-BLEB)
Placas de agar Oxford Modificado (MOX)
Placas de agar sangre de caballo 5% doble capa (SCDC)
Tubos con 5ml de caldo Infusión Cerebro Corazón (ICC)
Tripticase soya agar con sangre de oveja al 5%
Caldo neutralizante Dey-Engley (D/E)
Crioperlas Microbank PL.170
7.2.4 Reactivos y Kit
®
API Listeria
Aceite Inmersión
Discos de ß lisina Remel # 21-120
®
Prueba de ARN Ribosomal especifico para Listeria monocytogenes GeneTrak
7.2.5 Cepas de referencia
Listeria monocytogenes ATCC 19111
Listeria innocua ATCC 33090
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Rhodococcus equi ATCC 6939
Listeria ivanovii ATCC 19119
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7.3 Procedimiento
Día 1
7.3.1
Preparar la muestra de acuerdo al procedimiento IA –MBAPE-009 Preparación de la Muestra.
Pesar 25  1 g de muestra en forma compuesta, asegurando que la porción para ensayo sea
un representante compuesto de la muestra entera o de las muestras disponibles comunes a un
lote específico, colocar en bolsa de stomacher. Si el análisis no ha sido iniciado en una hora
guardar las muestras pesadas (25 g) a ≤ - 10 °C. Diluir la muestra en el momento que se inicie
el análisis.
7.3.2
Agregar a la bolsa 225  5 ml de caldo UVM, homogenizar en stomacher 2 minutos. (Diluir la
hasta que se inicie el análisis).
7.3.3
Incubar el caldo a 30°C  2°C por 22  2 horas.
7.3.4
Para muestras de superficie: Agregar 10mL 1 ml de caldo Dey-Engley a la esponja. Hacer
el muestreo de superficie.
7.3.5
Agregar 225 ml  5 ml de caldo UVM a cada bolsa con esponja del muestreo. Homogenizar en
stomacher 2 minutos.
7.3.6
Incubar el caldo a 30°C  2°C por 22  2 horas.
7.3.7
Siguiendo el mismo procedimiento preparar un control positivo con la cepa de Listeria
monocytogenes, un control negativo con la cepa de Listeria innocua y un control de esterilidad
o blanco con una alícuota UVM no inoculado. Para los subsecuentes pasos, use como control
no inoculado, el volumen de medio que especifica el método. Investigar cualquier fuente de
contaminación de los medios. Estos controles seguirán la misma secuencia de análisis
que siguen las muestras durante todo el procedimiento (aislamiento, identificación y
confirmación). Anotar los controles realizados con cada set de muestras en IA-MBA-PE-012RE-005 Control Interno para análisis de Listeria monocytogenes.
Día 2
7.3.8 Transferir 0.1 ml  0.02 ml de caldo UVM a tubos con 10  0,5 ml de CF o MOPS-BELB.
Incubar los tubos CF inoculados a 35 °C  2°C por 26  2 horas o los tubos MOPS-BLEB
inoculados a 35 °C  2°C por 18-24 horas.
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7.3.9
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Con un asa bacteriológica rayar aproximadamente 0.1 ml de UVM la superficie de una placa de
MOX. Alternativamente se puede introducir un aplicador con algodón estéril en el UVM y rayar
el 25 al 50 % de la superficie de MOX y con un asa bacteriológica estéril rayar la superficie del
plato restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a 35 °C 
2°C por 26  2 horas.
Día 3
7.3.10 Examinar los platos del UVM:
- Buscar colonias con morfología típica de Listeria, pequeñas colonias rodeadas de un halo
oscuro debido a la hidrólisis de esculina. Hacer un barrido de por lo menos 20 colonias de la
placa MOX, rayarlas colectivamente en placas de agar sangre de caballo doble capa. Incubar
las placas de agar sangre caballo a 35°C  2°C por 22 4 horas.
- Si no se observa crecimiento en la placa de MOX reincubar por 24 horas más.
7.3.11 Observar los tubos de CF:
Si hay evidencia de ennegrecimiento en cualquier grado, depositar 0,1 ml de CF en una placa de
MOX y rayar con hisopo estéril o asa bacteriológica el 25 al 40 % de la placa. A partir de la
superficie inoculada rayar con un asa estéril la superficie de la placa restante para aislar colonias.
Incubar el MOX a 35°C  2°C por un mínimo de 24 horas
-Si no hay evidencia de ennegrecimiento en CF reincubar por 24 horas más.
