Guia Determin Metabolitos -Practicas BQ-Ciencias 2006-II

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA
DEPARTAMENTO BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA
SECCION BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
PRACTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUIMICA– 2006 II
I.- DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE Y PRUEBA DE TOLERANCIA A LA
GLUCOSA
Azúcar en Sangre
La sangre es el vehículo por el cual la glucosa es distribuida a los tejidos y esta puede provenir de fuentes
exógenas (realimentación) o de la reserva de carbohidratos. En un adulto sano con 75 Kg de peso, la reserva
de glucosa es de aproximadamente 370 g y se encuentra almacenada en forma de glucógeno hepático y
muscular. Cuando es requerido por el organismo, estas reservas pueden ser movilizadas y degradadas
rápidamente, lo que permite una autonomía máxima de 4 a 8 horas dependiendo de la actividad realizada, es
por ello que el ser humano es altamente dependiente de la ingestión de carbohidratos de forma periódica.
Monitorizar los niveles de glucosa como índice de los estados extremos fisiológicos que ocurren entre el
ayuno y la realimentación no es posible, debido a que existen mecanismos de homeostasis finamente
regulados que, en condiciones de ayuno, permiten mantener niveles de glucosa en sangre entre 3.6 y 6
mmoles/L (65 y 108 mg/dl), gracias a la degradación de glucógeno inicialmente y de aminoácidos
glucogénicos posteriormente. Además, los niveles de glucosa son afectados por el ejercicio y por la presencia
de muchas enfermedades, la edad, uso de drogas, factores de stress, etc.
Sin embargo, después de corregir los niveles de glucosa en ayunas por los factores edad e interacción de
drogas, se puede determinar enfermedades relacionadas con el control de los niveles de glucosa circulante,
los cuales tienen gran importancia diagnóstica. Diabetes y problemas hepáticos pueden ser detectados
haciendo mediciones de glucosa en ayunas y realizando a su vez una prueba de tolerancia a la glucosa
Métodos para medir glucosa:
El primer método que se utilizó para determinar glucosa es el denominado sustancias reductoras en sangre
total, que utilizaba la reducción del cobre por la glucosa, para obtener un compuesto coloreado. Ese método
es histórico, y ya no se utiliza en la práctica clínica.
paso 1:
paso 2:
Cu ++ + glucosa

Cu2OCu+ + molibdato  complejos de molibdeno (azul)
calor
OH-
Este método da un sesgo positivo grande, porque la reacción puede darse no sólo con glucosa sino con otros
azúcares, creatinina, ácido ascórbico y otros compuestos reductores que puedan estar presentes en la sangre.
Sin embargo, el sesgo positivo de este método era reducido en parte porque la medición se hacía en sangre
total. Aunque la concentración de glucosa es usualmente la misma en el agua del plasma y en el agua dentro
del eritrocito, existe relativamente menos agua por volumen de eritrocito que en el plasma. En general, los
rangos de referencia para la glucosa son menores cuando se expresan para sangre total que para plasma.
La tendencia en los últimos años ha sido usar ensayos enzimáticos para medir glucosa, indistintamente en
suero o en plasma. Si bien los rangos de referencia para esos métodos no son muy diferentes, existe una
convención para diferenciar los métodos enzimáticos del de sustancias reductoras, y es denominar “azúcar”
al resultado del primer método y “glucosa” a los del segundo. La determinación de glucosa en plasma se
considera más representativa de la concentración de ésta en fluidos corporales y por ello se prefiere a la
determinación en sangre total.
1
El método que se va a utilizar en la práctica utiliza a la enzima glucosa oxidasa, produciendo acido Dglucónico y peróxido. El peróxido reacciona con el ácido p-hidroxibenzoico (p-HBA) y la 4-aminoantipirina
(4-AAP) formando un compuesto coloreado, el cual es cuantificado por espectrofotometría a 505 nm. La
glucosa oxidasa es altamente específica para la ß-D-glucosa.
