TÉCNICAS INMUNOCITOQUÍMICAS: 2004-2005
Lugar: Laboratorio Anexo a la Sala de Microscopía.
TÉCNICAS:
1. Técnica inmunocitoquímica con oro coloidal sobre cortes finos.
2. Técnica de los complejos avidina-biotina (ABC) en cortes de parafina.
3. Doble inmunocitoquímica en cortes de parafina.
PROGRAMA:
Primer día: -Explicación general
-Comienzo del ORO COLOIDAL
Segundo día: -Terminar ORO COLOIDAL
-Comienzo del ABC
Tercer día:
-Terminar ABC
Cuarto día: -Comienzo de la DOBLE ICQ
Quinto día: -Terminar la DOBLE ICQ
SEGURIDAD:
En la desparafinación, hidratación y deshidratación de las preparaciones se utilizan
xilol y alcoholes. La manipulación del xilol debe hacerse dentro de la campana mientras que
no es necesario para el resto de los pasos. La cubeta debe estar siempre tapada en todos los
pasos (sobre todo para evitar contaminación de las preparaciones). Las personas con asma o
muy sensibles a los olores fuertes deberán llevar mascarilla o no realizar los pasos en los que
se esté cerca del xilol.
La inhibición de la peroxidasa endógena del tejido se hace con peróxido de hidrógeno
(agua oxigenada) que es corrosivo. Las preparaciones deberán de manejarse con pinzas.
Los revelados tanto de la Streptavidina como del ABC y la deasactivación de los
productos del revelado se realizarán bajo campana y con guantes.
La diaminobenzidina (DAB), es un producto nocivo que hay que manipular con muchísima
precaución, ya que es cancerígena. Los alumnos nunca deben manipular el producto en polvo:
se utilizan alicuotas congeladas de la solución. La preparación de la solución de revelado en
las prácticas deberá hacerla el profesor o un alumno en presencia del profesor.
El proceso de revelado se hará siempre en campana, incluso con el microscopio dentro de ella.
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HORARIO:
Grupo 1:
1. Lunes 25 de Octubre de 4 a 6
2. Martes 26 de Octubre de 4 a 7
3. Miércoles 27 de Octubre de 4 a 8
4. Jueves 28 de Octubre de 4 a 8
5. Viernes 29 de Octubre de 4 a 8
Grupo 2:
1. Lunes 8 de Noviembre de 4 a 6
2. Martes 9 de Noviembre de 4 a 7
3. Miércoles 10 de Noviembre de 4 a 8
4. Jueves 11 de Noviembre de 4 a 8
5. Viernes 12 de Noviembre de 4 a 8
Grupo 3:
6. Lunes 22 de Noviembre de 4 a 6
7. Martes 23 de Noviembre de 4 a 7
8. Miércoles 24 de Noviembre de 4 a 8
9. Jueves 25 de Noviembre de 4 a 8
10. Viernes 26 de Noviembre de 4 a 8
Los lunes y miércoles de cada semana tendrán sesión teórico-práctica en el aula C de 16-17h.
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Licenciatura de Biología: Curso 2004-2005
Prácticas de Técnicas Histológicas: Técnicas Inmunocitoquímicas
TÉCNICA DE LOS COMPLEJOS AVIDINA-BIOTINA (ABC) EN CORTES DE
PARAFINA
1. Poner los cortes en la estufa de 60ºC durante 15 min.
2. Poner los cortes en xilol durante 30 min.(se realiza bajo campana).
3. Pasar por alcohol etílico absoluto, alcoholes de gradación decreciente y agua desionizada.
(Se realiza bajo campana).
4. Poner los cortes en H2O2 al 3% (45 cc de agua desionizada y 5 cc de H2O2 al 30%) durante
10 min y en la oscuridad.
5. Lavado de 5 min en agua corriente.
6. Lavado de 5 min. en TBS.
7. Secar los portas y poner una gota de SUERO NORMAL DE CONEJO diluido 1:20
durante 30 min. en cámara húmeda.
8. Decantar el suero normal y poner el ANTICUERPO ESPECÍFICO: monoclonal
(obtenido en ratón) a la dilución adecuada durante una noche a 4ºC en cámara húmeda.
