MICROBIOLOGIA APLICADA - Universidad Tecnológica de la
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MICROBIOLOGÍA APLICADA GUÍA DEL ALUMNO SECRETARÍA DE EDUCACIÓN PÚBLICA SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR E INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS ELABORÓ: APROBÓ: GRUPO DE DIRECTORES DE LA CARRERA DE PROCESOS AGROINDUSTRIALES COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS Revisión No. 0 Fecha de revisión: REVISÓ: COMISIÓN ACADÉMICA NACIONAL DEL ÁREA AGROINDUSTRIALALIMENTARÍA FECHA DE ENTRADA EN VIGOR: Pag. 1 de 133 1 I. DIRECTORIO DR. REYES TAMES GUERRA SECRETARIO DE EDUCACIÓN PÚBLICA DR. JULIO RUBIO OCA SUBSECRETARIO DE CIENTÍFICA EDUCACIÓN SUPERIOR E INVESTIGACIÓN DR. ARTURO NAVA JAIMES COORDINADOR GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS RECONOCIMIENTOS LIC. EN BIOL. FRANCISCA LAGUNES OLIVARES I.Q.I. ISRAEL ESTRADA GARCIA II. PROFESORES DE LA CARRERA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA HUASTECA HIDALGUENSE. MICROBIOLOGÍA APLICADA ESTA OBRA, SUS CARACTERÍSTICAS Y DERECHOS SON PROPIEDAD DE LA COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS (CGUT) FRANCISCO PETRARCA No.321, COL. CHAPULTEPEC MORALES, MÉXICO D. F. LOS DERECHOS DE PUBLICACIÓN PERTENEEN A LA CGUT. QUEDA PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN PARCIAL O TOTAL POR CUALQUIER MEDIO, SIN AUTORIZACIÓN PREVIA Y POR ESCRITO DEL TITULAR DE LOS DERECHOS. ISBN (EN TRAMITE) IMPRESO EN MÉXICO 2 II. INDICE CONTENIDO PÁGINA I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS II. ÍNDICE 1 III. INTRODUCCIÓN DE LA ASIGNATURA 2 IV. DIAGNOSTICO DE CONOCIMIENTOS 3 V. UNIDADES TEMÁTICAS Unidad 1. Fermentación, métodos de cultivo y cinética. Unidad 2. Cultivos industriales. Unidad 3. Fermentación alcohólica. Unidad 4. Fermentación acética. Unidad 5. Vinificación. Unidad 6. Fermentación láctica. Unidad 7. Producción de biomasa. Unidad 8. Enzimas microbianas y producción de aminoácidos. 4 8 10 22 31 44 74 83 VII ANEXOS Prácticas de laboratorio. 94 3 INTRODUCCIÓN A LA ASIGNATURA Los alimentos elaborados a base de fermentaciones han existido desde hace miles de años. Por ejemplo, la mayoría de las dietas incluyen vinagre, fruto de la fermentación mixta del vino mediante levaduras y, posteriormente, acetobacter (fermentos acéticos). El acetobacter aparece espontáneamente cuando el vino está expuesto al aire, aunque la producción comercial conlleva el uso de tanques de vinagre. La palabra "VINAGRE" proviene de vinagre (del francés, vino agrio). Aunque no sólo se elabora a partir del vino, cualquier otra bebida alcohólica puede emplearse como base, como por ejemplo la cerveza para producir vinagre de malta; y también algunas frutas (frambuesas, manzanas)o verduras y almíbares. También desde hace siglos en Oriente se produce la salsa de soja, el miso y el tempeh. En la elaboración de la salsa de soja se utiliza el hongo Aspergillus oryzae y otros microorganismos para fermentar una mezcla compuesta de soja y trigo. De ahí proviene su fuerte aroma y su color marrón rojizo oscuro. El proceso está dividido en dos etapas y puede durar entre 2 y 12 meses. Durante este tiempo, las proteínas y los azúcares se descomponen y los productos de la mezcla inicial dan lugar a una gran variedad de componentes de diversos sabores y aromas. En la producción del tempeh también se usa un hongo, el Rhizopus oligosporus. El tempeh es un alimento muy importante de la dieta de países como Indonesia, donde se utiliza como fuente principal de proteínas y otros nutrientes esenciales. El miso, fruto de la fermentación de la pasta de soja que se utiliza como base de sopas y salsas, se obtiene a partir de un cóctel de microorganismos similar. Se pueden producir diferentes variedades, todo depende de la cantidad de sal utilizada, los edulcorantes y el tiempo de fermentación. La fermentación y, por consiguiente, los microorganismos también se utilizan para elaborar aditivos. La propiedad del ácido glutámico (un aminoácido usado para obtener glutamato monosódico) de potenciar el sabor fue descubierta en Japón a principios del siglo XX. Además de dar sabor, los aminoácidos son nutrientes esenciales, ya que son componentes básicos de las proteínas. Algunos alimentos, como los cereales, contienen proteínas con un contenido del aminoácido lisina relativamente bajo. Puede añadirse lisina para mejorar la calidad nutricional de las proteínas. Las fermentaciones en las que intervienen las bacterias Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium flavum producen tanto ácido glutámico como lisina. Cabe mencionar también que el ácido cítrico se añade a refrescos, productos de confitería y medicinas. En el pasado, se extraía de los cítricos; sin embargo, hoy en día, alrededor del 99% de la producción mundial (más de 300.000 toneladas) proviene de la fermentación de un hongo, el Aspergillus niger. Los microorganismos también se utilizan para elaborar aditivos que dan consistencia a los alimentos. Muchas gomas producidas por microorganismos se utilizan en la industria alimentaria como espesantes, emulgentes y excipientes. Éstas pueden estabilizar la estructura del alimento y hacerlo más agradable tanto a la vista como al paladar. Las gomas más comunes son la xantina y la dextrina, producidas por cepas de las bacterias Xanthomonas y Leuconostoc respectivamente. 4 III.- DIAGNÓSTICO DE CONOCIMIENTOS NOMBRE:_____________________________________________________________ A.- CONTESTA CORRECTAMENTE LO QUE A CONTINUACIÓN SE TE PIDE (2.1). 1. ¿Qué es una fermentación? 2. ¿Cuántos tipos de fermentación conoces? 3. ¿Qué es un método de cultivo? 4. ¿Qué tipos de microorganismos intervienen en una fermentación? 5. ¿De qué forma es benéfica para nosotros la fermentación? 6. ¿Cómo actúan las enzimas en una fermentación? 7. ¿Qué productos podemos obtener por medio de la fermentación? 5 IV.- UNIDADES TEMÁTICAS UNIDAD 1.- FERMENTACIÓN, MÉTODOS DE CULTIVO Y CINÉTICA. DEFINICIÓN DE FERMENTACIÓN: o o o Proceso metabólico llevado acabo por microorganismos, bacterias y levaduras bajo condiciones aeróbicas y anaerobias obteniendo energía y teniendo características físico-químicas controladas. Es un proceso en el que se potencia deliberadamente el crecimiento de los microorganismos que consumen una cantidad de sustrato y enriquecen, por medio del cultivo los productos de su metabolismo. El proceso de fermentación es producido por acción de las enzimas cambios químicos en las sustancias orgánica. TIPOS DE FERMENTACIÓN: o o o o o Fermentación acética Fermentación alcohólica Fermentación butírica Fermentación cítrica Fermentación láctica Para llevar acabo la fermentación se requiere conocer el sustrato idóneo y microorganismos idóneo y conocer las características físico-químicas del sustrato. ¿QUE ES UN MEDIO DE CULTIVO? Un medio de cultivo es el sustrato que proporciona todos los requerimientos necesarios para el crecimiento de los microorganismos. CARACTERÍSTICAS IDONEAS QUE NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA LLEVAR A CABO UNA FERMENTACIÓN. Ser genéticamente estable en el medio de cultivo. Poseer células vegetativas, esporas algunas u otras unidades de reproducción. Tener un crecimiento rápido y vigoroso después de la inoculación (sembrar microorganismos en el sustrato). Ser un cultivo puro. Reproducirse en un tiempo respectivamente corto. Que no produzcan sustancias tóxicas . Tiempo de conservación debe de ser considerado (que el microorganismo no se muera rápido). El microorganismo debe ser industrialmente rentable . Que crezca o se desarrolle en condiciones relativamente sencilla. 6 CULTIVO DE MICROORGANISMOS. Los cultivos de microorganismos pueden prepararse de diferentes maneras, según el proceso de producción se clasifican desde el punto de vista industrial dependiendo del tipo de cambio que provocan en propiedades y transporte de las sustancias presentes en el proceso. FERMENTACIÓN POLIFÁSICO DISCONTINUO. Estos métodos se utilizan para el cultivo de bacterias, levaduras y mohos, se aplica sobre todo en la fermentación a gran escala recomendándose en la industria farmacéutica y en la producción de alimentos. Este tipo de fermentación industrial anaerobios facultativos se practica en donde se requiere grandes cantidades de gérmenes vivos para su posterior concentración (por ejemplo la obtención de biomasa, preparación continua de yogurt, crema, etc.). Las diversas etapas de la fermentación polifásica discontinua pasa por las etapas de preparación y cultivos de las cepas que por lo general se realiza en el laboratorio. En cambio en las etapas de la fermentación, en los fermentadores se suele acondicionar al proceso directo de producción. De acuerdo al tamaño de los fermentadores y a la cantidad de inóculo necesario se precisa un numero variable de etapas sucesivas de cultivo. ETAPAS DE FERMENTACION INDUSTRIAL Método polifásico de fermentación en superficie Este tipo de fermentar es muy útil en la microbiología de los alimentos. En un espacio de fermentación cerrada se colocan placas horizontales en una jaula que se llenan de medio nutricio liquido que llega por un producto central de alimentación. La siembra se realiza mediante inyección al primer medio nutricio con materia de inoculación de cepa a utilizar. 7 Siembra en jeringa Asa de nicromio Caja petri Cepa conservada liofilizada Cultivo Primer recultivo Tanque fermentador a nivel industrial. Segundo recultivo Etapa fermentativa m Envasado y envío Dosificador Solución Termómetro Fermentador Representación esquemática de una instalación polifásica. 8 MÉTODO MONOFÁSICO DE FERMENTACIÓN DE SUPERFICIE. En este tipo de fermentación las necesidades del material son escasos. El principio consiste en tomar con ayuda de asas o ganchos material de un cultivo madre, para sembrarlo directamente en los medios nutricios sólidos. Siembra en jeringa Asa de nicromio Caja petri m 9 UNIDAD 2.- CULTIVOS MICROBIANOS INDUSTRIALES IMPORTANCIA DE LOS CULTIVOS DE MICROORGANISMOS. Los microorganismos tienen importancia en la industria farmacéutica, alimenticia y la de agricultura, esto con una visión a la disgregación de las materias primas, así como una compleja y protección ambiental. El cultivo industrial necesario para la producción de determinados productos es materia de la microbiología (tecnología microbiana) o microbiología industrial. Factores con influencia sobre el crecimiento de los microorganismos. Influencia de la temperatura sobre el curso de la fermentación: Las temperaturas muy elevadas provocan la muerte de los microorganismos; y las temperaturas muy bajas inhiben el desarrollo de estos. Las temperaturas de crecimiento se clasifican en: Mínimas, Óptimas y Máximas. Temperatura mínima de crecimiento: es aquélla con la cual pueden evidenciarse toda vía, en las bacterias proceso de desarrollo y división. Temperatura óptima de crecimiento: es aquella en la cual es mínimo el tiempo que tardan los gérmenes en dividirse en la fase logarítmica. Temperatura máxima de crecimiento: se estima la mayor temperatura con la que independientemente del tiempo de actuación, toda vía tiene lugar de crecimiento y multiplicación. Óptimo Mínimo Máximo Logaritmo No. de M.O Logaritmo No. de M.O Tiempo Horas Logaritmo No. de M.O Tiempo Horas Tiempo Horas 10 Influencia de conservación de iones de hidrógeno sobre procesos de fermentación. En todos los procesos fermentativos, constituyen la concentración de iones de hidrógeno un parámetro esencial para el crecimiento de los microorganismos. La clasificación de los valores de pH para el desarrollo de los microorganismos, pH Mínimo, pH Óptimo y pH Máximo. En la zona de pH óptima que depende de la especie del microorganismo, del medio, etc. El tiempo que tardan los gérmenes en multiplicarse en la fase logarítmica es mínimo. Para lograr una adecuada fermentación industrial, resulta imprescindible efectuar ensayos para determinar el pH óptimo. 11 UNIDAD 3.- FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA INTRODUCCIÓN.La producción de bebidas alcohólicas ha sido una actividad ligada a la mayoría de las culturas durante miles de años. Existen evidencias arqueológicas de más de 7000 años de antigüedad que en forma empírica los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de diversos sustratos. Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados como los jugos de frutas, ya que éstos sólamente requieren poner en contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta. Desde épocas remotas diferentes civilizaciones aprendieron a fermentar diversos sustratos a fin de producir sus bebidas alcohólicas autóctonas ,pero fue hasta el siglo XV cuando empieza a popularizarse el arte de la destilación y de esta forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohólico. Las bebidas alcohólicas son compañeras constantes de el hombre en su historia, pero bien es cierto que su exceso es capaz de reducir nuestras sensibilidades y también es verdad que tiene la virtud de animar el espíritu y de establecer atmósferas propicias para la convivencia y conversación, esto cuando se consume con la justa medida y con la prudencia que caracteriza a quienes saben disfrutar de las cosas de la vida. Debido a al gran importancia de estos productos la investigación científica y tecnológica generan industrias las cuales son de mayor importancia económica en el mundo. BEBIDAS ALCOHOLICAS. Son soluciones acuosas que contienen además de agua alcohol sustancias orgánicas que ejercen influencia sobre los aromas y el sabor según “ Francisco Rico Benitez.” Son bebidas obtenidas a partir de cualquier jugo vegetal que no sea de uva y que tienen propiedades organolépticas nuevas y atractivas para una prueba estadística significativa de consumidores según Colin y Emilion. De acuerdo a su contenido alcohólico las bebidas alcohólicas se clasifican en: Fermentados.............................( 2-18% alcohol/volumen) Destilados................................ ( 30-60% alcohol/volumen) Generosas................................ (15-20% alcohol/volumen) Licores..................................... (15-90% alcohol/volumen) Ejemplo de un proceso para una bebida alcohólica jugo vegetal 80 y 230 g/l de azúcares fermentables pH: 3.6 y 4.3 antes de sulfatarlo. Clarificación Microfiltración. Inóculo cultivo puro. Fermentación 20 y 28°C bajo una atmósfera de CO2. ¿ Como se obtiene el alcohol ? 12 glucosa levadura alcohol + CO2 DESTILACIÓN. Es la separación de dos o más mezclas de sustancias con puntos de ebullición muy diferentes de una mezcla a otra (agua, alcohol) La temperatura de ebullición del alcohol es de 78oC. A partir de la glucosa, fructosa o sacarosa a través de las levaduras y temperaturas obtendremos alcohol (bebida fermentada) (2-18%) porque contiene agua y el agua diluye la concentración de alcohol y por eso es menos el porcentaje. Y así, aplicamos el proceso de destilación se separa el agua y obtendremos una bebida destilada de (30-60%) que es alcohol más puro porque se separa agua. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. Es un proceso bioquímico provocado por la acción de las levaduras y consiste en la formación de los azúcares en etanol y bióxido de carbono que es un subproducto del proceso. Es la formación de etanol producida por la fermentación anaerobia de la glucosa. La fermentación alcohólica no solo la sufren los azúcares fermentables (glucosa o fructosa). La sacarosa o azúcar de caña se desdobla en glucosa y fructosa por acción de la enzima invertasa y pentasa producida por las levaduras. Además los productos alcohol (anhídrido carbónico ), se forma también glicerina, ácido sucaníco, ácido subvolátiles, butiliglicol, alcoholes superiores (esencia de fusel ), acetaldehído, ácido láctico y esteres. La formación de los carbohidratos o azúcares a etanol mas bióxido de carbono se realiza en condiciones anaerobiosis mediante la ruta de la glicólisis, que consiste en la escisición de la glucosa para obtener energía (ATP). La transferencia de un fosforilo de ATP a la glucosa esta catalizada por hexoquinasa, los siguientes intermediarios de esta vía metabólica la dihidroxiacetona fosfato, gliceraldehido- 3-fosfato son azucares fosforilados, de hecho una de las estrategias de la glicólisis es formar intermediarios de 3 carbonos capaces de intransferir subgrupos fosfatos al ADP, y así obtener una síntesis neta de ATP. Desdoblamiento de la sacarosa a fructosa y glucosa por medio de la enzima invertasa Es un proceso que genera ATP en el cual las sustancias orgánicas actúan como ganadores y aceptores de electrones, la fermentación puede producirse en ausencia de O. Fue descubierto por Pasteur, que la describió como la vía sansi’air (la vida sin aire). Enzima : término propuesto en 1878 por Friedrich Wilhem Kuhne para designar a las sustancias catalíticamente activas, a las que previamente se les había llamado fermento. Derivado de las palabras griegas en (en) y zumos (levaduras). 13 ETAPAS Y RECCIONES QUÍMICAS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHOLICA. GLICÓLISIS. Derivado del griego glycos = azúcar (dulce), Lysis = disolución que quiere decir azúcar en disolución. La glucólisis es la secuencia de reacciones que convierte a la glucosa en piruvato con la producción convidante de ATP. La glicólisis es una de las diversas rutas catabólicas , conocidos generalmente como fermentaciones anaerobias, mediante muchos organismos , obtienen energía química de varios combustibles orgánicos en ausencia de oxígeno molecular. Dado en que los organismos vivos sugieren inicialmente en una atmósfera que careció de oxigeno. La glicólisis es la secuencia de las reacciones que invierten la fructosa en piruvato con la producción conocidamente en ATP . En los organismos aeróbicos la glicólisis sirve de preámbulo al ciclo del ácido cítrico y a la cadena de transporte electrónica , las cuales recolectan la mayor parte de la energía de la glucosa en condiciones aeróbicas , el piruvato entra a la mitocondria en donde es completamente oxidasa hasta CO2 y H2 O. Si el suministro es insuficiente como el músculo en contracción del piruvato se convierten en lactano. En algunos organismos anaeróbicos como las levaduras del piruvato se convierten en etanol : La formación del etanol y lactano a partir de glucosa son ejemplo de fermentación. 14 RUTA GENERAL DE LA GLICÓLISIS GLUCOSA ATP ADP GLUCOSA 6 FOSFATO ATP ADP FRUCTOSA 6 FOSFATO FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO ESCISIÓN GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO DIHIDROXICETONA FOSFATO GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO H2PO4 H2PO4 H2O 1, 3 BIFOSFOGLICERATO ADP H2O ATP 3 FOSFOGLICERATO 2 FOFOGLICERATO n H2O FOSFOENOL PIRUVATO ADP ATP PIRUVATO ACETALDEHÍDO ETANOL + H2O l 15 RUTA DE LA GLICÓLISIS CH2OPO-23 H CH2OH H H H H HEXOQUINASA + ATP OH H H OH OH OH H OH OH OH OH GLUCOSA FOSFATO GLUCOSA 6 La hexoquinasa entonces es una enzima que transfiere un grupo fosforilo desde el ATP a un grupo de azucares de 6 carbonos (hexosas) como la glucosa y la manosa. La hexoquinasa al igual que otras quinasas requieren para su actividad Mg u otro ion bivalente como el Mn el ion metálico bivalente forma un complejo con el ATP. La etapa siguiente de la glicólisis es la isomerización de la glucosa 6 fosfato a fructuosa 6 fosfato, como se ve en la siguiente reacción: H CH2OPO-23 H FOSFOGLUCOSA ISOMERASA H CH2OH OPO-23 + ATP H OH OH OH OH OH H GLUCOSA 6 FOSFATO OH OH H FRUCTUOSA 6 FOSFATO El siguiente paso es convertir la glucosa 6 fosfato a fructuosa 6 fosfato que lo hace la encima fosfato isomerasa es un rompimiento entre el enlace del carbono 1 y 2 haciendo así una isomerización que es como un recorrido de partículas. OPO-23 OPO-23 CH2OH CH2OPO-2 FOSFOFRUCTOQUINASA H OH OH OH + H ATP H FRUCTUOSA 6 FOSFATO H OH H OH OH H FRUCTUOSA 1, 6 DIFOSFATO + ADP + H 16 Lo que sucede en esta reacción es que la enzima fosfofructoquinasa hace que reaccione el ATP para que este sede un grupo fosfato a la posición 1 convirtiéndose el ATP en ADP pero también en esta reacción se va un H para que la transferencia del fosfato se ha exacta pasando de fructuosa 6 fosfato a fructuosa 1,6 difosfato. CH 2OPO3 H C=O ALDOLASA O H- C-H H H-C-OH C=O C=O H-C-OH H- C-OH CH2OPO3 CH2OPO3 H- C-OH CH2OPO3 FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO DIHIDROXIACETONA GLICERALDEIDO 3 FOSFATO La andolaza parte a la mitad a la fructuosa 1,6 difosfato formando 2 moléculas que son la dihidroxiacetona fosfato y el gliceraldehido 3 fosfato y también existe un reacomodo de moléculas o partículas. H H-C-OH TRIOFOSFATO H ISOMERAZA C C=O H -C-OH CH2OPO3 DIHIDROXIACETONA CH2OPO3 GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO En este caso la dihidroxiacetona fosfato se sede de la ruta y la tenemos que volver a reintegrar a la ruta convirtiéndola en gliceraldehido 3 fosfato con ayuda de la triofosfato baja 2 H a la posición 2 quitando la doble ligadura que existe en el O pero como en la posición uno quedan solamente 3 enlaces para que se estabilice se le agrega una doble ligadura ya que el carbono soporta 4 enlaces. H O 2 C H C NAD++PI + FOSFATO DESHIDROGENASA OPO-23 O C OH H C OH CH2OPO3 GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO CH2OPO3 1,3 DIFOSFATO 17 La isomerización de los azúcares fosforilados de 3 carbonos esta catalizada por la triofosfato isomerasa. Esta reacción es muy rápida y reversible. Así pues, se forma dos moléculas de gliceraldehido 3 fosfato a partir de una molécula de fructosa 1, 6 difosfato por la acción secuencial de la aldolasa y triofosfato isomerasa. La reacción inicial de esta secuencia es la conversión de gliceraldehido 3 fosfato. En 1,3 difosfato, reacción catalizada por el gliceraldehido 3 fosfato de deshidrogenasa. O= C OPO-23 O =C O FOSFOGLICERATO H C OH + ATP QUINASA H C CH2OPO3 CH2OPO3 1, 3 DIFOSFOGLICERATO 3 FOSFOGLICERATO 18 FORMACIÓN DEL PIRUVATO Y PRODUCCIÓN DE UN SEGUNDO ATP La posición del grupo fosforilo se desplaza en la conversión de 3 difosfoglicerato en 2 fosfoglicerato reacción canalizada por la fosfogliceromutasa. 2 H C O C OH FOSFOGLICERATO QUINASA C - O C - OPO-23 + ADP CH2OPO3 CH2OH 3 FOSFOGLICERATO 2 FOSFOGLICERATO O O H C PIRUVATO QUINASA H C C=O C-OPO3 H C H CH3 FOSFOENOL PIRUVICO PIRUVATO H O H C PIRUVATO CARBOXILASA C C=O C=O CH2 CH2 PIRUVATO ACETALDEHIDO H C ALCOHOL DESHIDROGENASA H H C OH C=O CH2 ACETALDEHIDO CH3 ETANOL +CO2 19 PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. La fermentación alcohólica no sólo la sufren los azúcares fermentables (glucosa y fructosa). La sacarosa o azúcar de caña se desdobla en glucosa y fructosa; por la acción de la enzima inversaza producida por las levaduras, además de los productos principales como alcohol y bióxido de carbono, se forma glicerina, ácido succínico, ácidos volátiles, butilenglicol , alcoholes superiores(esencia fusen), acetaldehído, ácido láctico y esteres. 1.- ALCOHOL (ETANOL). Es el producto más importante de la fermentación (etanol) espíritu de vino C2H5 (OH)3 cuya calidad (40-140g/l). Está sometido a grandes fluctuaciones según sea el contenido de azúcar del jugo de frutas. Es incoloro, muy fluido de agradable color que arde con llama azulada con formación de agua y del anhídrido carbónico a 20°C tiene un peso especifico del 0.7894, hierve a 78.37°C y se congela a –114°C. Se mezcla con el agua en todas las proporciones desprendiendo calor y provocando una disminución de volumen próximo al 4%. Cuando se encuentra sin diluir el alcohol tiene un penetrante olor a ardiente. 2.- GLICERINA Es un alcohol trivalente C3H5(OH)3 en estado puro tiene aspecto liquido espeso incoloro, de sabor dulce y no venenoso. Se mezcla con el agua y el alcohol en todas las proporciones, reduciendo considerablemente, el punto de congelación del agua. La glicerina pura tiene a 20°C un peso especifico de 1.2613, la glicerina se diluye en los productos de fermentación valiosos del vino, ya que este presta cuerpo y consistencia. 3.- ALCOHOLES SUPERIORES En 1910 fue emitido por f ehrlich que los alcoholes superiores, (alcohol propílico, isopropilico, amílico, isoamilico e isobutilico), se originan de los aminoácidos correspondientes (ácido amino butírico, valina leucina, isoleucina) mediante capacitación de agua y desprendiendo dióxido de carbono y amoniaco. Efectivamente en experiencias modelo puede comprobarse que agregando aminoácidos al medio que vaya a fermentar se estimula la formación de alcoholes superiores por levaduras. 20 Azúcar valina ácido pirúvico productos productor intermedio alcohol isobutilico intermedios cetoivaleriato productos intermedios leucina celoisacaprato productos intermedios alcohol isoamilico Esquema simplificado de la formación de los alcoholes superiores (isobutil e isoamilico) y de los aminoácidos valina y leucina por levaduras. Los alcoholes superiores solo se encuentran en el vino en escasa cantidad ( 0.1 a 0.3 g/l ). Ácido succínico ( COOH-CH2-CH2-COOH ) se origina también en la fermentación. Ya Pasteur había determinado en el vino una cantidad de 0.6 gr. de sete producto para cada 100gr de azúcar fermentado. El ácido succínico cristaliza en placas o columnas monoclínicas, se disuelve en agua y alcohol y tiene sabor limpiante ácido. La pequeña cantidad resulta de la fermentación (0.6 a 2 gr./l) compensa en parte la disminución de acidez que supone la merma de “Cartrato Potasio”. 4.- ÁCIDO ACÉTICO Lo explicaremos con más detalle en la siguiente unidad temática. 5.- SUSTANCIAS AROMÁTICAS El aroma de un vino obedece a varios cientos de componentes diferentes y está formado por sustancias de distintas clases (aldehídos, cetonas, alcoholes, esteres, ácido terpenos). Estas múltiples sustancias olorosas insípidas proporcionan en conjunto la intención total de dar un vino. En la constitución de los aromas y sabores peculiares de las uvas (bouquet) parece participar un número relativamente pequeño de compuestos el bouquet del vino depende fundamentalmente de números componentes generados en curso de la fermentación, conocidos con el nombre de “esencia de fusel”. Estos compuestos fundamentales del extracto de fusel no se originaron en la fermentación en cantidades constantes. Diversas cepas de levaduras forman distintas cantidades de estos compuestos. 21 Existen varios sabores: primarios, secundarios, tanto para olores como colores. Sabores secundarios: son la mezcla de los sabores primarios (1, 2 o más). Existen 4 sabores primarios: dulce, salado, agrio, amargo. Sabor dulce: Los compuestos que lo presentan son: los azúcares que son los carbohidratos: mono y disacárido. Los carbohidratos que son más complejos no presentan sabor (almidón, celulosa, hemicelulosa). Compuestos químicos que presentan sabor: GLICOLIS, GLICEROL, SORVITOL LIGERAMENTE DULCE (SABOR) CLOROFORMO NITRATO DE ETILO SABOR DULCE SABOR DULCE 6.- ANHÍDRIDO CARBÓNICO. Es el gas desprendido de la fermentación (gas carbónico ), es el bióxido de carbono (cco2) a partir del cual se forma el ácido carbónico. Este último no se presenta libre si no únicamente en sus sales (carbonatos ). El anhídrido carbónico es un gas inodoro e incoloro que es 1.52 más pesado que el aire y no hace combustión (no arde), el anhídrido carbónico no permite la respiración por lo que ejerce acción asfixiante, de un 3 a 4 % del CO2 en el aire y no hace combustión (no arde) . El anhídrido carbónico no permite la respiración por lo que ejerce acción asfixiante. El CO2 en el aire dificulta ya la respiración y desarrolla acción sofocante por liberarse el la fermentación de grandes cantidades de CO2 deben instalarse dispositivos de ventilación que aseguren su eliminación, de aquí que la entrada de las bodegas durante la etapa de fermentación suponga un evidente peligro de muerte . En los vinos para embotellar es muy conveniente que exista un cierto contenido de CO2 , el cual, hace al vino más espumoso. Clasificación de bebidas alcohólicas de acuerdo con el sustrato del que proceden. 22 SUSTRATO NO DESTILADAS DESTILADAS FORTIFICADAS Brandy, coñac, Vino, chapage, vinos Jere, oporto, vermut, Uva armañac, pisco y espumosos madeira y moscatel Groppa Sidra y sidra Manzana Calvados espumosa Pera Perry Cereza Kirsch Otros Vinos de frutas Cereales, cebada cerveza Whisky Burbon, whisky de Maíz Tesguino maíz, whisky de tennese Varios (incluyendo Vodka, ginebra y pan.) akvait Arroz Sake Sorgo Cerveza africana Cachazo, pinga, Caña, melazas o charanda Ron, jugos aguardiente. Agaves Pulque Tequila, Mezcal. Fue en la edad media cuando se descubrieron los principios físicos de la destilación, lo que permitió a los alquimistas la época de destilar por primera vez, es decir, llevar acabo una separación de los componentes volátiles (alcohólicos) y las no volátiles (stractiles del vino). El proceso de destilación del vino lo descubrió un sabio de Salerno (una de las más antiguas universidades del mundo occidental) llamado Magíster Salernos. En 1867 algunos escritores deducen que la destilación se usaba para la obtención de nuevos medicamentos. Siglos después de su descubrimiento el aguardiente constituía, aún en la mayoría de las culturas, un medicamento. En el año de 1530 la ciudad de Nüvemberg puso a punto los primeros carros destinados al transporte de los borrachos. En esta época apareció el término alcohol para denominar el espíritu que contenía el vino. Theophrastus, Bombastus Von Hohemhein paracel y médico, obtuvo el término de alcohol copiando del árabe en este idioma, la palabra alcohol “alko hul” designa algo esencialmente delicado y puro, “ la más útil de cada cosa “. El nuevo término acabó sustituyéndolo a todos los utilizados hasta entonces de origen latino como “ agua vitae” que quiere decir agua de vida o “ agua ordens “ por citar sólo algunos. Durante el siglo XVI el aguardiente pasó definitivamente de ser una medicina a convertirse en una bebida habitual. La producción de aguardiente constituye uno de los hallazgos que mayor trascendencia ha tenido comparación a la invención de la estructura, el dinero, la pólvora, la brújula, la imprenta, y ha dado lugar a medicinas y también a exquisitas bebidas bajo el seductor nombre de agua de vida. 23 UNIDAD 4.- FERMENTACIÓN ACÉTICA INTRODUCCIÓN.El vinagre es el producto de la fermentación del vino o de alcohol , debido a la reacción de Mycoderma aceti que oxida al etanol hasta ácido acético . El ácido acético es un ácido que se encuentra en el vinagre, y que es el principal responsable de su sabor y olor agrios. Su fórmula es CH3-COOH y, de acuerdo con la IUPAC se denomina sistemáticamente ácido etanoico. H O \ // H-C-C / \ H OH Es el segundo de los ácidos carboxílicos, después del ácido fórmico o metanoico, que sólo tiene un carbono, y antes del ácido propanoico, que ya tiene una cadena de tres carbonos. En estado puro el ácido acético es un líquido incoloro, de olor y de sabor penetrante a ácido, hierve a 118°C y posee una densidad de 1.0492 a 20 °C en la fermentación se origina en cantidades muy pequeñas a partir del acetaldehído. El punto de fusión es 16.6 °C y el punto de ebullición es 117.9 °C. En disolución acuosa, el ácido acético puede perder el protón del grupo carboxilo para dar su base conjugada, el acetato. Su pKa es de 4.8 a 25 ºC, lo cual significa, que al pH moderadamente ácido de 4.8, aproximadamente la mitad de sus moléculas se habrán desprendido del protón. Esto hace que sea un ácido débil y que, en concentraciones adecuadas, pueda formar disoluciones tampón con su base conjugada. HISTORIA.La historia del vinagre está íntimamente ligada a la historia del vino, como su mismo nombre demuestra. El nombre castellano del vinagre proviene del latín “vinum acre” o vino agrio y así ocurre en la mayoría de lenguas, con la excepción del italiano, que toma el nombre de su principal componente, el ácido acético, y lo llaman “ACETO”. No obstante el vinagre ese regalo que Dios nos dio, se puede obtener de muchas otras frutas, plantas y cereales. Las primeras noticias, sobre un tipo de vinagre, que se obtenía de la palma, provienen de Oriente y son del año 5.000 antes de Cristo (El salvador del mundo). Autores griegos y romanos nos hablan también del vinagre, en este caso procedente del vino, que no sólo utilizaban como condimento, sino como conservante de alimentos, muchas veces mezclado con sal y miel. 24 Al principio el vinagre se consideraba como una alteración natural del vino. Hasta el siglo VIII no se conoció la purificación del vinagre por destilación que fue dada a conocer por Geber en, lo que se puede llamar, el primer tratado sobre la elaboración del vinagre. El vinagre se preparaba de una manera casera, permitiendo que el vino u otros líquidos alcohólicos sufrieran, el contacto con el aire, una oxidación. Después se descubrió que en este proceso intervenían unas bacterias, denominadas acéticas, que eran las generadoras del proceso. Hasta la Edad Media no aparecieron los primeros artesanos elaboradores de vinagre. En Francia, durante el reinado de Carlos VI, se agruparon convirtiéndose en cofradía. Tenían unas severísimas normas para entrar en la orden y participar en los secretos de la elaboración del vinagre. Según ellos “Era más difícil hacer un discreto vinagre que un buen vino”. Aunque, en realidad, sus fórmulas secretas consistían en la utilización de algunas sustancias de fuerte sabor, como la pimienta o el jengibre, que daban al vinagre el sabor característico. Como en tantas otras cosas fue necesario el grito de libertad de la Revolución Francesa para que sé dejara libre la elaboración de vinagre en Francia. Si se ha hecho referencia a Francia es porque en este país es donde se inició la producción industrial del vinagre con el método Orleans. Se utilizaban, barriles en serie de 200 a 400 litros de cabida y, partiendo de una cantidad de vinagre al que se le añadía vino, por medio de una adecuada ventilación y unas condiciones idóneas de temperatura, este vino se trasformaba en vinagre. Y fue también en Francia, en el siglo XVIII, cuando Lavoisier empezó a dar una explicación científica al proceso de elaboración del vinagre. Su teoría consistía en decir que el espíritu del vino producía el vinagre al fijar el oxígeno del aire. Y lo que antes era un hecho que se producía sin saber bien sus causas, se convirtió en algo explicable al conocerse los agentes de la fermentación acética. Fue Pasteur el que explicó con más detalle y exactitud el proceso, consistente en la fermentación que una bacteria, el “Mycoderma aceti”, realiza en el alcohol vínico para obtener el ácido acético. Pero, si para Pasteur la formación del vinagre se debía considerar como un proceso fisiológico, ya que es una fermentación, para Liebig la transformación del alcohol etílico en vinagre por acción de las bacterias, no es otra cosa que un proceso de oxidación. En medio de este proceso de teorías el vinagre se seguía produciendo. Todos los países utilizaban las materias primas que tenían más a mano y elaboraban diferentes tipos de vinagre. Si en la cuenca mediterránea la base del vinagre era el vino, en Inglaterra del norte, donde la cerveza era la bebida nacional, predominaba el vinagre de malta y en el sur de Inglaterra, donde se cultivaban las manzanas, el vinagre era de sidra. En cada región, de acuerdo con su clima y los cultivos propios, se encontró una materia prima para producir vinagre. 