D-glucosa + O2
ácido D- glucónico + H2O2
Glucosa
Oxidasa
H2O2 +
p-HBA + 4-AAP
compuesto coloreado+ H2O
peroxidasa
Prueba de Tolerancia a la Glucosa
Se puede evaluar la eficiencia del metabolismo de glucosa cuantificando los niveles de glucosa en sangre
luego de una carga de glucosa oral. La tolerancia a la glucosa implica que luego de esta carga no se observe
glucosa en la orina (glucosuria) y que la glucosa en sangre siga una curva típica a la largo del tiempo (ver
figura).
Curva de Tolerancia Promedio
después de la ingestión de 100 g de glucosa
glucosa (mg/dL)
350
300
250
normal
200
daño hepático
150
diabetes ligera
diabetes severa
100
50
0
0
50
100
150
200
minut o s d esp ués
d e la ing est ió n
Idealmente, para realizar esta prueba la carga de glucosa debe ser ajustada al peso corporal del paciente (1.75
g glucosa/kg peso). Los valores de glucosa observados a los 60 minutos no deben sobrepasar las 160 mM/dL
(9 mmol/l), y deben retornar a los valores de referencia dentro de los 180 minutos posteriores a la ingestión
de la carga de glucosa.
Existe el caso en que no se observa un incremento de los niveles de glucosa sobre el basal a lo largo del
tiempo. Esto puede ser normal si se trata de un paciente joven y de contextura delgada. Sin embargo, estos
resultados también pueden indicar la presencia de hipotiroidismo o estados de malabsorción.
Las condiciones clínicas que pueden estar asociadas con un resultado anormal de tolerancia a la glucosa
(fuera de la diabetes) son las siguientes:
1. ingestión de carbohidratos disminuida en los días anteriores a la prueba
2. insuficiencia hepática severa
3. enfermedades crónicas con desnutrición (alcoholismo, uremia)
4. inactividad física prolongada (más de 72 horas en cama)
5. stress agudo (fiebre, trauma, cirugía mayor)
6. enfermedades endocrinas (acromegalia, síndrome de Cushing, insulinoma, glucagonoma entre otras)
7. uso de drogas
8. sobrepeso (más de 20% sobre el peso ideal)
9. trastornos gastrointestinales
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II.- DETERMINACION DE COLESTEROL Y TRIGLICERIDOS EN SANGRE
El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis, y tejido cerebral. Es el precursor de los ácidos biliares,
esteroides y de la vitamina D.
El colesterol así como los triglicéridos y fosfolípidos son esencialmente insolubles en el agua: Sin embargo
deben ser transportados desde el tejido de origen (el hígado donde son sintetizados o el intestino donde son
absorbidos a partir de la dieta) hacia los tejidos donde serán almacenados o consumidos: Son transportados
en el plasma formado lipoproteínas, las cuales se diferencian por su composición y por lo tanto en su
densidad: quilomicrones, VLDL, LDL, HDL.
En mamíferos, la síntesis del colesterol esta regulada por la concentración de colesterol intracelular y las
hormonas glucagon e insulina. Sin embargo esta regulación puede verse alterada por las condiciones de la
dieta o por defectos genéticos en el metabolismo del colesterol. Si la suma del colesterol sintetizado y el
obtenido de la dieta excede la cantidad requerida para la síntesis de membranas, sales biliares y esteroides, se
produce la acumulación patológica del colesterol produciendo la obstrucción de vasos sanguíneos
(ateroesclerosis). Varios investigadores han encontrado relación entre esta patología y las enfermedades
coronarias, con altos niveles de colesterol en particular el colesterol unido al LDL.
La evaluación de los niveles de colesterol (total, asociado a HDL, asociado a LDL) y los niveles de
triglicéridos constituyen una herramienta valiosa para la clasificación de los desordenes lipídicos y para
prevenir los riesgos de ateroesclerosis y enfermedades coronarias.