7.3.12 Tubos de MOPS-BLEB
Con una asa bacteriológica rayar aproximadamente 0,1 ml de MOPS-BLEB la superficie de una
placa de MOX. Alternativamente se puede introducir un aplicador con algodón estéril en el
MOPS-BLEB y rayar el 25 al 50 % de la superficie de MOX y con un asa bacteriológica estéril
rayar la superficie del plato superficie del plato restante para aislar colonias de la superficie
previamente inoculada. Incubar a 35 °C 2°C un mínimo de 24 horas.
Día 4
7.3.13 Examinar placa MOX 48 horas del UVM. Si hay colonias sospechosas seguir punto 7.3.10.
7.3.14 Buscar colonias con ß hemólisis en la placa de SCDC procedentes del UVM 22  2 horas.
7.3.15 Si hay colonias aisladas con ß hemolíticas inocular una colonia aislada en ICC y una placa de
SCDC. Incubar ICC a 23 ºC ± 1ºC por 16 a 18 horas y el SCDC a 35°C ± 2°C por 22 ± 4 h.
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Mantener los placas SCDC originales en refrigeración o temperatura ambiente hasta que
finalice la confirmación de las colonias.
7.3.16 Si hay colonias sospechosas o crecimiento con ß hemólisis pero no están aisladas rayar en
una o más placas de SCDC e incubar a 35°C ± 2°C por 22 ± 4 h.
7.3.17 Observar las placas del MOX rayadas a partir de CF 26  2 horas y MOPS-BLEB 18- 24 horas,
buscar colonias típicas. Si las hay proceder igual que en el punto 7.3.10.
7.3.18 Examinar el CF 48 horas, cualquier grado de evidencia de ennegrecimiento proceder igual que
punto 7.3.11.
7.3.19 Si no hubiera crecimiento en MOX y ninguna evidencia de ennegrecimiento en CF después de
48 horas, ni colonias sospechosas en SCDC, reportar el resultado como ausencia de Listeria
monocytogenes.
Día 5
7.3.20 Observar las placas de MOX rayadas del CF positivo a 48 horas. Si hay colonias sospechosas
proceder como punto 7.3.10.
7.3.21 Buscar colonias con ß hemólisis en la placa de SCDC procedentes CF 26  2 horas y MOPSBLEB 18- 24 horas. Si hay colonias con ß hemólisis proceder como puntos 7.3.13 y 7.3.14.
7.3.22 Si no hubiera colonias con ß hemólisis procedentes del SCDC del enriquecimiento primario o
secundario (UVM, CF y MOPS-BLEB) la muestra se puede reportar como negativa para
Listeria monocytogenes.
7.3.23
Prueba de motilidad
A partir del ICC a 23 ºC ± 2ºC por 16 a 18 horas, montar una gota al fresco, observar la
movilidad en tumbos característica de Listeria spp por medio del microscopio de contraste de
fases en un aumento de 100 X.
a) Si el cultivo se observa puro y la morfología y la motilidad no son características de Listeria
spp la muestra se puede reportar como negativa para Listeria monocytogenes.
b) Si se observa en el ICC mezcla de células típicas y no típicas a Listeria spp, rayar el ICC
en SCDC para purificar seguir pasos 7.3.13 y si corresponde seguir el punto 9.4.4.
Nuevamente hacer prueba motilidad.
c) Si no hay crecimiento evidente el ICC se re-incuba a 23°C ± 2°C hasta que el
crecimiento sea evidente o hasta un total de 48 horas de incubación.
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d) Si la morfología y la motilidad es típica de Listeria spp y el cultivo es puro hacer pruebas
Bioquímicas y de confirmación.
Nota: Si la primera colonia sospechosa escogida del SCDC, no se confirma como
L. monocytogenes, se debe confirmar hasta al menos 3 colonias si estas están disponibles.
®
7.3.24 Inocular API
Listeria usando colonias ß hemolíticas provenientes del SCDC del
enriquecimiento primario o secundario (UVM; CF o MOPS-BLEB). Seguir instrucciones del
fabricante.
Día 6
7.3.25 Hacer lectura del Listeria API® de acuerdo a instrucciones del fabricante
Nota: Cultivos identificados como L. monocytogenes/L. innocua o cualquier Listeria spp
beta hemolítica que bioquímicamente sea indeterminada o identificada como L. innocua
se le debe realizar hacerle la prueba de ARN ribosomal por medio de la prueba específica
GENE-TRAK® L. monocytogenes (punto 7.3.27)
7.3.26
Hacer prueba de CAMP
Prueba de CAMP beta lysin: Asépticamente poner un disco de beta lysin en el centro de un
plato de agar sangre de oveja al 5% e inocular por estría de 4 a 8 aislamientos, haciéndolo en
forma radial lo más cerca del disco pero sin tocarlo. Incluir como control positivo la cepa de
Listeria monocytogenes y como control negativo la cepa de Listeria innocua. Incubar por 24 ±
2 horas a 35ºC ± 2 ºC.