25 MICROORGANISMOS PARTICIPANTES. La especie de bacteria empleada es importante, cuanto más activa sea, más rápida y completa será la fermentación. Se sabe que los vinos utilizados para la obtención de vinagre no deben tener más de un 20% de agua y el alcohol en una concentración comprendida entre el 5 - 11% del volumen en ningún caso por encima del 15%. De no ser así, las bacterias acéticas mermarían su actividad prolongando el tiempo de fermentación. Clasificación de las cepas: Las bacterias acéticas, para cumplir su cometido necesitan, además, cantidades constantes de oxígeno y estar protegidas de la luz ultravioleta. Ésta, al tener acción germicida, puede destruir la célula o retardar su desarrollo. La temperatura ideal del proceso de fermentación acética está entre los 28 y los 30 ºC. A mayor temperatura la enzima alcoholdeshidrogenasa se destruye. Existen dos tipos de bacterias generadoras de ácido acético: El género “Gluconobacter” y el género “Acetobacter”. El genero “Gluconobacter” oxida los azúcares o alcoholes hasta cetonas y ácidos, pero no pueden continuar degradándolo hasta CO2 y H2O se trata de bacterias denominadas: sub – oxidantes. Se diferencia de acetobacter con sus flagelos situados exclusivamente en posición aplical ( polares ) y por su capacidad para seguir degradando al ácido acético y láctico, oxidan al etanol hasta ácido acético con una rapidez alta. El genero “Acetobacter” representantes del otro grupo por lo contrario pueden seguir degradando las cetonas y los ácidos hasta bióxido de carbono y agua y se les conoce como bacterias: superoxidantes. Dentro del genero Acetobacter encontramos a los súper oxidantes que se diferencias de tres especies con distintas subespecies. La especie más importante desde el punto de vista industrial es acetobacter aceti a ella pertenece como cepas de cultivo las de: ssp. Orlaense y ssp. Xylinum. Ssp. Orlaense. Son las bacterias del vinagre del vino y de la acidificación rápida que tiene las tasas máximas de conversión de etanol a ácido acético. Es la más eficaz porque produce un ácido muy concentrado. Ssp. Xylinum Se encuentra en las heces del vinagre (vinagre madre) conformando una capa sólida correosa en los depósitos del vinagre tiene una eficacia limitada y resulta indeseable porque forma colores y olores desagradables. Las otras dos especies Acetobacter Pasterianus y Peroxidans, no tienen elaboración de vinagre. La primera pertenece también a las bacterias perjudiciales vinagre de cerveza y forma sustancia musilaginosas durante la obtención del mosto. “Mycoderma aceti” La bacteria llamada “Mycoderma aceti” realiza la fermentación acética del alcohol, que contiene el vino, para transformarlo en ácido acético. Por esta razón, para la producción de un buen vinagre se debe tratar con sumo cuidado esta bacteria. Además la bacteria requiere unas condiciones especiales de trabajo. Su temperatura ideal para el 26 trabajo es de 25% a 30%, un exceso de temperatura causaría su muerte y con una temperatura muy baja su ritmo de trabajo es muy lento, se retarda el proceso y por lo tanto se incrementan los costos. Para su existencia y para su trabajo de oxidación necesita también abundancia de oxígeno por lo que durante el proceso se deberá mantener una buena oxigenación del vino. MATERIAS PRIMAS. En la elaboración de vinagre es importantísima la selección de la materia prima. Cuando el vino es de mejor calidad, mejor será el vinagre. La composición del vino debe ser la adecuada para ser transformado en un excelente vinagre. El Control de laboratorio en esta primera fase es indispensable. Con el fin de que el vino que se va a utilizar esté totalmente limpio, por medio del centrifugado, se procede a su limpieza y se almacena en grandes depósitos, de donde se alimentaran los generadores del vinagre, su grado alcohólico debe ser como mínimo de 11º y no debe tener ningún tipo de sabor y olor extraño. La materia prima para obtener vinagre es el alcohol etílico, que sufre un proceso aeróbico denominado “Oxidación”, debido a la presencia de bacterias del tipo Acetobacter. Se trata de un género microbiano caracterizado por tener células de formas elipsoidal y esférica, sueltas o unidas en cadenas, por lo general inmóviles, aunque algunas son móviles por ayuda de flagelos. Según su función pueden clasificarse en dos grupos: los que oxidan el ácido acético y lo transforman en dióxido de carbono y agua y los que carecen de esta propiedad. Teniendo en cuenta la materia prima de la cual ha sido fabricado, los vinagres se pueden clasificar en: 1. Vinagres de jugo de fruta manzana, uva, pera, bayas, etc. Un ejemplo es el vinagre de vino o de uva, se obtiene exclusivamente por fermentación de la uva y del vino. Es el tipo de vinagre más usado en la gastronomía de distintos países de Europa, en particular en Francia e Italia. Según el vino que se utilice se obtienen vinagres distintos a los que se les da diferentes aplicaciones; el vinagre de vino tinto realza el sabor de las carnes rojas; el de vino blanco resulta ideal para elaborar ciertas salsas (mayonesa, holandesa). El vinagre de cerezas en España, balsámico en Italia, vino tinto en Francia, etc. Muy apreciado por su ligero sabor acaramelado es el vinagre de Jerez, y el vinagre de vino Rioja, que se caracteriza por su tono teja brillante y un sabor muy definido. Excelente para el paladar es el vinagre balsámico de Módena, un vinagre de origen italiano de consistencia espesa y un bouquet muy apreciado. Se elabora con mosto fresco de uva que se hierve para concentrar el contenido de azúcar y el sabor y se deja envejecer de 6 a 12 años. Otro ejemplo es el vinagre de manzana o de sidra es muy consumido por su suave y delicado sabor. Se puede elaborar a partir de la pulpa de manzana o su zumo, cuyo azúcar se convierte primero en alcohol y posteriormente en ácido acético, o a partir de la sidra o mosto de manzana fermentado. A las ensaladas les proporciona un toque a manzana y combina muy bien con pescados, carnes blancas y salsas suaves. 27 2. Vinagres fabricados por hortalizas y amilasas, como son los vinagres de papatas, cuyo almidón debe ser previamente hidrolizado a azucares. Como ejemplo esta el vinagre de arroz es típico de países asiáticos como China o Japón donde se incluye en la mayoría de platos populares de la gastronomía propia de estos países. Se trata de un vinagre con sabor suave y algo dulce y con un color que oscila entre el blanco, dorado pálido o rojizo, según se elabore solo con arroz o se combine con otros cereales como el trigo, el sorgo o el mijo. 3. Vinagres fabricados por cereales malteados, Vinagre de cebada, vinagre de centeno, vinagre de trigo y vinagre de maíz. El vinagre blanco destilado es el más usado en el hogar. Este vinagre, de un tono casi transparente, se destila antes de que todo el alcohol se haya convertido en ácido acético. Este proceso aumenta mucho el contenido en ácido acético, y a esto se debe el sabor fuerte y pronunciado de estos vinagres. Se elaboran generalmente a partir de la caña de azúcar, el maíz o la melaza, y son los más empleados en la elaboración de encurtidos, salsas envasadas, etc. 4. Vinagres fabricados por productos azucarados. 5. Vinagres que se fabrican con espíritu de vino a alcohol, como el que se fabrica con el líquido que queda después de preparar las levaduras de cerveza. Como el que se fabrica con el alcohol desnaturalizado o diluido. 6. Sabores y aromas.- Cualquier vinagre se puede aromatizar o condimentar con hierbas aromáticas (romero, tomillo, estragón, albahaca...), especias (ajo, pimienta, chiles...), frutas (frambuesa, manzana, plátano, naranja, piña, zarzamoras, limón...) u otros condimentos como azúcar o miel. El resultado es un vinagre aromatizado que dan un toque especial a los alimentos o a los platos a los que se añade. 7. Color.- El vinagre se encuentra con una gran variedad de tonos de colores, desde un casi transparente vinagre blanco destilado a las diferentes tonalidades de rojo de los vinagres de vino, amarillentos de los vinagres de sidra y color chocolate de los vinagres de malta. El color del vinagre se deriva básicamente de los ingredientes usados para su elaboración. Es también de esperar que el color varíe entre los mismos tipos de vinagre, por ejemplo cambios naturales en la coloración de las manzanas varían de cosecha en cosecha, y los tipos de manzanas utilizados. Aunque también se puede utilizar color caramelo para darle un tono café al vinagre. PROCESO FERMENTATIVO. La fabricación de vinagre a partir de materias primas que contienen azúcar comprenden dos pasos: 1. La fermentación de azúcar a alcohol etílico. 28 2. La oxidación del alcohol a ácido acético. El primer paso es un proceso anaerobio llevado acabo por levaduras saccharomyce cereviseae var. Ellipsodeus. El segundo paso es la oxidación del alcohol a ácido acético, es una reacción aerobia llevado acabo por bacterias acéticas como son los del grupo acetobacter. La enzima catalizadora (alcoholdeshidrogenasa) que posee Acetobacter es la encargada de producir la oxidación del alcohol por retirada del hidrógeno. Condiciones del proceso fermentativo. No obstante, no solamente la presencia de Acetobacter hace posible la producción de vinagre ya que existen múltiples factores que intervienen en la fermentación acética como son la especie empleada y la pureza de la cepa, la concentración acuosa y alcohólica del vino utilizado, la luz, el oxigeno, el agua, el pH, las sales nutritivas y la temperatura. Si se cumplen todas estas condiciones, las fermentaciones se desarrollarán de manera perfecta. Las acetobacterias catalizan la oxidación de alcohol en ácido acético según la siguiente fórmula: C2H5OH + O2 ==> CH3COOH + H2O Siguiendo un proceso que se repite continuamente. En el ramo industrial se fabrica el ácido mediante oxidación de líquidos alcohólicos diluidos por bacteria acéticas. También se efectúa mediante la siguiente reacción: 2CH3 –CHO + H2O ----------------------- C2H5 OH ACETALDEHIDO AGUA ETANOL + CH3 –C00H AC. ACETICO En general el proceso de fermentación acética sigue la ruta de la glicólisis, la cual se explica con más detalle en la unidad denominada “Fermentación alcohólica”. IMPORTANCIA INDUSTRIAL DEL ÁCIDO ACÉTICO. El vinagre puede ser usado en muchas formas. Existen mas de 300 aplicaciones de cómo usarlo. A veces se piensa que sólo es utilizado en la cocina como acompañante de las ensaladas mezclándolo con aceite y/o pimienta y sal. Sin embargo, el vinagre tiene usos que van desde ser un ingrediente versátil de sus comidas como resaltador del sabor o condimento, un ablandador de las carnes, un preservante natural de alimentos, un agente medicinal y un elemento de gran utilidad en la limpieza del hogar y los equipos utilizados en la industria de alimentos. En fin, el vinagre se utiliza en cualquier medio 29 donde se requiera de un acidulante natural. Algunas aplicaciones se muestran a continuación: Acidulante.- Al igual que los cítricos, el vinagre es un excelente ingrediente para marinar ya que es un ablandador natural porque desdobla las fibras y proteínas de las carnes. Por ejemplo, es ampliamente utilizado para ablandar el bistec de cinta (Flank Steak). Solo una nota de precaución, debido a que el vinagre puede por si solo cocinar la carne se recomienda mezclarlo con aceite vegetal o de oliva cuando se use para marinar. Resaltador del sabor.- Puede agregarse a la salsa que vaya a utilizar para cocinar. Cuando se cocina su plato, el agua se evapora dejando el exquisito aroma y sabor del vinagre. En el caso de los mariscos, es mejor agregar el toque de vinagre luego de cocinados para mejorar así el sabor de los mismos. Conservador natural.- La mayonesa, salsa picante, mostaza, el ketchup, salsa de tomate y los encurtidos son preservados con vinagre. El vinagre es ampliamente utilizado en la industria alimenticia por tener la propiedad de reducir el pH de los alimentos para evitar el crecimiento de bacterias. Su sabor también ayuda a mejorar el de los alimentos que se preservan. Evita el crecimiento de hongos, desinfecta los equipos que se utilizan para procesar alimentos y neutraliza los malos olores característicos de ciertos alimentos. Higiene personal.- En los Estados Unidos un gran porcentaje de la producción de vinagre destilado es utilizado por la industria farmacéutica para la elaboración de duchas femeninas. Limpieza de materiales.- La industria química lo usa por ejemplo como ingrediente para elaborar limpiadores líquidos de vidrio. 30 UNIDAD 5.- VINIFICACIÓN CARACTERÍSTICAS GENERALES, ETAPAS Y REACCIONES QUÍMICAS DEL PROCESO DE VINIFICACIÓN. INTRODUCCIÓN. El vino es una bebida que se obtiene mediante fermentación alcohólica del sumo de la uva fresca. Los <vinos> preparados a partir de otros frutos , como manzanas y grosellas, no deben llamarse solamente vinos, sino que debe aludirse a los productos vegetales de que proceden. El vino debe prepararse a partir de uva fresca. Resulta esencial que el vino se obtenga mediante fermentación y que contenga alcohol. Una actividad que ha estado ligada a la mayoría de las culturas durante miles de años ha sido la producción de bebidas alcohólicas. Evidencias arqueológicas que demuestran que desde hace mas de 7000 años de antigüedad los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de diversos sustratos en forma empírica. Quizá las primeras bebidas se hicieron con base a sustratos azucarados como jugos de fruta, ya que éstos sólo requieren ponerse en contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta. Fue hasta el siglo XV cuando empezó a popularizarse el arte de la destilación y de esta forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohólico. Debido a la gran importancia de estos productos la investigación científica y tecnológica generan industrias, las cuales son de mayor importancia económica en el mundo. HISTORIA. En todas las etapas marcadas en la historia y aún antes de la prehistoria el vino a acompañado al hombre. Se extendió por los imperios y su elaboración cuidadosa cayo en el olvido durante unos siglos. El vino cruzo el océano hasta América buscando otras tierras. El vino y el hombre son compañeros de más de 4000 años de antigüedad. En este tiempo esta bebida de los dioses a estado presente en mitos y ritos, en leyendas y en el arte, como parte de la cultura de los pueblos. La producción de bebidas alcohólicas ha sido una actividad ligada a la mayoría de las culturas durante milenios. Existen evidencias arqueológicas de más de 7000 años de antigüedad. Se dice que los egipcios descubrieron las bebidas alcohólicas fermentadas en forma accidental ya que un rey egipcio mandaba a sus sirvientes a recolectar uvas y ellos depositaban el apreciado fruto en recipientes de cerámica. Las mozas daban al rey en la boca este apreciado fruto y nos relata la historia que uno de los recipientes de cerámica en donde se encontraban las uvas (almacenadas durante un largo tiempo) desprendían un olor extraño y que además se observaba dentro del recipiente un líquido azulado. Al darse cuenta sobre esto el rey, prohibió que el recipiente fuera tocado y que no se consumieran esas uvas, ya que el decía que se trataba de un “veneno”. 31 En una ocasión, una de sus mozas que se encontraba más tiempo al lado del rey fue desplazada por otra de sus mozas mas joven y bella. La moza al darse cuenta del desplazamiento que la nueva y bella joven había logrado, toma la decisión de quitarse la vida bebiendo de dicho veneno. Todos se quedaron sorprendidos esperando la muerte de esta mujer decepcionada, pero grande fue la sorpresa al ver que ella no agonizaba y lo único que observaron en ella fue una inmensa alegría y una actitud fuera de control. A partir de ese momento todos los que conformaban el reino de Egipto, probaron de esa misteriosa sustancia y descubrieron las grandes virtudes que esta poseía. En forma empírica los humanos aprendimos a encauzar las fermentaciones alcohólicas de diversos sustratos. (García Gariba y Col. Biotecnología Alimentaria, 1993). Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados como los jugos de frutas, ya que éstos sólamente requieren poner en contacto al jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta (Wacher y Col., 1990). Las bebidas alcohólicas son compañeras constantes del hombre en su historia, pero bien es cierto que su exceso es capaz de reducir nuestras sensibilidades, también es verdad que tienen la virtud de animar el espíritu y de establecer atmósferas propicias para la convivencia y la conversación, esto cuando se consume en la justa medida y con la prudencia que caracteriza a quienes saben disfrutar de las cosas buenas de la vida. CARACTERÍSTICAS GENERALES. Las uvas que se utilizan para fabricar vinos son de origen Europeo debido a que contiene eninas. Las eninas son compuestos químicos colorantes que se encuentran en la mayoría de las uvas, por lo tanto juega un papel primordial el la coloración del vino. ( las semillas le dan la coloración al vino). Un ejemplo del porque no todas las uvas, del mundo se pueden utilizar para hacer vinos son las que proceden de Chile. Las uvas de Chile no tienen la misma composición química que las Europeas, debido a que estas uvas contienen enidinas en lugar de eninas. Las enidinas es un compuesto químico que transfiere un sabor amargo, esto se debe a los factores ambientales como son: el clima, la temperatura, composición del suelo, la presión atmosférica y la altitud. Del tipo de uva recibe el título el vino, por ejemplo: TÍTULO Gabinete Cosecha tardía Cosecha selecta Cosecha especial Uvas pasas Vino Helado TIPO DE UVA Uvas maduras. Uva recolectada tardíamente y en estado de completa madurez. Sólo se utilizan uvas completamente maduras eliminando grados enfermos e inmaduros. Empleo únicamente de granos sobre maduros o con putridez Generosa. Sólo se utilizan granos arrugados con putridez generosa o bien granos sobre maduros y también arrugados. Las uvas deben estar congeladas en el momento de la vendimia y por lo general se efectúa una prendimia y una vendimia tardía. 32 Dependiendo de la zona vitivinícola que nos encontremos, es lo que determina el tipo de vino que se pretende elaborar e irá condicionado por una serie de factores sociales que predisponen los gustos del consumidor, por lo que demanda el mercado diferentes formas de presentar el producto para poder llegar a más público de edades distintas y gustos variados. Los tipos de vinos son extremadamente amplios. Pueden ser: o o o o o -Aromáticos o de aroma discreto. -Secos, semisecos, dulces o licorosos. -Tranquilos o espumosos. -Frescos y afrutado. -Rancios y maderizados. Existen una serie de características que determinan el tipo de vino del que se trata. Veamos: o o o -Envejecidos en madera o conservados jóvenes en envases herméticos. -Según las uvas: si están poco maduras, muy maduras o sobre maduras. -Según su estado sanitario y nivel de podredumbre. En la actualidad conocemos la incidencia que sobre los compuestos volátiles de un vino tienen los tratamientos que se realizan sobre la uva y el mosto. Dicho tratamiento no sólo condiciona el resultado aromático final del vino elaborado sino que además, repercuten en el desarrollo de la fermentación y en las posibles desviaciones o ralentizaciones de la misma. LEVADURAS UTILIZADAS.Otro factor importante son las levaduras, de composición muy sencilla, son células redondas ovaladas y elípticas envueltas en una membrana muy fina elástica cuyo diámetro es de 0.014 mm. El interior de dicha célula es incolora y a veces presenta un aspecto granular, el protoplasma se encuentra situado junto a la pared celular y en su interior aparece una o varías vacuolas que contienen el jugo celular. Esta demostrado que las distintas levaduras difieren entre sí y que no todas las especies de levaduras producen el mismo tipo de fermentación, presentando cada una de ellas características propias, las levaduras más importantes para la fabricación de vino son las comprendidas dentro del género saccharomyce y dentro de éstas encontraremos a la Saccharomyce cereviseae var. Ellipsodeus. Por otra parte la fermentación producida por levadura de uva origina valiosas sustancias aromáticas que son las responsables del bouquet. Las levaduras auténticas se encuentran en cualquier lugar de la naturaleza y abundan en las regiones vitícolas. Persisten en formas de esporas en las capas superiores de la tierra de los viñeros hasta que la lluvia y el viento y los insectos las transportan a fines de verano y en otoño y después de ahí al mosto. Las uvas que aún antes de haber madurado por completo han sido picadas y estropeados por avispas y pájaros, constituyen auténticas incubadoras de gérmenes 33 fermentativos. Muchas de estas células de levadura crecen a través de la tierra y forman ahí nuevas esporas que persistirán a lo largo del invierno. La formación de alcohol y el desplazamiento de aire por medio del bióxido de carbono que se está formando impide el desarrollo de los hongos formadores de micelios, las levaduras superficiales y a la mayoría de las bacterias, triunfando así las levaduras auténticas. Las levaduras auténticas se producen por gemación, en condiciones favorables formándose a un lado de las células de las levaduras, uno o varios brotes que al cabo de pocas horas alcanzan la dimensión de la célula madre y se desprenden de ellas. Existen diversos tipos de microorganismos de interés industrial, que varía de acuerdo al tipo de fermentación que se quiera realizar, como son los siguientes: Tipo de fermentación. Fermentación acética Fermentación alcohólica Fermentación butílica Fermentación cítrica Fermentación láctica Microorganismos que intervienen Acetobacterias Saccharomyce cerevisae Clostridium s.p.p. Aspergillus s.p.p Lactobacillus s.p.p. PIE DE CUBA. El proceso de vinificación consiste desde la recolección de las uvas conocidos como vendimia hasta el producto terminado (vino). La vendimia se conoce como la recolección de las uvas. La vinificación es la serie de operaciones físicas enzimáticas que transforman el jugo de las frutas en vino. La vinificación comienza con la trituración del vino (hollaje) y continua con el despalillado (eliminación de escobajo). A continuación se describen la etapas generales. La Vendimia.- El período de recolección se prolonga, en el Penedés, de agosto a octubre, según la época de madurez de las distintas variedades que se cosechan. La vendimiadora mecánica se utiliza hoy en algunos viñedos para acelerar las labores de recolección y transportar las uvas al lagar en el momento óptimo de madurez. Las vendimias se acarrean en tolvas o en pequeñas cajas, evitando siempre la oxidación de los mostos. Estrujado, escurrido y prensado.- Cuando las vendimias llegan a la bodega se procede al estrujado de la uva, liberando así el primer mosto. El escurrido puede realizarse de dos formas: 1.- Estática: deslizando el mosto, por gravedad, entre los partes sólidas (hollejos, pepitas, escobajos) de la vendimia. 2.- Dinámica: haciendo circular toda la masa de vendimia por un tornillo sin fin que extrae el mosto. La utilización de modernas prensas horizontales -movidas incluso por leve presión neumática e hidroneumática- permiten exprimir delicadamente los mostos. 34 Clarificado.- Los mostos turbios deben ser clarificados para obtener vinos limpios y de la máxima finura aromática. Las burbas o impurezas se eliminan por decantación, dejando reposar los mostos en los depósitos. Pero las técnicas más perfectas y modernas permiten la utilización de filtros y máquinas centrifugadoras que eliminan los sólidos por medios estrictamente físicos y naturales, sin utilizar ningún aditivo. La fermentación de los Vinos Blancos.- Las levaduras depositadas en la piel de la uva provocarán la fermentación alcohólica, o sea, la transformación del azúcar en alcohol y anhídrido carbónico. Las levaduras seleccionadas pueden garantizar el desarrollo más natural y completo de este proceso. La fermentación aromática de los delicados mostos se realiza, generalmente, en depósitos, eliminando así las lías sedimentadas en el proceso anterior. La fermentación y maceración de los Vinos Rosados.- Las vendimias tintas deben ser despalilladas y estrujadas para que los hollejos puedan macerarse en los mostos, extrayendo así el color y los aromas. Los vinos rosados permanecen sólo unas horas en contacto con sus hollejos, hasta que se ha extraído la coloración deseada, luego, prosiguen su fermentación en los depósitos de acero inoxidable sometidos a estricto control de temperatura. La fermentación y maceración de los Vinos Tintos.- Las vendimias tintas, despalilladas y estrujadas, fermentan en los depósitos de acero inoxidable, a temperatura controlada. La perfecta maceración de los hollejos en el mosto permite la extracción del color y de los aromas. Al terminar la fermentación alcohólica y la maceración, los tintos se someten a la fermentación maloláctica que afina el paladar de los vinos mediante la transformación del duro ácido málico en suave ácido láctico. El vino de prensa se obtiene mediante el prensado de los hollejos y se añade luego al "assemblage", en mayor o menor proporción, según las características de la cosecha. Se utilizan hoy delicadísimas técnicas para elaborar vinos tintos más finos y genuinos: maceraciones carbónicas, utilización de depósitos autovaciantes, vinificación de cada variedad por separado. Crianza de los Vinos.- La mayor parte de los vinos blancos son vinos jóvenes, embotellados en pleno esplendor frutal. Todos ellos exhiben en su etiqueta o en su collarín la añada. Se elaboran también algunos excelentes blancos de crianza, añejados en barrica de roble aromático y nuevo. Algunos tintos jóvenes y frutales reciben una ligera crianza en roble nuevo que no se prolonga más del tiempo justo para redondear sus taninos y ceñir su cuerpo, sin castigar su expresión varietal. 35 Los tintos añejos tradicionales y las nobles reservas permanecen un mínimo de 15 meses en barrica de roble y botella. Pero el carácter distintivo de la moderna enología del Penedés estriba, precisamente, en la flexibilidad y veracidad de las normas. Teniendo como único objetivo la garantía de calidad, muchos tintos del Penedés no se limitan hoy a pregonar los records de su permanencia en madera; sino que declaran sus credenciales fiables de crianza, beneficiándose del aporte aromático del roble nuevo y de las maderas más selectas (Limousin, Ailier, Trongais, etc.); y prolongando luego su maduración en barrica de roble de 3° o 4º año y en botella. PROCESO DE INDUSTRIALIZACIÓN. En la elaboración de vinos intervienen numerosas variables, no sólo en lo que se refiere a la variedad, siendo muy importante realizar las técnicas adecuadas para la obtención de un buen cultivo, sino también el estado sanitario de la uva. Por eso, es conveniente realizar una serie de pasos que les avanzamos a continuación y que trataremos a lo largo de esta unidad. 1. -Control de la Maduración. 2. -Transporte de la vendimia. 3. -Recepción en bodega y toma de muestras. 4. -Extracción del Mosto. 5. -Maceraciones prefermentativas. 6. -Corrección del Mosto. 7. -Separación de Fangos. 8. -Comportamiento Fermentativo. 9. -Fermentación en Barrica. 10. -Acabado de la fermentación Alcohólica . 1.- Control de la maduración.- Se realiza un control de maduración en viña para conocer el momento óptimo de maduración fénolica en la uva. Los análisis de grado Brix que determinan el azúcar contenido en la uva ,(la concentración de los azúcares superiores a 200mg/l pueden originar problemas para desdoblar los últimos gramos de azúcar con el riesgo que repercute en la fermentación), y los análisis de taninosantocianos, que determinan el equilibrio y estabilidad posterior de los vinos, y cuando estos parámetros son los adecuados para la recolección. También se examina la evolución del pH y la acidez total. Los parámetros óptimos son muy difíciles de conseguir al mismo tiempo, pero haciendo un seguimiento exhaustivo podremos determinar con gran exactitud el momento adecuado de recolección en nuestro viñedo. Sirve de gran ayuda el control de la materia nitrogenada. En un inicio de fermentación alcohólica para la formación de las estructuras celulares las levaduras, que son las responsables de la transformación del azúcar contenido en el mosto, el alcohol, necesitamos al menos de 180 mg/l de nitrógeno fácilmente asimilable,(sales amoniacales y aminoácidos, fundamentalmente la arginina). La falta de dichos nutrientes puede originar ralentizaciones e incluso paradas en la fermentación. Es recomendable, en estos casos, el uso de activadores amoniacales justo al inicio de la fermentación. 36 2. - Transporte de la vendimia.-Para potenciar la calidad de los vinos, el procesado de la vendimia debe realizarse lo más rápido posible, llegando los racimos casi intactos para evitar maceraciones incontroladas e inicios de fermentaciones. Lo ideal son cajas de 20 Kgs. Si el transporte se realiza en remolque, se recomienda no llenarlos demasiado para que el peso de las uvas no sea capaz de aplastar las que se encuentran debajo. En la actualidad, domina un concepto ya implantado en todas las bodegas; se prefiere tratar los mostos para no tener que tratar los vinos. Cada vez se van acondicionando las bodegas para la recepción de la uva en un proceso rápido y aplicando la tecnología adecuada a las necesidades de la uva en ese año, como por ejemplo, el enfriar las uvas. Sin embargo, la técnica más adecuada es escoger el momento del día o de la noche en que la temperatura es más baja, sobre todo, en la vendimia mecánica. Si no es posible se puede recurrir a sistemas como gas inerte o productos estabilizantes con el fin de que la uva llegue sin contaminación microbiana a la bodega para su posterior inicio de fermentación en los depósitos. 3.- Recepción en bodega y toma de muestras.- Al llegar a la bodega se extraerá una muestra representativa del conjunto de cajas o del remolque para cada entrada de uvas. El enólogo o técnico responsable será quien determine, después de analizar la uva, al depósito que va a ir destinado para su fermentación, ya que puede desviar dependiendo del estado sanitario de la uva u otros criterios a distintos depósitos de fermentación. 4. La extracción del mosto.