Determinación de Colesterol Total
El método para determinar el Colesterol Total consta de 3 reacciones acopladas:
1. La enzima Colesterol Ester Hidrolasa, libera el colesterol de los esteres de colesterol
2. EL colesterol liberado es oxidado por la Colesterol Oxidasa produciéndose péroxido de hidrógeno
3. El peroxido de hidrogeno, en presencia de la enzima Peroxidasa reacciona con el sistema
cromogénico dando origen a un compuesto coloreado, que es leido en el espectofotómetro a 505nm.
Colesterol ester
Colesterol + Acidos grasos
Colesterol ester
Hidrolasa
Colesterol + O2
colesterol-4-en-3-ona
+ H2O2
Colesterol
oxidasa
2 H2O2
+
4-AAP +
p-HBA
compuesto coloreado + 4H2O
peroxidasa
Determinación de LDL-Colesterol
EL LDL-Colesterol (colesterol asociado a las lipoproteínas de baja densidad, LDL) es obtenido por
precipitación selectiva del LDL mediante el uso de una solución de Heparina y Citrato de Sodio, quedando
el colesterol asociado al HDL y VLDL en el sobrenadante.
Por lo tanto la concentración de LDL-Colesterol precipitado se calcula obteniendo el diferencial entre el
valor de Colesterol Total y el valor obtenido en el sobrenadante, el cual corresponde al Colesterol asociado a
HDL y VLDL.
Determinación de Triglicéridos
El método para determinar los triglicéridos, se basa en la hidrólisis de los Triglicéridos por una enzima
Lipasa específica, liberando los ácidos grasos y el glicerol. El glicerol luego es fosforilado por la enzima
Glicerol kinasa y posteriormente el glicerol 1-fostato es oxidado a dihidroxiacetona – fosfato por la enzima
Glicerol fosfato oxidasa, generándose peróxido de hidrogeno. Posteriormente, el peróxido reacciona con
3
otro sistema cromogénico compuesto por 4-aminoantipirina (4-AAP) y 3,5 Dicloro-2-Hidroxibencensulfónico (DCBS) para producir por acción de la peroxidasa un compuesto coloreado, cuya
absorbancia es leída en el espectofotómetro a 520nm.
Triglicéridos
Glicerol + Acidos grasos
Lipasa
Glicerol + ATP
Glicerol-1-fosfato + ADP
Glicerol kinasa
Glicerol 1-fosfato
+ O2
Dihidroxiacetonafosfato + H2O2
Glicerol-fosfato
Oxidasa
2 H2O2 +
4-AAP + DCBS
compuesto coloreado +
4H2O
peroxidasa
III. DETERMINACION DE UREA EN SANGRE
La urea es el producto final mayoritario del metabolismo del nitrógeno proteico en los seres
humanos. Constituye la fracción más abundante de nitrógeno no proteico. Es producida por el
hígado, derivada hacia la sangre y luego excretada por la orina. Es por eso que la medición del
nitrógeno ureico en sangre permite evaluar la función renal. El rango de concentración normal de
urea sérica en humanos es del 10 a 50 mg/dL.
Es posible encontrar niveles elevados de urea en sangre como consecuencia de alteraciones en la
función hepática o renal, diabetes o luego de una ingesta elevada de proteínas.
La determinación de urea en orina tiene escaso valor clínico, aunque todavía se suele realizar para
evaluar el balance nitrogenado en pacientes sometidos a nutrición parenteral o en algunos casos de
pacientes con insuficiencia renal aguda o crónica.
La intoxicación por ingesta de exceso de urea u otras fuentes de nitrógeno no proteico es
usualmente aguda, progresa rápidamente y puede ser letal.
Fundamentos del método:
La urea (NH2CONH2) presente en la muestra es desdoblada a amonio por acción de la enzima
ureasa, según la proposición de Fauces y Scout.
Ureasa
CONH2CO + 2 H2O
2 NH3
+ CO2
+ H2O
El amonio producido reacciona con salicilato e hipoclorito en ambiente alcalino formándose un
complejo de color verde. La intensidad del color producido es directamente proporcional a la
cantidad de urea presente en la muestra y su absorbancia se lee a 600nm.
