Fungifast Inserto - Medica-Tec

Cada galería FUNGIFAST tiene un pocillo control positivo (pocillo C+) que pone en
evidencia la asimilación de la glucosa.
3.2 – Prueba de sensibilidad
La determinación de la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos está basada
en el crecimiento o no de las levaduras en presencia de diferentes antifúngicos
Ese crecimiento es visualizado por un cambio de color del medio.
La fermentación de la glucosa por las levaduras conduce a una acidificación del medio
que hace virar la resazurina presente en el medio del violeta oscuro al violeta, rosa o
incoloro.
4- REACTIVOS
Descripción
El FUNGIFAST permite la identificación de las levaduras más frecuentemente encontradas
en patología humana y determinar su sensibilidad a varios antifúngicos utilizados para
tratar las micosis superficiales o profundas.
2 - INTERES
La frecuencia de las infecciones y en particular la de las infecciones de las levaduras han
aumentado considerablemente durante los últimos años. Entre las especias de Candida,
solo unas diez son principalmente responsables de infecciones humanas (candidiasis).
Provocan infecciones superficiales (candidiasis cutáneas y mucosas) principalmente
debidas a Candida albicans y profundas o sistemáticas debidas a C. albicans pero
igualmente a C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis.
Las Candidas son igualmente responsables de infecciones nosocomiales.
Entre las otras levaduras, Cryptococcuss neoformans es responsable de Infecciones graves
especialmente para los pacientes inmunocomprometidos.
La prescripción de nuevos antifúngicos y la aparición de cepas resistentes a los
tratamientos hacen la necesidad de evaluar el comportamiento de las levaduras con
respecto a los antifungicos
3- PRINCIPIO
3.1 - Identificación
La identificación de las levaduras esta basada en:
La presencia o la ausencia de varias enzimas visualizada por reacciones
coloreadas. Las actividades enzimáticas se destacan por 3 tipos de reacciones:
Hidrólisis de sustratos cromogénicos : las actividades oxidasa y peptidasa de las
levaduras hidrolizan estos sustratos cromogénicos y provocan la liberación de paranitrofenol o de para-nitroanilina coloreados en amarillo(pocillos β-NAG y PRO).
Asimilación de sustratos naturales
- El uso de azucares se pone de manifiesto por el cambio de color del Púrpura de
bromocresol (BCP) del violeta al marrón o al amarillo o incoloro (pocillos TRE, MAL, CEL,
RAF, LAC).
- La hidrólisis de la urea libera amoniaco que alcaliniza el medio y hace virar el Rojo Fenol
(RP) a rosa fucsia (pocillo URE).
Oxidación de sustratos sintéticos
La actividad de fenoloxidasa en presencia de acido cafeico produce una coloración marrón
(pocillo POX)
SUSPENSION FUNGI:Frasco de 4 ml de medio semiagar, para suspensión de colonias e identificación.
Contiene Bacto Agar, colimicina y vancomicina
MES FUNGI: Frasco de 5 ml de medio líquido, para
estudio de sensibilidad (medio RPMI modificado)
conteniendo rezarsurina como indicador de crecimiento
y glucosa
TC FUNGI: Frasco de 4 ml con solución de sulfato de
bario, para control de la estandarización del inóculo
FUNGIFAST: galería con 20 pocillos , acondicionadas
individualmente en bolsas de aluminio
Cantidad
44408
44430
10
35
8
30
1
1
8
30
Serie para la identificación
pocillo 1(C+): control positivo conteniendo glucosa y BCP
pocillo 2 (ß-NAG) conteniendo un sustrato cromogénico de la
N-acetilß-D-glucosaminidasa
pocillo 3 (PRO) conteniendo un sustrato cromogénico de la L- prolina-amidasa
pocillo 4 (TRE) conteniendo trehalosa y BCP
pocillo 5 (MAL) conteniendo maltosa y BCP
pocillo 6 (CEL) conteniendo celobiosa y BCP
pocillo 7 (RAF) conteniendo rafinosa y BCP
pocillo 8 (LAC) conteniendo lactosa y BCP
pocillo 9 (POX) conteniendo un sustrato de fenoloxidasa
pocillo 10 (URE) conteniendo urea y RP
Serie para la prueba de sensibilidad
El pocillo 11 es un pocillo vacío de control de crecimiento (C+).