- El sistema ideal de obtención del mosto sería someter a la uva a presiones moderadas y pequeñas durante tiempos determinados y en función de los rendimientos de la uva en ese año. Además, con el menor roce posible entre las partes sólidas del racimo (hollejos, orujos, raspón,) con las superficies de presión. Para obtener el mosto se ha de trabajar en un equilibrio que nos permita conseguir los aromas agradables, sin extraer los herbáceos (hexanol y aldehídos C6). Es decir, disponer de sistemas que favorezcan únicamente los intercambios positivos entre zumo y partes sólidas. La mejor obtención del mosto se consigue combinando la rotura mecánica de la pared celular con la degradación enzimática. Para respetar la calidad de la primera fracción del "mosto flor" se han de vinificar por separado, ya que los mostos obtenidos de las últimas fracciones del prensado originarán vinos más bastos, con más polifenoles, mayores notas herbáceas, así como un contenido más bajo de acidez total. Esta vinificación se hará por salificación parcial del tartárico con el potasio del escobajo y un aumento en coloides (polisacáridos y proteínas). El sistema mecánico para obtener el mosto flor se consigue a través de una estrujadora de rodillos de caucho o de prensas neumáticas de membranas. Estas últimas consiguen mejores resultados en la calidad del mosto. 37 5. Esquema del sistema de obtención del mosto .- Veamos los pasos a seguir para la obtención del mosto. A) Tolva de recepción: las hay en acero inoxidable, asimétricas, con diámetro y paso de sinfín grande o con motovariador de velocidad. Es aconsejable poca longitud del sinfín ya que a menor vueltas y longitud, menor rozamiento y por tanto mayor calidad. B) Despalilladoras Horizontales: las hay en acero inoxidable con rotación del tambor y eje en sentido contrario. Éstos con el menor número de aristas posible (superficie redonda). Preparadas con motovariador de velocidad, con el fin de poder regular el menor número de vueltas, en el cual el raspón sale limpio, lo que lleva consigo una menor lesión al raspón, hollejos, etc. Tienen que estar preparadas para despalillar en el porcentaje deseado. C) Estrujado: el estrujado tiene como fin romper los hollejos y desprender la pulpa. El estrujado debe ser el suficiente como para facilitar la separación del zumo, pero no debe ser violento con el fin de no desgarrar y dilacerar las partes sólidas. Las estrujadoras de rodillos de caucho son las más recomendadas. La ventaja del no estrujado es la de producir un mosto que contiene pocos fangos ya que elimina toda trituración de la vendimia y es menos sensible a la oxidación porque es menos rico en polifenoloxidasas. Esta ventaja sólo se manifiesta cuando el prensado se hace correctamente, es decir, lentamente y con presión progresiva. D) Bomba de vendimia: se recomiendan dos tipos de bombas por el comportamiento respecto al buen trato que dan a la pasta y son: -Peristáticas: tienen bastante capacidad (dan altura o presión); la pasta no tiene ningún rozamiento. Sin embargo, su mantenimiento es muy costoso. -De leva excéntrica: menor altura manométrica, rozamiento tangencial, no eleva líquidos, pero necesita poco mantenimiento y tiene un menor precio. E) Escurridores o Patines: su misión es separar el zumo liberado por el estrujado e interviene inmediatamente después de esta operación. Se distinguen dos escurridos: -Estático: se efectúa por simple reposo de la vendimia estrujada. -Mecánico: es el más rápido. Cuando se trabaja con grandes volúmenes de vendimia este sistema permite obtener mostos sin excesivo fango y facilita el prensado por la hidrólisis de las pectinas. Sin embargo, provoca un aumento de la oxidación de los mostos, por los que es más conveniente utilizar el sistema estático. Los hay con cilindro giratorio y con sinfín inclinado que conduce la vendimia estrujada por una especie de canalón perforado. En estas instalaciones el escurridor se coloca bajo la estrujadora y se alimenta directamente por gravedad. F) Prensado: su misión es extraer el mosto por medio de la presión ejercida sobre la vendimia una vez estrujada y escurrida. Con ello se consigue la desecación del hollejo. Para este trabajo se pueden utilizar diferentes máquinas prensadoras: - Prensas horizontales: trabajan por rotación y acercamiento de dos platos móviles. Tiene unos programadores que modifican la velocidad del prensado y lo detienen 38 cuando alcanzan una determinada desmenuzado de los orujos. presión, procediendo automáticamente al - Prensas neumáticas: trabajan por medio de inflamiento de una bolsa axial interior de caucho grueso. La bolsa oprime la vendimia contra la jaula cilíndrica de acero inoxidable. El inflamiento se efectúa por medio de un compresor de aire. El prensado se consigue por los presión que libera el pastel de los orujos y por la rotación de la jaula de acero. Son las más utilizadas para la obtención de mostos de calidad. - Prensas continuas: trabajan a través de un sinfín helicoidal o tornillo de Arquímedes que empuja a los orujos formando un espeso tapón contra un obturador móvil provisto de contrapesos. Las prensas continuas poseen un husillo de gran diámetro que tiene rotación lenta y un sistema de regulación automática de presión. Disponen de distintas salidas de mosto que aseguran el fraccionamiento según la calidad. Aunque la extracción del mosto es muy rápida, es un prensado violento y hace una trituración excesiva de los orujos. La mejor cadena de trabajo es siempre la más corta, aquella que trasforma la uva en mosto en un tiempo mínimo, la que proporciona un mosto menos turbio y menos sensible a la oxidación. 6. Maceraciones prefermentarias.- La maceración prefermentaria, también conocida con el nombre más común de maceración pelicular, es un sistema utilizado en algunas regiones vitivinícolas como práctica de elaboración de caldos en un sistema tradicional. Pero, paralelamente a la extracción de aromas, el mosto se enriquece en sustancias astringentes y desagradables, potencialmente peligrosas para la evolución del vino, como polifenoles que aceleran el pardeamiento. Una práctica muy utilizada es la maceración a baja temperatura durante un tiempo corto, en función de las características varietales. Cuando se realiza una maceración pelicular podemos obtener unos resultados muy satisfactorios que son: - En mosto macerado aumenta la densidad y el grado Brix.- La acidez total se mantiene o eleva ligeramente, mientras que el pH aumenta conforme lo hacen los tiempos de maceración. Los tiempos de maceración breves ( 4 y 6 horas ) presentan un efecto poco significativo con respecto a los no macerados, por lo que es conveniente alargar los tiempos de maceración de 9 a 12 horas para obtener un aumento de componentes aromáticos y tener mejor estructura en boca. - Cuando no hay posibilidad de bajar las temperaturas y se quiere realizar una maceración pelicular se puede recurrir al empleo de preparados enzimáticos de calidad que acortan los tiempos de maceración. 7. Corrección del mosto.- Una vez obtenido el mosto, haya o no maceración prefermentativas, hemos de adicionar anhídrido sulfuroso lo antes posible. En cuanto el mosto se separa, por escurrido o prensado, aumenta la acidez con la adición de ácido tartárico hasta niveles de 5 - 5, 5 gr/l (expresado en ácido tartárico), lo que confiere al mosto y después al vino una cierta estabilidad biológica. Esta operación es más aconsejable realizarla tras el desfangado. El anhídrido sulfuroso ejerce una serie de acciones importantes; como son: - Antimicrobiana frente a levaduras y bacterias. - Solubilizante de antocianos (en elaboración de vinos tintos). - Acción antioxidante. - Antioxidásica, inactivando enzimas polifenolixidásicas. 39 Antiguamente el sulfatado de la vendimia era determinado en función del estado sanitario de las uvas, de la temperatura y del pH de los mostos. En la actualidad se tiende a disminuir la dosis de SO2 en vendimia, ya que se controla la obtención de uvas sanas, y una rigurosa higiene en todo el proceso y materiales utilizados. Por el contrario, nunca se debe de sulfatar la vendimia ya estrujada puesto que es una operación menos eficaz, ya que al anhídrido sulfuroso forma combinaciones estables con los compuestos con grupos carbonílicos C=O que se generan durante la fermentación: Etanal, ácido pirúvico, ácido 2-cetoglutárico, ácido glioxílico, ácido oxalacético, con lo cual disminuye notablemente el SO2 libre que es el que ejerce la función de protección en el mosto. Controlando la adicción de sulfuroso al mosto se podrá utilizar una cantidad mucho menor en el vino para conseguir la mismo cantidad de sulfuroso libre. La dosis necesaria de anhídrido sulfuroso puede variar de 6 a 12 g por Hl. Estas consideraciones son para vinos de calidad obtenidos a partir de mosto flor, ya que en vinos de prensa exigen por su distinta composición mayor cantidad de sulfuroso. 8. Separación de fangos.- Los fangos están constituidos por residuos terrosos, fragmentos de raspones y hollejos, sustancias pépticas y mucilaginosas, en fin, proteínas precipitadas por contactos establecidos con sustancias localizadas en puntos diferentes de los granos de las uvas. La cantidad y naturaleza de los fangos depende de la uva, de su estado de maduración y podredumbre, y de la técnica de obtención del mosto. 9. Comportamiento fermentativo.- Como se ha explicado anteriormente la clarificación de los mostos blancos es imprescindible para la obtención de buenos vinos, pero el desfangado puede originar una serie de riesgos que el enólogo puede solventar con ayuda de coadyuvantes de fermentación específicos para cada proceso. Una vez ajustada la dosis de activadores al mosto, realizamos una siembra de levaduras seleccionadas, lo cual nos encontramos en las últimas operaciones prefermentativas. En los "Estudios sobre el vino " PASTEUR escribió que "Las cualidades del vino dependen en gran parte de la naturaleza específica de las levaduras que se desarrollan durante la fermentación de los mostos". Así, podemos pensar que, al someter a un mismo mosto a la acción de levaduras distintas se lograrán vinos de distinta naturaleza. La garantía que tiene el enólogo al utilizar las levaduras secas seleccionadas es que le permite un buen manejo, tienen dificultad para su contaminación y la inoculación de una alta población viable. Una vez trascurridos estos procesos, lo ponemos a fermentar en tanque o depósitos de acero inoxidable que pueden variar en su capacidad de volumen, pero siendo más aconsejable depósitos con capacidades más reducidas, es decir, 5000 l a 50.000 l. Estos depósitos tienen que estar preparados con camisas de frío a diferentes alturas para que así el depósito esté uniformemente repartido en las frigorías . También se pueden utilizar camisas interiores para depósitos que no hay posibilidad de acondicionar exteriormente. La temperatura de fermentación será variable en función de las distintas variedades, pero siempre es aconsejable una temperatura entre 15-20 ºC. Si bajamos la temperatura de fermentación se repentizará varios días más su terminación, pero siempre obtendremos mejores aromas a bajas temperaturas. Este proceso durará aproximadamente unos 15 a 20 días hasta en final de la fermentación alcohólica. 40 10. La fermentación en la barrica.- La función principal de la fermentación de mostos en barrica es la obtención de vinos más estructurados y elegantes con matices de madera que armonizan en boca su cata. Se realiza el llenado de las barricas con mosto blanco sin terminar su llenado para evitar que se derrame en la fermentación más tumultuosa. En algunas regiones vitivinícolas el llenado de las barricas se realiza cuando el mosto ha descendido su densidad entre 1000-1010, fermentado en una primera fase en depósito para evitar que se produzcan derrames en las barricas. Por ello, una vez que ha pasado esta fase se termina su fermentación en barrica y su posterior crianza sobre lías finas. Existen otras alternativas a las barricas, que ya se están utilizando en algunos países con una reducida tradición vitivinícola, y se conoce con el nombre de Inserstave. Este sistema utiliza en el interior del depósito de acero inoxidable unas tablas de madera de roble francés o americano que tienen el mismo tratamiento que la madera utilizada para la construcción de barricas, y que se colocan con una estructura de acero inoxidable dentro del depósito, realizando las mismas condiciones que aporta la barrica con ayuda de un aparato microoxigenador. Con la utilización de este sistema podemos fermentar el mosto desde el inicio hasta el final de la fermentación alcohólica, controlando la temperatura y su posterior crianza sobre lías finas. En la región vitivinícola de La Borgoña tienen mucha tradición los vinos blancos fermentados en barricas de roble francés. 11. Acabado de la fermentación alcohólica.- Si la marcha de la fermentación alcohólica está bien definida por la toma de densidad, el densímetro no basta para decidir sobre el final de la transformación de todo el azúcar contenido en el mosto en alcohol. Para ello, hay que recurrir a análisis químicos y averiguar los azúcares reductores que hay en el medio. En algunas bodegas realizan la práctica de interrumpir la fermentación alcohólica al final de su proceso para así, obtener vinos dulces o semidulces, es decir, con 15 ó 20 gramos de azúcares reductores en el medio. Una vez terminada la fermentación alcohólica se procederá a una segunda fermentación, si es necesaria, llamada fermentación maloláctica, que se realiza sobre todo en vinos con un contenido ácido málico muy alto. Esta fermentación se realiza para conseguir la transformación del ácido málico en láctico. El resultado de estos vinos es muy bueno ya que los suaviza de esa acidez tan marcada que tenían los vinos al término de la fermentación alcohólica. Si el vino no es apto para la fermentación maloláctica se procederá a un trasiego inmediato con un aporte de sulfuroso de 4 a 6 gr/ Hl, de tal manera que la dosis de anhídrido sulfuroso libre después de la combinación sea del orden de 20 a 30 mg por litro. Si el contacto con la lía en depósitos grandes es muy prolongado aparecerán los olores a sulfhídrico (a huevo podrido). 41 Clarificación del vino.El gusto de los consumidores del vino se ha ido desplazando cada vez mas hacia los vinos jóvenes y frescos. En la actualidad se prefieren vinos brillosos y claros, completamente resistentes al aire. El enturbiamiento del vino se puede eliminar por: clarificación, filtración y centrifugación. Los tres procedimiento son eficaces proporcionando buenos resultados si se utilizan correctamente. El vino se puede clarificar con tierra de España o caolín. Estas se utilizan para clarificar los vinos dulces y para el tratamiento del vino viscoso en dosis de 100 a 4000 gr., por hectolitro ( 100-400 gr / Hl). La tierra de España o Caolín es el silicato de aluminio hidratado y es un producto que se obtiene de las ricas feldespatiferas. A).- Bentonita. Clarifica los enturbiamientos por precipitación de albúminas con materias de tipo de Caolín, la bentonita es un complejo de silicato de aluminio, Mg, Ca, , de origen volcánico. De acuerdo a la intensidad del enturbiamiento las necesidades del bentonita son: Enturbiamiento débil, igual de 50 a 100 gr./Hl . Enturbiamiento medio de 100 – 200 gr / Hl Enturbiamiento intenso de 200 – 400 gr de bentonita /Hl B).- Carbón Activado.Es el carbón vegetal ( de madera) y carbón animal (de hueso). El carbón activo se utiliza para decolorar los vinos y baja la concentración del sabor y color. El vino de matiz amarillento obscuros se utiliza una cantidad de 10 a 15 gr/Hl para decolorar vinos pardos se emplea de 15 a 30 gr/Hl . Composición del zumo de uva.a) H2O 750-850 g/l b) Contenido de azúcar 120g/l (glucosa, fructosa y sacarosa). c) Ácidos: -Ácido tartárico. - ácido málico. Ácido cítrico. d) sustancias minerales. Fosfato de potasio, calcio, magnesio, cloruros, sulfatos y silicatos. e) Sustancias nitrogenadas. - Proteínas (albúminas y globulina) pentosas y aminoácidos. f) Taninos y minerales colorantes. - antocianonas, enina. g) aceites, grasas y ceras - Vitina. h) fermentos. -(enzima) oxidasas. i) Sustancias responsables del color, sabor y aroma, aceites especiales. 42 ESPECIFICACIONES DEL VINO Grado alcohólico GL real a 15 °C Extracto seco reducido Cenizas g/l Acidez total (como ácido tartarico g/l) (Como ácido acético ) acidez fija (como ácido tartarico g/l) metanol mg/100 ml de alcohol 100 % bióxido de azufre total mg/l MINIMO MÁXIMO 9.0 15 1.0 4.5 14 10 1.2 4.0 300 300 Características fisicoquímicas de los vinos de acuerdo a las normas mexicanas NOM.1991. 43 UNIDAD 6.- FERMENTACIÓN LÁCTICA CARACTERÍSTICAS GENERALES, ETAPAS Y REACCIONES QUÍMICAS DE LA FERMENTACIÓN LÁCTICA. INTRODUCCIÓN. Los lactobacillus, son bacterias que utilizan la fermentación láctica para obtener energía; estos organismos transforman la lactosa de la leche en glucosa y posteriormente en ácido láctico. Este proceso tiene importancia industrial ya que se utiliza en la fabricación de yogurt. El ácido láctico también lo podemos producir en nuestro cuerpo. Un ejemplo es la acumulación de ácido láctico en tejidos humanos, lo podemos apreciar después de un ejercicio intenso, el ácido láctico se acumula en las células musculares provocando dolor, el cual va desapareciendo poco a poco, conforme el ácido láctico pasa a la circulación sanguínea y llega al hígado donde se transforma nuevamente en ácido pirúvico. El ácido láctico se produce en muchas bacterias (bacterias lácticas), también en algunos protozoos y en el músculo esquelético humano. Es responsable de la producción de productos lácteos acidificados ---> yoghurt, quesos, cuajada, crema ácida, etc. El ácido láctico tiene excelentes propiedades conservantes de los alimentos. Historia.- El alcohol láctico fue descubierto por Schell en 1780. Después de haber examinado muy detalladamente los resultados de anteriores investigadores y sus deducciones, Luis Pasteur llegó a conclusiones completamente diferentes. Sus últimos trabajos le permitieron establecer que existe una levadura láctica que está siempre presente cuando hay transformación de azúcar en ácido láctico, especialmente en una materia azoada, elemento indispensable para el desarrollo de una fermentación. Pasteur observaba que en la fermentación láctica se podía ver a menudo, en la parte superior, un depósito de cal y materia azoada, formado por unas manchas de sustancia gris en suspensión que se distinguía perfectamente del resto. Pensaba que esa materia gris desempeñaba un papel importante, lo que le llevó a separar la levadura de su parte soluble, manteniéndola en el punto de ebullición con aproximadamente 1/5 de su peso en agua. Luego, disolvió nuevamente en esa solución unos cien gramos de azúcar por litro, filtrándolo con mucho cuidado. La solución se mantenía en una estufa a una temperatura de 30 a 35 grados. Hizo pasar una corriente de ácido carbónico por el frasco para eliminar el aire y aproximadamente 24 horas después se produjo un cambio: el líquido se agitó y la cal desapareció, formándose un depósito que aumentaba sin cesar. 44 Según los trabajos de Pasteur, es evidente que la levadura láctica proviene de la atmósfera. Si se suprime todo contacto con el aire o se pone en ebullición el medio sintético (creado por el científico y donde había azúcar, sal de amoniaco, fosfato y cal), dejando entrar aire que atraviesa un conductor calentado al rojo vivo, no se desarrolla ninguna levadura ni organismo vivo. Para este experimento, Pasteur había creado un medio artificial que podía ser reproducido en su totalidad, eliminando de ese modo numerosas causas de errores. Hoy en día, la diferencia de medios -medios controlados-, todavía se utilizan de forma habitual en todos los laboratorios de biología, química-biología y microbiología. De 1857 a 1862, Luis Pasteur estudió las fermentaciones láctica y alcohólica demostrando que: 1.-Toda fermentación es debida a la presencia de un microorganismo; a cada fermentación le corresponde un fermento particular. 2.- De igual modo, constató que para estudiar una fermentación había que preparar un medio de cultivo apropiado al fermento y estéril; sembrar ese medio con una traza de fermento puro. La fermentación láctica es utilizada por numerosos microorganismos, así como por organismos superiores cuando el oxígeno está limitado (por ejemplo en el músculo, durante una actividad intensa). Conduce a la formación del ácido láctico, interviniendo en la producción de quesos, yogures, etc. MICROORGANISMOS ÁCIDO LÁCTICOS. Las bacterias lácticas son cocos y bacilos de longitud variable y de un grosor de 0,5-0,8 micrómetros. Se trata de un grupo de bacteria fisiológicamente uniforme, de pared Gram-positiva, que sólo utilizan sus substratos, predominantemente azúcares, de manera fermentativa con formación de ácido láctico. Carecen de actividad respiratoria porque les falta una enzima (citocromo catalasa) que contenga un grupo hemina, que les permita poner en marcha «cadena respiratorias con el oxígeno como aceptor de electrones« A pesar de su metabolismo anaerobio, son aerotolerantes, en los medios de cultivo sólidos forman colonias en presencia aire Otra característica importante son sus complejas necesidades de nutrientes. Ninguna bacteria láctica crece en un medio constituido exclusivamente por sales minerales, azúcar y sales amónicas como única fuente de nitrógeno. La mayoría necesita distintas vitaminas del grupo B (lactoflavina, tiamina, biotina, ácido nicotínico, ácido pantoténico, ácido fólico) y varios aminoácidos. Como su crecimiento disminuye linealmente en condiciones estándar en función de la concentración del nutriente presente en concentraciones subóptimas, desde hace tiempo se cultivan para realizar ensayos microbianos específicos y sensibles a la presencia de pequeñas cantidades de vitaminas o aminoácidos en los alimentos. Por ello se cultivan en medios complejos con abundante extracto de levadura, zumo de tomate o lactosuero. 45 Debido a sus requerimientos nutricionales complejos y a su metabolismo anaerobio se encuentran de manera espontánea principalmente en tres lugares: En la leche y productos lácteos, en plantas intactas o trasplantadas y también en el intestino y mucosas de los animales y del hombre, donde se encuentran como: simbiontes, adventicias o patógenas. Debido a que sintetizan intensamente ácido láctico y a su tolerancia a la acidez (pH 4-5), en medios adecuados se imponen rápidamente a otros microorganismos con lo que se consigue fácilmente su enriquecimiento. Para conseguir un mejor crecimiento durante su cultivo conviene detener la producción de ácido añadiendo carbonato calcio. Hay un gran grupo de bacterias que incluyen las que fermentan los azúcares a ácido láctico preferentemente, es decir, un 90 % o más. Estas bacterias lácticas que en la fermentación originan un único producto se engloban bajo el nombre de homofermentativas Existe, además otro grupo fisiológico formado principalmente por especies de Lactobacillus que como productos de la fermentación originan un 50 % de ácido láctico y un 30 % de ácido acético o etanol y un 17 % de CO2 estas especies productoras de gas se denominan bacterias lácticas heterofermentativas. Como consecuencia de sus características morfológicas ya no se incluyen todas las bacterias lácticas en la familia Lactobacillaceae. Los cocos constituyen su propia familia la de estreptococaceae, mientras que la especie Sporolactobacillus inulinus que forma endospora termorresistentes, al igual que las especies del género Bacillus se encuadra en la familia Bacillaceae Las bacterias lácticas homofermentativas, es decir, las especies del género Streptolactobacillus y una parte de las especies de los géneros lactobacilus y Sporolactobacillus degradan la glucosa ácido pirúvico por la ruta de la fructosa bifosfato, de manera análoga a las levaduras del vino y la cerveza. RUTAS METABÓLICAS. En la unidad denominada “Fermentación Alcohólica”, hemos detallado la ruta de la glicólisis. El piruvato (o moléculas derivadas del piruvato) se encuentra disponible luego del proceso de glicólisis. Glucosa + 2ADP Ácido piruvico + NADH + H+ ácido láctico + NAD+ 46 Como no poseen piruvato descarboxilasa, transfieren el hidrógeno formado por acción de la fosfotriosa-deshidrogenasa a ácido pirúvico con ayuda de nicotinamida-adenin dinucleótido (NAD) y lo transforman así en ácido láctico. Rendimiento energético de la fermentación láctica.Si comparamos el rendimiento de la fermentación láctica con respecto a la alcohólica, observamos que la fermentación láctica es mucho más eficiente a condiciones estándares. Debido a que se requiere mecho menor energía para la formación de ácido láctico. FERMENTACIÓN LÁCTICA C6H1206 + 2ADP + 2Pi FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA C6H1206 + 2ADP + 2Pi 2C3H603 + 2ATP + 2H2O DG0' = - 47 kcal/mol 2C2H50H + 2ATP + 2CO2 DG0' = - 56.3 kcal/mol Rendimiento energético (cond. estándar): (14.6/47.0)x100 = 31% Rendimiento energético (cond. estándar): (14.6/56)x100 = 26% La enzima lactato-deshidrogenasa, que reduce el ácido pirúvico a ácido, tiene una estereoespecificidad distinta según la especie bacteriana. Por ello algunas bacterias sólo forman ácido láctico dextrorrotatorio [D-(-)] y otras, por el contrario, levorrotatorio[L-(+)]. Hay bacterias que sintetizan además la enzima lactato-racemasa que lleva a cabo la interconversión de las dos formas ópticamente activas. En presencia de oxígeno, también en las bacterias homofermentativas una pequeña parte del ácido pirúvico (menos del 10 %) se descarboxila con liberación de C02, transformándose en ácido acético, etanol o acetoína dependiendo de la especie. Como las especies heterofermentativas de Laciobacillus no sintetizan ni aldolasa ni triosafosfatoisomerasa no pueden llevar a cabo la degradación preliminar de los azúcares 47 siguiendo la ruta de la fructosa bisfosfato, como hacen las bacterias hornofermentativas. Se realiza, por el contrario, por la ruta de las pentosas-fosfato (PP), que es común a la mayoría de las bacterias. En ella, la glucosa se transforma en pentosa, que se escinde a acetato y fosfogliceraldehído. Esquema de la heterofermentación ácido láctica. La glucosa se transforma en glucosa-6-fosfato con la ayuda del ATP y se oxida a ácido fosfoglucónico gracias a la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. La 6-fosfogluconatodeshidrogesa hidroliza el C, del grupo carboxílico del ácido 6-fosfogliicónico, formándose ribulosa-5-fosfato Y C02, el primer producto de la fermentación. Una epimerasa transpone los ligandos -H y -OH del C3 de la ribulosa, formándose xilulosa-5-fosfato. Este azúcar será escindido a acetilfosfato y gliceraldehído-3-fosfato por la fosfopentosacetolasa con ayuda del coenzima tiaminopirofosfato (TPP) por adición de un anión fosfato (Pi). El enlace fosfato rico en energía del acetilfosfato se transfiere al adenosindifosfato con formación de ATP. Se libera así ácido acético como segundo producto de la 48 fermentación, que, a su vez, puede ser reducido a etanol por distintas especies gracias a una aldehído alcohol-deshidrogenasa con la ayuda del NADH2- Como en las bacterias homofermentativas, el gliceraldehído-3-fosfato se transforma por el contrario, siguiendo la ruta de la fructosabisfosifato, en ácido pirúvico, por deshidrogenación y con formación de 2 moles de ATP vía 1,3-difosfoglicerato y fosfoenolpiruvato El ácido pirúvíco por acción de una lactato deshidrogenasa y del NADH2 se reduce también a ácido láctico. De este modo, algunas bacterias lácticas heterofermentativas pueden reducir a glicerina parte del gliceraldehído formado durante la degradación del azúcar. Las cepas que fermentan la fructosa reducen tambien así en parte la fructosa con formación de manita . por ello muchas bacterias lácticas pueden formar 5 – 6 productos de fermentación: ácido láctico, etanol, ácido acético, CO2, glicerina y manita.-. Para obtener ácido láctico puro por un proceso microbiológico, que es mas rentable que la síntesis química se emplean únicamente bacterias homofermentativas porque al no producir metabolitos secundarios, permiten unos rendimientos mayores. Leches y hortalizas fermentadas. Diferentes tipo de productos elaboradas a base de leche fermentada.La acidificación de la nata es uno de los procesos más importantes para la elaboración de mantequilla de nata ácida. La crema se inócula por cultivos constituidos por una mezcla de : 45 % Streptococcus cremoris y S.lactis. 10% Leuconostoc cremoris. Además de los productos de la fermentación del ácido láctico, cuando se utilizan los dos últimos microorganismos en la acidificación de la nata de forma diacetilo, que confiere el deseado aroma a mantequilla. Se origina vía ácido pirúvico, metabolito intermediario de la fermentación. O H3C – C CH3 HOOC CH3CHO Ácido Pirúvico OH CO2 H3C-C-CO–CH3 COOH Ácido a-acetil-láctico H2O H3C-CO-CO- ½ O2 diacetilo 49 Con Leuconostic cremoris se degrada también el ácido cítrico de la leche, vía ácido oxalacético, a ácido pirúvico y este a diacetilo: Los iniciadores acidificantes.Se obtienen por acidificación natural de la leche sin Pasteurizar. La leche fresca sin pasteurizar se inocula con leche acidificada espontáneamente. Después de repetir varías veces este proceso, se habrá desarrollado por enriquecimiento específico en bacterias lácticas un cultivo iniciador cuya composición es la ya citada. Su crecimiento posterior en leche que haya sido pasteurizada durante 1 hora a 85 'C tiene lugar en unas 18 horas si la temperatura es de 21 °C ,hasta que la cantidad de ácido formada sea equivalente a un hidróxido sódico 0,1 M. Después de eliminar la capa de nata, esta leche se emplea para acidificar cantidades mayores y finalmente se añade en una proporción que suponga el 3-4 % del volumen total del tanque de crema una vez llenado con crema fresca. Estos tanques de maduración de la crema son rectangulares y tienen doble pared y fondo hemiesférico para recoger el líquido. La acidificación de la crema tarda de 16 a 30 horas. Los tanques de maduración se mantienen a 18-20 °C durante 3-4 horas hasta el espesamiento de la crema, es decir, hasta la coagulación de las proteínas de la leche. Después se deja que prosiga la acidificación a 12-14 °C, hasta que se consigue un pH de 5.0 aproximadamente. Durante el proceso se agita la crema con frecuencia con el fin de proporcionar el oxígeno necesario para la síntesis del diacetilo. A temperaturas más altas, la formación de aroma es insuficiente y la grasa demasiado fluida como para hacer mantequilla. La crema madurada se pasa a la batidora donde se bate hasta que se forma la mantequilla. Además de grasa, puesto que se trata de una «emulsión plástica», la mantequilla contiene un 13-16 % de agua y también las sales, proteínas lácteas y productos del metabolismo de las bacterias lácticas. El residuo líquido que separa es la mazada. Contiene casi la totalidad de las bacterias de los géneros Estreptococos y Leuconostoc. El Yogur. Obtenido originariamente en los Balcanes a partir de leche de oveja o de cabra, se elabora hoy sobre todo a partir de leche de vaca. Esta leche se pasteuriza a 85 'C, se enfría a 50 'C y se inocula con un cultivo mixto de Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus. Ambas especies bacterianas necesitan calor, se desarrollan óptimamente a 40 'C y no crecen por debajo de 15 'C. La leche inoculada se pasa a los envases en los que vaya a ser comercializada y se incuba a 40 'C durante 9-12 horas hasta su coagulación y hasta que tenga un contenido de ácido láctico del 1.0 – 1.5 %. Después se enfría inmediatamente y se conserva en sitio frío hasta el momento de su venta, para 50 impedir una acidificación excesiva. L. bulgaricus proporciona el aroma característico, S. thermophilus el sabor fresco y ácido de este tipo de leche cuajada. El Kefir. Es una bebida de leche ácida de origen caucásico, que también se encuentra a la venta frecuentemente, el kefir además de las bacterias lácticas contiene levaduras que fermentan el azúcar, en una menor proporción, a alcohol Y C02. Esta acidificación y fermentación alcohólica simultáneas tienen lugar a 20 'C y duran unas 24 horas. El kefir, ya fabricado contendrá 1,0-1,5 % de ácido, 0,25 % de alcohol y C02 disuelto. El inoculo lo constituyen los granos de kefir, que se emplean también para uso doméstico. Están formados por proteínas lácteas coaguladas, sólidas, que contienen un cultivo mixto de las siguientes bacterias y levaduras: Lactobacillus (caucasicus), L. caseina, L. plantarum Leuconostoc cremoris y algunas levaduras fermentadoras de la lactosa (Torulopsis spp., Saccharomyces fragilis). Los granos de kefir pueden conservarse secos durante muchos años. Antes de su utilización hay que reactivarlos por maceración. Al final de la fermentación se extraen los granos, que habrán crecido como consecuencia de la coagulación de más proteínas, y podrán volver a emplearse inmediatamente o más tarde, después de su desecación. El Queso. Se obtiene por degradación microbiana más o menos intensa de los componentes de la leche . Se coagula la Caseína por fermentación láctica y dependiendo de si la caseína sufra o no una maduración microbiana se diferencian los quesos en: Madurados y Frescos. La consistencia y sabor de los madurados están influenciados por : El contenido graso. Tipo de coagulación de la caseína. Aditivos. Tratamiento con bacterias y mohos y especie a la que pertenezcan. Por combinación de estos factores pueden obtenerse numerosos tipos distintos de queso. Ajustando el contenido graso de la leche de partida se obtendrán quesos que en base a esto se clasifican en: QUESOS CONTENIDO EN GRASA 51 Doble crema Crema Super graso Graso Semigraso Poco graso Magros 60 % 50 % 45% 40 % 20 % 10 % menos del 10 %. Para la coagulación se emplea Quimosina o Renina que se obtiene del estomago de los terneros como proenzima inactiva y se activa con ácido clorhídrico a pH 5.3. Enzima inactiva HCl Caseína láctea (Solución coloidal paracaseinato insoluble) Enzima activada Paracaseínato cálcico Quesos Frescos. En estos no hay maduración después de la coagulación de la caseína o la hay en muy pequeña proporción (ver fig. 11). Todos tiene un sabor suave, débilmente ácido por que todavía no hay degradación microbiana de las proteínas y de los lípidos. A. Queso blanco B. Queso en capas y C. Queso crema fresco. A.