4
PARTE PRÁCTICA
OBJETIVO
Determinar los niveles de Glucosa, Colesterol, Triglicéridos y Urea en muestras de suero. Discutir según los
valores obtenidos para las muestras el riesgo de enfermedad coronaria, diabetes u otras patologías.
MATERIALES
 Equipo espectrofotómetro y cubetas de plástico de 1 cm de paso.
 Micropipetas automáticas
 Tubos de ensayo (de vidrio)
 Tubos de microcentrífuga, puntas de pipeta, guantes
REACTIVOS











Reactivo para la determinación de Glucosa (Solución G) (Cromógeno + buffer + enzimas )
Reactivo para la medición de Colesterol (C)
Reactivo para la medición de Triglicéridos (T)
Reactivo de precipitación de LDL (L)
Reactivo para la determinación de Urea (U)
Reactivo Hipoclorito (para la reacción de Urea) (H)
Estándar de Glucosa ( 100mg/dl)
Estándar de Colesterol ( 200mg/dl)
Estándar de Triglicéridos ( 200mg/dl)
Estándar de Urea (66 mg/dL)
Muestras de suero problema
PROCEDIMIENTO
I.
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
1. Rotular los tubos de ensayos como se indica en el cuadro
2. Pipetear los volúmenes correspondientes a cada tubo según como esta indicado en el cuadro.
Blanco
Estandar
Tiempo luego de ingesta de glucosa
Muestra
Estándar Glucosa
Solución (G)
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra
5
Basal
30 min
60 min
90 min
120min
0.01mL 0.01mL
0.01mL
0.01mL
0.01mL
1mL
1mL
0.01mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
3. Incubar a 37°C por 5 minutos o 10 minutos a Temperatura ambiente.
4. Leer absorbancia de las muestras a 505nm dentro de los primeros 30 minutos
5. Calcular la concentración de la glucosa en las muestras proporcionadas, según la siguiente
fórmula:
Concentración de Glucosa: Amuestra x Cestándar / Aestándar
6. Graficar la curva de tolerancia de glucosa con los datos obtenidos
7. Determinar el diagnóstico del paciente de la muestra según el grafico de la curva de tolerancia a
la glucosa
8. Discutir los resultados
DATO: El intervalo de referencia normal en suero es 70 mg/dL – 100 mg/dL
5
Cuestionario:
1. Cómo varían los niveles de glucosa con la edad?
2. Qué drogas y factores pueden afectar los niveles de glucosa en sangre?
3 Discutir los mecanismos metabólicos implicados en la ocurrencia de las condiciones anormales de
tolerancia a la glucosa listadas en el texto.
4 Discutir cómo aplicaría esta prueba en un paciente que tiene problemas gastrointestinales conocidos
II.
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL
1. Rotular los 3 tubos de ensayos como se indica en el cuadro
2. Pipetear los volúmenes correspondientes a cada tubo según como esta indicado en el cuadro.
Estándar Colesterol
Muestra
Reactivo (C)
Blanco
Estándar
0.01mL
1mL
1mL
MUESTRA
0.01mL
1mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a Temperatura ambiente
4. Leer las absorbancias a 505 nm, dentro de los primeros 30 minutos
5. Calcular la concentración del colesterol, según la siguiente fórmula:
Concentración de colesterol: Amuestra
x Cestándar / Aestándar
6. Discutir los resultados
III.
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL ASOCIADO A LDL
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
En un tubo de microcentrifuga colocar 0.05mL de la muestra
Agregar 0.5mL de reactivo precipitante para LDL
Mezclar y dejar reposar por 10 minutos a Temperatura ambiente
Centrifugar por 3 minutos a 10,000 rpm
Separar el sobrenadante en otro tubo de microcentrifuga nuevo
Rotular los tubos de ensayo según el cuadro
Pipetear los volúmenes correspondientes a cada tubo según como esta indicado en el cuadro.
Blanco
Estándar Colesterol
Sobrenadante
Reactivo (C)
1mL
Estándar
0.01Ml
1mL
MUESTRA
0.1 mL (100 uL)
1mL
8. Agitar bien e incubar por 10 a 37oC o 20 minutos a Temperatura ambiente
9. Leer las absorbancias a 505 nm dentro de los primeros 30 minutos
10. Calcular la concentración del colesterol en el sobrenadante:
Amuestra x factor
Factor =
240
.