-Prueba de CAMP tradicional: En una placa de agar sangre de oveja al 5 %, rayar una línea
simple de cultivos de referencia de S. aureus ATCC 25923 y R. equi ATCC 6939, las líneas
deben ponerse paralelamente y estar distanciadas por 3-4 mm. Los cultivos de las muestras
deben de ser rayados con una línea simple entre y perpendicularmente a los cultivos de
referencia, separados por 2-4 mm entre cada una de ellas (ver anexo 1). Incubar por 24 horas
a 35ºC ± 2ºC.
Día 7
7.3.27
Hacer lectura de la prueba de CAMP.
Prueba de CAMP Beta lisyn: Si se observa una zona de beta hemólisis en forma de cabeza de
flecha alrededor de la línea de inóculo próxima al disco, indica una reacción positiva.
L.monocytogenes, L. seeligeri y L. ivanovii presentan una reacción positiva. Si hay colonias
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con ß hemólisis en el SCDC pero no producen una reacción CAMP positiva a las 24 ±2 h,
continúe la incubación total por 48±2 h a 35°C ±2 °C y se reexamina. Si al reexaminar aún no
hay una reacción CAMP positiva, se tiene que determinar la identidad genética de la cepa por
la prueba basada en el ARN ribosomal. (Punto 7.3.27)
-Prueba de CAMP tradicional: Examinar el rayado de los cultivos por incremento de beta
hemólisis en ambos extremos proximales a las cepas de referencia. La zona de beta hemólisis
puede parecerse a la cabeza de una flecha, círculo o rectángulo. La presencia de esta zona
indica una reacción CAMP positiva y la ausencia una reacción CAMP negativa.
L.monocytogenes y L. seeligeri son CAMP positivas a S. aureus y CAMP negativa para R. equi.
L. ivanovii es CAMP positiva a R. equi y CAMP negativa a S. aureus. Si hay colonias con ß
hemólisis en el SCDC pero no producen una reacción CAMP positiva a las 24 ±2 h, continúa la
incubación total por 48±2 h a 35°C ±2 °C y se reexamina. Si al reexaminar aún no hay una
reacción CAMP positiva con S. aureus, se tiene que determinar la identidad genética de la
muestra por la prueba basada en el ARN ribosomal. (punto 7.3.27).
7.3.28 Prueba de ARN Ribosomal específico para Listeria monocytogenes GeneTrak
®
La prueba de ARN ribosomal se le debe hacer a cualquier cepa sospechosa de ser L.
monocytogenes atípica en las pruebas bioquímicas y de confirmación. Hacer la prueba de
ARN Ribosomal siguiendo instrucciones del fabricante.
Montar un control positivo de L. monocytogenes, un control negativo con L. innocua y un
control de esterilidad no inoculado.
Un resultado positivo confirma que la cepa atípica es confirmada como Listeria monocytogenes
Un resultado negativo indica que la cepa atípica no es Listeria monocytogenes
7.3.29
Mantenimiento de Cepas:
Mantener las cepas control de Listeria spp en un congelador a -70 ºC usando crioperlas
MicrobankTM
7.4
Control de Calidad
7.4.1
Cada lote de reactivos, kit GeneTrak y galerías API Listeria se les hará control de calidad
®
®
por medio de cepas de referencia siguiendo procedimiento IA-MBA- PE-015 Control de Calidad
de Reactivos.
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7.4.2 El control de calidad de los medios de cultivo utilizados se debe llevar a cabo de acuerdo al
procedimiento SEG-PE-005.
7.5 Informe
7.5.1 Reportar presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en 25 g o en el área de superficie
muestreada.
7.5.2 El resultado y los datos obtenidos en cada paso del análisis se registran en el formulario
IA-MBA-PE-009-RE-011
Hoja de trabajo: Análisis de Listeria monocytogenes
7.6 Puntos Críticos de Control
7.6.1 Control de las temperaturas de los incubadores: se debe mantener el registro de la temperatura
óptima de cada incubador, así como las medidas correctivas a seguir en caso de alguna variable, por
ejemplo interrupción fluido eléctrico o fallo del equipo, según se establece en el procedimiento IA-MBAPO-004 Control de Equipos
7.7 Bioseguridad
Se aplican las Normas de Bioseguridad para Laboratorios del nivel NB-2 Potencial Moderado.
8. Anexos
Anexo 1 : Prueba de CAMP con S. aureus y R. equi
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Anexo 1
 Prueba de CAMP con S. aureus y R. equi
Línea vertical (S) representa inóculo de S.aureus y línea vertical (R) R.equi. Las líneas horizontales representan
el rayado de las colonias sospechosas
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