- Queso blanco.- Se obtiene como cuajada ácida por precipitación a partir de Leche ácida y cuajada enzimática ( fermento lab.) mayoritariamente. B.- Queso en capas.- Contiene una capa intermedia algo más grasa. C.- Queso Crema y doble crema.- A partir de leche entera a la que se le añade crema. Quesos madurados.- se obtienen por: 1) Fermentación ácido láctica de cuajada ácida 2) Precipitación con Fermento lab. De cuajada enzimática . Quesos de leche ácida.- Son quesos magros que se obtienen por degradación microbiana progresiva de la cuajada ácida. Entre estos se encuentran los tipos: Haserkäse 52 Karbkäse Stangekäise Quesos de hierbas Quesos con mohos. Fuente C (ác.láctico) MADURACIÓN PARACASEÍNA Albumosa , a.a., aminas peptonas, ác.grasos y compuestos volátiles Degradación Bacteriana Bacterias lácticas: Lactobacillus casei, L.helveticus, Streptococcus lactis y S:cremoris y participan a demás Micrococcus caseolyticus y Arthrobacter sp. Los quesos de leche ácida, se condimentan, salan y conforman de acuerdo con el tipo al que pertenezcan y se almacenan en un lugar húmedo durante la maduración. Quesos con fermento lab.- Se realizan con leche acidificada débilmente y sin cuajar, se le añaden de 1-2 % ( en volumen ) de cultivo de bacterias lácticas y fermento Lab en forma de polvo o liquido. La coagulación de la leche va ha ser mayor cuanto más elevada sea la temperatura. Quesos blandos Coagulan 18 – 22 °C. Quesos duros Coagulan 31 – 33 °C. Si la coagulación es lenta por la ausencia de calcio, se le puede CaCl2 a la leche. Después de la cuajada el queso s e calienta varias horas hasta alcanzar los 54 – 55 °C. Para eliminar las levaduras y mohos de la leche . En el suero quedan : Lactato, albúmina, lactosa y sales minerales. Quesos blandos . Después de la coagulación se les da forma prensándolos únicamente entre tablas ajustables, en estos hay una degradación de la masa del interior y exterior hacia el centro, determinando especialmente la maduración externas el carácter del queso (ver fig. 11). Los quesos blandos pueden ser: 1) Madurados con mohos. 2) Madurados sin hongos. 53 Dentro de los madurados con mohos se encuentran los madurados con: Camembert y Brie que son madurados con Moho blanco, se inoculan con Penicillium camemberti y Endomyces sp. Roquefort, Bavaro azul que son madurados con moho azul , y se inoculan con Penicillium roqueforti. La maduración del queso fresco se realiza espolvoreándolo con migas de pan invadido por el moho. Quesos Duros. Se prensan envueltos en paños a presiones hasta de 20 bar. hay una maduración homogénea de toda la masa , dentro de los más importantes están: Tilsit.- Es semiduro , flexible, 4-5 kg., con ojos repartidos y recubierto de una capa pegajosa amarilla rojiza. Edam .- Grande redondo amarillo dorado, graso, semiduro, ojos escasos pequeños y redondos, corteza roja recubierta de parafina. Emmental o suizos.- Son duros, grandes hasta de unos 100 cm. de diámetro y unos 40 kg. de peso, grasos con grandes ojos y aroma característico. Cheddar.- La cuajada debe de acidificarse antes de proseguir su elaboración. Chester.- Son elaborados a partir de leche dulce y están recubiertos con cera. Parmesano.- También se acidifica la leche, con textura granulosa y dura y ojos pequeños y escasos. La maduración se lleva a cabo en dos etapas , premaduración y maduración principal (ver fig.). PREMADURACIÓN A).- Leche ácida.Lactosa residual Ácido láctico, ácido acético acetoína y diacetilo Bacterias lácticas y Estreptococos proteolisis. B).- Fermentación enzimática.Lactosa y Lactato cálcico . glucosa ácido + ácido + CO2 propionico acético 54 Propionibacterium freudenreichii P. ácidi- propionici P. jensennii El CO2 liberado forma los agujeros característicos de los quesos duros, los ojos. Maduración principal.Además de la fermentación a ácido propionico termina la degradación de la Caseína y el desarrollo del aroma. Su degradación y transformación conducen ala formación de : Cetoacidos Oxiacidos Ac. Grasos sencillos Esteres de ácidos grasos Existen otros muchos productos tradicionales de leche ácida originarios del medio y lejano Oriente, a los que no podemos referirnos aquí con más detalle (por ejemplo dahi, kumiss, leben, kurunga). Se obtienen a partir de la leche de distintos animales domésticos y de inóculos de diversa composición. 55 56 Elaboración de queso de fermentación láctica (queso de untar). Objetivo.- Que el alumno aprenda la elaboración de queso de fermentación láctica (queso de untar). Introducción. Este tipo de queso está directamente relacionado con el queso más sencillo que existe que es el que se elabora añadiendo un agente acidificante a la leche (ácido clorhídrico, limón o vinagre) ya que la base es la misma pero en el caso del uso de las bacterias ácido lácticas se tiene la gran ventaja de que es la lactosa (azúcar de la leche) la que se metaboliza produciendo un sabor, una textura y una digestibilidad muy superior que el producto obtenido por la simple acidificación. La coagulación de las proteínas lácticas (conocidas como caseínas) por medio del un descenso en la acidez de la leche origina la unión de las proteínas unas cono otras, formando estructuras de mayor tamaño. Cada molécula de ácido actúa como un cemento que se encargaría de unir las proteínas de la leche que actuarían como ladrillos siendo así muy fáciles de separar de la parte acuosa de la leche (suero) constituyendo lo que se denomina la cuajada. Como curiosidad conviene apuntar que este es un proceso químico reversible, es decir que si se le añade a la leche coagulada por la acción de un ácido un álcali (sustancia química con un pH alto como por ejemplo la lejía) la cuajada volvería a ser líquida otra vez (cuidado ya no sería leche que se pudiera beber aunque su aspecto sería igual que el de la leche fresca). El queso que se obtiene tiene un sabor marcadamente ácido y es magnífico para condimentar con finas hierbas, ajo y perejil, pimienta, nueces, etc. Su estructura es muy blanda ya que la acción cementante del ácido es débil por ello no se pueden hacer quesos con una determinada forma por medio de este tipo de fermentación. Su consistencia va desde una pasta muy densa hasta una crema ligera que se puede usar para hacer repostería como base de deliciosos bizcochos, etc. Material y equipo necesario: 57 1. 1 litro de leche. 2. Olla grande para el baño María si la temperatura es inferior a 22 ºC. 3. Recipiente para la coagulación puede ser de plástico, acero inoxidable o vidrio. No se recomienda la porcelana, ni el aluminio, ni cualquier recipiente que pueda ser alterado por la acción del ácido o no se pueda limpiar con facilidad. 4. Termómetro 5. Gasa 6. Fermento iniciador 7. Cazo de sopa o cucharón 8. Colador 9. Cuchillo de punta 10. Cuchara sopera Proceso de elaboración: Pasteurizar la leche si se trabaja con leche no comercial : calentar la leche hasta 70ºC al baño María nunca directamente y mantener esta temperatura de 1 a 3 minutos. Enfriar rápidamente introduciendo el recipiente de la leche en agua fría. Bajar la temperatura hasta los 30 ºC . Si se trabaja con leche de cabra actuar siempre por debajo de 29 ºC después de pasterizar. Tomar la punta de un de fermento Tomar 1 litro de leche cuchillo iniciador y depositarla en la Diluir el fermento en una pasteurizada y calentarla al cucharada de leche a 30 ºC. cuchara sopera. baño María hasta 30º. Diluir la cucharada de leche con el fermento en el litro Dejar reposar la mezcla sin de leche revolviendo molestar en un sitio suavemente. caldeado a temperatura nunca inferior de 20º ni superior a 35º durante 8 a 24 horas dependiendo de la temperatura ambiente. Es conveniente cubrir con una La cuajada está lista para desuerar cuando al introducir el cuchillo y levantar la punta hacia arriba se produzca una grieta en la superficie. Esto significará que la leche se ha coagulado o “solidificado” y por lo tanto la cuajada está a punto. 58 tela o trapo para evitar que se ensucie la leche pero que se airee. y forrar con ella el colador. Humedecer con agua la gasa de quesería Sacar con cuidado la cuajada y depositarla sobre la tela. Si se desea recuperar el suero para utilizarlo posteriormente poner debajo del colador un recipiente limpio y vaciarlo de vez en cuando. Si fuera necesario tomar la tela por sus extremos y levantarla ligeramente para destaponar la parte de la gasa que está en contacto con la cuajada y deje salir el suero. El tiempo de desuerado es muy variable y depende de cómo de consistente queramos dejar el queso y la temperatura ambiente, como orientación entre 4 y 8 horas. Y se envasa en un recipiente hermético para meterlo en la nevera donde se conservará hasta 10 días. Al enfriarse su consistencia se endurece. Cuando tenga el queso la consistencia deseada es el momento de añadirle los condimentos que queramos: sal, pimienta, nueces molidas, ajo, perejil, orégano, finas hierbas, azúcar, etc. 59 Para obtener un queso más cremoso se puede añadir nata comercial a la leche antes de empezar el proceso y se pueden variar los tiempos de fermentación y desuerado, así como la cantidad de fermento; para obtener texturas y sabores diferentes. Es ideal como ingrediente de repostería en vez de la nata o mezclado con los condimentos como aperitivo. Problemas más comunes y cómo resolverlos Queso muy acuoso: Ha tenido poco tiempo de fermentación o se ha realizado en ambiente muy frío y se ha desuerado antes de tener la cuajada la consistencia del corte limpio. Se ha desuerado poco tiempo o en ambiente muy frío. Sabor excesivamente ácido: Se le ha añadido demasiado fermento iniciador y lo tanto hay que reducir la dosis. Conservar el fermento correctamente porque puede que haya perdido fuerza. Hortalizas fermentadas. Los encurtidos son aquellos productos vegetales hortícolas que, tras ser sometidos a diversas transformaciones, tienen en común su aderezo con vinagre. Entre las especies hortícolas cultivadas para encurtir destacan: pepinos, zanahorias, remolachas (hervirlas diez minutos antes); repollo colorado, col crespo. Algunas combinaciones posibles: pepinos o chauchas con borraja, eneldo y menta; repollo colorado con zanahorias, granos de mostaza, kummel y coriandro; pimientos con zapallitos (probar que no sean amargos), cebollas, oregano y ajo. Remolachas con manzanas, kren (rábano blanco picante), cáscaras de limón, granos de mostaza y jengibre. Tallos de apio, manzana con kren o jengibre. Cada cultura ha desarrollado diferentes variantes para encurtir hortalizas a partir de esta técnica. La materia prima puede someterse a fermentación ácido-láctica o bien no fermentarse. También pueden elaborarse numerosos tipos de encurtidos mediante adiciones de azúcares, especias, esencias y aromas, pero siempre con presencia de vinagre, pues es la característica fundamental del encurtido. Los encurtidos , independientemente de que se fermenten o no, pueden pasteurizarse para mejorar su conservación. El proceso de fabricación de encurtidos comprende dos fases: o o Fase de fermentación: tiene lugar la fermentación ácido-láctica de la materia prima debido a la flora microbiana presente de forma natural en los frutos. Esta fase va acompañada de una serie de operaciones previas preparatorias. Esta fase puede no realizarse, pasando de las operaciones previas a la fase siguiente. Fase de elaboración: a partir de la materia prima fermentada y conservada en salmuera o bien partiendo de productos en fresco son elaborados los distintos tipos de encurtidos. El diagrama general que se sigue es el siguiente.- 60 Materia prima. La materia prima está constituida por los frutos inmaduros de las especies anteriormente citadas. La textura de los frutos destinados a encurtir debe ser firme y éstos deberán estar exentos de sabores extraños y amargos, así como de malos olores. El tipo de recolección es un factor muy importante para determinar la distribución de tamaños de los frutos recogidos. Mientras que la recolección manual produce mayor porcentaje de frutos pequeños, muy apreciados comercialmente y de mayor precio, la recolección mecanizada tiende a frutos de mayor tamaño, poco apreciados. Selección. Este apartado comprende diferentes operaciones, destinadas a incrementar la calidad de la materia prima que se dispone a fermentar. Deberán ser eliminadas las hojas y las flores que permanecen adheridos al fruto. Esta operación se realiza mecánicamente con una máquina compuesta por una cinta transportadora de rodillos vulcanizados en caucho que giran por pares en sentidos opuestos. Los rodillos atrapan las flores y restos de materia vegetal, mientras que los frutos continúan avanzando por la cinta. El objetivo de esta operación reside en la eliminación de las partes de la planta, que contienen de forma natural poblaciones de hongos que son fuente de enzimas responsables del reblandecimiento de estos frutos fermentados comercialmente. Se ha comprobado que aquellos depósitos que contienen un porcentaje muy elevado de restos vegetales muestran una gran actividad enzimática, y por lo general, el producto final fermentado es blando o de poca firmeza. 61 Calibrado. Los frutos se clasifican según su diámetro. Esta característica es muy importante debido a la fuerte demanda comercial de tamaños pequeños. No existe uniformidad internacional en la clasificación teniendo cada país su propia norma. El calibre va a ser un factor muy importante, que determinará la aparición de ciertas alteraciones que deprecian el valor del encurtido en salmuera y del producto elaborado. Este es el caso de la formación de huecos durante la fermentación, que está directamente relacionada con el tamaño de los frutos. Se recomienda evitar fermentar en el mismo depósito frutos de tamaños extremos, puesto que los pequeños fermentan con mayor rapidez que los grandes. La clasificación se realiza mecánicamente mediante calibradoras que constan de varios canales de calibrado, formados por cordones de caucho o nylon en forma divergente. Regulando la divergencia de los cordones se consiguen los distintos calibres que se recogen en tolvas. Lavado. Esta operación se realiza previa a la fermentación, cuyo objetivo es disminuir la suciedad y los restos de tierra que los frutos llevan adheridos. Esta operación no se realiza en la industria encurtidora, pues los fabricantes depositan los frutos en los depósitos de fermentación tal y como los reciben del campo. Como la fermentación ácidoláctica es un proceso microbiológico, la higiene en el manejo de la materia prima es fundamental. El reblandecimiento de los frutos se debe a la presencia de enzimas pectinolíticas y celulolíticas. El lavado constituye uno de los procesos más importantes en la fabricación de encurtidos, pues la suciedad de los frutos y la presencia de hojas y frutos descompuestos, dificulta el normal desarrollo de la fermentación natural. El lavado se realiza simplemente con agua, la maquinaria empleada suele ser lavadoras de tipo rotativo compuestas por cilindro de chapa perforada semisumergido en agua y cintas transportadoras, también perforadas, con duchas a presión. Fermentación. Es la operación más importante en todo el proceso de fabricación. De forma general esta operación consiste en colocar las especies hortícolas en solución salina (salmuera) y dejar que la flora microbiana, realice la fermentación natural. La fermentación ácido-láctica se consigue mediante la combinación de dos factores: la concentración de sal y el descenso del pH de la salmuera debido a la producción de ácido láctico por las bacterias fermentativas. La fermentación tiene lugar en depósitos de plástico con diferentes capacidades, pudiendo oscilar éstas entre 120-14.000 litros, dependiendo del lugar de emplazamiento y de las facilidades operativas. Estos depósitos se suelen instalar en naves industriales 62 cubiertas, aunque en algunas zonas cálidas los depósitos se colocan abiertos y al aire libre. Los depósitos han de ser limpiados antes y después de su uso. En la preparación de la salmuera se utilizará agua potable, que esté exenta de materia orgánica en suspensión; las aguas duras no se emplearán. La sal empleada debe contener menos del 1% de carbonatos o bicarbonatos de sodio, calcio y magnesio, debido a que estas sales pueden neutralizar el ácido producido por las bacterias que realizan la fermentación. Transcurridas 24 horas de la recolección; una vez llevadas a cabo las operaciones de selección, calibrado y lavado, se introduce la materia prima en los bidones y se adiciona una salmuera que contenga 10% de sal. En estas condiciones se mantiene durante la primera semana. A continuación semanalmente, se añade sal en cantidad suficiente para elevar la concentración de la salmuera en 1% de sal, hasta alcanzar 16% de sal. Se tendrán en cuenta que las natas sobrenadantes presentes en la superficie de la salmuera, constituidas por levaduras oxidativas y mohos, se deben eliminar con periodicidad. Esta práctica evita el el consumo por dichos microorganismos del ácido láctico producido en la fermentación. Durante la fermentación se producen numerosos cambios físicos, químicos y microbiológicos, que se describen a continuación: Cambios físicos. En las primeras 48-72 horas el agua, los azúcares, proteínas, minerales y otras sustancias contenidas en los frutos se difunden por ósmosis a la salmuera. En la salmuera estas sustancias constituirán el alimento de las bacterias productoras de ácido láctico y otros microorganismos. Como consecuencia, el producto pierde peso y se produce en él un arrugamiento. Transcurrido este periodo, la sal comienza a penetrar en los tejidos y con ella se produce la entrada de agua, con la que los frutos ganan peso y vuelven a su situación normal. El cambio de textura de los productos durante la fermentación es el aspecto físico más importante, ésta va a determinar las diferencias cualitativas entre los encurtidos procedentes de producto fermentado y fresco. Cambios químicos. El principal cambio químico consiste en la transformación de los azúcares contenidos en los frutos en ácido láctico debido a la acción microbiana. Aunque el principal producto de la fermentación es el ácido láctico, también producen cantidades inferiores de ácido acético. Otros compuestos que aparecen en menores proporciones son alcoholes y ésteres. En ocasiones, durante la fermentación ácido-láctica se originan cantidades importantes de anhídrido carbónico e hidrógeno. Cambios microbiológicos. Los microorganismos más importantes que intervienen en la fermentación son: bacterias productoras de ácido láctico, bacterias productoras de gases y levaduras. Estos microorganismos están presentes de forma natural en los frutos. Las bacterias 63 productoras de ácido láctico, aunque presentan variaciones estaciónales y de distribución, son siempre las responsables de los mayores cambios en los frutos. Dentro de este grupo se encuentran Leunostoc mesenteroides, que en los primeros momentos de la fermentación predomina sobre el resto, esta bacteria se cultiva sobre medios hipersacarosados produciendo voluminosas cápsulas (dextrano), esta producción se ha empleado en la producción de alimentos de textura más o menos filante o espesa. También están presentes las siguientes especies: Streptococcus faecalis (bacteria homofermentativa, pues su fermentación es de tipo homoláctico, transformando la lactosa en ácido láctico), Pediococcus cerevisiae, un coco muy productor de ácido, cuya actividad microbiológica se incrementa en proporción al tiempo transcurrido, y Lactobacillus brevis, que puede contribuir a la formación de ácido láctico y a su vez es productora de gas. Lactobacillus plantarum es la bacteria más importante a la hora de producir ácido láctico. Dentro del grupo de bacterias productoras de gases tenemos las especies coliformes del género Aerobacter, que se caracterizan por la producción de anhídrido carbónico e hidrógeno. También dentro de este grupo se encuentra Lactobacillus brevis, que es un bacilo productor de gas, pero que en determinadas ocasiones ayuda a la formación de ácido láctico, se trata de una bacteria heterofermentativa que no puede desarrollarse en anaerobiosis con glucosa, porque no es capaz de reducir el acetil-fosfato a etanol. Almacenamiento. Los frutos fermentados pueden ser almacenados si no van a elaborarse inmediatamente. Para ello la concentración de la salmuera se eleva al 20%. La acidez total de la salmuera, expresada en ácido láctico, debe estar por encima del 1%, para lo cual si fuera necesario se añadiría ácido láctico comercial. De esta forma se impide el desarrollo de levaduras que podrían deteriorar el producto fermentado. Fase de producción y envasado. La planta de envasado recibe la materia prima, calibrada y fermentada, para llevar a cabo su procesado. El procedimiento seguido durante esta fase se muestra en el siguiente esquema: 64 Recepción y control de la materia prima. La materia prima es transportada en camiones hasta la planta de envasado, donde se procede al pesado de todos y cada uno de los barriles de plástico que contienen los diferentes productos. A continuación se procederá a la toma de muestras de los productos para determinar si alcanzan o no la calidad requerida por la industria. También se determina el contenido en sal de la salmuera, el pH y la acidez total. Desalado. Los frutos almacenados en salmuera no pueden consumirse directamente. Para poder procesar el producto almacenado, éste debe ser previamente desalado, reduciendo su contenido salino a un nivel aceptable por los consumidores. Se trata de un proceso inverso al de salazón, que consiste en eliminar la sal con agua. 65 Mediante escurrido se elimina la salmuera inicial de los bidones. A continuación se vuelven a llenar de agua y al cabo de unos minutos se escurren nuevamente, alcanzando así los productos una concentración aproximada del 2% de sal. En cada lavado se consumen 25 litros de agua para 100 kg de producto. Lavado. Una vez desalado el producto, se realiza un último y ligero lavado del mismo con agua corriente. Para esta operación se emplea una cinta transportadora, provista en su mitad inicial, de un sistema de aspersores o duchas de baja presión. La segunda parte de la cinta, sin aspersores, completa el escurrido, con objeto de eliminar el exceso de agua de la superficie del producto. Llenado de los envases. Se empleará como único material de envasado el vidrio. Su elección se debe a las siguientes ventajas: Son impermeables al agua, gases, olores, etc. Son inertes. Se pueden someter a tratamientos térmicos. Son transparentes. Realzan el contenido que contienen. Previamente al llenado, el envase debe ser lavado, lo cual se lleva a cabo en una lavadora de frascos dispuesta para tal fin. En primer lugar se vierte el envase y, a continuación, se lanza un chorro de agua caliente, manteniéndose los frascos invertidos para evitar contaminaciones y facilitar el escurrido antes del llenado. Una vez preparada la materia prima para su envasado, es enviada por medio de una banda transportadora a la llenadora-dosificadora, que realiza el llenado de los frascos de manera precisa sin derramar el producto, ni contaminar la zona de cierre. Este hecho es de gran importancia ya que la presencia de pequeñas partículas de producto entre el borde de la tapa y el envase, puede producir problemas en el cierre y, como consecuencia, tener lugar posibles alteraciones de oxidación o de reinfección por microorganismos, con la consiguiente putrefacción. Adición del líquido. La adición del líquido de gobierno cumple entre otros los siguientes objetivos: Mejorar la transferencia de calor a las porciones sólidas del alimento. Desplazar el aire de los envases. Mejorar el sabor y la aceptabilidad del alimento, así como contribuir a su conservación. Actuar como medio de distribución para otros componentes (especias, aditivos, etc.). 66 El preparado consistirá en una disolución al 10% de vinagre puro de vino en agua. Su añadido, a los envases con el producto, se realizará por medio de una dosificadora volumétrica que se alimenta de un depósito en el cual se formula el líquido de gobierno. La máquina permite variar de forma automática e independiente el volumen a dosificar. La temperatura del líquido en el momento de su incorporación será de unos 85 ºC. Cerrado. Si los envases se cerraran a presión atmosférica, difícilmente resistirían la presión interna producida durante el tratamiento térmico. Por tanto, es necesario expulsar el aire del espacio de cabeza reservado y producir un vacío parcial. Esto se consigue con una temperatura elevada del líquido de gobierno. De esta forma, también se reduce la cantidad de oxígeno disponible que acarrearía la corrosión, la destrucción de vitaminas y la decoloración del producto. Para esta operación se empleará una cerradora de tapas de rosca. Tratamiento térmico. El pH influye considerablemente en la temperatura y el tiempo de tratamiento, condiciones que definen el procesado térmico, para obtener un producto aceptable. Los ácidos ejercen un efecto inhibidor sobre los microorganismos. Por tanto, en productos muy ácidos con pH < 3.7 no se multiplican las bacterias, solo los hongos y bastaría con un tratamiento térmico consistente en un proceso de pasteurización. El tratamiento térmico se llevará a cabo en un túnel de pasteurizado, con duchas de agua caliente a la entrada y fría a la salida, para evitar roturas en los envases. Una vez concluido el proceso de pasteurización, se enfrían los envases paulatinamente, evitando un cambio térmico brusco que pueda aumentar la fatiga de los envases por sobrepresiones. La temperatura final de enfriamiento será de unos 38 ºC, para que el calor residual ayude a secar los envases, con lo que se evita la corrosión y se contribuye a evitar la recontaminación. A continuación del túnel de pasteurizado y como una extensión del mismo, se instalará un túnel de secado por chorros de aire. Su función será eliminar completamente las gotas de agua existentes en los envases, elemento antiestético de cara a su posterior comercialización. Etiquetado. El etiquetado se realizará una vez llevado a cabo el marcado de las tapas de los envases. Para esta operación se empleará una etiquetadora lineal automática autoadhesiva, dotada de dos cabezales para practicar, según las circunstancias, etiquetado simple o doble. Embalaje. A la salida de la etiquetadora una mesa de acumulación recoge los envases marcados y etiquetados listos para su embalado y expedición. Como consecuencia de las diversas formas de embalaje demandadas, así como los distintos destinos de producción se llevará a cabo el embalado de dos maneras diferentes. Desde la mesa de acumulación 67 se instalarán dos líneas de embalado, una en cajas de cartón y otra en bandejas, también de cartón, retractiladas. Embalado en cajas de cartón. En una mesa empaquetadora con plegadora de solapas inferiores, un operario forma la parte inferior de la caja, para posteriormente proceder al llenado de la misma con los envases de la mesa de acumulación. Finalizada esta operación, la caja es introducida manualmente en la precintadora, ubicada a continuación, que lleva a cabo el precintado simultáneo por la parte superior e inferior con un mecanismo de cerrado automático de solapas superiores. Embalado en bandejas de cartón retractiladas. Una vez formada la bandeja, se procede al llenado de la misma en una mesa de embalaje, situada junto a la mesa de acumulación de los envases procedentes de la etiquetadora. Seguidamente la bandeja es conducida por medio de un transportador de rodillos a la retractiladora. A la entrada del túnel de retractilado, una empaquetadora realiza el estuche del film plástico que envuelve la bandeja, que es empujada automáticamente al túnel para su termoretracción. Paletizado. Se trata de la última operación de todo el proceso, a partir de la cual el producto está preparado para su expedición. El paletizado se realizará de forma manual con las cajas o bandejas procedentes de las respectivas líneas de embalado. Después de situar aquellas en el palet, se practicará un enfardado como elemento de seguridad, que en el caso de ser insuficiente se reforzará mediante flejes a ambos lados. Almacenamiento. Las dependencias para el almacenamiento de los encurtidos elaborados, por sus especiales características, no precisan de un importante acondicionamiento. Para mantener los elaborados durante el periodo de almacenamiento en condiciones adecuadas que garanticen su calidad, se llevarán a cabo las siguientes recomendaciones: o Evitar la exposición prolongada de los productos a la luz solar directa, principal causa de la aparición de decoloraciones. o Mantener la temperatura ambiental por debajo de los 25 ºC, evitando así el efecto de cocido y de ablandamiento del producto y, por tanto, la aceleración de la oxidación. o Almacenar los palets colocando unos junto a otros, sin realizar ningún tipo de apilado que pueda dar lugar a la rotura de envases, deformaciones en las tapas, etc. o Realizar controles periódicos del tiempo y de la temperatura de almacenamiento, de la evolución de la calidad, estado de los palets, etc. 68 La adopción de estas medidas es imprescindible para una buena conservación de los encurtidos. Se trata de productos de duración media superior a dieciocho meses, que en condiciones adecuadas pueden permanecer varios años en perfecto estado de consumo. La producción procesada al cabo de una semana deberá permanecer en almacén hasta su distribución, operación que se realizará, generalmente con periodicidad semanal. Elaboración de repollo fermentado. De las hortalizas fermentadas, el chucrut es la que más está en boca de todos. Si bien se lo asocia con los alemanes (curiosamente junto a las salchichas de Viena, que deberían ser austríacas) a tal punto que en muchas regiones se los apoda con este nombre, la técnica de elaboración se remonta prácticamente al origen de la horticultura, o al menos, al origen de la domesticación de los repollos. Plino, quien describe los hábitos de vida del Imperio Romano, ya narra el procedimiento mediante el cual se mantenía fresco el repollo en los largos viajes. Se utilizaban coles de las costas de la península itálica que se comprimían con el agregado de sal en vasijas (limpias y secas). También cita la costumbre romana de conservar olivas en salmuera. Este proceso, en el que se agregaban especias, se denominaba "compositus". Bajo este nombre se difundió la elaboración del chucrut en Europa central en el siglo 11. El tiempo trasladó el nombre de compositus a compost y composta, dos términos relacionados con la huerta pero con significados bien distintos. Sin embargo, habían sido los chinos los primeros en hacer fermentar el repollo (como también el arroz y la soja). La fermentación láctica (ahora redescubierta por la industria alimenticia en las leches cultivadas y otros brebajes del rubro, con rimbombantes nombres científicos y un apoyo publicitario espectacular), es de todos los procesos de fermentación en los que intervienen ácidos orgánicos, el que más inhibe el desarrollo de microorganismos. Esta propiedad, junto a su capacidad de facilitar el acceso a nutrientes de alto valor biológico en épocas de escasez, justifican la importancia que ha tenido en la cultura alimentaria de casi todo el mundo. Sigue siendo hoy día una técnica sencilla para producir y conservar alimentos nutracéuticos que son la principal fuente de vitamina C, y encimas de muchos pueblos. El proceso de conserva no es muy diferente al de los modernos silos húmedos (esos chorizos grandotes de plástico blanco que se ven por doquier en el campo) en los 69 que se conserva, enriquece y predigiere el forraje almacenado para vacas u otros animales. La versión "Fast food" de picar un poquito de repollo y agregarle limón o vinagre antes de hervirlo, puede ser una rápida solución culinaria pero no puede ser considerada ni siquiera un sustituto del proceso de fermentación natural. Ilustración: Chucrutera Dr. Kuhl: pesa adaptada al recipiente, canaleta superiror que se llena con agua hervida y en la que calza la tapa para un cierre hermético. Con esta técnica se puede reducir el uso de sal a 3 g. por Kg. de hortaliza fresca. La sal es un componente fundamental para el buen desarrollo de la conserva. El contenido de proteínas de las hortalizas favorece su descomposición, sobre todo en contacto con el aire. El agregado de sal inhibe este proceso, hasta que la fermentación genere el suficiente ácido láctico que actúa luego como un conservante natural. Se sugiere el uso de sal natural o marina (asegúrese que realmente lo sea, busque un proveedor confiable) ya que la sal de mesa puede tener aditivos que enturbien el "Compositus", si bien no lo harán indigesto. Los romanos no se medían la presión sanguínea y los alemanes del medioevo tal vez hayan vivido con menos stress, por lo que utilizaban 10 gramos de sal por kg. de hortaliza. Así como muchos horticultores abusan de los agroquímicos para asegurarse una buena cosecha, estos conservadores querían estar seguros de su producción. Hoy día se usan unos 5 g. por Kg. de hortaliza fresca, y si se tiene especial cuidado en la higiene y la "cancha" necesaria, se puede llegar a 3 g. por Kg. para acelerar el inicio de la fermentación, sobre todo en clima frío, puede agregarse un poco de suero de manteca, que se obtiene batiendo un pote de crema hasta que se corte la misma y se separa en suero y manteca. También podría agregarse algo del jugo de chucrut de una fermentación anterior. Material y equipo utilizado. Utilizamos un jarro, balde, vasija o barril, pudiendo ser de vidrio, cerámica o madera de una capacidad mínima de cinco litros. Si va a utilizar plástico, asegúrese de que esté apto para alimentos y en especial para ácidos, y que no esté contaminado con ningún tipo de residuos tóxicos. Jamás utilice envases metálicos o que hayan contenido detergentes, agrotóxicos u otro tipo de sustancias químicas de uso industrial, ni envases plásticos de baja calidad. La limpieza es fundamental. Llenamos el recipiente el día anterior con agua para remojarlo. Luego lo lavamos con jabón neutro y enjuagamos 70 reiteradas veces con agua caliente. Finalmente lo llenamos con agua y un veinte porciento de vinagre común, para desinfectarlo. Lavamos muy bien un repasador o un paño de tela natural cruda (sin teñir), un plato de loza o madera y una piedra que calcen en el envase y sirvan como pesa. Los colocamos en el recipiente para que también entren en contacto con el agua con vinagre. Recuerde que en toda preparación de alimentos, nuestro lugar de elaboración y los utensilios estarán perfectamente limpios y secos, al igual que nuestras ropas y manos. El cuchillo, bien afilado. Procedimiento. Para llenar un recipiente de 5 litros, necesitamos unos 3,5 kg. de repollo. Elegimos piezas bien armadas y jugosas. Las lavamos bien con agua potable y le recortamos las partes dañadas. Partimos el repollo en dos para extraer el corazón, que suele demasiado duro (si llegara a estar sobremaduro o feo, descarte la planta). Con la cuchilla y sobre tabla cortamos el repollo en tiritas finas. Se puede utilizar una multiprocesadora o la cuchilla de un rallador, aunque los trozos no queden tan elegantes. A medida que vamos cortando, colocamos las tiritas en una palangana y les agregamos unos 3 a 5 gr. de sal por Kg de repollo. Condimentamos a gusto (tenga presente que la fermentación resalta el sabor de algunas especias, úsese con moderación): laurel, trocitos de cebolla, rebanaditas de zanahoria, gajos de manzana (sin semillas), semillas de eneldo y alcarabea (Kümmel). Es conveniente hervir las cebollas diez minutos, antes de utilizarlas. Mezclamos bien todo y apisonamos con la ayuda de un pisón de madera (bien limpio) del tipo que se utilizan en morteros, u otra herramienta similar. Vaciamos el recipiente (el agua con vinagre se descarta) y colocamos una capa de unos cinco centímetros del repollo picado y sazonado. Apretamos bien el repollo dentro del envase con el pisón (o con el puño limpio), para que comience a soltar el jugo. Agregamos otra capa y repetimos la operación, hasta llenar el envase unos diez centímetros debajo de su borde. Es fundamental comprimir bien el repollo. Estrujamos bien el paño o repasador y lo colocamos sobre la boca del recipiente. Luego ponemos el plato en el centro y finalmente la piedra (un adoquín por ejemplo). Tapamos el envase lo mejor posible, por ejemplo con una bolsa plástica apta para alimentos, para que no entren impurezas y lo depositamos en un lugar limpio. Fermentación: Las levaduras y los bacilos que producen la fermentación láctica están presentes en el ambiente. Si no, no se cortaría la leche. La velocidad del proceso de fermentación dependerá de la temperatura ambiente. a 16 grados centígrados demorará unas seis semanas, a 18 grados, cinco, a 21, cuatro y a 24 grados, lo que se considera la temperatura ideal, unas tres semanas. A mayor temperatura se corre el riesgo de que se descomponga antes de acumular suficiente acidez que conserve el alimento. A temperatura muy baja, el proceso es demasiado lento y puede producir el mismo resultado. En ambos extremos es conveniente agregar un poco de suero de manteca, como ya se describió. 