9. Lavado de 5 minutos en TBS.
10. Incubación con el ANTICUERPO PUENTE BIOTINADO: IgG de conejo contra la
fracción Fc de IgG de ratón diluido1/100 en TBS durante 30 minutos, a temperatura ambiente
en cámara húmeda.
11. Lavado de 5 minutos en TBS.
12. Incubación con los COMPLEJOS AVIDINA-BIOTINA (ABC), diluidos 1/100 en TBS,
durante 30 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda. NOTA: los complejos
avidina-biotina han de prepararse media hora antes de su utilización. Para ello se emplea
avidina y peroxidasa de rábano biotinada.
13. Lavado de 5 minutos en TBS.
14. REVELADO: Se lleva a cabo mediante una solución de 3,3´-diaminobencidina
tetrahidroclorada (DAB) diluida en acético-acetato y glucosa oxidasa.
MÉTODO: La solución de revelado se encuentra ya disuelta en dos tubos eppendorf, en otro
eppendorf se mezclan 250 μl de DAB y 250 μl de glucosa oxidasa. Se secan los portas y se
coloca una gota de la solución de revelado. La tinción se controla bajo microscopio. Una vez
reveladas las preparaciones se introducen en TBS para parar la reacción.
15. Lavar las preparaciones en agua corriente durante 5 min.
16. CONTRASTAR si se desea con hematoxilina de Harris durante 3-4 s. Diferenciar la
hematoxilina bajo agua corriente durante unos segundos.
18. Deshidratar con alcoholes de gradación creciente y xilol.
19. Montar con DPX.
TBS: Tris-HCl buffer salino (0,05 M de trizma base y 0,5 de ClNa; pH 7,36)
Tampón acético-acetato: 0,1 M de acetato sódico y ácido acético glacial; pH 5,6
¡¡¡ATENCIÓN!!!: el revelado debe hacerse con guantes y bajo campana. Las
soluciones de revelado y todo lo que haya estado en contacto con ellas debe tratarse con
lejía y también bajo campana.
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Licenciatura de Biología: Curso 2004-2005
Prácticas de Técnicas Histológicas: Técnicas Inmunocitoquímicas
TÉCNICA INMINOCITOQUÍMICA
CON ORO COLOIDAL SOBRE CORTES FINOS
1. Poner las redes en la estufa de 37ºC durante un día.
2. Hidratar los cortes en una gota de “gold buffer”, 10 min., temperatura ambiente
3. Pasar las redes a una gota de suero normal de cabra al 10% en “gold buffer”, 60 min., a
temperatura ambiente
4. Pasar las redes a la gota de ANTICUERPO ESPECÍFICO (utilizamos un monoclonal
obtenido en ratón) diluido en “gold buffer”, e incubar en cámara humeda, durante una noche.
5. Tres lavados en gota con “gold buffer” de 10 min. cada uno, a temperatura ambiente.
6.- Pasar las redes a la gota de ANTICUERPO PUENTE diluido 1:20 en “gold buffer”, 60
min.,a temperatura ambiente (IgG de cabra contra la fracción Fc de IgG de ratón marcadas
con oro coloidal de 10 nm).
7. Tres lavados en gota con “gold buffer” de 10 min. cada uno, a temperatura ambiente.
8. Lavados a chorro con el lavador de agua desionizada y secar las redes.
9. Contrastar con acetato de uranio 4 min, a temperatura ambiente y secar las redes; contrastar
seguidamente con citrato de plomo, 2 min., temperatura ambiente y secar las redes.
“Gold buffer”: TBS; 1% BSA, 0,05% azida sódica.
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Licenciatura de Biología: Curso 2004-2005
Prácticas de Técnicas Histológicas: Técnicas Inmunocitoquímicas
TECNICA DE DOBLE INMUNOTINCIÓN: MÉTODO DE LOS COMPLEJOS
FOSFATASA ALCALINA-ANTI-FOSFATASA ALCALINA (APAAP) Y DE LOS
COMPLEJOS AVIDINA-BIOTINA (ABC) EN CORTES DE PARAFINA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Poner los cortes en la estufa de 60 °C durante 15 min.
Poner los cortes en xilol durante 30 min.
Pasos por alcohol etílico absoluto, alcoholes de gradación decreciente y agua
desionizada.
Poner los cortes en H2O2 al 3% en agua desionizada (45 cc de agua y 5 cc de H2O2 al
30%) durante 15 min. Al finalizar, lavar en agua corriente.