Absorb. standard
11. Calcular la concentración del LDL colesterol, según la siguiente fórmula:
LDL colesterol (mg/dL) = Colesterol total - Colesterol en Sobrenadante
12. Discutir los resultados
6
IV.
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS
1. Rotular los tubos de vidrio como se indica en el cuadro
2. Pipetear los volúmenes correspondientes a cada tubo según como esta indicado en el cuadro.
Estándar Triglicéridos
Muestra
Reactivo (T)
Blanco
Estándar
0.01mL
1mL
1mL
MUESTRA
0.01mL
1mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 5 minutos a 37oC
4. Leer las absorbancias a 520 nm dentro de los primeros 30 minutos
5. Calcular la concentración de los Triglicéridos, según la siguiente fórmula:
Estándar de Triglicéridos = 200 mg/dL
Concentración de Triglicéridos =
Amuestra x Cestándar / Aestándar
6. Discutir los resultados
Cuestionario:
1. En un cuadro comparativo indique la densidad y composición (% de proteínas, fosfolípidos, colesterol
libre, esteres de colesterol, triacilgliceroles) de las diferentes lipoproteínas
4. ¿Cuál es la lipoproteína más rica en colesterol? Que puede ocurrir en el organismo si la concentración del
colesterol asociado a esta lipoproteina es muy alto?
IV. DETERMINACIÓN DE UREA EN SUERO
Procedimiento:
a. Preparar los tubos de ensayo según indica la siguiente tabla (todos los valores están dados en
mililitros).
Blanco
Estándar
Muestra desconocida
Estándar (ml)
0.0
0.01
--Muestra (ml)
----0.01
Reactivo enzimático (ml)
1 ml
1 ml
1 ml
Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
(o por 3 minutos a 37 oC)
Reactivo Hipoclorito (ml)
1 ml
1 ml
1 ml
Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos
(o por 5 minutos a 37 oC)
b. Leer la absorbancia de cada tubo a 600nm (en el plazo de no más de 1 hora)
c. Calcule la concentración de urea de la muestra problema siguiendo la siguiente fórmula:
Factor = 66 / Absorbancia del estándar
Urea (mg/dL) = Factor x Absorbancia de la muestra desconocida.
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Rangos de Referencia para Urea en humanos:
Suero o plasma:
Urea
10 a 50 mg/dl
Nitrógeno ureico
4.5 a 22.7 mg/dl
Orina:
Urea
Nitrógeno ureico
15 a 30 g / 24 horas
7 a 14 g / 24 horas
Cuestionario:
1. Discutir los resultados obtenidos en las muestras desconocidas.
2. Explicar por qué es importante la eliminación de la urea presente en la sangre?
ANEXO
Los resultados de las pruebas enzimáticas para triglicéridos y colesterol dan valores discriminantes
universales que ya han sido aprobados y establecidos para la evaluación de riesgos de contraer una
enfermedad cardiaca coronaria (ECC) y se denominan como valores referenciales, siendo estos los
siguientes:
VALORES DE COLESTEROL
Hasta 200 mg/dL
200-239 mg/dL
≥ 240 mg/dL
Riesgo bajo o nulo (sujetos normales)
Riesgo Moderado
Riesgo Elevado
VALORES DE LDL-COLESTEROL
Menores de 150 mg/dl.
150-195 mg/dL
≥ 195 mg/dL
Riesgo bajo o nulo (sujetos normales)
Riesgo moderado a elevado (individuos con
probabilidad de contraer ECC)
Riesgo muy elevado (individuos sospechosos de
padecer ECC)
VALORES DE TRIGLICERIDOS
25 - 150 mg/dL.
Rango deseable
150-199 mg/dL
Rango moderadamente elevado a elevado
200-499 mg/dL
Rango Elevado
≥ 500 mg/dL
Rango muy elevado
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