71 La temperatura ambiente de su lugar de depósito, además de la disponibilidad de hortalizas, serán entonces los condicionantes para la elaboración de hortalizas ácidas. En el Sur de la Argentina, esto se realizará en verano, en el Norte en invierno y en regiones moderadas, al inicio de la primavera o otoño. Unas seis horas después de rellenado el recipiente, el repollo debe haber liberado suficiente jugo como para quedar cubierto de líquido al menos un centímetro. Si no hay líquido suficiente, hervir agua con sal (15 g. de sal por litro de agua), dejarla enfriar y agregar hasta llevar al nivel indicado. Agregar también un poco de suero de manteca, para favorecer la fermentación. Para evitar esto, la selección de repollos con alto contenido de humedad y el buen machacado inicial son fundamentales. Mientras las hortalizas fermentan, va ascendiendo espuma en el recipiente. Este proceso dura entre una y dos semanas. Deberá quitar la espuma con una espumadera bien limpia a diario. Cuando termina la fermentación (ya no se forma más espuma), se sacan todos los pedacitos turbios con la espumadera, hasta que el repollo quede cubierto sólo por el jugo transparente. Almacenado: Las hortalizas fermentadas deben almacenarse en un lugar fresco, sin calefacción ni excesiva temperatura. Si no poseemos un lugar con estas condiciones, esperamos el tiempo de elaboración necesario como se indicó más arriba y se prueba el preparado. Si ya tiene un grado de acidez intenso, se procede a remover toda la capa superior (si ésta está turbia o "babosa"). Se envasa el chucrut (u otras hortalizas) junto con el jugo en vasos de vidrio para conserva, se cierran bien, se colocan en una cacerola con agua (que los tape completamente 5 cm.) y se cocinan durante 30 minutos a 85 grados centígrados. Luego se sacan y se dejan enfriar y se guardan como cualquier otra conserva, en un lugar oscuro. Es conveniente envasar en recipientes del tamaño de la porción que se empleará en una sola comida. Si se conserva en el envase original, para utilizar una porción, ésta se saca con una pinza de acero inoxidable u otra herramienta bien limpia. Ni bien se forma una baba (levaduras) en el paño que recubre el encurtido, se debe quitar, lavar bien, lavar bien el plato y la piedra, hervir el paño en agua con vinagre y volver a colocar todo en su lugar. Notas. Algunas hortalizas, en particular las chauchas, deben hervirse ya que poseen alcaloides que se transforman en cianuros tóxicos y sólo se destruyen al hervirlos antes de su consumo. Recuerde siempre recubrir a las hortalizas con agua hervida con sal y suero de manteca, si luego de unas horas de preparado, no liberaron suficiente jugo, para asegurarse la acidez necesaria, sobre todo en hortalizas como los pimientos y las cebollas. El sabor de estos alimentos deberá ser siempre ácido, lo cual es un indicador de su buen estado de conservación. Si el líquido se tornara turbio y perdiera su acidez, el alimento puede deteriorarse y no debe ser utilizado. En su conservación en el envase 72 original, las hortalizas nunca deben quedar fuera del jugo. En contacto con el aire del ambiente, pueden contaminarse con hongos y levaduras que iniciarán un proceso de alcalinización, con el consiguiente riesgo de intoxicación por salmonelas. Por este motivo, se descarta generalmente la capa superior y se utiliza el plato con el paño y la pesa. 73 UNIDAD 7 B I O M A S A INTRODUCCIÓN. La vegetación empleada para energía puede llegar a ser uno de los combustibles más importantes en el futuro. En los próximos veinte años podría suministrar un octavo del presupuesto energético mundial. Una gran variedad de desechos agrícolas y madereros y de cultivos energéticos, simbolizados por el campo de maíz, pueden transformarse para suministrar una gama de combustibles para el transporte, o pueden ser quemados para generar electricidad. Un ejemplo de esto es la conversión de las astillas de madera en un gas rico en metano. Al igual que los combustibles fósiles, este gas puede quemarse en centrales eléctricas eficientes que maximicen el contenido energético del combustible, generando electricidad al mismo tiempo que utilizan el calor sobrante. La utilización de la biomasa es tan antigua como el descubrimiento y el empleo del fuego para calentarse y preparar alimentos, utilizando la leña. Aún hoy, la biomasa es la principal fuente de energía para usos domésticos empleada por más de 2.500 millones de personas en el Tercer Mundo. La combustión de la biomasa es contaminante. En el caso de la incineración de basuras, tal y como se viene haciendo con los residuos urbanos en la mayoría de las ciudades europeas y norteamericanas, la combustión emite a la atmósfera contaminantes, algunos de ellos cancerígenos, como las dioxinas. El reciclaje y la reutilización de los residuos permitirá mejorar el medio ambiente, ahorrando importantes cantidades de energía y de materias primas, a la vez que se trata de suprimir la generación de residuos tóxicos y de reducir los envases. Biomasa es la abreviatura de masa biológica, cantidad de materia viva producida en un área determinada de la superficie terrestre, o por organismos de un tipo específico. El término es utilizado con mayor frecuencia en las discusiones relativas a la energía de biomasa, es decir, al combustible energético que se obtiene directa o indirectamente de recursos biológicos. La energía de biomasa que procede de la madera, residuos agrícolas y estiércol, continúa siendo la fuente principal de energía de las zonas en desarrollo. En algunos casos también es el recurso económico más importante, como en Brasil, donde la caña de azúcar se transforma en etanol, y en la provincia de Sichuán, en China, donde se obtiene gas a partir de estiércol. Existen varios proyectos de investigación que pretenden conseguir un desarrollo mayor de la energía de biomasa, sin embargo, la rivalidad económica que plantea con el petróleo es responsable de que dichos esfuerzos se hallen aún en una fase temprana de desarrollo. Los combustibles derivados de la biomasa abarcan varias formas diferentes, entre ellas los combustibles de alcohol (mencionados antes en este artículo), el estiércol y la leña. La leña y el estiércol siguen siendo combustibles importantes en algunos países en vías de desarrollo, y los elevados precios del petróleo han hecho que los países industrializados vuelvan a interesarse por la leña. Por ejemplo, se calcula que casi la mitad de las viviendas de Vermont (Estados Unidos) se calientan parcialmente con leña. 74 Los científicos están dedicando cada vez más atención a la explotación de plantas energéticas, aunque existe cierta preocupación de que si se recurre a gran escala a la agricultura para obtener energía podrían subir los precios de los alimentos. En España actualmente el potencial energético de la biomasa asciende a 37 Mtep, pero tal cifra incluye 19,6 Mtep de cultivos energéticos y 3,8 Mtep de residuos forestales y agrícolas. La producción de biocombustibles y un uso energético excesivo de los residuos forestales y agrícolas no es deseable, dadas sus repercusiones sobre la diversidad biológica, los suelos y el ciclo hidrológico, sin olvidar que lo más importante es producir alimentos, y no biocombustibles para los automóviles privados. El objetivo de alcanzar las 4,2Mtep en el 2.005 en la práctica supone duplicar el consumo oficial de biomasa. La obtención de biogás en digestores a partir de residuos ganaderos reducirá las emisiones de metano, y debe ser promocionada, con el fin de reducir la contaminación, obtener fertilizantes y producir energía. BIOMASA ( MASA CELULAR) . Producción microbiana bruta obtenida por fermentación a partir de levaduras, bacterias, mohos y algas. En algunos casos puede ingerirse directamente y en otras debe ser sometida a una purificación mas o menos intensa. Este concepto ésta próximo al de proteínas unicelulares “SIGLE CELL PROTEINS “. Los microorganismos como alimento del hombre y de los animales. En instalaciones biotecnológicas a gran escala y mediante numerosos procesos pueden cultivarse grandes cantidades de microorganismos. Sirven como alimento de alto valor proteico, por ejemplo, el cultivo de hongos (principalmente champiñones), como complemento en la alimentación o como material de partida para la obtención de grasas o de otras sustancias celulares útiles. Los microorganismos se emplean también para la obtención de enzimas y saborizantes para la industria alimentaría. Por ejemplo, se utilizan amilasas e invertasas en las industrias de panadería y pastelería y ácido glutámico y nucleósidos como sustancias aromatizantes en la industria conservera. Utilidad en la alimentación animal y humana. La principal demanda actual y sobre todo futura de proteína rnicrobiana «single cefl protein», S.C.P., Proviene del sector de la industria de los piensos. Las fuentes principales de proteínas vegetales son las tortas de soja con un 45 % de proteínas y las tortas de semillas oleaginosas de algodón y girasol con cerca del 41 % de proteínas. También se emplean como suplemento proteico harinas de pescado y de carne y leche desnatada en polvo con contenidos de proteína del 66,50 y 3 5 % respectivamente. 75 Pero en la calidad nutritiva de los microorganismos no sólo son decisivos el contenido de proteína y la composición de aminoácidos sino también la digestibilidad y la tolerancia. Mientras que la digestibilidad depende, entre otros factores, del grosor y composición dé la pared celular, en la tolerancia es especialmente importante el contenido de sustancias tóxicas o nocivas para el metabolismo. Las posibilidades de utilizar las proteínas monocelulares se ven reducidas en primer lugar por el contenido de ácidos nucleicos (ácidos ribo y desoxirribonucleico), puesto que si éste es alto se produce un gran acúmulo de metabolitos finales como bases púricas y pirimidínicas y ácido úrico. Dado que ni los mamíferos ni el hombre son capaces de sintetizar por sí mismos ocho aminoácidos a partir de los alimentos, se ven obligados a ingerir ciertas cantidades mínimas de dichos «aminoácidos esenciales». En la siguiente Tabla se muestran algunos de los aminoácidos más importantes. Tabla.- Composición de los piensos concentrados microbianos , animales y vegetales y necesidades humanas de aminoacidos esenciales. Levaduras a partir de parafinas Proteína bruta Grasa bruta Minerales Aminoácidos esenciales Leucina Lisina Valina Fenilalanina Y tirosina Isoleucina Treonina Metionina Y cistina Triptófano Bacterias a partir de metanol Harina de Pescado Triturados de soja Necesidades humanas g. 66.2 9.0 6.0 78.1 4.9 11.5 66.2 8.1 15.5 45.0 1.0 5.7 70 - 90 4.2 4.2 3.2 4.9 4.3 3.8 5.0 4.9 3.7 3.4 2.8 2.3 7.2 4.9 4.6 4.7 2.7 2.9 4.8 3.0 3.3 5.2 3.0 3.0 3.8 2.2 1.9 4.2 3.9 3.3 1.8 0.8 2.4 0.6 2.6 0.9 1.3 0.6 2.7 1.1 Los microorganismos, por ser células de crecimiento rápido, tienen un mayor contenido de ácidos nucleicos que las células animales y vegetales de los alimentos. Para las necesidades humanas sólo se contempla la posibilidad de utilizar como alimento las levaduras en forma de suspensión, pasta o polvo seco. Su alto contenido de vitaminas (coenzimas) del complejo B las hace especialmente apropiadas para la terapéutica dietética de convalecientes con una gran necesidad de vitaminas. 76 MATERIAS PRIMAS Y MÉTODOS DE PRODUCCIÓN. Cultivo de biomasa bacteriana en metanol. El metanol tiene ventajas decisivas como sustrato si se le compara con los hidrocarburos gaseosos y líquidos. Es hidrosoluble y evita los problemas de reparto que se presentan cuando existe una fase insoluble en agua y los de formación de mezclas gaseosas explosivas. Además, su obtención a partir de muchas materias primas, sobre todo carbón, gas natural y petróleo es fácil quimiotécnicamente y económicamente posible. Es fácil de purificar, su degradación microbiana tiene un calor de reacción bajo y necesita por ello una menor refrigeración que los hidrocarburos. Los compuestos C, metanol y formaldehído son tóxicos para la mayoría de los organismos con excepción de algunas levaduras como Candida spp. y bacterias como algunas especies del género Methylomonas y algunas Pseudomonas spp. Los organismos citados disponen de dos rutas especiales para incorporarlos compuestos C, como metano, metanol, formaldehído y formiato a su metabolismo y utilizarlos como sustrato: adicionarlos a la ribulosamonofosfato o a la glicina ( reacciones). Para obtener proteínas a partir de metanol se seleccionó una cepa de Pseudomonas methylotropha de crecimiento rápido y buena calidad proteica y se ensayó a gran escala. Su ventaja sobre las levaduras radica en su mayor contenido de proteína (85 %), un tiempo de generación menor, de dos horas, así como una concentración de producto de 30 g – L. de peso celular seco. El elevado aporte de oxígeno necesario se consiguió con un fermentador cíclico que funciona por aire a presión distribuido homogéneamente. El cultivo bacteriano, colocado en un tubo ascendente ancho que se estrecha hacia arriba, se airea intensamente con aire estéril a presión distribuido homogéneamente que se introduce por la parte inferior y que se mezcla con burbujas que ocupan un 50 % del volumen, con lo que el cultivo se ve empujado hacia arriba. Un filtro para la espuma situado en la parte superior facilita la separación del aire y del medio de cultivo. Al tiempo que se elimina el aire efluente, el cultivo fluye por un tubo horizontal hacia un tubo descendente, donde es impelido nuevamente por aire a presión y transportado hacia abajo. Por el extremo superior del tubo ascendente se extrae el cultivo bacteriano que se haya desarrollado. 77 Diagrama. Fermentador continuo con aire a presión para la obtención de biomasa. LEVADURA: PANIFICACIÓN. Cultivo de Levaduras. Las levaduras pueden cultivarse biotecnológicamente en sustratos que contengan hidratos de carbono de muy distinta procedencia, en alcoholes y en n-parafinas. Los sustratos que contienen almidón y celulosa se degradan primero por hidrólisis química en mono y disacáridos utilizables, mientras que otros sustratos como melazas, pulpas de cítricos y distintas aguas residuales pueden emplearse sin hidrólisis previa. Muchos sustratos, como los hidrolizados de madera, los residuos de lejías sulfíticas y otros residuos vegetales tratados contienen, además de hexosas, pentosas, que no pueden ser utilizadas por Saccharomyces pero si por Candida y Torula, Sobre todo las cepas de Candida tienen múltiples aplicaciones porque pueden utilizar la mayoría de los sustratos. El rendimiento celular por kg. de sustrato empleado depende del contenido energético y de la concentración del sustrato, así como de su coeficiente de asimilación, es decir, la parte de él asimilada como nutriente. Esta se ve influenciada a su vez por las condiciones del cultivo, especialmente la temperatura, la intensidad de la aireación, la concentración de nutriente y él pH y además por la presencia de sustancias inhibidoras del crecimiento. 78 Cuando la aireación de los fermentadores con sustratos azucarados no se lleva a cabo con la suficiente intensidad, parte del azúcar fermenta a alcohol, es decir, no se oxida totalmente. Pero como los rendimientos máximos sólo son posibles cuando la oxidación es completa, hay que suprimir la fermentación con una aireación intensiva. Esta desviación del metabolismo dependiendo de la disponibilidad de oxígeno de la fermentación hacia la respiración ya había sido observada por Louis Pasteur y se conoce como «efecto Pasteur». La mayoría de las veces se trabaja en proceso continuo. A 30 °C y pH 5.0 el consumo de oxígeno asciende en un tiempo de generación de 5 horas a 2,2 kg. por kg. de levadura. Pero hay que airear más intensamente porque sólo se utiliza un 30 % del oxígeno disponible para la producción de biomasa. Además, la adición de pequeñas cantidades de ozono de hasta un 1,5 % en volumen estimula la respiración y el crecimiento de la levadura y es a la vez letal para posibles bacterias y virus contaminantes. Las n-parafinas que van llegando al sistema se transforman totalmente en C02, H20, calor y masa celular, de manera que no es necesario ningún tipo de purificación especial del Cultivo efluente.. Las células se separan por centrifugación y se desecan. Levadura en la panificación. La levadura que hemos añadido a la masa debe mantenerse viva para hacer su función. La energía necesaria para la actividad celular la obtiene a partir de los azúcares libres presentes en la masa, preferiblemente glucosa. Se consumen primero los que ya aporta la harina y que provienen del grano de trigo. Después, debe ponerse en marcha una compleja maquinaria bioquímica: la amilolisis. Teniendo en cuenta los niveles de temperatura a los que se realizan las distintas operaciones de la panificación, podemos distinguir tres fases: 1. Amasado y fermentación. 2. Cocción. 3. Enfriamiento y almacenamiento. Maltosa formada y fermentación de la masa La maltosa es la fracción más importante de la fracción de bajo peso molecular, producto de la amilolisis. Una vez transportada al interior de las células de levadura, puede ser desdoblada en dos moléculas de glucosa, materia prima básica para la fermentación alcohólica que produce el dióxido de carbono –o gas carbónico–, necesario para el desarrollo de la masa. Su comportamiento químico es éste: C12H22O11+H2O –––>2 C6H12O6 Maltosa Agua Glucosa C6H12O6––>2 CH3 – CH2–OH + 2 CO2 Glucosa Etanol Dióxido de carbono 79 C12H22O11 + H2O –––> 2 C6H12O6 Maltosa Agua Glucosa C6H12O6 ––> 2 CH3 –CH2 – OH + 2 CO2 Glucosa Etanol Dióxido de carbono La producción de CO2 es, pues, proporcional a la velocidad de formación de maltosa por las amilasas. La cocción del pan se produce a una temperatura de unos 250º C y en presencia de vapor de agua, siendo una etapa tan importante como la fermentación. El aumento de temperatura de la masa se produce de manera gradual desde el exterior hacia el interior de la pieza. Como en toda reacción química, el aumento de la temperatura supone una aceleración de las diferentes reacciones que constituyen la amilolisis. La existencia de un gradiente de temperatura entre la superficie y el corazón de la pieza añade un efecto de progresividad de los fenómenos que ocurren con el incremento de la temperatura. Primero se forma una fina película en la superficie, que se mantienen flexible gracias al vapor de agua condensado sobre la misma. Por dilatación de los gases que contiene, aumenta mucho el crecimiento de la masa . Además, las actividades vitales de la levadura sufren también el efecto del aumento de temperatura, acelerándose la producción de carbónico y alcohol. Cuando el interior de la pieza alcanza los 65º C, los gránulos de almidón sufren un violento hinchamiento acompañado de una salida de amilosa, precisamente cuando la actividad de las amilasas es máxima. Sin embargo, las enzimas, como cualquier proteína, son sensibles al calor. Cuando se alcanzan los 70º C, la beta-amilasa y la amilasa fúngica añadida, quedan inactivadas. La alfa-amilasa natural resiste hasta los 80º C. El efecto final de la amilolisis en esta fase, está directamente ligado a la cinética térmica interior de la pieza –la velocidad con que aumenta la temperatura en su interior–, y al tipo de alfa-amilasa (natural o añadida; entre éstas, fúngica o bacteriana). La alfa-amilasas fúngicas se inactivan antes de la gelificación total del almidón, con lo que su efecto en la cocción es mucho menor que el de las naturales o las microbianas. Los mejores resultados tecnológicos se obtienen cuando existe un equilibrio ente alfa y beta amilasa. APLICACIONES. Cultivo de Bacterias. Debido a las dificultades para separar las pequeñas células bacterianas del medio de cultivo y por su alto contenido en ácidos nucleicos, hasta ahora se ha empleado poco la biornasa bacteriana como suplemento proteico. 80 Un método de aprovechamiento de residuos vegetales que contengan celulosa para la obtención de proteínas, consiste en degradar dichos residuo con un cultivo mixto de bacterias y levaduras. Obtención y aprovechamiento de grasas microbianas. Muchas levaduras, mohos, bacterias y algas sintetizan y almacenan, en condiciones adecuadas de cultivo, entre el 25 y el 70 % de su peso celular seco en forma de grasas. Las necesidades nutricionales humanas se cubren actualmente de manera exclusiva con las grasas animales y vegetales, más baratas. Además, las grasas y ácidos grasos técnicos, que se obtienen de los vegetales por ejemplo para fabricación de detergentes estará también al alcance de la síntesis biotecnológicas con microorganismos. Además de las parafinas también son adecuados para la obtención de grasas los sustratos azucarados principalmente. De las levaduras son especialmente adecuadas las especies de Rhodotorula, Candida, Lipomyces y Endomyces; de los mohos las especies de Mucor, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus y Fusarium Entre las bacterias son buenas formadoras de grasas algunas cepas de Streptococcus, Enterobacter, Bacillus y Mycobacterium. Además de la selección de las cepas adecuadas, son importantes sobre todo los sustratos pobres en nitrógeno y fósforo para que haya un almacenamiento importante de grasas en la célula microbiana. Por ello en muchas levaduras la mejor síntesis de grasas se consigue cuando el medio de cultivo tiene un contenido de nitrógeno de un 50 –70 % por debajo del contenido óptimo. También en este caso los medios de cultivo tienen que ser ricos en azúcares pero pobres en nitrógeno y fósforo. Se ha comprobado que resulta ventajoso que la relación C:N en el medio de cultivo sea 66:1. Las algas unicelulares fotosintéticas también pueden llevar a cabo una gran producción de grasas sí se les suministra sólo una pequeña parte de sales nutritivas nitrogenadas (como máxirno 1 % del medio de cultivo). Especialmente el alga verde Chlorella pyrenoídosa pueden almacenar un máximo de 70-80 % de su peso seco como grasa respectivamente. Cultivo del Champiñón. Se empezaron a cultivar sobre todo Agaricus bisporus y A. bitorquis Ambos están estrechamente emparentados con el champiñón silvestre, A. campestris. A modo de experimento se cultivó también A. arvensis que forma un cuerpo fructífero de mayor tamaño. A. bitoquis crece en todos los climas bajo el asfalto de las calles atravesándolo al formar el cuerpo fructífero por lo que se denomina “ champiñón de calle “ 81 Las especies de Agaricus crecen sobretodo en los suelos de prados y bosques descomponiéndolos y aprovechando los componentes del humus. Para los cultivos sean productivos necesitan compost o estiércol en descomposición ricos en nitrógeno. Vitaminas. Algunas vitaminas se obtienen por medio de la biomasa, la mayoría de estas vitaminas son necesarias para la actuación de determinados enzimas, ya que funcionan como coenzimas que intervienen en distintas rutas metabólicas y , por ello, una deficiencia en una vitamina puede originar importantes defectos metabólicos, como puede verse en la tabla adjunta: VITAMINAS FUNCIONES C (ácido ascórbico) Coenzima de algunas peptidasas. Interviene en la síntesis de colágeno Coenzima de las descarboxilasas y de las enzima que transfieren grupos aldehídos B1 (tiamina) B2 (riboflavina) Constituyente de los coenzimas FAD y FMN B3 (ácido pantotinico) B5 (niacina) Constituyente de la CoA Constituyente de las coenzimas NAD y NADP Interviene en las reacciones de transferencia de B6 ( piridoxina) grupos aminos. B12 Coenzima en la transferencia de grupos metilo. (cobalamina) Coenzima de las enzimas que transfieren grupos Biotina carboxilo, en metabolismo de aminoácidos. Enfermedades carenciales Escorbuto Beriberi Dermatitis y lesiones en las mucosas Fatiga y trastornos del sueqo Pelagra Depresisn, anemia Anemia perniciosa Fatiga, dermatitis... 82 UNIDAD VIII. ENZIMAS MICROBIANAS Y PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS. INTRODUCCIÓN. Las enzimas, en griego in ferment, son biocatalizadores compuestos por una parte proteica llamada apoenzima y una no proteica llamada coenzima. Las enzimas, también denominadas fermentos, son sustancias capaces de acelerar las reacciones bioquímicas del organismo. Están formadas por una proteína unida a una coenzima, sustancia de naturaleza no orgánica que es, a veces, un oligoelemento, imprescindible para el funcionamiento de la enzima, y que suele ser el centro activo de la misma. Casi todas las reacciones químicas de las células son catalizadas por enzimas, con la particularidad de que cada enzima sólo cataliza una reacción, por lo que existirían tantas enzimas como reacciones, y no se consumen en el proceso. Los catalizadores no biológicos son inespecíficos. En una reacción catalizada por enzima (E), los reactivos se denomina sustratos (S), es decir, la sustancia sobre la que actúa la enzima. El sustrato es modificado químicamente y se convierte en uno o más productos (P). Como esta reacción es reversible se expresa de la siguiente manera: La enzima libre se encuentra en la misma forma química al comienzo y al final de la reacción. Especificidad. Las moléculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominado sitio activo, donde, tiene lugar la catálisis. La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus isómeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894) enunció: "El sustrato se adapta al centro activo o catalítico de una enzima como una llave a una cerradura". Clases de enzima. El nombre de las enzimas es el del sustrato + el sufijo: -asa. Los nombres de las enzimas revelan la especificidad de su función: Óxido-reductasas: catalizan reacciones de óxido-reducción, las que implican la ganancia (o reducción) o pérdida de electrones (u oxidación). Las más importantes son las deshidrogenasas y las oxidasas Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molécula a otra. Ej.: quinasas; transfieren fosfatos del ATP a otra molécula. Hidrolasas: rompen varios tipos de enlaces introduciendo radicales -H y -OH. Liasas: adicionan grupos funcionales a los dobles enlaces. Isomerasas: convierten los sustratos isómeros unos en otros. 83 Ligasas o Sintasas: forman diversos tipos de enlaces aprovechando la energía de la ruptura del ATP. Ej: polimerasas Mecanismo de acción de una enzima. Una enzima, por sí misma, no puede llevar a cabo una reacción, su función es modificar la velocidad de la reacción, entendiéndose como tal la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Tal variación se debe a la disminución de la energía de activación Ea; en una reacción química, la Ea es la energía necesaria para convertir los reactivos en formas moleculares inestables denominadas especies en estado de transición, que poseen mayor energía libre que los reactivos y los productos. Una enzima efectúa estas acciones mediante los siguientes pasos: 1. Orienta a los sustratos: parte de la energía de activación se utiliza para que los sustratos roten y se enfrenten con los átomos correctos para formar los enlaces. 2. Agregan cargas a los sustratos: las cadenas laterales (R) de los aminoácidos de las enzimas pueden participar directamente haciendo a los sustratos químicamente más reactivos. 3. Inducen la deformación en el sustrato: cuando una sustancia se une al sitio activo, la enzima puede causar que los enlaces se estiren, poniéndolo en un estado de transición inestable. 4. Cambio de forma de la enzima al unirse al sustrato: el modelo de llave- cerradura de Fisher fue actualizado cuando se descubrió que las enzimas son flexibles y sus sitios activos pueden cambiar (expandirse) para acomodarse a sus sustratos. Este cambio de forma causado por la unión al sustrato se denomina ajuste inducido. 