Los pocillos 12 a 20 contienen diferentes antifúngicos :
pocillo 11 (C+) : (0 μg/mL)
pocillo16 (ITZ) : (0.125 μg/mL)
pocillo 12 (AB) : (0.5 μg/mL)
pocillo 17 (ITZ) : (0.5 μg/mL)
pocillo 13 (AB) : (2 μg/mL)
pocillo 18 (FCZ) : (8 μg/mL)
pocillo 14 (5FC) : (4 μg/mL)
pocillo 19 (FCZ) : (32 μg/mL)
pocillo 15 (5FC) : (16 μg/mL)
pocillo 20 (VRZ) : (1 μg/mL)
Principio activo
Anfotericina B
Abreviación
AB
Denominación comercial
FUNGIZONE (convencional)
ABELCET, AMBISONE (liposomal)
Flucitosina
Intraconazol
Fluconazol
Voriconazol
5FC
ITZ
FCZ
VRZ
ANCOTIL
SPORANOX
TRIFLUCAN
VFEND
5- PRECAUCIONES
- Los reactivos de ese kit son destinados a un uso in vitro únicamente y deben ser
manipulados por personal habilitado
- Las muestras de pacientes y los reactivos sembrados son potencialmente infecciosos.
Deben ser manipulados con precauciones, en cumplimiento de las normas de higiene y la
normativa vigente para este tipo de producto en el país de uso
- Ciertos pocillos de la galería contienen materias primas de origen animal y deben ser
manipulados con precauciones.
- Ciertos pocillos de la galería contienen sustancias químicas peligrosas y deben ser
manipulados con precauciones
- No usar los reactivos después de la fecha de caducidad
- No utilizar los reactivos dañados o mal almacenados antes de su uso.
6- RECOGIDA DE LAS MUESTRAS
La identificación y las pruebas de sensibilidad deben ser realizadas sobre colonias jóvenes
(24 horas) y perfectamente aisladas a 37°C en un medio agar, de preferencia en placa de
Petri. Es recomendado efectuar el aislamiento en medios específicos de levaduras tal como
los medios Sabouraud o los medios cromogénicos (Agar CANDICHROM II, REF 44211).
7- CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS
Los reactivos conservados a 2-8°C en sus estados originales son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la caja.
Los medios SUSPENSION FUNGI y MES FUNGI así como las galerías FUNGIFAST están
listos para usar y deben ser utilizados inmediatamente después de abiertos
8 – REACTIVO Y MATERIALREQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO
• Aceite de parafina
• Pipetas estériles
• Estufa à 37 °C
• Recipiente para desechos contaminados
9 – METODO
Llevar los reactivos a temperatura ambiente (18-25°C) antes del uso
Picar 2 à 3 colonias aisladas idénticas con el uso de un ansa o de una pipeta Pasteur
bloqueada. A continuación descargar en un medio de SUSPENSION FUNGI.
Homogeneizar. La estandarización del inoculo puede ser realizada de varias maneras:
Con respecto al frasco TC FUNGI
Ajustar la opacidad del medio SUSPENSION FUNGI sembrado a la del TC FUNGI
ayudándose de las líneas negras de las etiquetas del frasco.
Si el medio de suspensión es más claro (inoculo insuficiente), sembrar de nuevo el frasco
hasta la obtención de una opacidad igual a la del frasco de control.
Si el medio de suspensión es turbio (inoculo demasiado rico), diluir ayudándose de un
nuevo frasco de SUSPENSION FUNGI hasta obtener una opacidad correcta
Con el uso de un densitómetro
Verificar con un densitómetro que la turbidez de un medio de suspensión sembrado es igual
a 2 Mac Farland. Si es necesario, operar como se indica anteriormente hasta ajustar la
turbidez
9.2. Inoculación de la galería
Serie de pocillos para la identificación
Identificar correctamente la galería con las muestras a analizar
Levantar la etiqueta adhesiva y a continuación distribuir en cada uno de los 10 pozos:
- 100μL de SUSPENSION FUNGI sembrada y estandarizada
Poner cuidadosamente la etiqueta adhesiva en la galería.
Serie para la prueba de sensibilidad
En un primer lugar, inocular el medio MES FUNGI con 10μL de SUSPENSION FUNGI
sembrada y previamente estandarizada.
Mezclar. A continuación en un segundo tiempo levantar la etiqueta adhesiva y distribuir en
cada uno de los pocillos para la prueba de sensibilidad.
- 100 μL de MES FUNGI previamente sembrado
- 2 gotas de aceite de parafina
Poner cuidadosamente la etiqueta adhesiva en la galería
9.3. Incubación de la galería
Incubar la galería a 37°C durante 24 horas. Si necesario y según las cepas, seguir la
incubación hasta 48 horas o 72 horas (10.1).