Lavado de 5 min. en TBS
Secar los portas y poner una gota de SUERO NORMAL MEZCLA: de cabra diluido
1/30 y de cerdo diluido 1/20 en el volumen total (1/2 volumen de cabra a 1/15 y 1/2
volumen de cerdo a 1/10) durante 30 min y en cámara húmeda.
Decantar el suero normal y poner la MEZCLA DE LOS ANTICUERPOS
ESPECIFICOS: policlonal (obtenido en conejo) y monoclonal (obtenido en
ratón) a la dilución adecuada durante una noche a 4 °C en cámara húmeda.
8.
9.
Lavado de 5 min en TBS.
Incubación con la MEZCLA DE ANTICUERPOS PUENTE: Igs G de cerdo contra
la fracción Fc de IgG de conejo BIOTINADAS e IgsG de cabra contra la fracción Fc de
ratón, ambas diluidas 1/100 en el volumen total (½ volumen de Igs G de cerdo a 1/50 y
½ volumen de Igs G de cabra a 1/50 ).
10. Lavado de 5 min en TBS.
11. Incubación con la MEZCLA DE LOS COMPLEJOS FOSFATASA ALCALINAANTI-FOSFATASA ALCALINA (APAAP), diluidos 1/50 en el volumen total y
APAAP a 1/25 y 1/2 volumen de ABC a 1/50), durante 30 min y a temperatura ambiente
en cámara húmeda. NOTA: los complejos avidina-biotina han de prepararse media
hora
antes de su utilización. Para ello se emplea avidina y peroxidasa de rábano
biotinada.
12. Lavado de 5 min en TBS.
13. Lavado de 5 min en Tris/HCl 0,2M, pH 9.2 (una gota de100-150 l del tampón sobre el
tejido).
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14. REVELADO. Se procederá del siguiente modo: 1º revelado de la fosfatasa alcalina de
los complejos APAAP y 2º revelado de la peroxidasa de los complejos ABC.
1º. Revelado de la FOSFATASA ALCALINA con Naftol AS-TR-F y New
Fuchsin (da un color rojo). Se prepara en el momento la siguiente mezcla:
-1 ml de solución de naftol (1mg/ml).
-3 ml de buffer Tris/HCl 0.2M, pH 9,2.
-50 l de New Fuchsin
de New Fuchsin al 4% en HCl 2M y 25 l de nitrito sódico al 4% en H2O).
La solución de revelado debe de quedar de un color amarillento. Se secan los portas y
se coloca una gota de la mezcla de revelado FILTRADA. La tinción se controla bajo el
microscopio. Una vez reveladas, las preparaciones se lavan en agua corriente 5 min y
se pasan después otros 5 min TBS, de este modo ya están listas para el 2º revelado.
2º. Revelado de la PEROXIDASA con la técnica con glucosa oxidasa
intensificada con níquel (da un color negro). La solución de revelado está alicuotada
y congelada en dos eppendorfs por separado. En el momento del revelado se mezcla el
contenido de ambos a partes iguales. La composición de las soluciones es la siguiente:
- A:
sulfato de amonio y níquel: 1 mg/ml
-D-glucosa: 4 mg/ml
cloruro amónico: 0,8 mg/ml
glucosa oxidasa: 0,06 mg/ml
(Todo ello disuelto en tampón acético-acetato 0,2 M, pH 5,6)
- B: 3,3'-diaminobencidina tetrahidroclorada (DAB): 1 mg/ml, disuelta en
agua desionizada.
Tras mezclar las soluciones, se secan los portas y se coloca una gota de la solución
de revelado. La tinción se controla bajo el microscopio. Una vez reveladas, las
preparaciones se introducen en el tampón acético-acetato.
15. Lavar las preparaciones en agua corriente durante 5 min.
16. Montar con PBS/glicerol (1:1).
TBS: Tris Buffer Salino (0,05 M de Trizma base y 0,5 M de ClNa, pH 7,36)
¡ATENCION! Las soluciones de revelado deben manipularse siempre con guantes y bajo
campana. Tras su utilización, tanto las soluciones como todo lo que haya estado en contacto
con ellas debe tratarse con lejía, también bajo campana.
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TÉCNICAS INMUNOCITOQUÍMICAS: 1999-2000