5. En la Hexoquinasa puede observarse este ajuste inducido, con el sustrato (glucosa) y sin él. El ajuste inducido alinea las cadenas laterales reactivas del sitio activo de la enzima con los sustratos. Acompañantes no proteicos de las enzimas. Ya sea que consistan en una única cadena polipeptídica plegada o en varias unidades, muchas enzimas requieren otras moléculas no proteicas para funcionar. COFACTORES: son iones inorgánicos que se unen temporariamente a las enzimas molécula Hierro Fe 2+ o Fe 3+ Cobre, Cu + o Cu 2+ Cinc, Zn2+ papel en la reacción catalizada Oxidación / reducción Oxidación / reducción Ayuda a unir el NAD COENZIMAS: moléculas pequeñas que tiene carbono, interaccionan débilmente durante la catálisis. La mayor parte de las coenzimas son vitaminas, muchas de las cuales deben ser incorporadas con la dieta. molécula papel en la reacción catalizada Biotina transporta -COO- 84 Coenzima A NAD y FAD transporta -CH2-CH3 transportan electrones GRUPOS PROSTETICOS: están permanentemente unidos a las enzimas molécula papel en la reacción catalizada une iones O2 y electrones, contiene el Hemo cofactor hierro Flavina Une electrones Retinal Cofactor en la absorción de la luz Las coenzimas reaccionan con la enzima de igual modo que el sustrato, uniéndose al sitio activo. Se mueven de una enzima a otra agregando o quitando grupos químicos del sustrato. ENZIMAS MICROBIANAS. El Hongo Pleurotus ostreatus. El hongo Pleurotus ostreatus es un basidiomiceto que produce cuerpos fructíferos con forma de concha. Se cultiva a nivel industrial para emplearlo como consumo humano, ya que es un hongo comestible de excelente sabor rico en proteínas y vitaminas. Para el cultivo industrial de Pleurotus ostreatus, se utilizan substratos lignocelulósicos o paja de cereales. El hongo P. ostreatus posee una maquinaria enzimática muy compleja que le permite degradar los grandes polímeros (lignina y celulosa) que componen el substrato. Sin embargo, la forma de nutrición de los hongos implica que la capacidad del hongo para producir enzimas hidrolíticas específicas debido a la presencia de genes específicos, no es suficiente para la eficiente degradación del substrato. Dado que los hongos filamentosos presentan una pared celular rígida exterior a la membrana plasmática, las enzimas hidrolíticas además deben ser secretadas al exterior de la célula, donde degradan los polímeros (lignina y celulosa) para dar lugar a compuestos de bajo peso molecular que puedan ser absorbidos. La secreción de enzimas por hongos filamentosos es un proceso muy relacionado con el crecimiento. Y al igual que éste, la secreción está localizada exclusivamente en los ápices de las hifas. Se han detectado importantes diferencias en la velocidad de crecimiento entre diferentes monocariontes de P. ostreatus, pero se desconoce qué estructuras o procesos son responsables de estas diferencias. Xilanasas. La producción de cultivos de hongos para la producción de celulasas y de hemicelulasas (xilanasas) especialmente para su aplicación en la industria papelera y de la celulosa así como también para la modificación y producción de lignocelulosa. Se obtiene a partir de cultivos de hongo Trichoderma reesei modificados genéticamente que producen mas celulasa que el cultivo original (15 mg celulasa / g micelio/ hora). 85 Amilasas. De un correcto equilibrio en la acción de las alfa y beta amilasas en las harinas y en el proceso de panificación depende el resultado de un pan con una miga bien esponjosa y una corteja rojiza. En este artículo, su autor estudia la forma en que las amilasas actúan en el proceso panario y su interrelación entre ellas. Esta interrelación pone en marcha una compleja maquinaria bioquímica: la amilolisis, que actúa durante el amasado, fermentación y cocción de los productos panarios. Nosotros molemos el grano para aprovechar su harina, y parte de las amilasas quedan en ella. Se distinguen dos tipos de amilasas, que se denominan alfa (a) y beta (b), y cuya acción combinada permite liberar unidades de maltosa, azúcar que se forma por la unión de dos unidades de glucosa. Pero las moléculas de almidón, sistema de reserva de energía de muchos vegetales, en su estado natural se encuentran empaquetadas en unas estructuras denominadas gránulos, cuya forma y tamaño es característica de la especie (trigo, maíz, patata...). La accesibilidad de las amilasas al interior de los gránulos de almidón está limitada, salvo que tengan fisuras por donde penetre el agua. En estos gránulos, muchos de los cuales han sido dañados en la propia molienda, cuando han llegado a un cierto nivel de hidratación, entran las amilasas y empiezan a actuar. Aunque la proporción de gránulos dañados suele ser baja, el efecto combinado de humedad y temperatura produce cambios drásticos en la estructura de los gránulos dañados, que favorecen la amilolisis. Teniendo en cuenta los niveles de temperatura a los que se realizan las distintas operaciones de la panificación, podemos distinguir tres fases: 1. 2. 3. Amasado y fermentación. Cocción. Enfriamiento y almacenamiento. Durante el amasado y la preparación de las piezas, la temperatura se mantiene en torno a 25º C, por lo que la actividad amilolítica es moderada y prácticamente constante. El almidón no sufre mayor alteración física que la hidratación de los gránulos dañados, sobre los que se produce la rápida acción de las amilasas. Sin embargo, los gránulos intactos, son totalmente impermeables a la beta-amilasa, y sólo la alfa-amilasa provocará una hidrólisis lenta. Podemos simplificar el balance de la amilolisis en esta fase: Almidón dañado + Agua + Amilasas ––>Dextrinas + Maltosa + Glucosa La maltosa es la fracción más importante de la fracción de bajo peso molecular, producto de la amilolisis. Una vez transportada al interior de las células de levadura, puede ser desdoblada en dos moléculas de glucosa, materia prima básica para la fermentación alcohólica que produce el dióxido de carbono –o gas carbónico–, necesario para el desarrollo de la masa. Su comportamiento químico es éste: C12H22O11+H2O –––>2 C6H12O6 Maltosa Agua Glucosa 86 C6H12O6––>2 CH3 – CH2–OH + 2 CO2 Glucosa Etanol Dióxido de carbono C12H22O11 + H2O –––> 2 C6H12O6 Maltosa Agua Glucosa C6H12O6 ––> 2 CH3 –CH2 – OH + 2 CO2 Glucosa Etanol Dióxido de carbono La producción de CO2 es, pues, proporcional a la velocidad de formación de maltosa por las amilasas. La producción de maltosa es responsabilidad de la beta-amilasa, bien directamente de las cadenas de amilosa y amilopectina, o a partir de las dextrinas liberadas por las alfa-amilasas. El nivel de beta-amilasa de las harinas es más que suficiente, por lo que su actividad –la intensidad de la producción de maltosa– está, pues, parcialmente condicionada por el nivel de alfa-amilasa existente en la masa. Así, cuando el contenido en amilasa natural de la harina es bajo, se mejora la velocidad de formación de maltosa al añadir amilasa fúngica al inicio del amasado, lo que es práctica habitual ya que la contienen los mejorantes panarios. Las dextrinas no transformadas en maltosa juegan un papel relevante en la retención de agua y en la esponjosidad de la miga. Conforme se va degradando el almidón dañado, parte del agua absorbida por estos gránulos pasa de nuevo a la masa, reduciéndose la consistencia de la misma. Un exceso de dextrinas contribuye a hacer pegajosa la masa. La actividad de las amilasas depende de la temperatura y de la acidez del medio. La cocción del pan se produce a una temperatura de unos 250 ºC y en presencia de vapor de agua, siendo una etapa tan importante como la fermentación. El aumento de temperatura de la masa se produce de manera gradual desde el exterior hacia el interior de la pieza. Como en toda reacción química, el aumento de la temperatura supone una aceleración de las diferentes reacciones que constituyen la amilolisis. La existencia de un gradiente de temperatura entre la superficie y el corazón de la pieza añade un efecto de progresividad de los fenómenos que ocurren con el incremento de la temperatura. Primero se forma una fina película en la superficie, que se mantienen flexible gracias al vapor de agua condensado sobre la misma. Por dilatación de los gases que contiene, aumenta mucho el crecimiento de la masa . Además, las actividades vitales de la levadura sufren también el efecto del aumento de temperatura, acelerándose la producción de carbónico y alcohol. Cuando el interior de la pieza alcanza los 65º C, los gránulos de almidón sufren un violento hinchamiento acompañado de una salida de amilosa, precisamente cuando la actividad de las amilasas es máxima. Sin embargo, las enzimas, como cualquier proteína, son sensibles al calor. Cuando se alcanzan los 70º C, la beta-amilasa y la amilasa fúngica añadida, quedan inactivadas. La alfa-amilasa natural resiste hasta los 80º C. 87 El efecto final de la amilolisis en esta fase, está directamente ligado a la cinética térmica interior de la pieza –la velocidad con que aumenta la temperatura en su interior–, y al tipo de alfa-amilasa (natural o añadida; entre éstas, fúngica o bacteriana). La alfaamilasas fúngicas se inactivan antes de la gelificación total del almidón, con lo que su efecto en la cocción es mucho menor que el de las naturales o las microbianas. Los mejores resultados tecnológicos se obtienen cuando existe un equilibrio ente alfa y beta amilasa. Así, en una harina hiperdiastásica, la actividad de la beta-amilasa es insuficiente para transformar todas las dextrinas presentes, quedando parte que produce pegajosidad de la miga y corteza de color rojizas. Proceso de producción de enzimas y aminoácidos. Introducción. Muchos grupos de investigación en biotecnología alimentaría, han creado tecnologías que permiten el desarrollo de nuevos iniciadores, aminoácidos, enzimas o herramientas de diagnóstico con potencial aplicación en la industria agroalimentaria. Una planta piloto de biotecnología se ha diseñado para generar, a escala piloto, la cantidad suficiente de productos. Algunos de estos se detallan a continuación: o o o o o o o o o Microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) para iniciadores en la industria agroalimentaria. Aditivos alimentarios específicos (enzimas, colorantes, aromas). Herramientas de diagnóstico molecular para la detección de contaminantes microbianos o fraudes en alimentos. Microorganismos probióticos (de utilización en salud, nutrición del consumidor, etc.). Productos farmacéuticos microbianos. Insecticidas microbianos, productos fitosanitarios. Validación de procesos (biosensores). Manejo de los distintos microorganismos usados como iniciadores en la industria alimentaría (bacterias lácticas, levaduras y hongos filamentosos). Producción por vía microbiana de aditivos. o Diseño de métodos de purificación de proteínas a partir de caldos de fermentación. o o o o Adaptación de técnicas moleculares en alimentos. Crecimiento de microorganismos en fermentadores de hasta 50 litros. Optimización de procesos a partir de fermentadores de laboratorio. Manipulación de los caldos de cultivo tanto para la recuperación de células como para la separación de componentes de alto valor añadido. Descripción de una planta productora de enzimas. Vista parcial de una planta piloto: fermentadores de 50 y 25 litros. 88 Se distinguen cinco zonas con funciones bien diferenciadas: 1.- Almacén: Se efectúa la recepción de materias primas, previa cuarentena de aquellas que la precisen. 2.- Laboratorio: Se realizan los controles de calidad de materia prima de acuerdo con la normativa vigente y se preparan las muestras para su tratamiento posterior considerando aspectos microbiológicos, de reproducibilidad de muestras y de seguridad para evitar las contaminaciones. 3.- Zona de producción: En esta zona se realizan los procesos de fermentación y la preparación de las muestras. Fermentadores de 5 y 2 litros 89 4.- Sala de separación: En esta etapa se realiza la recuperación del producto de valor añadido o de interés, biomasa, proteínas, aromas, etc.., mediante la utilización de técnicas de: A. Separación por filtración tangencial B. Liofilización y secado C. Cromatografía líquida 5.- Sistema fermentador: El biorreactor dispone de sensores específicos que permiten la medida y el control "in situ" de las variables de una forma precisa y reproducible. 6.- Cepario: Se permite almacenar los productos obtenidos para garantizar la futura producción y la seguridad. Se realiza la conservación en ultra congelación a - 80 ºC, mediante liofilización. 7.- Controles de calidad: En todas y cada una de las fases del proceso, y al finalizar el mismo, se realizan controles de calidad Variables implicadas: Los microorganismos crecerán a una velocidad característica que depende tanto de la composición del medio de cultivo como de la temperatura, pH, oxígeno suministrado y condiciones de la mezcla. Por este motivo, durante el proceso de producción se controlan mediante los oportunos sensores las siguientes variables: o o o pH temperatura presión parcial de oxígeno 90 o o producción de espumas nivel. AMINOÁCIDOS. Los aminoácidos son moléculas hidrocarbonadas de bajo peso molecular. nitrogenadas simples con cadenas Todos los aminoácidos, a excepción de la glicina, tienen dos formas estructurales o estereoisómeros: L y D. En las proteínas animales todos los aminoácidos presentes pertenecen a la serie L. Sin embargo, en ciertos casos el animal dispone de la capacidad enzimática precisa para aprovechar la forma D, previa transformación a la forma L correspondiente. Así, por ejemplo, para la metionina ambas formas son totalmente disponibles. Para el triptófano la equivalencia está en torno al 90-100% en porcino pero sólo es del 55 al 85% en aves. Los isómeros D de lisina y treonina no son biológicamente activos por lo que no tienen valor para el animal. Lisina, metionina, treonina y triptófano son los aminoácidos actualmente disponibles a precios competitivos para la fabricación de piensos. Como hemos visto, la producción de enzimas y aminoácidos se efectúa a través de un proceso de fermentadores perfectamente controlados, existen diverso tipos de aminoácidos y enzimas que pueden ser sintetizados por este proceso, entre ellos destacan los siguientes: La lisina. La L-Lisina es un aminoácido esencial o constructor la proteínas, que no se puede producir por el cuerpo y se debe obtener de otros alimentos. Ayuda a asegurar la absorción adecuada del calcio y la formación del colágeno para el hueso, el cartílago y el tejido conectivo. La lisina colabora en la producción de anticuerpos, hormonas y enzimas. La lisina fortalece el sistema circulatorio y ayuda al sistema inmune a fabricar anticuerpos. También colabora en el control el equilibrio ácido - alcalino del cuerpo, tiene influencia sobre las glándulas pineal y mamarias así como en la vesícula biliar. Es necesaria para la asimilación de los aminoácidos. Una deficiencia puede dar lugar a sensación de fatiga, falta de concentración , irritabilidad, los ojos rojos, crecimiento retardado, pérdida del pelo, anemia y problemas reproductivos. La lisina libre o pura es altamente higroscópica lo que limita su uso directo en la fabricación de piensos. La forma comercial más frecuente es el monoclorhidrato de Llisina, que se obtiene mediante fermentación oxidativa utilizando una fuente de carbono (azúcar, almidón, melazas, etc) y una fuente de nitrógeno (sales amónicas, amoníaco, hidrolizados proteicos, etc) como sustrato de los microorganismos. También puede obtenerse mediante procesos químicos enzimáticos a partir del a-amino-e-caprolactama. Los productos comerciales actuales tienen una pureza mínima del 98% que se corresponde con un valor en lisina del 78% y un contenido en cloro cercano al 19-20%. Recientemente, se ha iniciado la comercialización de la lisina líquida al 50% obtenida por un proceso similar al del clorhidrato. La diferencia más notable con respecto a la L-lisina, aparte de la presentación y de la riqueza en el aminoácido, es que no aporta cloro. La ventaja práctica más importante es la facilidad de manejo y de almacenamiento. 91 La metionina. La metionina se comercializa actualmente en dos formas: DL-metionina y DLmetionina hidroxianálogo (DL-2 hidroxi-4 metiltiobutanoico o HMB). La DL-metionina se obtiene por síntesis química a partir del propileno, metiltiol, metano y amoníaco. El producto sólido comercial tiene una riqueza superior al 99%, mientras que la presentación líquida (sal sódica), menos utilizada por la industria, tiene una riqueza en metionina del 40%. Por su naturaleza química su contenido en Na y S es alto (6,2 y 8,6%, respectivamente). El hidroxianálogo está disponible en forma líquida, con un 88% de riqueza en el producto original, o en forma sólida, como sal con un 12% de calcio. Se obtiene por síntesis química a partir del óxido de calcio y del ácido 2-hidroxi 3metiltiobutanoico. La equivalencia en metionina del precursor ha sido objeto de profundas discusiones en los últimos 20 años. Valores entre el 60 y el 100% han sido publicados en la literatura, con las cifras más bajas obtenidas normalmente con dietas semisintéticas. En las presentes tablas hemos adoptado el valor equivalente del 100% (880 g de metionina por cada Kg. de producto comercial) que es el valor recomendado por los proveedores del producto comercial. Además, es un producto ligeramente ácido, lo que potencia en cierta medida el control de hongos por antifúngicos. La L-treonina. La L-treonina se obtiene preferentemente mediante un proceso fermentativo por microorganismos. También puede obtenerse por aislamiento a partir de hidrolizados de proteína para uso farmacéutico. El producto comercial en fabricación de piensos tiene una riqueza mínima del 98% y un equivalente en proteína bruta en torno al 73-74%. El triptófano. El L-triptófano se obtiene mediante fermentación a partir de la glucosa u otras productos carbonados como el indol. El producto comercial tiene un mínimo del 98% de riqueza y un equivalente en proteína bruta del 85-86%. La síntesis química a partir del éster acetaminomalónico y fenilhidracina produce DL-triptófano, de menor disponibilidad en monogástricos y de escaso uso en la industria. Recientemente ha aparecido en el mercado una combinación de triptófano y lisina sintética excipientada en solubles de fermentación. El producto contiene 55,3% de lisina y 15% de triptófano totalmente disponibles y su equivalente en proteína es del 95%. El ácido glutámico. El ácido glutámico juega un papel importante en la función neuronal ya que es el principal neurotransmisor excitador del sistema nervioso central, participando en fenómenos tan importantes como el aprendizaje, la memorización y la plasticidad neuronal durante el desarrollo del cerebro. La fermentación y, por consiguiente, los microorganismos también se utilizan para elaborar aditivos. La propiedad del ácido glutámico (un aminoácido usado para obtener glutamato monosódico) de potenciar el sabor fue descubierta en Japón a principios del siglo XX. Además de dar sabor, los aminoácidos son nutrientes esenciales, ya que son 92 componentes básicos de las proteínas. Algunos alimentos, como los cereales, contienen proteínas con un contenido del aminoácido lisina relativamente bajo. Puede añadirse lisina para mejorar la calidad nutricional de las proteínas. Las fermentaciones en las que intervienen las bacterias Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium flavum producen tanto ácido glutámico como lisina. Sus funciones : Es capaz de controlar el exceso de amoníaco en el cerebro evitando así los daños que éste pueda causar. Participa en los procesos de producción de energía para el cerebro. Junto con la vitamina B6 es precursor de un importante neurotransmisor, el ácido gamma aminobutírico (GABA), con una importante acción sedante sobre el sistema nervioso. Ayuda a la producción de ácido clorhídrico. Ayuda a controlar el alcoholismo. Ayuda a la cicatrización de úlceras. Alivia la fatiga, la depresión y la impotencia. Se usa en el tratamiento de la esquizofrenia y la demencia senil. Excelente en el tratamiento de las funciones normales de la próstata. Interviene específicamente en la utilización de la glucosa por las células del cerebro. Funciona como sistema de transporte de aminoácidos y de nitrógeno desde tejidos periféricos hacia el hígado. Precursor en la biosíntesis de las bases purínicas y primidínicas. 93 VI.- ANEXOS. PRACTICAS DE LABORATORIO PRACTICA N° 1 ELABORACIÓN DE VINO OBJETIVO: El alumno obtendrá una bebida tipo vino de frutas, a partir de un sustrato de frutas inoculando con levaduras mediante un proceso de fermentación. INTRODUCCIÓN El vino es una bebida que se obtiene mediante fermentación alcohólica del sumo de la uva fresca. Los <vinos> preparados a partir de otros frutos , como manzanas y grosellas, no deben llamarse vinos sin más de más, sino que debe aludirse a los productos vegetales de que proceden. El vino debe prepararse a partir de uva fresca. Resulta esencial que el vino se obtenga mediante fermentación y que contenga alcohol. Una actividad que ha estado ligada a la mayoría de las culturas durante miles de años ha sido la producción de bebidas alcohólicas. Evidencias arqueológicas que demuestran que desde hace mas de 7000 años de antigüedad los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de diversos sustratos en forma empírica. Quizá las primeras bebidas se hicieron en base a sustratos azucarados como jugos de fruta, ya que estos solo requieren ponerse en contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta. Fue hasta el siglo XV cuando empezó a popularizarse el arte de la destilación y de esta forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohólico. Debido a la gran importancia de estos productos la investigación científica y tecnológica generan industrias, las cuales son de mayor importancia económica en el mundo. III. Bebidas Alcohólicas “Son soluciones acuosas que contienen además de agua y alcohol sustancias orgánicas que ejercen influencia sobre los aromas y el sabor “. “Son bebidas obtenidas a partir de cualquier jugo vegetal que no sea de uva y que tienen propiedades organolépticas nuevas y atractivas para una prueba estadística significativa de consumidores”. HISTORIA DEL VINO Los hallazgos fósiles, que se remontaron hasta la Era Terciaria, y los descubrimientos hechos en construcciones lacustres (palafitos), permiten sacar la conclusión de que las formas primitivas de nuestra vid estaban difundidas por toda Europa, Norteamérica y Japón. Plantas absolutamente semejantes a las vides actuales aparecen sólo en los sedimentos superiores de la Era Terciaria, habiéndose hallado hasta el presente únicamente en Grecia e Italia (Toscana y Piamonte). La obtención del vino y las prácticas de viticultura tienen evidentemente su origen en los valles fluviales ricos en vides silvestres de Asia Menor. Allí habitaban pueblo indogermánicos que 94 deben que deben considerarse antecesores inmediatos del cultivo de la vid y de las prácticas viticultoras. Los colonizadores griegos se encargaron de extender el cultivo de la vid a Italia y sur de Francia (Marsella). Los griegos llamaron al sur de Italia “país del vino” (Oinotria). III. COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL VINO. La composición de un vino y sus características dependen de la clase de uva, de la localización y suelo de la viña, del tiempo atmosférico reinante durante el desarrollo y maduración, del grado de madurez de los racimos y del estado sanitario de los mismos. También influyen sobre la composición y calidad de un vino el tratamiento del mosto, tipo fermentación, levaduras actuantes y los cuidados prestados al vino durante su maduración. De acuerdo con su parentesco químico y desde el punto de vista analítico, las sustancias que componen el vino se clasifican en los siguientes grupos: alcoholes, ácidos, hidratos de carbono, tanino y pigmentos, compuestos nitrogenados y sales minerales. A demás contienen el vino pequeñas cantidades de pectina, polisacáridos, aldehídos, ésteres, terpenos y por lo común también algo de ácido carbónico y ácido sulfuroso. Todas estas sustancias están disueltas en agua, que constituye el 85 – 90 % del total del vino. Los compuestos no volátiles de los citados se reúnen en Química Enológica bajo la denominación de extracto. El valor de la calidad de un vino depende de manera muy particular de su contenido de alcohol etílico (etanol), extracto, azúcar, ácidos y sustancias del buqué. MATERIALES Y REACTIVOS. 4 matraces erlenmeyer redondos de fondo plano de 500 ml. 1 refrigerante 1 matraz erlenmeyer de 250 ml. 1 probeta de 100 ml. 1 tina para baño Maria 1 soporte universal 1 pinza de tres dedos 1 anillo metálico 1 tela de asbesto 1 mechero bunsen 1 parrilla de calentamiento 1 estufa para incubación 1 alcoholímetro 1 termómetro 1 bureta automática 1 pipeta de 10 ml. 1 potenciómetro 1 refractómetro 0-30 1 bureta de 50 ml pinzas para bureta 95 1 embudo de filtración 1 cuchillo 1 campana de flujo laminar 3 matracez erlenmeyer de 125 ml. 1 baso de precipitado de 1000 ml 2 vasos de precipitado de 250 ml 1 baso de precipitado de 1000 ml 1 matraz volumétrico de 1000 ml 1 matraz volumétrico de 100 ml 3 matracez de 500 ml 1 licuadora 1 extractor de jugos Centrifuga Balanza analítica Etiquetas Gasas Algodón Papel estraza Mangueras látex Hielo Fenolftaleina NaOH 0.1 N Solución Buffer PH 4, 7, 10. Azul de metileno Felhing A y B Sacarosa Na Cl TÉCNICA: a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) n) o) Se selecciona la materia prima (fruta). Se desinfecta la fruta. Mondar y picar la fruta. Licuar para obtener la pulpa (sin agregarle agua). Determinar la humedad de la pulpa. Cuando se tenga lista la pulpa, este se vacía 100 ml en un matraz volumétrico ( 1000 ml), se le agrega la cantidad de azúcar calculada y agua hasta aforar. Esto se realiza en dos matraces. Homogenizarlo y determinar los °Brix, que debe dar un valor de 18°B. Determinar azúcares reductores totales del jugo. Determinar acidez del jugo. Una vez que el jugo esté bien homogenizado y se haya obtenido los °B, verter 50 ml de jugo en cada matraz erlenmeyer de 500 ml. Esto se realiza en 4 matraces de 500 ml. Tapar los matraces con un tapón de algodón y con un caperucho de papel estraza. Poner a hervirlos en la parrilla de calentamiento. Dejarlos de enfriar En 2 matraces se le agrega 0.5 g de levadura y en los otros 2 matraces se le agrega 1.5 g de levadura. Meter los matraces a la estufa que se encuentra a 28°C. 96 p) q) r) s) t) u) v) 2 matraces salen a las 25 hrs. que contiene 0.5g de levadura. 2 “ “ 35 hrs. que contiene 1.5g de levadura. 2 “ “ 45 hrs. que contiene 1.5g de levadura. 2 “ “ a las 55 hrs. que contiene 2.5g de levadura. Filtrar el jugo en algodón o con papel estraza. Centrifugar. Realizar determinación de pH, Acidez, concentración de alcohol y la prueba de evaluación sensorial. DETERMINACIÓN DE ACIDEZ: Verter 20 ml de vino en un vaso de precipitado. Agregarle carbón activado hasta que desaparezca el color del vino. Se pone a hervir. Se deja enfriar un poco y enseguida se filtra. Agregarle 3 gotas de fenolftaleína y después titular con hidróxido de sodio hasta obtener un color rosa. Se realiza el mismo procedimiento para los siguientes matraces que contienen vino de diferentes hrs. Y diferente cantidad de levadura. CONCENTRACIÓN DE ALCOHOL: Colocar el refrigerante en el soporte universal. Verter 50 mL de vino y 50 ml de agua en un matraz erlenmeyer (500ml). Tapar el matraz con un tapón y colocar el termómetro dentro del matraz. Conectar con el refrigerante de modo que no se escape el vapor cuando este empiece a hervir. A un extremo del refrigerante se coloca la parrilla para poner a hervir dicha solución. Cuando empiece a hervir, en el otro extremo del refrigerante se coloca un vaso de precipitado para recolectar 50 ml del destilado (alcohol). Se determina el alcohol con el alcoholímetro. Se realiza el mismo procedimiento para los demás matraces que contienen vino de diferentes horas y diferente cantidad de levadura. 97 PRACTICA 2 Cerveza Negra Clásica OBJETIVO: El alumno obtendrá una bebida denominada “Cerveza Negra Clásica” , a partir de un sustrato de cebada inoculando con levaduras mediante un proceso de fermentación. INTRODUCCIÓN Vieja amiga del hombre, era ya conocida por egipcios y babilonios 4.000 años a.C., el español Pizarro cuando conquista los Andes descubrió que los Incas la fabricaban a partir del maíz fermentado (chicha). Bebida característica de los pueblos del norte europeo, se elabora a partir del malteado de varios cereales como el maíz y la avena, aunque generalmente se utiliza cebada. Para su producción se debe partir del malteado de la cebada que se transforma en malta, para ello se humedece la cebada y se la deja una semana para que germine, se corta el proceso y se procede a secarla, si se quiere obtener cerveza negra se la debe tostar. El paso siguiente es el molido de la malta, paso siguiente es el braceado que consiste en mezclar la malta con agua caliente hasta obtener una pasta espesa. El almidón de la malta se transforma en azúcares fermentados; se filtra el líquido pasándolo a otro recipiente en donde se calentara hasta el punto de ebullición, antes de que hierba se le incorpora un poco de lúpulo que le dará ese sabor amargo característico y exquisito. Se la pasa a las cubas de fermentación en donde se baja la temperatura y se agrega una selección de levaduras, elemento muy importante para obtener una buena cerveza, al igual que el agua que debe ser de la mejor calidad y en lo posible de manantial natural y con poca dureza y acidez, en sí, debe ser neutra y con excelentes características. Para la fermentación existen dos técnicas, una es la que se realiza en frío, a 5°, y dura una semana o dos, luego se la lleva a una fermentación secundaria o maduración a una temperatura de 1 a 2 grados, durante 4 a 5 semanas. La otra fermentación es en caliente, o de modo natural, a temperaturas más altas y el periodo de maduración –fermentación secundaria- se realiza en pocos días. Las cervezas comerciales se pasteurizan para estabilizarlas, sobre todo cuando son destinadas a la exportación, cosa que no ocurre con las artesanales, que no pueden perder su cadena de frío, ya que se trata de un producto perecedero, se la debe consumir en corto tiempo. Otro detalle es que se debe conservar en recipientes de vidrio oscuro o cerámica ya que se deteriora rápidamente con la luz. Ingredientes: 2 kgs. Extracto de Malta líquido 1 oz. Bittering Lúpulo 1 oz. Lúpulo Final 1 cucharadita de té Irish moss ¾ taza Priming Sugar 50 unidades y Tapas para botellas 1 cucharadita de Levadura Nottingham Ale Equipo: 1 cacerola de 10 litros aprox. 1 batidor 1 cuchara larga 1 espumadera 1 fermentador (5 galones) 1 hidrómetro 1 termómetro 1 embotelladora 1 Airlock (trampa de aire) 1paq. De solución blanqueadora para esterilizar (One Step No-Rinse Cleaner) 1 tubo para embotellar 1 sifón 1 bottling bucket 1 grifo 1 colador 50 botellas de 250 cm3 98 Procedimiento: Cheque los ingredientes y equipamiento para asegurarse de tener todo antes de comenzar. Esterilice TODOS los instrumentos y el lugar de trabajo. Utilice barbijo y guantes de goma para mantener las condiciones de asepsia. Ponga 2 a 2 ½ galones de agua en una cacerola y lleve al fuego. Cuando ésta hierva, sáquela e introduzca los dos paquetes de extracto de malta y bata vigorosamente. Nota: el extracto de malta se mezclará más fácilmente si la deja reposar en agua caliente por 10 minutos. Agregue el bittering lúpulo directamente en la cacerola. Ponga al fuego nuevamente hasta que alcance el hervor. Deje esta mezcla (mosto) hierva por 45 minutos batiendo ocasionalmente. Agregue al mosto el lúpulo final junto con el Irish moss y deje hervir por 15 minutos más. Saque la cacerola del fuego; usando una espumadera remueva el lúpulo de la superficie y deséchelo. Introduzca la cacerola en una pileta de agua fría y recambie el agua hasta que el mosto alcance una temperatura por debajo de los 100 ºF, preferentemente 80/85 ºF. En el fermentador esterilizado ponga 2 galones de agua a 55/60 ºF y agregue el mosto enfriado. Mezcle bien y agregue agua hasta alcanzar la marca de los cinco galones y la temperatura sea de 70 ºF; revuelva. Usando el hidrómetro, mida la gravedad específica, el porcentaje de azúcar y el de alcohol y vuelque la información obtenida en la bitácora. En una taza esterilizada, hidrate la levadura no más de 15 minutos en 4 a 6 onzas de agua a una temperatura de 90 ºF. Luego, agréguelo al mosto. Finalmente, introduzca en la boca del fermentador la trampa de aire esterilizada y llene esta misma con agua hasta alcanzar la marca intermedia. Sitúe el fermentador en un lugar con una temperatura ideal de 68 a 72 ºF y fuera del alcance de la luz solar. En 12 a 72 horas verá burbujas en la trampa de aire. Eso indicará que el proceso de fermentación ya ha comenzado y la levadura está comiendo el azúcar para producir alcohol y dióxido de carbono. De 3 a 7 días después las burbujas comenzarán a desaparecer. Utilice el hidrómetro para chequear la gravedad específica. Si obtiene la misma lectura en los siguientes 3 días, la cerveza estará lista para embotellar. La gravedad final es usualmente un 25 % mayor que la inicial. Por ejemplo: Inicial 1,044 ; Final 1,011. Use botellas retornables únicamente. No utilice botellas a rosca. Limpie y esterilice las botellas con la solución blanqueadora y cúbralas con un plástico para evitar la contaminación aérea. Caliente 1 taza de agua en una cacerola y disuelva en ella ¾ taza de priming sugar. Enfríe y vuelque el azúcar en el bottling bucket. Utilizando un sifón esterilizado, transfiera la cerveza del primer fermentador al bottling bucket. ¡NO SALPIQUE! Esterilice las tapas. Embotelle la cerveza dejando 1 cm. de espacio entre la tapa y el líquido. El priming sugar proveerá en la segunda fermentación la carbonatación. Almacene las botellas a temperatura ambiente en un lugar oscuro por al menos 10 días. La cerveza estará lista para consumir. Disfrútela! 