Nota: No leer luego de una incubación de solamente 18-20 horas
10- LECTURA E IDENTIFICACIÓN
10.1. IDENTIFICACION
10.1.1. Validación (pozo 1)
Después 24 horas de incubación leer la galería cuando el pozo de control positivo vire de
violeta a amarillo / incoloro, si queda de color violeta ampliar el tiempo de incubación
No extender la incubación más allá de 48 horas excepto en caso de sospecha de
Cryptococcus neoformans para el cual la incubación puede seguirse hasta 72 horas
máximo.
10.1.2. Lectura (pozos 2 a 10)
Leer los resultados de la galería refiriéndose a la gama de colores incluida en la caja. Las
coloraciones son estables por 4 horas.
La interpretación de la galería se hace por un sistema de códigos o por una tabla de
identificación incluidas en la caja. Si después de 24 horas de incubación el código obtenido
no es referenciado, seguir la incubación 24 horas suplementarias. Si después de 48 horas
de incubación el código resultado no es todavía listado, consultar la tabla de identificación.
Para una levadura dada, todos los caracteres mayores indicados en esta tabla deberán
imperativamente ser positivos.
Para establecer el código, los caracteres son catalogados en triplete:
- ß-NAG, PRO, TRE
- MAL, CEL, RAF
- LAC, POX, URE
A cada carácter es atribuido un valor cero si el elemento es negativo. Si el elemento es
positivo su valor depende de su posición en el triplete
- 1 para la posición 1
- 2 para la posición 2
- 4 para la posición 3
En un mismo triplete, los valores son adicionados, se obtiene así un número de tres cifras.
Este código se busca en el listado adjunto.
Ejemplo: Código 710; en el listado este código corresponde a C. albicans
C dubliniensis. Estas dos especies pueden ser diferenciadas utilizando la prueba
ELITex Bicolor dubliniensis (REF 44502)
Si los resultados obtenidos no corresponden a una especie catalogada, otra galería más
completa deberá ser utilizada para identificar la levadura (ELIchrom FUNGI, REF 44328).
Nota: Para la identificación, es igualmente posible de ayudarse con el esquema de colores
impreso o con la hoja de resultados.Leer el resultado de pozo ß-NAG (+/-) e identificar el
ultimo pozo positivo a la derecha hasta el pozo LAC. El nombre del germen es indicado en
la intersección del carácter positivo (filas inferiores) o negativa (filas superiores) del pozo
PRO y del zúcar localizado.
10.1.3.Diagnostico diferencial
Para confirmar la identificación de Candida krusei (código 000) es necesario efectuar
exámenes complementarios.
- Sobre agar CANDICHROM II Candida krusei presente colonias de color blanca crema, con
bordes ondulados e irregulares y de tamaño my grande.
- La prueba ELITex krusei (REF 44504) permite igualmente la identificación rápida de
Candida krusei directamente desde las colonias.
10.2 PRUEBA DE SENSIBILIDAD
Para la lectura y la interpretación de los resultados, es recomendado utilizar la gama de
colores y la hoja de resultados incluidos en la caja.
10.2.1 Validación (pozo 11)
Verificar que el medio correspondiente al control de crecimiento (C+) viró al rosado o al
incoloro, caso contrario seguir la incubación 48 o 72 horas.
En caso de identificación
(pozos 1 a 10) de Cryptococcus neoformans, prolongar la
incubación a 30ºC hasta 72-96 horas máximo.
Un cambio de color del medio, inicialmente violeta oscuro a violeta, rosado o incoloro
traduce la capacidad de la cepa a desarrollarse a la concentración testada del antifúngico.
Al contrario, la ausencia del cambio de color del medio indica que la cepa se inhibió a la
concentración del antifúngico.
10.2.3 Interpretación de los resultados.
La cepa es caracterizada como Sensible (S), intermedio (I) / Sensible Dosis Dependiente
(SDD) o Resistente (R) dependiendo del crecimiento o del no crecimiento en presencia de
concentraciones críticas de antifúngicos.
Es recomendado interpretar los resultados ayudándose de la hoja de resultados.
10.2.4 Concentraciones críticas
Las concentraciones críticas (μg/ml), habitualmente utilizadas en la interpretación de la
resultados son las siguientes:
ND: no determinado
*: Para la anfotericina, una CMI > 2 μg/ml indica una resistencia probable. Los criterios de
interpretación escogidos son: S: < 1μg/ml, I: =2 μg/ml, R: > 2 μg/ml
**: concentraciones determinadas por el CLSI
Observación: C. krusei presente una resistencia intrínseca al fluconazol y el resultado
debe ser sistemáticamente dado (R) para este antifúngico.