99 PRÁCTICA No. 3 CURVAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO OBJETIVO. Utilizar algunos métodos para evaluar el crecimiento de los microorganismos. INTRODUCCIÓN. El crecimiento celular se define como un aumento ordenado de la cantidad de los constituyentes y las estructuras celulares. Este crecimiento lleva a un incremento en el tamaño y peso de las células lo que, en la mayoría de los microorganismos, conduce a la división celular, dando por resultado el aumento en el numero de células (crecimiento poblacional). Es importante no confundir este concepto con el de crecimiento individual que implica solamente el aumento de tamaño, volumen y diferenciación dentro de un mismo individuo. En general cuando se habla de crecimiento en bacterias se refiere a crecimiento poblacional. En la mayoría de las bacterias, el crecimiento se lleva a cabo por un proceso que se conoce como fisión binaria, durante el cual todos los componentes estructurales de la célula se duplican. El producto de la división celular genera el ciclo celular que en bacterias puede ser muy sencillo como el de Escherichia coli (fig. 1). En el crecimiento bacteriano se involucran aproximadamente 2000 reacciones químicas como son: - Reacciones de transformación de energía. - Biosíntesis de moléculas pequeñas. - Biosíntesis de cofactores y coenzimas. - Reacciones de polimerización, como la síntesis de RNA, DNA y proteínas. El tiempo requerido para que se lleve a cabo la fisión binaria se conoce como tiempo de generación que es el intervalo necesario para que se formen dos células a partir de una. Los tiempos de generación varían entre los diferentes microorganismos y dependen del medio y condiciones de cultivo o hábitat en el que se encuentran (tabla1). 100 Las poblaciones microbianas muestran un patrón de crecimiento característico donde el número de células se duplica por unidad de tiempo, al que se llama “Crecimiento exponencial”. Experimentalmente esto se puede observar mejor si se hace una gráfica del número de células a diferentes tiempos, obteniéndose una línea recta (fig. 2). Esta gráfica se puede utilizar para calcular el tiempo de generación de una bacteria determinada (en el ejemplo es de 2 horas). 101 Los datos presentados en la figura anterior reflejan sólo una parte del ciclo de crecimiento de una población bacteriana. La curva completa de crecimiento de cualquier población bacteriana (fig. 2), la cual se puede dividir en las siguientes fases: a) Fase Lag o de adaptación: la cual puede ser corta o larga dependiendo de el medio del que proviene la cepa, las condiciones del medio y del estado de desarrollo de la población microbiana. Así, por ejemplo, si tomamos un inóculo de un cultivo bacteriano que esté creciendo activamente y lo ponemos en un recipiente con un medio de cultivo igual y lo incubamos en las mismas condiciones ambientales, la fase lag puede ser muy corta o no presentarse. Por el contrario, si tomamos un inóculo de un cultivo “viejo” al ponerlo en otro matraz con el mismo medio, la fase lag se presenta, debido a que las células necesitan de un determinado tiempo para inducir y volver a sintetizar los constituyentes que se requieren para su crecimiento. En esta fase, aunque no se presente un incremento en el tamaño y en la actividad celular, provocando con esto un aumento en la síntesis de macromoléculas. En primer lugar aumenta el RNA y poco tiempo después la síntesis del DNA y de proteínas. Esta diferencia en la síntesis de macromoléculas durante el periodo inicial de cambio o fase lag se conoce como crecimiento desbalanceado. b) Fase Exponencial: En esta etapa las células se duplican en número y en masa cada vez que transcurre un cierto tiempo. La velocidad del crecimiento exponencial depende de las características genéticas del microorganismo, de las condiciones y medio de cultivo. En cualquier caso, la velocidad de crecimiento se mantiene constante durante esta fase. Aquí se producen los llamados metabolitos primarios (por ejemplo, aminoácidos). Mientras menor sea la pendiente de esta fase, mayor será el tiempo de generación. Debido a que durante el crecimiento exponencial, todos los constituyentes bioquímicos se están sintetizando más o menos a la misma velocidad se conoce como crecimiento balanceado. Aunque la fase exponencial no se puede mantener por mucho tiempo en un sistema o cultivo cerrado, si es posible mantenerla indefinidamente en un sistema de cultivo continuo diseñado para proveer nutrientes frescos y eliminar continuamente los desechos metabólicos del cultivo. Existen dos tipos principales de cultivo continuo: el quimiostato y el turbidostato. En el quimiostato, se va adicionando medio fresco al cultivo microbiano a la mismo velocidad que se va eliminando parte del medio que contiene microorganismos. El medio de cultivo de un quimiostato generalmente posee un nutriente esencial (como un aminoácido) en cantidades limitadas y debido a esto, la velocidad del crecimiento está determinada por la velocidad a la cual se está adicionando el medio fresco al cultivo microbiano, La velocidad de este intercambio de nutrientes se expresa como la velocidad de dilución, la cual relaciona la velocidad del flujo del medio fresco con el volumen total del cultivo microbiano. Así, cuando la velocidad de dilución aumenta, el tiempo de generación del microorganismo disminuye, es decir la velocidad de crecimiento se incrementa; pero se tiene que controlar muy bien la velocidad de dilución ya que si esta última es muy alta, los microorganismos pueden ser completamente eliminados del cultivo donde están creciendo (cuando la velocidad de crecimiento). El turbidostato posee una fotocelda que mide la absorbancia o la turbidez del crecimiento microbiano dentro del reservorio; así, la velocidad de flujo del medio fresco hacia el cultivo microbiano se regula automáticamente y de esta forma se mantiene una determinada turbidez o densidad celular. El medio de cultivo de un turbidostato no posee 102 ningún nutriente limitante y mientras que el quimiostato es más efectivo a velocidades de dilución bajas, el turbidostato trabaja mejor a velocidades de dilución altas. c) Fase Estacionaria: Esta etapa se presenta en un sistema cerrado y es debida principalmente a que un nutriente esencial del medio de cultivo se terminó o a que un producto de desecho del microorganismo en crecimiento es inhibitorio para él mismo. También se puede producir porque la población microbiana no puede seguir creciendo debido a que en el medio ya no existe espacio físico para que esto ocurra. En esta fase el número de microorganismos se mantiene más o menos constante en un estado al que se conoce como crecimiento críptico. Al mismo tiempo, se producen cierto metabolitos celulares llamados metabolitos secundarios como los antibióticos, pigmentos. En las bacterias esporuladas, las esporas se producen precisamente en esta fase de desarrollo. Cuando existen dos fuentes de carbono en concentración limitantes pueden desarrollarse dos fases exponenciales y dos estacionarias dando forma a una curva de crecimiento diaúxico (fig. 3) d) Fase de Muerte: En esta fase la cuenta total de microorganismos puede permanecer constante, medida por cuenta directa al microscopio o absorbancia, pero la cuenta viable disminuye. En algunos casos, la muerte se acompaña de destrucción o lisis celular con la subsecuente disminución en la turbidez del cultivo o en la cuenta microscópica directa. Generalmente la muerte de una población microbiana ocurre en forma logarítmica. Existen muchas formas de aplicar los conocimientos adquiridos acerca de una curva de crecimiento en las diferentes áreas de la Microbiología; así por ejemplo, el microbiólogo industrial involucrado en la producción de alcohol intentará disminuir el tiempo de la fase lag e incrementar el de la fase exponencial de su cultivo y de esta manera obtener una producción máxima de alcohol en un tiempo mínimo. Por otro lado, el microbiólogo clínico determinará la reacción de Gram de los cultivos que se encuentren en la fase exponencial de crecimiento ya que se sabe que durante la fase estacionaria la pared celular puede no sintetizarse en forma óptica dando variabilidad a esta técnica de tinción. Al contrario, en la producción de levadura para alimento, el microbiólogo obtendrá el cultivo de interés durante la fase estacionaria, ya que es en ésta donde la masa celular llega a su máximo nivel. Es muy importante para un microbiólogo conocer y estudiar el crecimiento microbiano durante la fase exponencial, ya que esto contribuye a la investigación básica 103 en fisiología y ecología microbianas y a la solución de varios problemas que se presentan en el área de la microbiología industrial. Así, cuando un medio de cultivo se inócula con una sola célula que se divide cada 20 minutos, la población total será de dos células después de transcurridos los primeros 20 minutos, de cuatro células después de 40 minutos y así sucesivamente. Debido a que la población se está duplicando cada vez que las células se dividen, podemos expresar con base de 2 el crecimiento exponencial de la siguiente forma: 21 ----- 22 ----- 23 ----- 24 … 2n (1) donde “n” representa el número de generaciones. De esta forma, empezando con una célula, la población total o final “Nf” después de “n” generaciones será: Nf=1 x 2n (2) Si la población original o inicial no es una sino cientos o miles de células, expresamos la población final como: Nf = No x 2n (3) Donde “No” representa el tamaño de la población original al tiempo cero. Para determinar el valor de “n” se transforma la ecuación anterior a logaritmos con base 10, obteniéndose: Log Nf = log No + n log 2 Si de aquí despejamos “n” (4) (5) n = logNf-logNo Log2 Para simplificar la ecuación, substituimos el valor del log de 2: N = logNf-logNo 0.301 (6) Así, conociendo la población inicial “No” y la población final “Nf”, se puede calcular el número de generaciones “n” que se han producido después de un tiempo de incubación “t”. Por otro lado, el tiempo de generación o duplicación “T” de una población microbiana es igual a tiempo de incubación “t” dividido entre el número de generaciones “n”: T= t n (7) Despejando “n”, tenemos que: N= t T (8) 104 Substituyendo la ecuación (8) en la (6): t Log Nf- log No T = Tx0.3010 (9) En algunos casos se requiere conocer el comportamiento de una población microbiana dentro de una curva de crecimiento que presenta una determinada fase lag, en estos casos, la ecuación (9) se modifica y tenemos que: log Nf – logNo t-L = T T x 0.3010 (10) Donde “L” es el tiempo de duración de la fase lag y “t”, “T”, “Nf” y “No” tienen los significados establecidos anteriormente. Otra de las formas matemáticas de considerar el crecimiento exponencial es mediante el uso del cálculo diferencial, el cual toma como base que dentro de una población heterogénea (población donde existe una mezcla de células que se encuentran en un estadio diferente del ciclo celular) una pequeña fracción de esta población está dividiéndose en un tiempo dado y está contribuyendo con esto a un aumento infinitesimal en el tamaño de la población. Por lo tanto, si consideramos una población inicial “No” a un tiempo t=0, entonces después de un intervalo pequeño de tiempo “dt”, una pequeña fracción de los organismos presentes en “No” completará su ciclo celular, dividiéndose y aumentando el tamaño de la población en “dN”. Considerando que la magnitud de “dN” depende del tamaño de “No” a un “dt” constante, la velocidad del cambio celular o más comúnmente conocida como la velocidad de crecimiento de la población será directamente proporcional al tamaño de la población inicial. Lo anterior lo podemos expresar como: dN No (11) dt substituyendo la proporcionalidad por una constante: dN = No (12) dt donde es una constante de proporcionalidad conocida como la velocidad específica de crecimiento y cuyas unidades son: t -1 o bien, h –1 o 1 h 105 dichas unidades se obtienen si despejamos “” de la ecuación (12): g = dN 1 dt No = l 1 h g = 1 = h -1 h “” tiene un significado biológico muy preciso, es la medida del número de individuos nuevos producido por un número dado de individuos ya existentes en un tiempo fijo de crecimiento. Ahora bien, con este tipo de planteamiento matemático podemos calcular tanto la velocidad específica de crecimiento como el tiempo de generación de un microorganismo determinado. Por lo que si integramos la ecuación (12), obtenemos: dN = No dt Nt = Noe t (13) Si transformamos la ecuación anterior con logaritmos naturales: In Nt = In No + t (14) En este modelo, el tiempo en que se duplica la población será: t= 1n2 (15) Por lo tanto, con estas dos ecuaciones (14 y 15) podemos calcular las variables que se mencionaron en párrafos anteriores. El crecimiento poblacional puede obedecer a un modelo exponencial sólo bajo circunstancias especiales (de laboratorio generalmente) y por periodos cortos, pues ninguna especie exhibe en realidad un patrón de incremento indefinido debido a que algún factor limita su crecimiento. 106 En general, conforme aumenta la cantidad de células en un medio dado, la tasa de incremento dN/dt disminuye gradualmente hasta que alcanza un valor de cero, en donde la densidad de la población llega a un máximo; esta mediante una curva como la que se muestra en la Fig. 4b, que en general puede ser descrita adecuadamente por la ecuación logística de crecimiento de Verhulst-Pearl y que se expresa de la siguiente forma: dN = N (K-N) = N(1 – N) k (16) k En esta ecuación, la letra “K” se conoce como la capacidad portadora del medio y representa la densidad de población máxima que de manera estable puede soportar un ambiente dado y en la que por definición = 0, y, dN = C dt dN La disminución en la tasa de crecimiento dt se logra mediante una retroalimentación negativa de la densidad, haciendo que cada célula que se agregue a la población produzca una reducción en la velocidad de crecimiento; dicho mecanismo retroalimentador queda manifiesto mediante el término 1-N K En el caso del crecimiento exponencial la velocidad específica de crecimiento se mantiene constante, pero en el modelo logístico ésta va disminuyendo a medida que “N”, el número de individuos, tiende al valor de “K”, lo cual expresa se expresa de la siguiente manera: dN1 = (1 – N ) dt N (17) K N Conforme “N” aumenta, la razón K se aproxima cada vez más a la unidad y el término entre paréntesis finalmente llega a hacerse igual a cero, indicando que cuando N=K, la población se mantiene estable y el crecimiento efectivo es nulo. Si efectuamos una modificación a la ecuación (17), obtenemos: N = (1 – N) = - (N) d Ndt K (18) K Esta expresión representa la ecuación de una recta con una ordenada al origen igual a “”, una pendiente negativa igual a y que corta al eje de las abscisas cuando N = K (y cuando dN = 0 (ver Fig. 5). 107 En el modelo logístico del crecimiento existen dos densidades en las que dN=0 dt , una que corresponde a los inicios del desarrollo cuando “N” es muy pequeña y representa una población crítica por debajo de la cual la población no se desarrollará y la otra corresponde a la densidad máxima en la que semantiene una población estable. Así conforme “N” aumenta, también lo hará dN hasta que se alcanza un incremento máximo cuando el tamaño de la dt población es igual a k , que es donde se presenta el punto de inflexión de la curva de crecimiento (fig. 2). A densidades mayores, cuando “N” tiende al valor de “K”, dN empieza a dt disminuir asintóticamente hasta que en N = K alcanza un valor de cero y en donde no hay un crecimiento efectivo, sino de reposición de células, es decir, las células muertas se substituyen por las que se están dividiendo, manteniéndose un número estable de organismos. Si se construye una gráfica de dN con respecto al tiempo se obtiene una curva en forma de campana como dt la mostrada en la Fig. 2, la cual representa la gráfica típica de la expresión diferencial de la ecuación Verhulst-Pearl; sin embargo , para el ajuste de datos experimentales se emplea la forma integrada de la ecuación (16), que se expresa de la siguiente manera: Nt = K (19) (1+e a-f) 108 en donde Nt es el tamaño de la población al tiempo “t”, ; “K”, “” y “t” tienen los significados ya mencionados y “a” es una constante surgida de la integración de (16), la cual se define como: a= Iv (K-No) No En la que “No” es la población inicial. La gráfica descrita por la ecuación (19) es una curva sigmoidal como la mostrada en la Fig.6ª 109 Para el cálculo de las constantes de la ecuación (19), trabajando con datos experimentales, ésta se transforma para obtener: 1v (K-N) = a - t (20) N Que de acuerdo al modelo de crecimiento logístico representa la ecuación de una recta que tiene una pendiente negativa (fig. 5). Para efectuar el cálculo de la pendiente y de la ordenada al origen “a” se tiene que utilizar la ecuación (20) y se requiere de una estimación inicial de “K” que junto con las observaciones de “N” a los correspondientes “ts” obtenidos en el desarrollo de la población nos permite, a su vez, efectuar una regresión lineal de 1 n K-N N Contra “t” mediante el método de los mínimos cuadrados. Para determinar el crecimiento bacteriano se pueden utilizar diferentes métodos, ya sean directos o indirectos. Entre los tres principales métodos directos se encuentran: A) La cuenta directa al microscopio: donde se utiliza la cámara de PetroffHausser y se cuentan directamente las bacterias presente en una muestra dada, posteriormente esta cuenta se multiplica por un factor para finalmente determinar el número de bacterias/ml. B) La cuenta viable: en la cual se realizan diluciones de la muestra original y una alícuota de éstas se siembra en el medio de cultivo adecuado, expresándose el resultado como el número de bacterias o unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) según sea el caso. C) La medición de la turbidez: la cual puede efectuarse debido a que las bacterias absorben y desvían cierta cantidad de luz, permitiendo de esta forma medir el grado de turbidez del cultivo. Esto último se realiza con la ayuda de un fotocolorímetro con un filtro rojo o azul o un espectrofotómetro y la lectura se expresa en unidades de absorbancia. Para organismos unicelulares la absorbancia es proporcional al número de células. Dentro de los métodos indirectos, podemos mencionar: A) La medición de algún componente celular, como las proteínas o el ATP. B) La medición del consumo de la fuente de carbono del medio de cultivo. C) La medición en el cambio de algunas variables fisicoquímicas como el pH. CRECIMIENTO DE HONGOS Cuando una espora germina, emite un filamento o hifa que se alarga y ramifica rápidamente a medida que va creciendo, formando así un conjunto de hifas llamado micelio. El crecimiento de los hongos se lleva a cabo en los ápices de las hifas por lo que se le conoce como crecimiento apical. Este crecimiento se puede ver al microscopio de luz con un hongo de crecimiento “rápido” como Neurospora crassa el cual crece a una velocidad de 40 m/min. a 25°C. También se ha visto un movimiento neto del citoplasma hacia el ápice de la hifa, por lo tanto, para que el ápice de la hifa crezca tiene que utilizar el material citoplásmico que viene de atrás. Por otro lado, se sabe que el ápice hifal también está rodeado por la pared celular, aunque ésta es más delgada y más “plástica” que la que se Presenta en el resto de la hifa. Por lo tanto, en el crecimiento de la hifa deben intervenir tanto una degradación como una síntesis de pared celular de una manera balanceada. 110 Hace tiempo se observaron en los ápices hifales ciertas vesículas que aparecían cuando la hifa estaba creciendo y desaparecían cuando dejaba de crecer. Dichas vesículas no se han caracterizado completamente pero presentan varios precursores para la biosíntesis de pared celular y algunas enzimas murolíticas. En la Fig. 6 se observa una representación hipotética de lo que sucede con las vesículas en la pared celular del ápice hifal. No se sabe cual es el mecanismo del movimiento de estas vesículas hacia el ápice, pero se ha sugerido que puede ser: a) por un gradiente electrogénico a través de la hifa, b) por un flujo electroosmótico de agua hacia el ápice, o c) por un sistema de microtúbulos o microfilamentos. También se ha observado que cuando la espora germina existe una fase inicial de “hinchazón” donde aumenta de tamaño debido a la entrada de agua y que, por lo tanto, dicha espora tiene que sintetizar pared celular nueva de una manera más o menos uniforme. Posteriormente la “hifa joven” llamada tubo germinativo emerge de la espora y es en el ápice de esta estructura donde la síntesis de pared celular empieza a ocurrir. (fig. 7) En otras palabras, la germinación de la espora involucra una fase inicial donde la pared celular se sintetiza de forma no polar u homogénea en la superficie de la espora seguida de una síntesis polar en el ápice de tubo germinativo. ¿Cuál es el mecanismo de ramificación de las hifas una vez que la primera de ellas ha germinado y ha formado el tubo germinativo? 1.- Se sabe que los hongos muestran un crecimiento con dominancia apical aunque no se conoce el control de dicha dominancia. Las ramificaciones hifales van apareciendo sólo un poco atrás de los ápices. 2.- Las ramificaciones divergen unas de otras, es decir, crecen hacia direcciones opuestas, quizá respondiendo al gradiente de nutrientes del medio de cultivo o a la presencia de inhibidores producidos por la hifa ya existente (fig. 8). 3.- La densidad de una colonia fúngica o el número de ramificaciones que forma está directamente relacionada con la cantidad de nutrientes en el medio. 4.- Se han observado los diferentes estadios de desarrollo de las colonias fúngicas jóvenes y se encontró que la unidad de crecimiento hifal “G” se puede expresar de la forma siguiente: G= Longitud total del micelio Número de ápices hifales 111 Después de fluctuaciones que se presentan al comienzo del crecimiento, el valor de “G” se mantiene constante conforme la colonia se desarrolla, siendo dicho valor característico para cada hongo, por ejemplo, para Geotrichum es de 160 m y para Neurospora es de 120 m. Al mismo tiempo, se puede calcular la velocidad específica de crecimiento “” se relaciona con la velocidad de crecimiento radial y el diámetro de la colonia “W”, como sigue: Velocidad de crecimiento radial = W El crecimiento de los hongos filamentos se puede poner de manifiesto por varios métodos, como son la determinación del crecimiento radial, del crecimiento longitudinal, del peso seco y del peso húmedo. REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO. Tubos de ensaye de 16 x 150 c0n 4.5 ml de agua destilada estéril Cajas de Petri con gelosa nutritiva Pipetas estériles de 1 y 10 ml Tubos de Ryan con gelosa Sabouraud Cajas de Petri con gelosa Sabouraud Matraces nefelométricos con 25 ml de medio E +0.25% de glucosa Tubos para fotocolorímetro Klett-Summerson Probeta de 200 ml limpia Matraces Erlenmeyer de 125 y 500 ml. Cepas: Escherichia coli, Penicillium sp., Aspergillis sp., Rhizopus sp., Fusarium sp. METODOLOGÍA. I.- Cuenta de bacterias por el método nefelométrico. 1.- Inocular un matraz nefelométrico que contenga 25 ml de un cultivo de 12 horas de E. Coli. 2.- Homogeneizar el inóculo en el medio y medir la turbidez del cultivo en fotocolorímetro Klett-Summerson (tiempo cero). Incubar el matraz en un baño de 37°C. El cero del fotocolorímetro se ajusta con medio E sin inocular. 3.- Realizar lecturas como en el punto 2 cada 0.5 horas durante 7 horas, manteniendo el cultivo a 37°C. II.- Cuenta viable del inóculo bacteriano original. 1.- Marcar del 1 al 10 dos series de 10 tubos que contienen 4.5 ml de agua destilada estéril. 2.- Agregar al primer tubo 0.5 ml del cultivo joven (12h) de E. Coli. 3.- Efectuar diluciones decimales hasta 10-10. 4.- Colocar o.1 ml de las diluciones 10-6 a 10.10 en la superficie de 5 placas de gelosa nutritiva marcadas previamente con la dilución correspondiente (hacer lo anterior por duplicado). 5.- Extender con la varilla de vidrio previamente esterilizada. 6.- Incubar a 37°C durante 24-48 horas. III.- Determinación de la relación de la turbidez como unidades KlettSummerson (U.K.) y la concentración bacteriana. Esta determinación no es necesario realizarla en condiciones de esterilidad, ni con material estéril. 1.- Colocar 4.5 ml del cultivo original de E. Coli en un tubo para fotocolorímetro Klett-Summerson y medir su turbidez. 112 2.- Realizar el siguiente esquema de diluciones al cultivo anterior, utilizando medio E como diluyente. Determinar la turbidez en el fotocolorímetro a cada una de las diluciones. Diluir (ml) 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 10.5 13.5 18.5 25.5 38.5 63.5 medio E (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 3.0 5.0 7.0 13.0 25.0 150.0 Medir U.K. “ * * “ “ “ “ “ “ “ 113 IV.- Crecimiento longitudinal de hongos. 1.- Sembrar en un extremo del tubo de Ryan con gelosa Sabouraud una porción del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a 28°C. 2.- Medir la longitud del crecimiento en mm a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación. V. Crecimiento radial de hongos. 1.- Sembrar por punto el centro de una caja de Petri con gelosa Sabouraud con una porción del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a 28°C. 2.- Medir el diámetro en mm de la colonia a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación. PRECAUCION: Mover lo menos posible los tubos de Ryan y las cajas de Petri una vez inoculadas para evitar la dispersión de las esporas. INFORME. 1.- Tabular los resultados de la curva de crecimiento por el método nefelómetrico, como se indica en la siguiente tabla. Tiempo (horas) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 Unidades Klett 2.- Escribir en la tabla siguiente, el número de colonias encontradas en cada una de las diluciones que efectuó del cultivo original de E. Coli. Dilución UFC/0.1 ml UFC/ml 3.- Con base en los datos de la tabla anterior, ¿cuál es el número de bacterias 114 /ml del cultivo original de E. Coli. 4.- De acuerdo con el punto III de la sección de Métodos, tabule las unidades Klett que corresponden a cada una de las diluciones efectuadas y calcule la Concentración de bacterias en cada dilución de la muestra original de E. Coli. Dilución Unidades Klett Bacterias/ml a) 1:1.22 b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) 5.- Hacer una gráfica con los resultados de la tabla anterior. Interpolar en la gráfica anterior cada uno de los valores de U.K. obtenidos en el punto 1 de esta sección y tabularlos de la siguiente forma: Tiempo (horas) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 Unidades Klett-Summerson Bacterias/ml 7.- Hacer la gráfica en papel milimétrico o en computadora con los resultados de la tabla anterior, colocando en el eje de las abscisas el tiempo de incubación y en el de las ordenadas el número de bacterias/ml. 8.- Efectuar con los datos obtenidos en esta práctica, una regresión lineal por el método de los mínimos cuadrados. 9.- Con base en todos los datos obtenidos en esta práctica, diga usted cuál fue la densidad máxima de población que se alcanzó (“K”) y calcule cuál fue la velocidad específica de crecimiento (“”) para E. Coli y cuál su tiempo de 115 generación. 10.- Tabular los resultados del crecimiento lineal y radial de los hongos, como se indica en la siguiente tabla. Tiempo (días) Radial Lineal 0 1 2 3 4 Cepa 11.- Hacer una gráfica con los resultados de la tabla anterior, colocando el tiempo de incubación en el eje de las abscisas y el crecimiento en centímetros en el de las ordenadas. CUESTIONARIO. 1.- De acuerdo con el modelo de crecimiento exponencial, resuelva el siguiente problema: usted inoculó 106 células de E. Coli en 25 ml de medio de cultivo adicionado de glucosa, incubó su matraz durante 4 horas. Sabiendo que el tiempo de generación es de 20 min. Calcule el número de bacterias, toma 0.01 ml del matraz y lo inocula en medio de cultivo con manitol; incuba durante 4 horas, obteniendo al cabo de este tiempo 2.4 X 107 bacterias/ml. En este medio se presentó una fase lag de 20 min. Calcule usted el tiempo de generación para este microorganismo en el medio con manitol. 2.- Si tenemos un cultivo que contiene 100 células de E. Coli, el cual presenta un tiempo de generación de 30 min. a 35°C, dibuje la curva de crecimiento de dicha bacteria cuando: a) las células se incuban a 35°C durante 5 horas. b) después de 5 horas, la temperatura se cambia a 20°C durante 2 horas. c) después de 5 horas a 35°C la temperatura se cambia a 5°C durante 2 horas, al término de las cuales se regresa a 35°C durante 5 horas más. REFERENCIAS. Campbell, R.C. 1974. Statistics for biologists. 2nd Ed. Cambridge University Press, London. P 385. Deacon, J.W. 1984. Introduction to modern mycology. 2nd. Ed. Blackwell Scientific Pub. Pp 42-56 Donachie, W:D: 1993. The cell cycle of Escherichia coli. Ann. Rev. Microbiol. 47: 199-230 Hutchinson, G.E. 1978. An introduction to population ecology. Yale University Pree. P 260 p. Kolter, R., D. A. Siegele y A: Tormo. 1993. The stationary phase of the bacterial life cycle. Ann. Rev. Microbiol. 47:855-874. Krebs, C.J. 1978. Ecology: the experimental analysis of distribution and 116 Abundance. 2nd. Ed. Harper and Row, Pub. P 678. Martínez Jerónimo, F:F: 1983. Crecimiento poblacional. En: Comparación De curvas de crecimiento poblacional de Ankistrodesmus falcatus (Chlorellales, Chlorolleceae) obtenidas al utilizar diferentes medios de cultivo. Aspectos ecológicos y de nutrición mineral en el cultivos de algas microscópicas. Tesis profesional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN. México, D.F. Poole, R.W. 1974. An introduction to quantitative ecology. Mc. Graw Hill Kogakusha, Ltd. P. 532. 117 PRÁCTICA No. 4 FERMENTACIÓN ACÉTICA EN UN REACTOR DE LECHO FIJO. OBJETIVOS. Producir vinagre de vino por un método industrial a escala de laboratorio como es el caso del biorreactor con células inmovilizadas del tipo Frings determinando los parámetros de proceso: cálculo de las mezclas vinagre-hidroalcohólicas para la alimentación del biorreactor; cálculo de oxigeno necesario para la oxidación alcohólica; cálculo de rendimientos de alcohol-vinagre; determinación del intervalo de temperatura óptima de producción y obtención de vinagre al 4%, de tal manera que se amplíen los criterios de aplicación de la Ingeniería Bioquímica. INTRODUCCIÓN. Aunque hace miles de años que se conoce el vinagre, no se determinó la naturaleza microbiológica de su producción hasta hace poco m s de 160 años, cuando Kútzing dio a conocer que la conversión del etanol en ácido acético era llevada a cabo por microorganismos vivos. Quince años antes, Peerson había designado con el nombre de Mycoderma a la película que se forma sobre los líquidos en los cuales tiene lugar una fermentación acética. Pasteur (1868), confirmó la opinión de Kútzing y demostró la naturaleza fisiológica de la fermentación acética, pero Pasteur creía que esta fermentación era ocasionada por una sola especie de bacteria, Mycoderma aceti. En 1878, Hansen demostró que eran más de una las especies de bacterias capaces de producir la acidez de la cerveza, es decir, la oxidación del etanol a ácido acético. Aisló y dio nombre a Bacterium aceti, y a Bacterium pasteurianum. Más tarde aisló Bacterium kutzingianum, mientras que Brown describía una cuarta especie. Hacia el año 1879. Hemberg estudió el grupo, lo reclasificó y describió varias especies más. La nomenclatura y clasificación vigente es la adoptada en el Manual de Bergey. Actividades bioquímicas tic Acetobacter. Las actividades bioquímicas de Acetobacter consisten principalmente en procesos catabólicos aerobios y anaerobios y en la síntesis de polisacáridos. Desde el punto de vista industrial las m s importantes son las desasimilaciones aerobias que comprenden el catabolismo oxidante de azúcares y alcoholes. De ellas la mejor conocida y más antigua es la de producción de ácido acético o vinagre. bacterias CH3CH20H + 02 CH3COOH + H20 acéticas El vinagre es el condimento hecho a partir de sustancias azucaradas o feculentas por fermentación alcohólica seguida de fermentación acética cuyo producto final no debe contener menos de 4 g de ácido acético por cada 100ml de solución a 20 grados centígrados. De acuerdo con lo anterior el proceso general quedaría descrito por: levaduras C6H 12O6 + O2 CH3CH2OH + CO2 Bacterias acéticas CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2o 118 Requisitos generales de la fabricación: En la moderna fabricación de vinagre hay que considerar varios factores: la selección de microorganismo, la naturaleza de la materia prima, las concentraciones del etanol empleado y del vinagre añadido al principio para acidificarlo, la cantidad de oxígeno suministrada, la naturaleza del medio de fermentación, la temperatura de fermentación, la maduración y conservación, la clarificación, el embotellado y la pasteurización y finalmente el carácter y composición de los depósitos, recipientes y materiales que se ponen en contacto con el vinagre durante el proceso de fabricación. METODOLOGÍA. Aunque hace miles de años que se conoce el vinagre, no se determinó la naturaleza microbiológica de su producción hasta hace poco m s de 160 años, cuando Kútzing dio a conocer que la conversión del etanol en ácido acético era llevada a cabo por microorganismos vivos. Quince años antes, Peerson había designado con el nombre de Mycoderma a la película que se forma sobre los líquidos en los cuales tiene lugar una fermentación acética. Pasteur (1868), confirmó la opinión de Kútzing y demostró la naturaleza fisiológica de la fermentación acética, pero Pasteur creía que esta fermentación era ocasionada por una sola especie de bacteria, Mycoderma aceti. En 1878, Hansen demostró que eran más de una las especies de bacterias capaces de producir la acidez de la cerveza, es decir, la oxidación del etanol a ácido acético. Aisló y dio nombre a Bacterium aceti, y a Bacterium pasteurianum. Más tarde aisló Bacterium kutzingianum, mientras que Brown describía una cuarta especie. Hacia el año 1879. Hemberg estudió el grupo, lo reclasificó y describió varias especies más. La nomenclatura y clasificación vigente es la adoptada en el Manual de Bergey. Actividades bioquímicas tic Acetobacter. Las actividades bioquímicas de Acetobacter consisten principalmente en procesos catabólicos aerobios y anaerobios y en la síntesis de polisacáridos. Desde el punto de vista industrial las m s importantes son las desasimilaciones aerobias que comprenden el catabolismo oxidante de azúcares y alcoholes. De ellas la mejor conocida y más antigua es la de producción de ácido acético o vinagre. bacterias CH3CH20H + 02 CH3COOH + H20 acéticas El vinagre es el condimento hecho a partir de sustancias azucaradas o feculentas por fermentación alcohólica seguida de fermentación acética cuyo producto final no debe contener menos de 4 g de ácido acético por cada 100ml de solución a 20 grados centígrados. De acuerdo con lo anterior el proceso general quedaría descrito por: levaduras C6H 12O6 + O2 CH3CH2OH + CO2 Bacterias acéticas CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2o Requisitos generales de la fabricación: En la moderna fabricación de vinagre hay que considerar varios factores: la selección de microorganismo, la naturaleza de la materia prima, las concentraciones del 119 etanol empleado y del vinagre añadido al principio para acidificarlo, la cantidad de oxígeno suministrada, la naturaleza del medio de fermentación, la temperatura de fermentación, la maduración y conservación, la clarificación, el embotellado y la pasteurización y finalmente el carácter y composición de los depósitos, recipientes y materiales que se ponen en contacto con el vinagre durante el proceso de fabricación. RESULTADOS. Presentar en un cuadro los cálculos para. el ajuste de la concentración de la mezcla vino-vinagre y la aireación necesaria. Presentar cuadro y gráfica de la velocidad media de reacción. Si la velocidad de reacción es de primer orden, usando los valores experimentales, determinar: a) - la constante k de la reacción b) - el tiempo óptimo de cosecha Proponga y establezca las condiciones de operación de un biorreactor tipo Frings capaz de producir 500 1 de vinagre de vino cada 24 horas. REFERENCIAS. Amerine, M.A.1974. Análisis de vinos y mostos. Ed. Acribia, Barcelona Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Blackwell Scientific Publications, London. Prescott, S.C. & Dunn, C.B. 1962.Microbiología Industrial. 3a Edición. Editorial Aguilar. Madrid Antonio Madrid, V. 1991. Vinos e industria vinícola. Tecnología del vino y bebidas derivadas. Mundi-Prensa Libros S.A.. Madrid España 1991. Vinagre envasado para consumo público. Norma Oficial Mexicana DGN-F-1221968. Secretaria de Comercio y Fomento Industrial Nomura, Y., lwahara, M. & Hong, M. 1994. Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum in electrodialysis culture using a fermenter equipped with an alectrodialyser. World lournal of Microbiology and Biotechnology. 10 (4):427-432 Han, K, henry c. Lim, H.C. & Hon& J. 1992. Acetic acid formation in Escherichia col- fermentation. Biotechnology and Bioengineering. 39:663-671 Hekmat, D. & Vortmeyer, D. 1992. Measurement, control, and modeling of submerged acetic acid fermentation. Journal of Fermentation and Bioengineering. 73:2630 120 PRÁCTICA No. 5 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS DE HONGOS OBJETIVOS. Realizar la extracción y purificación parcial de la invertasa de levaduras. INTRODUCCION. Los caldos de fermentación son mezclas complejas, compuestas de células, productos solubles extracelulares, productos intracelulares y medio de cultivo sin convertir. Particularmente un bioproceso incluye los procesos de producción de un metabolito específico y su posterior recuperación. La selección del proceso de recuperación del producto se basa en los siguientes criterios: La localización del producto (intracelular o extracelular). La concentración del producto en el caldo de fermentación. Las propiedades físicas y químicas del producto (tamaño, carga, solubilidad, etc.). El uso tentativo de] producto. Las impurezas del caldo de fermentación. El precio del producto en el mercado. La secuencia de operaciones a través de las cuales se somete el caldo de fermentación para obtener el producto deseado con una alta pureza son generalmente las siguientes: Remoción de partículas insolubles. Las operaciones más comúnmente usadas en esta etapa son filtración, centrifugación, sedimentación y decantación. Aislamiento primario. La extracción con disolventes, la adsorción, precipitación y ultrafiltración son las operaciones m s usadas. Durante este aislamiento primario, la concentración del producto deseado aumenta considerablemente. Purificación. Con esta operación se remueven las impurezas del producto concentrado, se utilizan entre otras operaciones la precipitación fraccionada, diferentes tipos de cromatografía o la adsorción. Obtención del producto final. En esta última etapa se obtiene el producto con el nivel de pureza requerido. Los procesos que se incluyen aqu¡, son un secado al vacío, cristalización y liofilización. En la presente práctica se realizar la extracción y parcial purificación de la invertasa de levaduras La enzima invertasa y en especial la invertasa de levadura ha tenido un papel primordial en el desarrollo de la enzimología. Gran parte de los conocimientos en cinética enzimática se deben a esta enzima. La invertasa es una enzima con especificidad de fructofuranosidasa que participa en la reacción de hidrólisis de los oligosacáridos con enlaces del tipo - 121 21,fructofuranosos. Se obtiene comercialmente a partir de la levadura de Saccharomyces cerevisiae que es un subproducto de la industria cervecero. Sin embargo después de un estudio cinético realizado, se encontró que en la levadura Candida utilis Y-900 bajo ciertas condiciones se presenta una mayor actividad específica (U/g de células). Actualmente en México no se produce invertasa y la que se utiliza en la industria es importada de Europa y los Estados Unidos. A pesar de que es una enzima extracelular, la mayor parte de ella está retenida en la pared celular, por lo que es necesario la desorganización de esta estructura para su liberación. Se ha informado que compuestos con grupos sulfhidrilos son capaces de inducir la liberación de enzimas que se encuentran de alguna forma unidas a la pared celular de levaduras. La adición de cisteína a altas densidades celulares de la levadura reduce el tiempo de liberación de la enzima. Una vez que se tiene el extracto enzimático, se seleccionan las técnicas para la purificación de la invertasa. En este caso el mejor m‚todo fue la precipitación con etanol, estableciendo las condiciones para precipitar selectivamente a la invertasa, dejando en solución al resto. El etanol ha sido empleado por varias décadas como un agente precipitante de proteínas. La obtención de proteínas puras de una mezcla compleja se facilita por la influencia de factores como el pH, la fuerza iónica, la temperatura y la concentración de proteína sobre la acción precipitante del etanol. Además de interaccionar con otras variables, el etanol por s¡ mismo causa precipitación de proteínas ya que disminuye significativamente la constante dieléctrica de las soluciones acuosas. Finalmente se utiliza la centrifugación para recuperar el precipitado. METODOLOGÍA. Se utilizará la biomasa generada en la práctica de Producción de proteínas unicelular mediante la técnica de cultivo extendido como materia prima para la obtención de la invertasa, o bien, se emplear S. cerevisiae de origen comercial. ACTIVIDADES POR SESIÓN. SESIÓN 1. EXTRACCIÓN DE LA ENZIMA UTILIZANDO CISTEINA. Se utilizará una concentración celular de aproximadamente 200 g/-, resuspendiendo el paquete celular en una solución reguladora de fosfatos 0.1 M pH 7.2. Se adicionará cisteína hasta una concentración de 0.25% (p/v) y se incubará a temperatura ambiente por 24 horas. Después de este tiempo la suspensión se colocará en el refrigerador hasta la siguiente sesión. Una hora después de haberse iniciado la autolisis, se tomará una muestra a la que se le determinará la actividad enzimática y la concentración de proteína. Se comparará con una muestra tomada al inicio de la incubación para asegurarse de que está llevándose a cabo el proceso de autolisis. SESIÓN 2. RECUPERACIÓN PARCIAL Y PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA. Recuperación de la enzima. Separar los residuos celulares por centrifugación de la suspensión celular a 3500 rpm por 10 minutos Tomar una muestra del sobrenadante para su posterior análisis de actividad y concentración de proteína. 122 Purificación parcial de la enzima. Al sobrenadante obtenido se le adicionan 4°C volúmenes de etanol muy lentamente y con agitación en un baño de hielo. Se deja reposar por una hora a 40C para permitir la precipitación de la enzima. Después de este tiempo se recuperar el precipitado por centrifugación a 3500 rpm por 10 minutos. El precipitado se resuspende en un volumen exacto de regulador de TRIS-HCI 50 mM y pH de 7.2. A este precipitado se le determinará la actividad de invertasa empleando el método de glucosa-oxidasa-peroxidasa y la concentración de proteína por el método de Lowry. METÓDOS ANALÍTICOS. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE INVERTASA POR EL MÉTODO DE LA GLUCOSA-OXIDASA-PEROXIDASA. Reactivos: A. Solución enzimática: a un litro de regulador de fosfatos 0.1 M pH 7.0 se le adicionan 5 mg de peroxidasa (SIGMA) y 1 ml de la enzima glucosa oxidasa (SIGMA). B. Solución de o-dianisidina: 300 mg de o-dianisidina en 50 mi de agua destilada. C. Mezcla enzimática: 20 mi de reactivo A m s 1 mi de reactivo B (preparada al momento de usarse). D. Solución de sacarosa 0.5 M. E. Solución de HCI 6 N. F. Regulador de acetatos 0.1 M PH 4.5. Procedimiento: En un tubo de ensayo se colocan 100 microlitros del reactivo F y 50 microlitros del reactivo D. La mezcla se incuba 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se adicionan 2 mi del reactivo C y se deja a temperatura ambiente durante 8 minutos. Transcurrido este tiempo se detiene la reacción adicionando 2 mi del reactivo E. El color desarrollado se mide a 540 nm en un espectrofotómetro. Para ajustar el espectrofotómetro se prepara un testigo de reactivos siguiendo el mismo procedimiento usando agua destilada en lugar de muestra. También se utiliza un control de glucosa 2 mM. Una unidad de invertasa (U) se define como un micromol de glucosa liberada por un minuto en las condiciones de ensayo. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE LOWRY. Reactivos: A. Solución de tartrato de sodio y potasio al 1% en sulfato cúprico al 0.5%. B. Solución de carbonato de sodio al 2% en hidróxido de sodio 0.1 N. C. Se mezclan 50 mi de B con 1 mi de A (preparado al momento de usarse) D. Reactivo Folin-Ciocalteu diluido 1:2 con agua destilada. Procedimiento: En un tubo de ensayo se adicionan 500 microlitros de muestra diluida y 5 ml del reactivo C, se dejan incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, pasado este tiempo se agregan 0.5 ni] del reactivo D, la mezcla se agita y se esperan 30 minutos para que se lleve a cabo la reacción, transcurrido este tiempo, el color desarrollado se mide en un espectrofotómetro a 500 nm. De la misma manera se prepara un blanco de reactivos, 123 sustituyendo la muestra por agua destilada, y un control utilizando una solución de albúmina de bovino de 0.5 mg/ml tratado en forma similar. RESULTADOS. 1. Elaborar un cuadro comparativo de la actividad enzimática en el sobrenadante y el paquete celular antes y después de la extracción. 2. Determinar el % de liberación de la enzima durante la extracción. 3. Determinar la eficiencia de recuperación de la enzima durante la purificación. 4. Determinar el grado de purificación relativo de la invertasa. 5. Discusión y conclusiones. REFERENCIAS. Ahuatzi C. D. Extracción y purificación de la invertasa de Cándida utilis Y-900. Tesis Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN. México. Castro B.F. & Romero, F.F. 1984. Cinética de acumulación de invertasa de levaduras cultivadas en distintos sistemas fermentativos. Tesis Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN. México. De la Vega, G. M., & Paneque, A. 1990. Purification and properties of an extracellular invertase from Acetobacter chroococuni. Enzynic & Microbial Technol.13:267-271. Casc¢n, S & Lampen, 0. J. 1968. Purification of the internal invertase of yeast. J. Biol Chem. 243:1567-1572. Lam, K.S., & Grootwassink. W. D. 1985. Efficient, non-killing extraction of -fructofuranoside (an exo-inulase) form Kluyveroniyces fragilis at high density. Enzyme Microb. Technol. 7:239-242. Lowry, 0. H. Rosebrough, N. J. Farr, A.L. & Randall R. J. 1951. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275. 124 PRÁCTICA No. 6 FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA OBJETIVOS. Esta práctica tiene como objetivo que el participante conozca la importancia económica y social que tiene la producción de alcohol, permitiendo la integración de conocimientos de microbiología industrial, ingeniería bioquímica, operaciones unitarias, as¡ como diversos métodos analíticos, para su elaboración a escala de laboratorio, partiendo desde el acondicionamiento de la materia prima hasta la recuperación de] producto, basados en una investigación previa de los métodos actuales de producción de alcohol a nivel industrial. INTRODUCCIÓN. Una de las fermentaciones industriales de mayor importancia económica y, quizás, la más antigua producida por el hombre, es la fermentación alcohólica, que es la base para la producción del aguardiente, por destilación de un mosto fermentado. El mosto fermentado se obtiene a partir de la acción de un microorganismo usualmente una levadura, sobre una solución azucarada. La fuente más común para la producción de alcohol, es la caña de azúcar, utilizando principalmente en la industria las melazas. Otras son los frutos, los granos, tubérculos, y agaves. El uso de una u otra dependerá del producto que se desea y de un estudio económico. A continuación se presenta una tabla que relaciona el tipo de bebida alcohólica según la materia prima que se utilice. MATERIA PRIMA BEBIDAS NATATURALES BEBIDAS DERIVADAS I.Frutas Uvas. a) Vinos generosos. b) coñac. c) Brandy. Manzana. Durazno, zarzamora, Naranja, etc. II. Caña de azúcar Piloncillo. Licores (bebidas naturales con ingredientes y endulzadas). a)Sidra. b)Licores a) Aguardiente. b) Ron. Licores Vodka, Ginebra. a) Aguardiente. b) Ron. c)Alcohol Licores Vodka Ginebra Alcohol industrial c) Alcohol Melazas.. III. Granos Maíz glucosa a) Whisky. b) Alcohol Vodka. Ginebra. 125 Cebada, maltosa, Y glucosa. a) Cerveza. b) Whisky. Arroz. a) Sake. b) Whisky IV.Tubérculos Remolacha. Papa a) Aguardiente. b) alcohol. .a) Aguardiente. b) Whisky. V.Agaves Agave atrovirens. a) Pulque. Agave azul. a) Tequila Agave esperrima Jacobi a) Mezcal Agave. a) sotol . REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO. 1. Materias primas: Fuente de carbono (de acuerdo a la disponibilidad en el laboratorio, melazas, piloncillo, ó almidón y malta), sulfato de amonio dibásico, fosfato de amonio, sulfato de magnesio, ácido sulfúrico 1:1, levadura de panificación seca o fresca, y agua. 2. Mosto: Preparar el mosto a partir de melazas, o piloncillo, continuar en el inciso 3. Si la materia prima es almidón y malta, continuar en el punto 7. 3. Determinar el contenido de azúcares reductores y los grados Brix a las melazas (piloncillo). 4. Con el resultado anterior, y utilizando el diagrama de Pearson, estimar la cantidad de melazas que se requieren para 15 litros de mosto con una concentración de 18 % de azúcares reductores. 5. Enriquecer el mosto con: NH4)2SO4 0.300 g/l. NH4)2HP04 0.240 g/l. MgSO4 0.024 g/l. 6. Ajustar el pH entre 4.0 y 4.5 con ácido sulfúrico diluido 1:1 7. Almidón, en este caso se requiere como paso preliminar la transformación del almidón en azúcares fermentables por la levadura, este proceso se realiza utilizando enzimas procedentes de otras fuentes, que hidrolizan al almidón en maltosa y glucosa. El grano de trigo se somete a una molienda regular, para aumentar el rea de contacto del almidón con las enzimas, pesar y colocar la molienda en un recipiente y agregar dos veces su peso de agua, y calentar para gelatinizar el almidón. La temperatura de gelatinización varía con el tipo de almidón y tamaño de los granos, por ejemplo el almidón de trigo gelatiniza a temperatura de 60 a 85°C, el de papa entre 55 y 60°C y el almidón de arroz entre 80 y 85°C. el tiempo de gelatinización es de 15 a 20 minutos. Ya gelatinizado, se ajusta la temperatura a 70°C y se le adiciona de un 20 a 30% de malta referido al peso de la molienda del grano de almidón, se mantiene a 70'C para que las enzimas que se encuentran en la malta actúen hidrolizando el almidón, el tiempo de hidrolizado se determina con una prueba sencilla de tinción de almidón con una solución de yodo al 1%, 126 cuando la prueba es negativa, habrá terminado el proceso de gelatinización (el yodo ya no da color, ya que los almidones han sido hidrolizados). 8. Se procede como en los puntos 3, 4. y 6, y luego pasar al inciso 9 9. Fermentación: Para iniciar la fermentación primero se tiene que inocular adicionando 2 g de levadura fresca de panificación por litro de mosto, o 1 g de levadura de panificación seca por litro de mosto. Se recomienda activar la levadura 30 min. antes en 1.5 litros del mismo mosto con burbujeo de aire estéril. Una vez realizado esto, se tapa el recipiente en que ha de efectuarse la fermentación, del cual se tomar n muestras cada 6 horas para el control del proceso, iniciando con una muestra al tiempo cero. CONTROL DEL PROCESO. A.R. (g/1) Bx pH CONC. (20*C) CELULAR Gl. TEMP. (150C) (*C) materias primas x x mosto x x x x fermentación x x x x x x Azúcares: Tomar 5 ml de muestra en un matraz volumétrico de 100 mi, agregar 20 ml de agua y 1 mi de ácido clorhídrico concentrado. Poner a ebullición 5 minutos, enseguida agregar 20 ml de agua y 1.5 ml de hidróxido de amonio concentrado y llevar a 100 mi con agua destilada. Con esta solución titular el reactivo de Fehling (5 ml de solución "A" más 5 mi de solución "B" más una gota de azul de metileno al 1%). Para cuantificar el azúcar presente es necesario conocer el factor de la solución de Fehling y las diluciones que se hayan hecho. Concentración celular. En un tubo de ensayo colocar 5 ml de muestra y agregar agua destilada para lavar (el volumen de agua es de acuerdo al tamaño del tubo), centrifugar 10 minutos a 3500 rpm. Desechar el sobrenadante y resuspender en agua destilada y repetir la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en un matraz volumétrico de 100 ml, con agua destilada hasta el aforo, leer la absorbancia. a 595 nm e interpolar la lectura de densidad óptica en la gráfica tipo. El resultado multiplicarlo por 20 que es la dilución. Grado alcohólico real: En un matraz balón de 500 ml, colocar 100 ml de muestra (15 o 20°C), mas 60 ml de agua destilada. Destilar lentamente recibiendo el destilado en un matraz volumétrico de 100 m], éste se sumerge en un recipiente con hielo. Recoger el destilado hasta 2 ml antes del aforo, completar con agua destilada, homogeneizar y medir el grado alcohólico con un densímetro Ga -Lussac, y la temperatura (corregir por temperatura y referir la lectura Gay-Lussac a 15 °C) METODOLOGÍA. La práctica se efectuará en cuatro sesiones, de acuerdo a. la programación que le ser entregada por el coordinador del laboratorio, más tiempo extraclase. En la primera sesión los participantes del equipo, presentarán en una sesión de Seminario los siguientes puntos que habrá investigado con anticipación a la fecha de la práctica programada. Ruta metabólica a través de la cual se verifica la fermentación alcohólica y organismos que la llevan a cabo. 127 Antecedentes históricos sobre la producción de alcohol en el país. Importancia económica e impacto social. Uso del alcohol Fuentes de carbono susceptibles de ser usados como materia prima en la producción de alcohol y su acondicionamiento. Producción industrial de alcohol por vía fermentativa, a) materias primas, b) condiciones del proceso, c) cinética de la fermentación d) productos y subproductos,e) recuperación del producto. Las siguientes tres sesiones se realizarán de acuerdo al plan de trabajo que el equipo participante y el profesor diseñen. Para acreditar la práctica se consideran los siguientes puntos. Entrega de una memoria del seminario. El trabajo de laboratorio en equipo. Entrega de un informe de la práctica. RESULTADOS. El informe de la práctica incluir los siguientes puntos: Presentación e introducción. Cinética de producción de etanol, consumo del sustrato y crecimiento microbiano. Comparar los rendimientos, teórico y experimental de producción de etanol. Calcular el rendimiento de la primera destilación. Discusión y conclusiones. Bibliografía. REFERENCIAS. Amerine, M.A. 1974. Análisis de vinos y mostos. Ed. Acribia Barcelona Palacios L. H. 1956. Fabricación del alcohol. Salvat editores, S.A. Lehninger. 1981. Bioquímica, 4a edición, Omega, Barcelona Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Blackweil Scientific Publications, London Prescott, S.C. & Dunn C.G. 1962. Microbiología Industrial, 3a. edición Aguilar, Madrid 128 PRÁCTICA No. 7 PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR MEDIANTE LA TÉCNICA DEL CULTIVO EXTENDIDO OBJETIVOS. Realizar un proceso fermentativo de producción de proteína unicelular programando la alimentación de sustrato a partir de la simulación del proceso basada en los modelos, las constantes cinéticas y estequiométricas que rigen el crecimiento del microorganismo. INTRODUCCIÓN. Los cultivos por lote co - suministro de sustrato han recibido a lo largo de su historia diversas denominaciones; proceso "Zulauf - término introducido por investigadores daneses y alemanes a principios de este siglo -, proceso "batch fed", "Semibatch" y "fedbatch" en los países de habla inglesa. Este último término es actualmente el de uso más generalizado y fue introducido por Yoshida en 1973. Existen otras denominaciones para casos particulares como son los de: "cultivo extendido" y el de "fed-batch exponencial" que se aplican para describir un cultivo alimentado en donde la concentración de sustrato limitante del crecimiento es mantenida constante por manipulación de la velocidad de suministro de nutrientes. Ocasionalmente, estos cultivos son referidos como “fermentaciones de volumen variable”.. La técnica del cultivo extendido (CE) se ha venido utilizando desde hace por lo menos medio siglo. Su uso fue completamente empírico hasta bien entrada la década de los setenta en que coinciden; el desarrollo de modelos matemáticos para este tipo de cultivos con el auge de la aplicación de los microprocesadores en la tecnología de fermentaciones, coincidiendo además con el desarrollo de nuevos sensores y servomecanismos para el seguimiento y control de procesos. Para que un cultivo alimentado sea realmente productivo y en ‚l se obtengan valores elevados de conversión de nutrientes a productos, se requiere de una exacta predicción de los eventos que ocurrir n en el cultivo, tales como variación en los indicadores cuantitativos de: crecimiento, producción de metabolitos y consumo de nutrientes y de oxígeno, del microorganismo; así como de un estricto control de las variables ambientales que afectan al proceso fermentativo. Una inadecuada predicción de eventos puede resultar en alteraciones ambientales que modifiquen de forma imprevista la fisiología del microorganismo, provocando una desviación en la fermentación hacia la producción de metabolitos indeseables, abatiéndose la productividad, el rendimiento o ambos. Dependiendo del objetivo de una fermentación, la estrategia de alimentación de nutrientes a un cultivo puede ser de dos tipos: velocidad de suministro constante o variable. En este último caso, la velocidad de suministro se incremento paulatinamente con el fin de sostener un nivel constante del sustrato limitante en el cultivo. La variación en este suministro puede programarse previamente para satisfacer la demanda creciente del cultivo por nutrientes o bien, puede introducirse un sistema de control capaz de estimar y satisfacer dicha demanda. Tal sistema tendría una serie de sensores que suministrarían información a una unidad de procesamiento de datos, la cual enviaría a servomecanismos periféricos específicos (válvulas, bombas, motovariadores, etc.) para modificar velocidades de suministro de nutrientes o de oxígeno, cuando esto fuera necesario. 129 BASES TEÓRICAS DEL CULTIVO EXTENDIDO. a) Ecuaciones de balaiwe. Consideremos un reactor con un volumen inicial [Vo] de medio de cultivo con una concentración de sustrato limitante [s] y una densidad de población celular [x] que se incremento con una velocidad específica de crecimiento []. A un tiempo dado se comienza a suministrar al cultivo un flujo [F] de medio fresco que contiene al sustrato limitante del crecimiento a una concentración [Sr]. No habiendo salida del mosto del reactor durante el proceso, el volumen de medio en el fermentador variará continuamente, a menos que la alimentación se haga con sustrato puro (sólido o líquido), en cuyo caso el volumen se mantendrá constante. Se consideran las siguientes restricciones para el sistema: 1. La suspensión celular es homogénea. 2. Aún cuando la población consiste de un número de partículas discretas, su concentración es o suficientemente alta y el tamaño de partícula lo suficientemente pequeño para considerar como una variable continua a la densidad de población [x]. Por otra parte, el volumen ocupado por las partículas representa sólo una fracción del volumen total del sistema y se considera despreciable. 3. Tan pronto como los nutrientes entran al cultivo son instantáneamente dispersados en él. 4. Toda la población celular permanece viable. 5. La velocidad específica de crecimiento [] es una función de la concentración de un solo sustrato limitante [s] y se asume la funcionalidad de Monod. =máxs/(Ks+s) 6. Si el sustrato que limita al crecimiento es la fuente de energía, la cantidad de biomasa producida por unidad de sustrato limitante utilizado no ser constante. Este rendimiento celular [Y] ser una función de la velocidad específica de crecimiento y est dado por la ecuación: Yxs = Yg/( + mYg) (2) Donde: Yg= Rendimiento celular m ximo para crecimiento. m = Coeficiente de mantenimiento celular. Si el sustrato que limita al crecimiento no es la fuente de energía, el valor de [Yxs] se asume constante. 7. Durante el proceso no existe inhibición del crecimiento por los metabolitos producidos por el mismo microorganismo. Con base en las anteriores consideraciones, las ecuaciones de balance en el reactor serán las siguientes: Balance de biomasa: Acumulación global Entrada - Salida + Crecimiento global [d(Vx)/dt]ac = 0 - 0 + [d(Vx)/dt]crec = (Vx) Haciendo (Vx = X): V(dx/dt)ac + x(dV/dt) = dX/dt = X (3) Pero (dV/dt = F); despejando de la ecuación anterior a (dx/dt)ac y haciendo (F/V=D), se obtiene la velocidad de acumulación volumétrica de biomasa: (dx/dt)ac = x( - D) (4) Siendo [D] la velocidad de dilución del cultivo. Balance de sustrato: Acumulación global = Entrada - Salida - Consumo global. 130 [d(Vs)/dt]ac = F(Sr) - 0 - qs(Vx) = F(Sr) - (/Yxs)(Vx) (5) Siendo (qs = /Yxs), donde [qs] es la velocidad específica de consumo de sustrato. s(dV/dt) + V(ds/dt) = F(Sr) - (/Yxs)(Vx) Por lo tanto la velocidad volumétrica de acumulación de sustrato estar dada por: (ds/dt)ac = D(Sr - s) - x/Yxs (6) Cuando interesa describir la acumulación de algún producto en el reactor, se hace a partir de la ecuación de balance para producto. Las ecuaciones de balance anteriores pueden considerarse como las fundamentales para el cultivo alimentado. b) Comportamiento de un cultivo extendido. Partiendo de la base de que el suministro de nutrientes se mantendrá igual a la demanda del cultivo; se tendrá un valor constante de la concentración de sustrato limitante [s], y por lo tanto una velocidad específica de crecimiento [m] constante. En estas condiciones tendremos que en la ecuación de balance (6), el valor de la acumulación volumétrica de sustrato ser cero. Por tanto: (F/V)(Sr - s) = (x/Yxs) De donde: F = [(xV)/Y(Sr - S)] (7) Sustituyendo el valor (xV = X) en la ecuación de balance (3) e integrando entre los límites (to = 0 -> t): X = Xo e(t) = xV (8) Sustituyendo esta expresión en la ecuación (7), tendremos: F = [Xo/Yxs(Sr - s)] e(t) (9) Con base en las consideraciones iniciales planteadas (s= cte, = cte.) tendremos que de acuerdo a la ecuación (2); el valor d‚ [Y] ser también constante. Por lo tanto tendremos que el flujo variar exponencialmente de acuerdo a la ecuación: F = a e(t) (10) Donde: a = [.Xo/Yxs(Sr - S)] = Constante. La variación en volumen se obtiene sustituyendo el valor de [F] en la diferencial: dV/dt = F = a e(t) Integrando entre los límites (to = 0 -> t), obtendremos: V=Vo + [Xo/ Yxs(Sr - s)] [e(t) – 1] (11) Por sustitución de las ecuaciones (2) y (11) en la ecuación (8), obtendremos la trayectoria de la concentración celular en un cultivo alimentado exponencialmente: x = [(XoVo) e(t)]/(Vo +[xoVo ( + mYg)/(Yg)(Sr - s)][e(t) – 1]} (1,2) Para poder alimentar exponencialmente a un cultivo, manteniendo un nivel constante del sustrato limitante, se requiere de un control muy preciso de la velocidad de operación de Ia bomba de suministro de nutrientes. Para efectuar tal control puede recurriese al uso de equipo relativamente sofisticado; bombas acopladas a un trazador automático de curvas, con el objeto de alimentar nutrientes de acuerdo a un perfil gráfico predeterminado o bien, alimentar bajo el control de una computadora. Cuando no se dispone de tal equipo, es posible hacer una aproximación al suministro exponencial mediante la adición (manual o autom tica) de volúmenes discretos de medio de suministro a intervalos de tiempo programados, para mantener los niveles de sustrato limitante dentro de un intervalo de valores preestablecidos. 131 METODOLOGÍA. 1. Se realizará un cultivo por lote en donde se estimarán los siguientes valores: [máx] y [Yxsl. Estos, junto con otros valores obtenidos anteriormente (m, Yg y Ks), para Candida utilis Y-900 en cultivo continuo a 35'C, ser n utilizados para establecer el programa de alimentación del cultivo. 2. El suministro de medio fresco ser exponencial y se iniciará cuando la concentración de sustrato llegue a un valor mínimo preestablecido. La alimentación programada a partir de la simulación del comportamiento del cultivo, se hará por medio de una bomba peristáltica de velocidad variable para mantener un valor de [s] constante. 3. Durante el cultivo por lote y el cultivo extendido se tomar n muestras, a las que se les determinará inmediatamente la concentración celular y la concentración de glucosa. La concentración celular se estimar por turbiedad y por peso seco, y la glucosa por ensayo enzimático con glucosa oxidasa. RESULTADOS. Calcular [máx], y los valores de rendimiento y productividad celular media de Candida utilis Y-900 en el cultivo por lote. Para el cultivo extendido, construir curvas comparativas (teóricas y experimentales) de: x = f(t) X = f(t) = f(t) s = f(t) Estimar los valores de productividad media y los de rendimiento celular medio en el cultivo extendido (teóricos y experimentales). Discusión de resultados y conclusiones. REFERENCIAS. Araujo, M. D. 1980. Producción de proteína unicelular a partir de desechos de plátano mediante un proceso fermentativo de volumen variable con alimentación programada. Tesis profesional. ENCB. Dunn, 1. J., y J. R. Mor. 1975. 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