11 – CONTROL DE CALIDAD
Para asegurarse de la estandarización del método, se recomienda realizar un un control de
calidad en forma periódica utilizando las cepas de referencia, Candida albicans ATCC
90028 y Candida krusei ATCC 6258.
Los resultados esperados son dados en la tabla siguiente:
12- CAUSAS DE ERRORES
-Preparación del inóculo desde una mezcla de cultivos.
- Galería y/o medio de aislamiento no incubados a 37ºC.
12.1. Identificación
- Etiqueta adhesiva despegada durante la incubación
- Galería incubada más de 48 hs, excepto la C. neoformans
12.2. Prueba de sensibilidad
• Preparación de un inoculo demasiado rico o demasiado bajo.
• Preparación de un inoculo con colonias aisladas de más de 48 h.
• Olvido de la adición de aceite de parafina en los pozos 11 a 20.
• Lectura de la galería con un tiempo de incubación de 24 horas.
• Lectura de la galería en ausencia de cambio de color en los pozos de
control de crecimiento.
• Lectura de la galería 24 o 48 horas tras el viraje de color en el pozo de
control de crecimiento. Y de manera general, el no cumplimiento de las
recomendaciones de este folleto.
13- LIMITES DEL METODO
13.1. Identificación
La galería FUNGIFAST solo permite identificar las especies descriptas en la base de datos
13.2. Prueba de sensibilidad
El método de determinación in vitro de la sensibilidad a los antifúngicos tiene un valor
indicativo sobre la interacción de la pareja antifúngico/levadura durante los tratamientos
in vivo.
14 – PERFORMANCES
Identificación : un estudio comparativo fue realizado, comparando con el método
AUXACOLOR 2 de Biorad con 94 levaduras (50 Candida albicans / dubliniensis, 15 C.
tropicalis, 15 C. glabrata, 4 C. guillemondii, 3 C. kefyr, 3 C. krusei, 3 C. lusitaniae, 4 C.
parapsilosis, 4 Saccharomyces cerevisiae, 3 Cryptococcus neoformans), la mayoría
aisladas de muestaras clínicas.
93/94 (98,9%) cepas han sido correctamente identificadas:
- 89 cepas fueron correctamente identificadas por ambos métodos.
- 3 cepas Saccharomyces cerevisiae fueron identificadas únicamente con
FUNGIFAST.
- 1 cepa C. guillermondii fue identificada con FUNGIFAST y falsamente
identificada con el AUXACOLOR 2.
- 1 cepa C. lusitaniae fue falsamente identificada con FUNGIFAST y no
Identificada con AUXACOLOR 2.
Antifúngico: un estudio comparativo fue realizado en comparación con el método ATB
FUNGUS 3 de Biomérieux con 109 levaduras (55 Candida albicans, 21 C. glabrata, 6 C.
parapsilosis, 5 C. tropicalis, 5 C. lusitaniae, 6 C. krusei, 3 C. kefyr, 2 C. guillermondii, 5
Saccharomyces cerevisiae, 1 Cryptococcus neoformans), la mayoría frescamente
aisladas de muestras clínicas.
Los resultados de los porcentajes de concordancia, en categorización
clínica, son dados en la tabla a continuación:
dm: discordancia menor
DM: discordancia mayor
DTM: discordancia muy mayor
% conc. : % de concordancia
* Las 4 DTM fueron obtenidas con cepas de S. cerevisiae.
La concordancia global fue de 87,5%.
15 - ELIMINACION DE LOS DESECHOS
Los desechos deben ser eliminados respectando las reglas de higienes y la reglamentación
en vigor para este tipo de reactivo en el país de uso.
16- BIBLIOGRAFIA
Michel-Nguyen A., M.L. Darde, A. Penaud et B. Bouteille. 1997. Evaluation de la galerie
colorimétrique FUNGIFAST® I TWIN identifiant dix espèces de levures d’intérêt médical. J.
Mycol. Méd. 7: 81-86. Paugam A., M. Benchetrit, A. Fiacre, C. Tourte-Schaeffer and J.
Dupouy-Camet. 1999.
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Gosey L.L. , Odds F.C., Rinaldi M.G., Sheehan D.J. and Warnock D.W. 2001. Antifungal
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